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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Anmeldung Nr. 09/328.611,
die am 9. Juni 1999 eingereicht wurde.
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FACHGEBIET DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft das Fachgebiet von Abführmitteln, Behandlungen zur
Senkung des Blutserumcholesterins und kalorienarmen Nahrungsmittelverdickern
und Fett-Ersatzstoffen. Insbesondere betrifft die Erfindung nicht
fermentierte gelbildende Polysaccharide aus Indischen Flohsamenschalen
und Verfahren für
deren Isolation.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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In
der gesamten Beschreibung wird in Klammern auf verschiedene wissenschaftliche
Artikel und Fachartikel Bezug genommen. Diese Artikel sind hierin
durch Verweis aufgenommen, um den Stand der Wissenschaft in jenem
Fachgebiet zu beschreiben, welchem die Erfindung angehört.
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Die
Indischen Flohsamenschalen (Plantago ovata, auch als Ispaghula bekannt)
werden häufig
als Abführmittel
und zur Förderung
der regulären
Darmfunktion verwendet. Indische Flohsamenschalen fördern die Defäkation teilweise
durch Steigerung des Massen- als auch des Feuchtigkeitsgehalts des
Stuhls [Marteau et al., Gut 35, 1747-1752 (1994)]. Zusätzlich dazu
sind die Exkrete von Tieren und Menschen, die Nahrungsmittel zu
sich nahmen, die Indische Flohsamenschalen enthalten, gallertartig.
Diese gallertartige Eigenschaft trägt zu den abführenden
Eigenschaften von Indischen Flohsamenschalen bei, indem die Reibung
im Darm verringert wird. Beobachtete Anstiege der Fäkalmasse
und Wasserretention sind ebenfalls diesem gallertartigen Material
zugeschrieben worden [Marteau et al., siehe oben (1994)]. Das Gel
besteht großteils
aus nicht fermentierten Psylliumpolysacchariden [Cabotaje et al.,
1302-1307 (1994)].
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Derzeit
verwendete Formulierungen von Indischen Flohsamenschalen haben bestimmte
Nachteile. Abführende
Formulierungen von Indischen Flohsamenschalen bestehen im Allgemeinen
aus gemahlenen Schalen und führen
zu einem groben und unangenehmen Gefühl im Mund, wenn sie in Getränken verabreicht werden.
Indische Flohsamenschalen sind in Kekse, Cracker und ähnliche
Produkte inkorporiert worden, jedoch tendieren diese Produkte dazu,
im Mund unangenehm zu gelieren. Noch deutlicher, Indische Flohsamenschalen
können
in der Speiseröhre
aufquellen, was eine Speiseröhrenobstruktion
verursacht, die Würgen
verursachen kann. Aus diesem Grund sind Formulierungen Indischer
Flohsamenschalen für
die Einnahme durch Personen, die Probleme beim Schlucken haben (z.B. ältere Personen),
nicht empfohlen. Letztlich ist die empfohlene Tagesdosis von Indischen
Flohsamen von 3,5-11 g täglich
in keiner Form angenehm einzunehmen. Was erforderlich ist, ist eine
Form von Indischen Flohsamen, die praktisch und angenehm einzunehmen
ist.
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Indische
Flohsamenschalen haben viele Eigenschaften von löslichen Ballaststoffquellen.
Häufig
verwendete Quellen von löslichen
Ballaststoffen umfassen Pektin, Gummen und Haferkleie. Lösliche Ballaststoffe (SDF)
finden in Nahrungsmitteln und medizinischen Formulierungen vielerlei
Anwendungen. Lösliche
Ballaststoffe sind Komponenten von minimal verarbeiteten Nahrungsmittelquellen,
wie z.B. Hafer, Haferkleie und Gerste, oder sind als Konzentrate
verfügbar,
wie z.B. Gummen, Pektine und Schleime. Gummen und Schleime sind
Kohlenhydratpolymere, die im Allgemeinen aus Pflanzenquellen isoliert
werden. Schleime produzieren insbesondere glitschige oder gallertartige
Lösungen
in Wasser. Pektine sind Polymerketten aus teilweise methylierten
Galacturonsäuren,
die auch die Fähigkeit
besitzen, in Wasser ein Gel zu bilden. Die meisten löslichen
Ballaststoffe werden rasch und vollständig fermentiert und weisen
keine Eigenschaften von Abführmitteln auf.
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Quellen
löslicher
Ballaststoffe, die auch viskos sind, verringern das Serumcholesterin
bei Tieren und Menschen [Marlett, Dietary Fiber and Health, Plenum
Press, New York, Hrsg. Kritchevski und Bonfield, 109-121, (1997)].
Die Viskosität
von löslichen
Ballaststoffen, statt ihre Vergärung
im Gastrointestinaltrakt, ist der Schlüssel zur cholesterinsenkenden
Wirkung [Marlett et al., Hepatology 20, 1450-1457 (1994)]. Visko sität im Lumen
des unteren Dünndarms
beeinflusst die Absorption von Gallensäuren, und mehr Gallensäure geht durch
den Stuhl verloren. Es wird angenommen, dass Blutcholesterin primär gesenkt
wird, weil es in der Leber verwendet wird, um mehr Gallensäuren zu
synthetisieren, um die verlorengegangenen zu ersetzen. Die Synthese
von Gallensäuren
in der Leber macht 40 bis 50% der täglichen Elimination von Cholesterin
aus dem Blut aus. Jedoch erhöht
die Hinzufügung
einer Quelle von löslichem
Ballaststoff, Haferkleie, zur Ernährung den Anteil von Desoxycholsäure im Gallensäurepool,
der die Absorption von exogenem Cholesterin in der Nahrung verringert.
Die Ergänzung
der Nahrungsmittel mit Indischen Flohsamen erhöht auch die Exkretion von Gallensäuren um
etwa 50% [Gelissen et al., Am. J. Clin. Nutr. 59, 395-400 (1994)].
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Lösliche Ballaststoffkonzentrate
werden auch oft aufgrund ihrer hydrokolloidalen Eigenschaften als Verdickungsmittel
und kalorienarme Fettersatzstoffe in der Nahrungsmittelindustrie
verwendet [Ward, Cereal Food World 42, 386-390 (1997)]. Gummen mit
niedriger Viskosität
wie Akaziengummi haben sowohl hydrophile als auch lipophile Eigenschaften,
die sie als Emulgatoren, Tenside und Stabilisatoren ideal machen.
Pektine und Schleime haben gelbildende Eigenschaften, die sie zu
idealen Verdickungsmitteln von Nahrungsmittelprodukten machen. Pektine
werden traditionellerweise aus Apfel und Zitrusfrüchten extrahiert.
Häufig
verwendete Schleime werden im Allgemeinen aus Tang extrahiert und
umfassen Carrageen, Agar und Alginat. Ein Fettersatzstoff kann durch
Kombination vom Gummi mit Schleimen und/oder Pektin hergestellt
werden, um eine Verbindung mit den emulgierenden Eigenschaften und
der Geschmeidigkeit eines Fettes herzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt die gelbildende Komponente von Indischen
Flohsamenschalen in gereinigter Form bereit. Dieser Gelanteil stellt
abführende
und cholesterinsenkende Wirkungen von intakten Indischen Flohsamenschalen
bereit, liegt aber in einer Form, die einfach als Tablette, Kapsel
oder Flüssigkeit
zu verabreichen ist, ohne bestimmte unangenehme oder unsichere Eigenschaften,
die mit der Ver wendung von intakten Indischen Flohsamenschalen assoziiert
sind, vor. Der Gelanteil ist auch in der Behandlung von anderen
Darmanomalien und zur Aufrechterhaltung der normalen Darmfunktion
und als Nahrungsmittelverdickungsmittel und Fettersatzstoff nützlich.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung ist ein gelbildender Anteil von Indischen Flohsamenschalen
bereitgestellt, der mikrobielle Fermentation beim Durchgang durch
einen monogastrischen Verdauungstrakt eines Säugetiers übersteht. Unter anderen Komponenten
umfasst der Gelanteil vorrangig Xylose und Arabinose in einem Trockengewichtsverhältnis von
2,5:1 bis 4,5:1. Der Anteil umfasst bemerkenswerterweise begrenzte Mengen
anderer Zucker, z.B. insgesamt etwa 2,5%-13,5% von Rhamnose, Galactose,
Glucose und Uronsäuren.
Der Anteil umfasst weniger als 2 Gew.-% Rhamnose. Genauer gesagt
können
die gelbildenden Anteile folgende Zuckerzusammensetzung aufweisen,
die als Prozentsatz aller Zucker ausgedrückt wird:
zwischen etwa
19 und 22% Arabinose;
zwischen etwa 68% und 76% Xylose;
zwischen
etwa 0% und 0,5% Mannose;
zwischen etwa 1% und 2% Galactose;
zwischen
etwa 0% und 1% Glucose; und
zwischen etwa 1% und 6% Uronsäuren.
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Nach
weiterer Reinigung wird der gelbildende Anteil in Ramnose, Glucose
und Uronsäuren
weiter abgebaut.
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Der
gelbildende Anteil ist auch höchst
viskos, wobei eine 0,2% Konzentration in Formamid über eine Scheinviskosität von zumindest
500 s, vorzugsweise 750 s und am bevorzugtesten 850 s, verfügt. Der
Anteil ist in einer verdünnten
alkalischen Lösung
löslich
und bildet nach Ansäuerung
der Lösung
auf einen End-pH von etwa 4,5 ein Gel.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung wird in einem bevorzugten Verfahren
zur Gewinnung des gelbildenden Anteils Indischer Flohsamenschalen
auch ein separater Kohlenhydratanteil erhalten. Dieser Anteil ist
in verdünnter
alkalischer Lösung
löslich
und bleibt nach Ansäuerung
der Lösung
auf einen pH von etwa 4,5 löslich.
Dieser Anteil umfasst Xylose, Arabinose, Rhamnose, Uronsäure und
Galactose, worin die Xylose und Arabinose in einem Verhältnis von
zumindest 4:1 und die Rhamnose zu zumindest 12 Gew.-% und die Uronsäure zu zumindest
15 Gew.-% vorliegt. Die Xylose und Galactose liegen in einem Verhältnis von
weniger als 40:1 vor.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Auftrennung von
Indischen Flohsamenschalen zur Gewinnung eines gelbildenden Anteils
und eines weiteren Kohlenhydratanteils bereitgestellt. Das Verfahren
umfasst: (a) Einmischen der Schalen in Gegenwart eines chemischen
Reduktionsmittels in eine wässrige
alkalische Lösung,
die zwischen 0,15 und 1,0 M (vorzugsweise 0,15-0,5 M, noch bevorzugter 0,15-0,4
M, noch weit bevorzugter 0,15-0,3 M und am bevorzugtesten 0,15-0,2
M) Hydroxylionen umfasst, wodurch die Schalen in einen alkalilöslichen
Anteil und alkaliunlöslichen
Anteil aufgetrennt werden; (b) Entfernen des alkaliunlöslichen
Anteils; (c) Ansäuern
des alkalilöslichen
Anteils auf einen pH zwischen 3 und 6 (vorzugsweise zwischen etwa
4 und 5, am bevorzugtesten etwa 4,5), was zu einer Gelierung des
gelbildenden Anteils führt,
und d) Auftrennen des Gelanteils, z.B. durch Zentrifugation oder
andere Mittel, von dem zusätzlichen Kohlenhydratanteil,
der in der angesäuerten
Lösung
enthalten ist. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren
weiters das Waschen des Gelanteils mit einer wässrigen oder gepufferten Lösung und
das Entwässern
des gewaschenen Gelanteils.
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In
einem anderen Aspekt der Erfindung ist ein gelbildender Anteil aus
Indischen Flohsamenschalen bereitgestellt, der durch das zuvor genannte
Verfahren produziert wird. Der zusätzliche Kohenhydratanteil ist auch
in diesem Aspekt der Erfindung bereitgestellt.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung sind alternative Verfahren zur Gewinnung
eines Polysaccharidanteils bereitgestellt, der den zuvor genannten
gelbilden den Anteil enthält.
Ein solcher Anteil wird durch Lösungsmittelextraktion
unter Verwendung von Formamid, Dimethylsulfoxid oder 4-Methylmorphilin-N-oxid
erhalten (50% Lösung
in Wasser). Das lösungsmittelbehandelte
Material wird zentrifugiert, um lösliche Materialien zu gewinnen,
die dann in Ethanol gegossen werden, um eine Konzentration von 80%
Ethanol zu erreichen. Das Präzipitat,
das sich dann bildet, ist in der Zusammensetzung ähnlich dem
alkalilöslichen
gelbildenden Anteil.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung sind pharmazeutische Formulierungen
zur Behandlung von Obstipation oder anderen Darmanomalien oder zur
Senkung der Serumcholesterinspiegel bei einem Patienten bereitgestellt.
Diese Formulierungen sind so formuliert, dass sie wirksame Dosen
des gelbildenden Anteils Indischer Flohsamenschalen enthalten. Es
sind ebenfalls Verfahren zur Behandlung dieser verschiedenen Leiden
bei Patienten bereitgestellt, welche die Verabreichung der pharmazeutischen
Formulierungen der Erfindung umfassen.
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Andere
Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus
der detaillierten Beschreibung und den nachfolgenden Beispielen
offensichtlich.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen höchst polymerisierten gelbildenden
Anteil von Indischen Flohsamenschalen bereit, der in der Behandlung
und Prävention
von Obstipation und als cholesterinsenkendes Mittel sehr nützlich ist.
Dieser Gelanteil bleibt beim Durchgang durch den Gastrointestinaltrakt
(Beispiel 6 und Beispiel 7) im Wesentlichen nicht fermentiert und
fördert
Defäkation
durch eine Vielzahl von Mitteln, einschließlich Steigerung des Feuchtigkeitgehalts
und der Gesamtmasse des Stuhls, und dadurch, dass dem Stuhl eine schlüpfrige Eigenschaft
verliehen wird, die einen leichteren Durchgang des Stuhls ermöglicht (Beispiel
6).
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Der
gelbildende Anteil von Indischen Flohsamenschalen ist auch als ein
cholesterinsenkendes Mittel gezeigt worden. Dementsprechend kann
die gelbildende Fraktion alleine oder in Kombination mit anderen
aktiven Substanzen als therapeutische Behandlung verwendet werden,
um das Serumcholesterin zu senken.
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Stuhl
von Ratten und Menschen, denen Indische Flohsamenschalen verabreicht
werden, ist manchmal gallertartig [Cabotaje et al., siehe oben (1994);
Beispiel 6)]. Jedoch sind Versuche, ein gelbildendes Material zu
reinigen und zu charakterisieren [Kennedy et al., Carbohydrate Res.
75, 265-274 (1979); Sandhu et al., Carbohydrate Res. 93, 247-259
(1981)], nicht erfolgreich gewesen, und bisher hat niemand den hoch
gereinigten gelbildenden Anteil bereitgestellt, der die gemäß der vorliegenden
Erfindung beschriebenen Eigenschaften aufweist. Das Verfahren zur
Auftrennung von Indischen Flohsamenschalen, das gemäß der Erfindung entwickelt
worden sind, hat zu der unerwarteten Entdeckung geführt, im
Gegensatz zu veröffentlichten
Berichten [z.B. Kennedy et al., siehe oben (1979)], dass ein gallertartiger,
alkalilöslicher
Anteil von Indischen Flohsamenschalen weiter aufgetrennt werden
kann, um einen hoch viskosen Gelanteil (hierin als „Anteil
B" bezeichnet) und
einen zweiten Kohlenhydratanteil mit einer anderen Zusammensetzung,
wie nachstehend im Detail beschrieben (hierin „Anteil C" genannt), zu bilden. Sowohl der viskose
gelbildende Anteil B und der zusätzliche Anteil
C sind in einer Vielzahl von Substanzen löslich, einschließlich verdünntes und
konzentriertes Alkali, Formamid, Dimethylsulfoxid und 4-Methylmorpholin-N-oxid
(50% wässrige
Lösung);
in der Folge können
diese beiden Anteile zusammen auf Basis dieser Löslichkeitseigenschaften isoliert
werden. Jedoch ist die weitere Trennung der Anteile entweder nicht
erfolgreich gewesen [z.B. konnte ein mit starker Alkali extrahierter
gelbildender Anteil von Kennedy et al., siehe oben (1979), nicht
weiter getrennt werden] oder ist unentdeckt geblieben. Die Erfinder
haben herausgefunden, dass unter Verwendung eines geeigneten ersten
Extraktionsverfahrens zur Gewinnung eines Produkts, das Anteile
B und C gemeinsam umfasst, die Anteile durch Ansäuerung einer Lösung getrennt
werden, die ein Gemisch aus Fraktionen enthält. Anteil B wird zur Trennung
aus einem angesäuerten
Gemisch durch Zentrifugation konzentriert, während Anteil C in der Säure löslich bleibt.
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Beschreibung von Kohlenhydratpolymeren
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Der
viskose gelbildende Anteil von Indischen Flohsamenschalen der Erfindung
(Anteil B) besteht hauptsächlich
aus Xylose und Arabinose. In einer bevorzugten Ausführungsform
weist der gelbildende Anteil zumindest 50 Gew.-% Xylose und Arabinose,
in einer bevorzugteren Ausführungsform
zumindest 75 Gew.-% Xylose und Arabinose und in einer am meisten
bevorzugten Ausführungsform
zumindest 85 Gew.-%
Xylose und Arabinose, auf. Der gelbildende Anteil hat eine Scheinviskosität, wie im
Verfahren in Beispiel 3 bestimmt, von zumindest 500 s, in einer
bevorzugteren Ausführungsform
von zumindest 750 s und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform
von zumindest 850 s. Dem gelbildenden Anteil fehlt weiters insbesondere Rhamnose,
Galactose und Uronsäuren
im Vergleich zu Xylose. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Gewichtsverhältnis
von Xylose zu Rhamnose größer als
50, in einer bevorzugteren Ausführungsform
größer als
60, und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Verhältnis größer als
65. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Gewichtsverhältnis
von Xylose zu Galactose größer als
25, in einer bevorzugteren Ausführungsform
größer als
35, in der am meisten bevorzugten Ausführungsform größer als
42. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Gewichtsverhältnis
von Xylose zu Uronsäure
größer als
15, in einer bevorzugteren Ausführungsform
ist das Verhältnis
größer als
25 und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Verhältnis größer als
35. Das Gewichtsverhältnis
von Xylose zu Arabinose von Anteil B liegt zwischen 2,5 und 4,5,
im einer bevorzugteren Ausführungsform
zwischen 3,0 und 4,0 und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform
zwischen 3,25 und 3,75.
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Der
säurelösliche Anteil
von Indischen Flohsamenschalen (Anteil C) weist auch einen hohen
Anteil an Xylose und Arabinose auf. In einer bevorzugten Ausführungsform
weist der säurelösliche Anteil
zumindest 25 Gew.-% Xylose und Arabinose auf, in einer noch bevorzugteren
Ausführungsform
zumindest 40% Xylose und Arabinose und in einer am meisten bevorzugten
Ausführungsform
zumindest 45 Gew.-% Xylose und Arabinose. Obwohl Anteil C eine Scheinviskosität hat, die
jener von Anteil B ähnlich
ist, weist er nicht die gelbildende Eigenschaft von Anteil B auf.
Anteil C ist weiters insbesondere reich an Rhamnose, Galactose und
Uronsäuren im
Vergleich zu Xylose. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gewichtsverhältnis von
Xylose zu Rhamnose geringer als 6,0, in einer bevorzugteren Ausführungsform
ist das Verhältnis
geringer als 4,5, und in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform
ist das Verhältnis
geringer als 3,0. Das Gewichtsverhältnis von Xylose zu Galactose
ist geringer als 40, in einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Verhältnis geringer
als 30, und in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Verhältnis geringer
als 25. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gewichtsverhältnis von
Xylose zu Uronsäure
geringer als 30, in einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Verhältnis geringer
als 10, in der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Verhältnis geringer
als 5,0. Das Gewichtsverhältnis
von Xylose zu Arabinose von Anteil C ist größer als 4,0, und in einer am
meisten bevorzugten Ausführungsform
ist das Verhältnis
größer als
4,5.
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Herstellung von Anteilen Indischer
Flohsamenschalen
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Auftrennung von
Indischen Flohsamenschalen bereit, um die oben beschriebenen gereinigten
und getrennten Anteile zu ergeben. In seiner Grundform umfasst das
Verfahren die folgenden Schritte:
- 1. Suspendieren
von Indischen Flohsamenschalen in einer verdünnten alkalischen wässrigen
Lösung
(vorzugsweise 0,15-0,2 M Hydroxylionen), die ein Reduktionsmittel
enthält,
in welchem sich Teile des Schalenmaterials auflösen, während ein bestimmter Teil unlöslich bleibt;
- 2. Entfernen des alkaliunlöslichen
Materials (hierin „Anteil
A" genannt), z.B.
durch Zentrifugation;
- 3. Ansäuern
des alkalilöslichen
Anteils von Schritt eins auf einen pH zwischen 3 und 6, vorzugsweise
4,5, um ein Gel (Anteil B) und einen säurelöslichen Anteil (Anteil C) zu
ergeben; und
- 4. Trennen des Gels von der angesäuerten Lösung, z.B. durch Zentrifugation.
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Ein
Beispiel für
dieses Verfahren ist in Beispiel 1 beschrieben. Es gibt viele Variationen
dieses Verfahrens, welche das isolierte Produkt nicht wesentlich ändern. Diese
sind nachstehend detailliert beschrieben.
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Es
gibt verschiedene Variationen des Schritts alkalischer Solubilisierung.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren hat diese Solubilisierung
gegenüber
jener nach früherem
Stand der Technik verbessert. Vorherige alkalische Solubilisierungen
von Polysacchariden Indischer Flohsamenschalen verwendeten konzentrierte
Lösungen
von Base [d.h. 1,2 M NaOH, Kennedy et al., siehe oben (1979)] ohne
Reduktionsmittel. Unter Anerkennung des herben Wesens dieser Behandlung
und ihres partiellen Abbaus von Polysaccharidketten in dem gelbildenden
Anteil haben die Erfinder gezeigt, dass ein gelbildender Anteil
erhalten werden kann, insbesondere in einer vermutlich für weitere
Auftrennung geeigneteren Form, unter Verwendung einer weit weniger konzentrierten
alkalischen Lösung
und eines geeigneten chemischen Reduktionsmittels, wie z.B. Borhydrid. Obwohl
bis zu 4 N alkalischer Lösung
verwendet werden können,
ist die Konzentration der Base in der alkalischen Solubilisierung
vorzugsweise zumindest 0,15 N und nicht mehr als 1,0 N, in einer
bevorzugteren Ausführungsform
zumindest 0,15 N und nicht mehr als 0,5 N und in der am meisten
bevorzugteren Ausführungsform
zumindest 0,15 N und nicht mehr als 0,2-0,3 N. Es kann jegliche
Standardbase in der alkalischen Extraktion verwendet werden, einschließlich aber
nicht ausschließlich
Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Ammoniumhydroxid
und Tetramethylammoniumhydroxid.
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Ein
chemisches Reduktionsmittel, wie z.B. Borhydrid, soll zum alkalischen
Solubilisierungsschritt hinzugefügt
werden, um die basenkatalysierte Depolymerisierung zu minimieren.
In Beispiel 1 wird eine Konzentration von 1 g/l Natriumborhydrid
verwendet, aber wirkungsvolle Konzentrationen reichen von etwa 50
mg/l bis 10 g/l. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Natriumborhydridkonzentration
zumindest 100 mg/l und nicht mehr als 4 g/l, in einer bevorzugteren
Ausführungsform
zumindest 500 mg/l und nicht mehr als 2 g/l und in einer am meisten
bevorzugten Ausführungsform
zumindest 800 mg/l und nicht mehr als 1,2 g/l. Andere Formen von
Borhydrid sind ebenfalls zur Verwendung in diesem Schritt geeignet,
einschließlich
unter anderem Lithiumborhydrid, Kaliumborhydrid und Natriumcyanoborhydrid.
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Der
Grad der anfänglichen
Verarbeitung von Indischen Flohsamenschalen kann die alkalische
Solubilisierung auf Arten verändern,
die fachbekannt sind. Es ist wichtig, dass das Schalenmaterial so
verarbeitet wird, dass es in kleinen Stücken vorliegt, um den viskosen
Polysacchariden zu ermöglichen,
einfach von den unlöslichen
und fibrösen
Materialien der Zellwände
getrennt zu werden. In Beispiel 1 werden die Indischen Flohsamenschalen
gemahlen, aber es kann jegliches Verfahren verwendet werden, welches
das Pflanzenmaterial pulverisiert, und diese Verfahren sind fachbekannt.
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Das
Verhältnis
von Samenschalenmaterial zu alkalischer Lösung kann für die wirkungsvolle Solubilisierung
von Polysaccharidanteilen wichtig sein. In Beispiel 1 wird ein Verhältnis von
2 g Indischer Flohsamenschalen zu 400 ml alkalischer Lösung hinzugegeben,
aber dieses Verhältnis
kann variiert werden, ohne die Solubilisierung wirkungsvoll zu beeinflussen.
Zum Beispiel kann das Verhältnis
so variiert werden, indem so wenig wie etwa 0,1 g Samenschalen oder
so viel wie etwa 4 g Samenschalen zu 400 ml einer alkalischen Lösung hinzugefügt werden.
Zusätzlich
kann die Solubilisierungszeit (0,5-24 h) variiert werden, um das
Verfahren in einem Temperaturbereich (4-50°C) zu optimieren.
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Schritt
zwei des Verfahrens der Erfindung erfordert, dass die alkaliunlöslichen
Materialien von den alkalilöslichen
Materialien getrennt werden. In Beispiel 1 wird Zentrifugation verwendet,
um dieses Ziel zu erreichen. Jedoch können zahlreiche Variationen
und andere Verfahren ersetzt werden, ohne die isolierten löslichen
Materialien wesentlich zu ändern.
Ein Fachmann weiß,
wie Zeit und Zentrifugationskraft geändert werden sollen, um die
Trennung an verschiedene Zentrifugationsrotoren, Pflanzenmaterialien
und alkalische Lösungen
anzupassen. Andere Verfahren, die diese Trennung erreichen, sind
fachbekannt. Einige dieser Verfahren sind für die großtechnische Verwendung des
Verfahrens der Erfindung besser geeignet. Trennungsverfahren von
Interesse umfassen unter anderem Durchflusszentrifugatin oder Filtra tion
(mit Rühren).
Beispiel 1 zeigt weiters das Auswaschen des unlöslichen Materials mit der alkalischen
Lösung
und erneute Trennung, um die Ausbeute der alkalilöslichen
Materialien zu verbessern. Dieser Waschschritt ist optional, kann
aber zum Vorteil verwendet werden, um die Ausbeute zu verbessern.
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Schritt
drei erfordert, dass die alkalilöslichen
Materialien aus Schritt zwei Ansäuerung
unterworfen werden. In Beispiel 1 wird dies durch Hinzufügung von
Eisessig zu vereinigten alkalilöslichen
Materialien erreicht, bis der pH auf 4,5 angepasst ist. Der pH-Bereich, der für diese
Säuresolubilisierung
verwendet wird, kann ohne wesentliche Wirkung auf die Produkte variiert
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der pH zwischen
3 und 6, in einer bevorzugteren Ausführungsform zwischen 4 und 5,
und einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der pH wie in
Beispiel 1 beschrieben etwa 4,5. Die Auswahl der Säure variiert.
Beispiele für
Säuren,
die für
die Verwendung in diesem Schritt geeignet sind, sind unter anderem
Essig-, Salz-, Schwefel-, Oxal-, Trichloressig- und Trifluoressigsäuren. Hier
kann wie in Schritt 1 die Dauer, Temperatur etc. der Solubilisierung
variiert werden, wird aber vorzugsweise bei Umgebungstemperatur
etwa 2 Stunden lang durchgeführt.
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Schritt
vier erfordert, dass das säureunlösliche gelähnliche
Material (Anteil B) von säurelöslichen
Materialien (Anteil C) getrennt wird. Zentrifugation wird typischerweise
verwendet, um diese Trennung zu erreichen. Es kann auch eine optionale
Auswaschung der unlöslichen
Gelmasse (z.B. mit Wasser, Puffer oder einem anderen geeigneten
Lösungsmittel)
durchgeführt
werden, um die Wirksamkeit der Trennung zu verbessern.
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Als
Alternativen zur Zentrifugation in Schritt vier können zwei
andere Ansätze,
wovon beide auf Formulierungen in großem Maßstab angewendet werden, verwendet
werden. Die Erfinder haben beobachtet, dass gelähnliches Material von Anteil
B schwimmt und dass das Gel gute Integrität aufweist. Dementsprechend
kann das Gel filtriert oder unter Verwendung einer Schaufel, z.B.
jener Art, die verwendet wird, um bei der Käseherstellung Käsebruch
abzuschöpfen,
aus dem angesäuerten
Gemisch abgeschöpft
werden. Das Gelmaterial wird danach in einen separaten Behälter ge legt,
wo dieses als weiterer Reinigungsschritt gewaschen wird. Alternativ
dazu kann das Gefäß, das die
angesäuerte
Lösung
enthält,
wobei das Gel oben schwimmt, durch Schwerkraft oder sanftes Vakuum
vom Boden entleert werden, um das Gel am Boden des Gefäßes zurückzulassen.
Das Gel kann wieder gewaschen werden.
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Herstellung
von Anteil B und Anteil C zur Speicherung und/oder Verwendung kann
mehrere Verfahren verwenden. Die Polysaccharidformulierungen von
Anteil B und C können
verwendet werden oder hydratisiert gespeichert werden. Wenn sie
in einer hydratisierten Form gespeichert werden, können Konservierungsmittel oder
bakteriostatische Mittel hinzugefügt werden. Trocknung der Polysaccharidformulierungen
ist besonders zur Verwendung oder Speicherung von Vorteil. In einer
bevorzugten Ausführungsform
werden Anteil B und Anteil C durch Behandlung mit 95% Ethanol, Waschung
mit Diethylether und Trocknung entwässert. Die Anteile können auch
mit anderen Lösungsmitteln
entwässert
werden, wie z.B. Methanol, Aceton oder Isopropylalkohol. Jegliches
Standarddehydratisierungsverfahren (z.B. Verdampfung, Gefriertrocknung)
kann verwendet werden, um die Anteile zu trocknen, vorausgesetzt
die Temperatur wird bei weniger als etwa 60°C gehalten, noch bevorzugter
bei weniger als etwa 40°C.
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III. Anwendungen von Anteilen Indischer
Flohsamenschalen
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Die
Anteile Indischer Flohsamenschalen der Erfindung finden als therapeutische
Behandlungen Anwendung. In dieser Hinsicht hat sich der viskose,
gelbildende Anteil, Anteil B, als wirkungsvoll zur Förderung der
Defäkation
und auch als cholesterinsenkendes Mittel erwiesen. Dieses Material
kann alleine oder in Kombination mit anderen aktiven Substanzen
in therapeutischen oder prophylaktischen Formulierungen für Obstipation,
Durchfall und/oder hohes Serumcholesterin verwendet werden. Solche
Formulierungen können
den gelbildenden Anteil in Pillen, Kapseln oder Flüssigkeiten
inkorporieren, die über
den Mund verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine getrocknete Form des Gels zur herkömmlichen Verabreichung als
Pille oder Kapsel verabreicht. Das Gel rehydratisiert bei der Einnahme.
Hinsichtlich Rehydratisierung besitzt der gelbildende Anteil Hydratationseigenschaften,
die besonders vorteilhaft sind. Nachdem der gelbildende Anteil isoliert
und getrocknet worden ist, hydratisiert er langsam. Basierend auf
Beobachtungen nach der Verabreichung des Materials an kolektomisierte
Ratten ist es klar, dass das Gel im oberen Darm hydratisiert wird,
wo es seine cholesterinsenkende Wirkung ausübt. Diese Verzögerung der
Hydratisierung ist insofern vorteilhaft, als dass das Risiko frühzeitiger
Hydratisierung z.B. durch Verzögerung
im Ösophagus,
minimiert oder vermieden werden kann.
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Die
gelbildenden Formulierungen können
zusätzlich
in Nahrungsmittelprodukte inkorporiert werden. Da die aktiven Polysaccharide
von den anderen Pflanzenzellkomponenten durch das Verfahren der
Erfindung isoliert worden sind, lösen sie kein unangenehmes Gefühl im Mund
aus oder die Notwendigkeit, große
Dosen zu verabreichen, die mit den Formulierungen Indischer Flohsamenschalen,
die derzeit verwendet werden, assoziiert sind.
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Das
nicht-fermentierte gelbildende Polysaccharid aus Indischen Flohsamenschalen
ist für
seine abführenden
Wirkungen auf den monogastrischen Verdauungstrakt von Säugetieren
bekannt. Für
einen erwachsenen Menschen ist eine geeignete Dosis des gelbildenden
Anteils in Trockenform etwa 2 g, ein bis dreimal täglich, um
die regelmäßige Darmfunktion
aufrechtzuerhalten und als Behandlung von Obstipation.
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Wie
in Beispiel 4 beschrieben ist der gelbildende Anteil von Indischen
Flohsamenschalen als cholesterinsenkendes Mittel gezeigt worden.
Dementsprechend kann dieser Anteil auch alleine oder in Kombination mit
anderen aktiven Substanzen als therapeutische Behandlung verwendet
werden, um das Serumcholesterin zu senken. Für einen erwachsenen Menschen
reichte eine geeignete Dosis von Anteil B in Trockenform von etwa
3 g bis etwa 7 g täglich.
Die Anteile B und C der Indischen Flohsamenschalen der Erfindung
können
weiters als Nahrungsmittelzusatzstoffe verwendet werden. Sie können als
Verdickungsmittel, Gelbildner und Füllmittel in vorbereiteten Nahrungsmitteln
verwendet werden. Sie können
auch mit anderen Nahrungsmittelzusatzstoffen kombiniert werden,
um fettnachahmende Systeme herzustellen. Da die Polysaccharidformulierungen
der Erfindung teilweise nicht verdaut werden, sind sie zusätzlich kalorienarm,
senken den Cholesterinspiegel und sind abführend. Die Polysaccharidformulierungen
der Anteile B und C können
in vielen der Nahrungsmittelprodukte verwendet werden, wo derzeit
Gummen und Schleime verwendet werden.
-
Die
folgenden Beispiele sind bereitgestellt, um die Erfindung detaillierter
zu beschreiben. Sie sollen die Erfindung veranschaulichen, aber
nicht einschränken.
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BEISPIEL 1
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Auftrennung von Indischen Flohsamenschalen
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Gemahlene
Indische Flohsamenschalen (2 g) wurden mit 0,2 N Kaliumhydroxid
(400 ml), das Natriumborhydrid (400 mg) enthielt, in einer Stickstoffatmosphäre 90 min
lang gerührt.
Das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 23.500 × g zentrifugiert. Der Überstand
wurde von einem unlöslichen
Anteil dekantiert, der sich in der Zentrifugenflasche abgesetzt
hatte. Der unlösliche
Anteil („Anteil
A" genannt) wurde
mit frischer Natriumhydroxid/Natriumborhydrid-Lösung (100 ml) weitere 15 min
lang gerührt
und erneut zentrifugiert. Die Überstände aus
beiden Zentrifugationen wurden vereinigt. Der pH der vereinigten Überstände wurde
mit Eisessig bei Umgebungstemperatur unter Rühren auf 4,5 eingestellt und
dann 60 min lang bei 25.500 × g
zentrifugiert. Der Überstand
(Anteil C) wurde von der Gelmasse (Anteil B), die sich in der Zentrifugenflsche
abgesetzt hatte, dekantiert. Das Gel wurde sanft mit Wasser (50
ml) gewaschen, um anhaftende Überstandlösung zu
entfernen, und dieses Waschwasser wurde zum Überstand hinzugegeben. Der
Gelanteil wurde durch Behandlung mit 95% Ethanol entwässert und
letztlich mit Diethylether gewaschen und getrocknet.
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Vor
Entwässerung
von Anteil B wurde der Anteil in manchen Fällen weiter gereinigt, indem
die oben beschriebenen Schritte der alkalischen Solubilisierung
und Ansäuerung
wiederholt wurden. Das Gel wurde in 0,2 N KOH resuspendiert, auf
pH 4,5 angesäuert
und zentrifugiert, um das Gel zu gewinnen.
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BEISPIEL 2
-
Messung der Zuckerzusammensetzung von
Anteilen B und C der Indischen Flohsamenschalen
-
Die
jeweiligen Zuckerzusammensetzungen des Gelanteils (Anteil B) und
des säurelöslichen
Anteils (Anteil C), die von den in Beispiel 1 dargelegten Verfahren
produziert wurden, wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
1 dargestellt. Tabelle 1. Zusammensetzung von Anteilen
der Indischen Flohsamenschalen (Trockengewicht)
| Indische
Flohsamenschalen (2 g) | alkaliunlöslich
(Anteil A) | alkalilöslich |
| säureunlöslich
(Anteil
B) | säurelöslich
(Anteil
C) |
| Ausbeute
(g) | - | 0,328 | 1,164 | 0,255 |
| Zusammensetzung
(%
Trockengewicht) |
| Rhamnose | 3,17 | 0,49 | 0,95 | 14,86 |
| Arabinose | 19,93 | 33,58 | 19,45 | 8,11 |
| Xylose | 49,15 | 3,16 | 67,20 | 38,79 |
| Mannose | 2,17 | 10,84 | 0,0 | 0,0 |
| Galactose | 3,83 | 12,86 | 1,59 | 1,89 |
| Glucose | 4,37 | 19,34 | 0,37 | 0,75 |
| Uronsäuren | 5,41 | 3,58 | 1,74 | 16,84 |
| Verhältnisse
von
% Trockengewichten |
| Xylose/Rhamnose | 15,50 | 6,45 | 70,70 | 2,61 |
| Xylose/Arabinose | 2,47 | 0,094 | 3,46 | 4,78 |
| Xylose/Galactose | 12,83 | 0,25 | 42,26 | 20,52 |
| Xylose/Uronsäuren | 9,08 | 0,88 | 38,62 | 2,30 |
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BEISPIEL 3
-
Messung der Viskosität des gelbildenden Anteils
von Indischen Flohsamenschalen
-
Scheinviskosität des gelbildenden
Anteils (Anteil B) von Indischen Flohsamenschalen wurde bestimmt.
Die Lösung
zur Bestimmung der Scheinviskosität wurde durch Rühren einer
0,2% Lösung
des Trockenanteils in Formamid über
Nacht hergestellt. Die Lösung
wurde dann über
einen Zeitraum von 5 Minuten unter Rühren auf 70°C erwärmt und 1 Stunde lang bei Umgebungstemperatur
gerührt.
Die Scheinviskosität wurde
unter Verwendung eines Pipettenviskosimeters, Kat.-Nr. 13-695, Fisher
Scientific, Pittsburgh, PA, gemessen. Die Viskosität der Lösung wurde
dann dreimal gemessen und Mittelwerte bestimmt. Tabelle 2. Scheinviskosität von Anteil
B von Indischen Flohsamenschalen.
| | Scheinviskosität (s) |
| alkalilöslicher,
säureunlöslicher
Anteil (Anteil B) | 876 |
| Formamid (nur Lösungsmittel) | 303 |
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BEISPIEL 4
-
Lösungsmittelextraktion
von Komponenten Indischer Flohsamenschalen
-
Komponenten
Indischer Flohsamenschalen können
auch durch Extraktion mit verschiedenen Lösungsmitteln erhalten werden.
Solche Lösungsmittel
umfassen Formamid, Dimethylsulfoxid und 4-Methylmorpholin-N-oxid
(50% Lösung
in Wasser).
-
Gemahlene
Indische Flohsamenschalen (2 g) wurden in kleinen Teilen zu einem
ausgewählten
Lösungsmittel
(200 ml) unter Rühren über 30-60
min hinzugefügt.
In einer Arbeitsvorschrift wurde das Gemisch zwei Tage lang bei
Raumtemperatur gerührt,
dann 40 min lang bei 27.000 × g
zentrifugiert. In alternativen Arbeitsvorschriften wurde das Gemisch
bei erhöhten
Temperaturen von bis zu 60°C
gerührt,
worauf die Länge des
Rührens
auf 12 Stunden reduziert werden konnte.
-
Das
pelletierte unlösliche
Material wurde resuspendiert und in zusätzlichem Lösungsmittel (50 ml) 30 min
lang gerührt,
dann rezentrifugiert. Die kombinierten Überstände wurden unter Rühren zu
95% Ethanol (5 Volumeneinheiten) hinzugefügt, wobei die Ethanol-Endkonzentration
auf 80% gebracht wurde. Methanol, Isopropylalkohol, Aceton oder ähnliche
Lösungsmittel
konnten in diesem Schritt für
Ethanol substituiert werden. Das Präzipitat wurde gewonnen und
mit absolutem Ethanol, gefolgt von Diethylether, gewaschen, dann
getrocknet.
-
Das
ethanolunlösliche
Präzipitat,
das sich bildet, ist in der Zusammensetzung der in den Beispielen 1-3
beschriebenen alkalilöslichen
Materialien ähnlich.
Die Zuckerzusammensetzungen der Fraktionen, die durch die vorangegangenen
anfänglichen
Lösungsmittelextraktionen
erhalten werden, sind in Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3. Zuckerzusammensetzungen von
Anteilen (% Trockengewicht)
| | Formamid | 4-Methylmorpholin-N-oxid | Dimethylsulfoxid |
| Rhamnose | 3,03 | 3,25 | 0,48 |
| Arabinose | 18,95 | 16,54 | 17,38 |
| Xylose | 65,56 | 57,47 | 65,33 |
| Mannose | 0,05 | 0,0 | 0,12 |
| Galactose | 1,54 | 1,50 | 1,64 |
| Glucose | 0,21 | 0,22 | 0,34 |
| Uronsäuren | 4,30 | 4,69 | 0,94 |
-
BEISPIEL 5
-
Wirkung von Indischen Flohsamenschalen
und Anteilen davon auf Reabsorption von Gallensäuren aus den Dünndarmen
von Ratten
-
Eine
der Hauptstellen für
die cholesterinsenkende Wirkung von Ballaststoffen liegt im Dünndarm (Ileum),
trotz ihrer Wirkung auf Gallensäuren.
Gallensäuren
wirken als Emulgatoren im Dünndarm,
um Fettverdau und -absorption zu erleichtern. Sie werden aus Cholesterin
in der Leber synthetisiert, in der Gallenblase gespeichert und als
Reaktion auf Nahrungsaufnahme in den Dünndarm sekretiert. Gallensäuren werden
durch Reabsorption im Ileum und Rückführen in die Leber durch das
Blut konserviert. Nahrungsmittel werden verdaut und Fluid als Nahrungsbrei
distal in den Darm absorbiert, sodass im unteren Drittel des Dünndarms
die Lumeninhalte großteils
aus unverdaulichem Material (d.h. Ballastoff) und ein wenig Fluid
bestehen. Es ist bekannt, dass viele der viskosen löslichen
Ballaststoffquellen ihre Viskosität während des Transports durch
den oberen Gastrointestinaltrakt beibehalten und im Wesentlichen
im unteren Darm konzentriert werden. Der lösliche Ballaststoff beeinflusst
wirksam die Reabsorption von Gallensäuren im Ileum, der einzigen
Stelle im Darm, welche die notwendigen Transportproteine für Gallensäuren aufwies.
Gallensäuren,
die durch den Stuhl verloren gehen, werden durch neue Synthese in
der Leber aus Blutcholesterin ersetzt, das die Blutcholesterinspiegel
wirksam senkt.
-
Ratten
wurden chirurgisch verändert,
indem Caecum und Colon entfernt wurden und das Ende des Ileums mit
dem Rektum verbunden wurde. Nach einer Erholungszeit von 7-10 Tagen
sekretieren diese Tiere weiches, geformtes Material, das Ileumexkrete
genannt wird. Ileumexkrete sind für Stuhl zur Messung der Wirkung
einer Substanz auf die Absorption von Gallensäuren bevorzugt, da bakterielle
Transformation von Gallensäuren
im Dickdarm bis zur Hälfte
von ihnen im Stuhl nicht-identifizierbar machen.
-
Testmahlzeiten
wurden Gruppen von Ratten verabreicht. Jede Mahlzeit wurde an vier
Ratten verabreicht, die Testmahlzeiten enthielten 5% Ballaststoffe
entweder als (1) Indische Flohsamenschalen (PSH), (2) Zellulose
(als Kontrolle) oder (3) die Men ge eines ausgewählten Anteils Indischer Flohsamenschalen
(A, B oder C) einfach oder kombiniert, der in 5% Indischer Flohsamenschalen
gegenwärtig
wäre. Die
Testmahlzeiten enthielten auch einen nicht-absorbierbaren Marker,
sodass die Konzentration des Markers in den Ileumexkreten dazu verwendet
werden konnte, die Menge der Testmahlzeit zu berechnen, die in den
gewonnen Ileumexkreten gegenwärtig
war.
-
Die
Ergebnisse der akuten Testmahlzeitstudien sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4. Gallensäuren, die nach der Verabreichung
von Testmahlzeiten, die verschiedene lösliche Ballaststoffe enthielten,
exkretiert wurden.
| Testmahlzeit | Exkretierte
Gallensäuren*
(μmol/g
Testmahlzeit) |
| Zellulose | 8,32 ± 2,42 |
| Ungemahlene
PSH | 18,41 ± 2,61 |
| Anteil
A | 9,07 ± 2,75 |
| Anteil
B | 16,08 ± 3,20 |
| Anteil
C | 13,76 ± 2,71 |
| Kombiniertes
A, B, C | 15,65 ± 1,37 |
- Mittelwert ± SEM, n = 4 Ratten
-
Ein
Anstieg der exkretierten Gallensäuren
zeigt einen gleichzeitigen Rückgang
der Gallensäuren,
die in das Blut reabsorbiert wurden. Von einem Mittel, das einer
Reabsorption von Gallensäuren
aus dem Ileum in das Blut vorbeugt, wird erwartet, dass es cholesterinsenkende
Eigenschaften hat. Die obigen Ergebnisse zeigen die cholesterinsenkende
Eigenschaften von Indischen Flohsamenschalen und noch wichtiger
des bequem verabreichbaren gelbildenden Anteils, Anteil B, der mit
den intakten Indischen Flohsamenschalen in cholesterinsenkender
Wirkung im Wesentlichen äquivalent
war.
-
BEISPIEL 6
-
Die nicht-fermentierte Gelkomponente von
Indischen Flohsamenschalen fördert
als Gleitmittel Defäkation beim
Menschen
-
Zusätzlich zu
erhöhtem
Stuhlgewicht produziert ein Ergänzungsmittel
von Indischen Flohsamenschalen (PSH) einen Stuhl, der glatt und
gallertartig ist. In diesem Beispiel zeigen die Erfinder, dass ein
Gelanteil von Indischen Flohsamen mikrobieller Fermentation entkommt
und für
diese Eigenschaften verantwortlich ist, die Defäkation verstärken.
-
Materialien und Verfahren:
-
Versuchsdesign.
-
Die
Studie bestand aus 3 Perioden, einer Screeningphase, der PSH-Periode
und der Basalperiode. Während
der Screeningphase konsumierten die Subjekte 15 g/Tag Metamucil® (5
g/Mahlzeit) (Smooth Texture Metamucil®, The
Procter & Gamble
Co., Cincinnati, OH) gemeinsam mit ihrer üblichen Nahrung 12 Tage lang, um
zusätzliche
8,8 g/Tag Ballaststoffe bereitzustellen. Subjekte wurden gebeten,
Nahrungsaufnahmeberichte von Tag 9-12 auszufüllen, um das Einhalten eines
Protokolls zu evaluieren und mehr Information über typische Nahrungsaufnahme
zu erhalten. Von jedem Subjekt wurden zwei Stuhlproben während Tag
9 bis 12 entnommen, auch um die Einhaltung des Protokolls zu evaluieren.
Während
der nächsten
7 Tage (Tag 13-19 der Studie) konsumierten die Subjekte eine definierte
Nahrung mit wenig Ballaststoffen und mit jeder Mahlzeit die PSH und
einen nicht-absorbierbaren
Marker (Chromsesquioxid, 100 mg/Mahlzeit). Über die nächsten zwei Wochen (Tag 20-33
der Studie) konsumierten Subjekte ihre übliche Nahrung, um allen PHS
zu ermöglichen,
exkretiert zu werden. In den 7 Tagen (Tag 34-40 der Studie) der
Basalphase wurde dieselbe kontrollierte Nahrung mit wenig Ballaststoffen
und nicht-absorbierbarem Marker, aber keiner PHS-Ergänzung konsumiert.
Dieses Versuchsdesign basierte auf Ergebnissen einer Vorstudie.
Es wurde in der Vorstudie beobachtet, dass Tag 7-10 der Aufnahme
des Ergänzungsmittels
notwendig waren, um einen hohen Grad an PSH-Exkretion zu erreichen. Vorherige
Beobachtungen zeigten auch, dass es 7-10 Tage von der Einnahme der
letzten Testdosis für
das ge samte PHS dauerte, exkretiert zu werden. Deshalb folgte die
PSH-Periode zur Datengewinnung den 12 Tagen des PSH-Konsums, der
die Screeningphase ausmachte, und es wurde kein Crossover-Versuchsdesign verwendet.
-
Stuhlproben
und qualitative Darmreaktion, Nahrungsmittelaufnahme und Aktivitäten wurden
täglich
in beiden Wochen kontrollierter Ernährung gewonnen. Diese Studie
wurde vom College of Agricultural and Life Sciences Human Subjects
Committee, University of Wisconsin-Madison, genehmigt.
-
Subjekte.
-
Einundzwanzig
der 33 Personen, die auf lokale Anzeigen reagierten, wurden in die
Screeningphase aufgenommen. Ausschlusskriterien aus der Screeningphase
waren: Lactoseintoleranz, Ernährungsgewohnheiten,
die nicht alle Nahrungsmittel beinhalteten, und fehlende Bereitschaft,
spezielle Nahrung einzunehmen. Das Einhalten, die Verlässlichkeit
und Verfügbarkeit
und Einstellung des Subjekts wurden während der Screeningphase beurteilt,
und 15 Subjekte (8 Männer
und 7 Frauen) wurden ausgewählt,
um an der Studie teilzunehmen. Vierzehn Subjekte beendeten die Studie.
(Daten eines Subjekts, das zugab, nicht jeden Stuhl in den speziellen
Sammelperioden bereitzustellen, wurden aus der Endanalyse gelöscht.) Subjekte
wiesen ein Alter von 18-30 Jahren (Mittelwert ± SE, 24 ± 1 Jahre) und normales Körpergewicht
auf (Body-Mass-Index 24,2 ± 0,9).
-
Ernährung.
-
Alle
Subjekte konsumierten während
PSH-ergänzten
Phasen und Basalphasen festgelegte Nahrung, die aus Nahrungsmitteln
bestand, die ihnen als Teile der Studie bereitgestellt wurden. Frühstück wurde
zuhause konsumiert und bestand aus Rice-Krispies®-Cerealien,
Magermilch, Orangensaft, Weißbrot,
Margarine oder Butter und Marmelade. Das Mittagessen bestand aus
einem Sandwich, frischem Obst und Milch. Das Abendessen bestand
aus Fleisch, einer Stärkequelle,
Salat und Dessert. Subjekte konsumierten vorgeschriebene Mengen
der Nahrungsmittel des Menüs.
Die Mengen an Brot und Milch variierten mit den täglichen
Energiebedarfen. Beschränkte
Mengen an ballaststofffreien Snacks und Alkohol waren ebenfalls
erlaubt. Kaffee war ad libitum erlaubt. Subjekte wurden beim Abendessen überwacht.
-
Konsum
des Ergänzungsmittels
und nichtabsorbierbaren Markers wurde täglich überprüft, wenn leere Packungen mit
der Zuteilung des Ergänzungsmittels
für den
nächsten
Tag ausgetauscht wurden.
-
Daten und Probengewinnung.
-
Alle
Stuhlproben, die während
den PSH- und Basalphasen der Studie exkretiert wurden, wurden individuell
gewonnen, sofort gekühlt
und gewogen und innerhalb von 8 h der Gewinnung gefroren. Subjekte
beurteilten jeden Stuhl unter Verwendung einer 9-Punkte-Beurteilungsskala,
die aus Folgendem bestand: -4 am negativsten, -3 extrem negativ,
-2 sehr negativ, -1 negativ, 0 neutral, +1 positiv, +2 sehr positiv,
+3 extrem positiv, und +4 am positivsten.
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Subjekte
füllten
die täglichen
Nahrungsmitteleinnahmeberichte aus, um den Konsum der Nahrungsmittel
in der kontrollierten Ernährung
nachzuweisen. Formulare über
die physische Aktivität
wurden täglich ausgefüllt, um
jegliche große
Veränderungen
in der täglichen
Routine zu identifizieren. Tägliche
Routinen für jeden
Teilnehmer blieben in den zwei Wochen der Probenentnahme konstant.
-
Analyse.
-
Stuhl,
der während
Tag 4-8 jedes Zeitraums kontrollierter Ernährung exkretiert wurde (Tag
16-20 und Tag 37-41 der Studie), wurde gefroren, für jedes
Subjekt durch Handmischung gepoolt und bis zur Verwendung erneut
gefroren oder wie nachstehend beschrieben verarbeitet. Duplikataliquoten
(3 g) wurden getrocknet (16 h, 70°C),
um den Feuchtigkeitsgehalt zu bestimmen [Marlett et al., JNCI 76,
1065-1070 (1986)].
Stuhlchromgehalt wurde unter Verwendung einer Modifikation [Rosig
et al., Cereal Chem. 73, 392-398 (1996)] des Verfahrens von Guncaga
et al. [Clin. Chim. Acta 47, 77-81 (1974)] bestimmt. Teile von gepooltem
Stuhl wurden für
doppelte (25 mg) Bestimmungen von neutralen und Aminozuckergehalt
durch Gaschromatographie wie die Alditolacetatderivate nach Säurehydrolyse
und Reduktion [Kraus et al., J. Cromatog. 513, 71-81 (1990); Monsma
et al., Appl. Environ. Microbiol. 58, 3330-3336 (1992)] und für Uronsäureanalyse
unter Verwendung eines kolorimetrischen Tests [Blumenkranz et al.,
Anal. Biochem. 54, 484-489 (1973)] lyophilisiert. Ein wässriges
Extrakt von aufgetautem gepooltem Stuhl wurde dazu verwendet, die
relative Viskosität
von Stuhl zu bestimmen („Ostwald
dropping pipet viscosi meter",
Kat-Nr. 13-695, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Wässrige Anteile wurden
durch Verwirbeln von Aliquoten (2 g) mit Wasser (10 ml), Zentrifugation
(30.000 × g,
30 min, 4°C)
und Gewinnung und Rezentrifugation des Überstands erhalten.
-
Das
Auftrennungsverfahren zur Isolation der Komponente, die für die Geleigenschaft
verantwortlich ist, wurde auf aufgetaute Aliquoten von gepooltem
Stuhl von jedem Subjekt aus beiden Ernährungszeiträumen angewendet. Die Lipide
der Aliquoten (25 g) wurden entfernt, und die Aliquoten wurden einer
Base ausgesetzt (0,18 N KOH), die Natriumborhydrid enthielt (0,026
M), um die basenkatalysierte Depolymerisierung zu minimieren. Der
alkalilösliche
Anteil wurde mit Eisessig auf einen pH von 4,5 angesäuert, und
ein Präzipitat
(Anteil 1) wurde durch Hinzufügung
zu Ethanol gewonnen. Anteil 1 wurde in Wasser suspendiert, bis zum
Sieden erwärmt,
zentrifugiert und das Volumen des Überstands durch Rotationsverdampfen
reduziert. Das Konzentrat wurde zu Ethanol hinzugefügt, um eine
Alkohol-Endkonzentration von 70% zu ergeben. Die fibröse Masse,
die sich durch Hinzufügung
des konzentrierten Überstands
zu Ethanol bildete, wurde mit Ethanol, Ether gewaschen und vakuumgetrocknet.
Dieses Material repräsentierte
die gallertartige Komponente von PSH-Stuhl (Anteil 2). Es bildete
sich an diesem Punkt während
der Analyse der Kontroll-Stuhlproben kein Präzipitat. Neutrale und Aminozuckergehalte
und Uronsäurenkonzentrationen
wurden wie oben beschrieben auf Aliquoten dieses Materials bestimmt.
-
Hauptnährstoff-
und Energiegehalte der geplanten Menüs und der täglichen Einnahmen jedes Subjekts
wurden unter Verwendung von Nährstoffzusammensetzungstabellen
berechnet.
-
Ballaststoffeinnahmen
wurden aus Nahrungsmitteleinnahmeberichten unter Verwendung einer
detaillierten Datenbank des Ballaststoffgehalts und der Zusammensetzung
für US-amerikanische
Nahrungsmittel berechnet. Die Summen der täglichen Einnahmen an den Tagen
2-6 jedes Zeitraums kontrollierter Ernährung (Tag 14-18 und Tag 35-39)
wurden als Einnahme der neutralen Zucker (Glucose, Arabinose, Xylose,
Mannose, Galactose) verwendet und die Uronsäuren für die Bestimmung scheinbarer
Verdaulichkeit von ballaststoffabstammenden Zuckern. Die Zuckerzu sammensetzung
des PSH-Ergänzungsmittels
wurde durch Gaschromatographie nach Säurehydrolyse wie oben dargestellt
berechnet. Fäkalienexkretion
von Zuckern wurde angepasst, um die Exkretion von 5 Tagen der Einnahme
unter Verwendung des Gehalts von Chrom im gepoolten Stuhl zu reflektieren
[Chen et al., Am. J. Clin. Nutr. 68, 711-719 (1998)]. Scheinbare
Verdaulichkeiten von ballaststoffabstammenden Zuckern wurden als
Unterschied zwischen Einnahme und Exkretion berechnet und als Prozentsatz
der Einnahme ausgedrückt
[Chen et al., siehe oben (1998)].
-
Statistische Analysen.
-
Daten
werden als Mittelwert ± SE
beschrieben. Daten, die während
den Basal- und mit indischen Flohsamen ergänzten Phasen der Studie gewonnen
wurden, wurden durch Einfach-Varianzanalyse unter Verwendung von
SAS-Computerprogrammsoftware
Version 6.12 verglichen. Signifikante Unterschiede wurden durch den
Mitteltrennungstest mit geringsten signifikantem Unterschied identifiziert.
-
Ergebnisse:
-
Der
erste Anteil (Anteil 1), der durch Gelisolationsschema gewonnen
wurde, wurde aus basalen und PSH-enthaltenden Stuhlen extrahiert,
wobei dieser alkalilösliche
Anteil aus PSH-Stuhlen signifikant größer war (P < 0,0005) als jener, der aus Basalexkreten
extrahiert wurde. Ein ethanolpräzipierbarer
Anteil (Anteil 2), der gallertartig war, wurde durch Behandlung
des alkalilöslichen
Anteils mit heißem
Wasser aus Stuhl von Subjekten, die das Ergänzungsmittel der indischen
Flohsamen konsumierten, extrahiert. Es wurde während der Basalphase mit wenigen
Ballaststoffen der Studie kein gallertartiger Anteil aus Stuhl extrahiert.
-
Die
Hauptkomponente von Anteil 2, die aus Stuhl der 14 Subjekte isoliert
wurde, die PSH konsumierten, war ein Polysaccharid, das 763 ± 18 mg
Zucker/g von Anteil 2 enthielt, wovon das meiste Xylose war (64 ± 1%) und
Arabinose (27 ± 0%)
war, wobei die restlichen Zucker (%) Folgendes waren: 2 Glucose,
3 Galactose und 3 andere Zucker (Fucose, Ribose, Mannose, Myoinosit,
Muraminsäure,
Glucosamin und Ga lactosamin). Die Xylose und Arabinose in diesem
Gelanteil machten 53,9 ± 2,1
und 31,1 ± 1,4%
des jeweiligen Zuckers in Fäkalien
aus.
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Da
kein Anteil aus Basalexkreten gewonnen wurde, die mit dem Gel vergleichbar
waren, das aus dem PSH-enthaltendem Stuhl gewonnen wurde, wurden
wässrige
Extrakte von Stuhl für
einen Vergleich der relativen Viskosität von Stuhl aus den zwei Studienperioden
hergestellt. Die Scheinviskosität
des wässrigen
Extrakts des PSH-entaltenden
Stuhls war signifikant höher
(p < 0,01) als
jene der basalen Exkrete mit wenigen Ballaststoffen, 238 ± 38 gegen
128 ± 7
s.
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Das
PSH-Ergänzungsmittel
erhöhte
mittleren täglichen
Nass-Output von 117 ± 7
auf 188 ± 13
g/Tag (P < 0,0001),
mittleren täglichen
Trocken-Output von 29 ± 2
auf 37 ± 2
g/Tag (P < 0,0001)
und Stuhlfeuchtigkeit von 74,4 ± 0,9% auf 80,2 ± 1,0%
(P < 0,05). Andere
Maßnahmen
der Dickdarmfunktion waren signifikant unterschiedlich. Das mittlere
Nassgewicht jedes Stuhls erhöhte
sich von 121 ± 6
auf 173 ± 14
g (P < 0,005),
mittleres Trockengewicht jedes Stuhls von 30 ± 2 auf 34 ± 3 g (p < 0,0001) und Stuhlganghäufigkeit
von 1,0 ± 0,1 auf
1,1 ± 0,1
(P < 0,05), wenn
das PSH-Ergänzungsmittel
konsumiert wurde.
-
Die
kontrollierte Ernährung
mit gemischten Nahrungsmitteln enthielt ein Gemisch aus ballaststoffabstammenden
Zuckern, und die scheinbare Verdaulichkeit des ballaststoffabstammenden
gesamten neutralen Zuckers war 67 ± 4% während der ballaststoffarmen
Basalperiode. Die Zusammensetzung der PSH-Formulierung war (mg/g):
21 Rhamnose, 127 Arabinose, 325 Xylose, 8 Mannose, 25 Galactose,
44 Glucose, 35 Uronsäuren,
19 Asche, 18 rohes Protein und 346 Beschichtung. Scheinbare Verdaulichkeiten
der ballaststoffabstammenden Xylose und Arabinose verringerten sich
(P < 0,001), während Uronsäure-Verdaulichkeit
zunahm (p < 0,03),
als das Ergänzungsmittel
eingenommen wurde. Subtraktion von Xylose und Arabinose, die während der
Basalernährungsperiode
exkretiert wurden, von den Mengen dieser Zucker in dem PSH-enthaltenden Stuhl
stellt ein Mittel zur Beurteilung der scheinbaren Verdaulichkeit
der zwei Hauptzucker in PSH bereit. Die scheinbaren Verdaulichkeiten der
Xylose, Arabinose und gesamten neutralen Zucker, die durch PSH bereitgestellt
werden, waren 59 ± 5,
28 ± 7
bzw. 54 ± 9%
und waren variabel.
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Die
Testdosis von PSH wurde von allen Subjekten gut toleriert. Im Vergleich
zur Dickdarmfunktion während
der Basalperiode resultierte PSH in sanfteren Darmbewegungen, weicherem
Stuhl, der einfacher abgegeben werden konnte, einfacherem Abwischen,
einem Gefühl
der vollständigen
Erleichterung und erhöhter Menge.
Das PSH-Ergänzungsmittel
zeigte keine Wirkung auf Abdominalkrämpfe, auf das Bedürfnis, den
Darm zu entleeren, oder auf die Erfahrung einer wiederholten Darmentleerung,
noch verursachte es Diarrhoe, obwohl Subjekte mehr Blähungen und
Aufschwemmung wahrnahmen. Obwohl weich und geformt, waren die meisten
Stuhlgänge
sichtbar gallertartig und würden
beim Bewegen vibrieren. Die Hauptnährstoff- und Ballaststoffgehalte, die von den
Nahrungsmitteln in der Nahrung bereitgestellt wurden, veränderten
sich nicht, als das PSH-Ergänzungsmittel
konsumiert wurde.
-
Daher
wird im Gegensatz zu anderen viskosen Ballaststoffen, die im Colon
vollständig
fermentiert werden, eine Komponente von Indischen Flohsamen nicht
fermentiert. Die Ergebnisse der vorangegangenen Studie zeigen, dass
durch die Funktion als Weichmacher und Gleitmittel das nicht-fermentierte
Gel, das aus PSH-enthaltendem Stuhl isoliert wurde, einen neuen
Mechanismus zur Defäkation
eines Ballaststoffs repräsentiert.
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BEISPIEL 7
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Demonstration von schlechter In-vitro-Fermentation
des gelbildenden Anteils von Indischen Flohsamenschalen
-
In-vitro-Fermentationen
von Flohsamenschalen und ihrer Anteile wurden in 40-ml-Fermentationskolben
durchgeführt.
Kohlenhydrat für
Fermentation betrug 200 mg, wovon 31 mg aus Kalbinfusionsnährlösung und
45 mg aus Hefe stammten; wobei der Rest aus den Anteilen A, B und
C von Indischen Flohsamenschalen stammte. Anteile wurden aus gemahlenen
Indischen Flohsamenschalen wie oben beschrieben isoliert. Die Probe
der „3
kombinierten Anteile" bestand
aus drei Anteilen, die aus den Indischen Flohsamenschalen isoliert wurden,
die im Verhältnis
zu ihrer ursprünglichen
Konzentration in den Schalen rekombiniert wurden. Inokulum bestand
aus Caecuminhalten, die aus Ratten geerntet wurden, die mit gereinigten
Nahrungsmitteln gefüttert wurden,
die 5 Gew.-% Indische Flohsamenschalen enthielten. Versuchsprotokolle
und Analysen entsprachen den von Monsma & Marlett [J. Nutr. 126, 554-563 (1996)]
beschriebenen Verfahren. Es hat sich gezeigt, dass Ergebnisse, die
durch dieses Verfahren erhalten wurden, ähnlich jenen sind, die durch
In-vivo-Fermentation bei
Menschen gewonnen wurden (Monsma et al., J. Nutr. 130, 585-593 (2000)].
Alle Fermentationen wurden in einer anaeroben Kammer vorbereitet
und ausgeführt
und zweimal durchgeführt.
-
Tabelle
5 zeigt die Ergebnisse der In-vitro-Fermentation. Kohlenhydrat in
den Fermentationskolben bestand aus elf neutralen und Aminozuckern,
gemeinsam mit Uronsäuren;
diese wurden durch das Testsubstrat Kalbinfusionsnährlösung und
Hefe bereitgestellt (siehe Tabelle 5, Fußnoten „a" und „b"). Die offensichtliche Fermentation
der Zucker aus diesen Quellen ist zusammengefasst, sodass die Fermentation
der Testanteile hervorgehoben wird. Wie aus der Tabelle ersichtlich
ist, war Anteil C nach 24 Stunden fast vollständig fermentiert. Hingegen
war Anteil B nur teilweise fermentiert (etwa 25-35%), und seine
Fermentation schien nach 48 Stunden aufgehört zu haben. Anteil A war schlecht
fermentiert, und seine Fermentation war auf die ersten 12 Stunden
des Fermentationszeitraums beschränkt. Tabelle 5. Verschwinden von neutralen
Zuckern während
In-vitro-Fermentation von Indischen Flohsamenschalen und ihrer Anteile
| Polysaccharid/Zucker | 0 h Puffera Anteilb | 12 h | 24
h | 48
h | 72 h |
| mg/Kolben | % verbleibend |
| Indische
Flohsamenschale | | | | | | |
| Rhamnose | 0,6 | 4,5 | 21 | 22 | 21 | 22 |
| Arabinose | 0,9 | 28,1 | 84 | 84 | 76 | 82 |
| Xylose | 2,6 | 69,3 | 68 | 46 | 39 | 40 |
| Galactose | 4,3 | 5,4 | 61 | 67 | 61 | 66 |
| andere | 65,5 | 9,2 | 23 | 22 | 19 | 21 |
| 3
kombinierte Anteile | | | | | | |
| Rha | 0,6 | 4,4 | 19 | 22 | 22 | 22 |
| Ara | 0,9 | 29,9 | 85 | 81 | 76 | 80 |
| Xyl | 2,6 | 70,0 | 73 | 47 | 44 | 44 |
| Gal | 4,3 | 5,7 | 56 | 61 | 58 | 60 |
| andere | 65,5 | 8,6 | 24 | 22 | 21 | 20 |
| Anteil
C | | | | | | |
| Rha | 0,6 | 21,4 | 16 | 6 | 6 | 6 |
| Ara | 0,9 | 11,6 | 47 | 19 | 18 | 19 |
| Xyl | 2,6 | 57,3 | 53 | 11 | 9 | 8 |
| Uronsäuren | 3,1 | 30,5 | 22 | tr | tr | tr |
| andere | 69,9 | 3,6 | 14 | 12 | 8 | 9 |
| Anteil
B | | | | | | |
| Rha | 0,6 | 1,3 | 79 | 61 | 52 | 53 |
| Ara | 0,9 | 26,8 | 93 | 85 | 78 | 76 |
| Xyl | 2,6 | 91,4 | 84 | 76 | 65 | 59 |
| andere | 69,9 | 2,2 | 13 | 10 | 10 | 10 |
| Anteil
A | | | | | | |
| Ara | 0,9 | 49,2 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Xyl | 2,6 | 4,6 | 68 | 58 | 59 | 59 |
| Man | 15,4 | 16,0 | 56 | 58 | 65 | 55 |
| Gal | 4,3 | 19,8 | 91 | 89 | 94 | 98 |
| Glc | 35,3 | 29,4 | 53 | 50 | 54 | 55 |
| andere | 17,4 | 0,7 | 27 | 23 | 19 | 19 |
- a Zucker in der Kalbinfusionsnährlosung
und Hefe, die Teil des Fermentationsprodukts sind und etwa 70-75 mg
des Kohlenhydrats zur Fermentation beitrugen.
- b Zucker im Testsubstrat, die nach Berechnung etwa 120-125 mg
zur Fermentation beitragen.
- c Umfasst jene Zucker aus der folgenden Liste, die nicht im
Speziellen aufgelistet sind: Rhamnose, Fucose, Ribose, Arabinose,
Xylose, Mannose, Galactose, Glucose, Myoinosit, Glucosamin und Galactosamin.
Obwohl Uronsäuren
in die Berechnung der Menge von Kohlenhydrat, die fermentiert werden
sollte, inkludiert wurden, sind sie nicht in allen Proben gemessen
worden und deshalb in dieser Zusammenfassung nicht enthalten, mit Ausnahme
der Zusammenfassung von Anteil C.
-
BEISPIEL 8
-
Reduktionsspaltung und NMR-Analyse von
Anteil B Indischer Flohsamenschalen
-
Das
Polysaccharid von Anteil B Indischer Flohsamenschalen wurde vollständig methyliert,
dann in Gegenwart von Triethylsilan und Trimethylsilyltrifluormethansulfonat
gemäß Standardverfahren
reduktionsgespalten. Die Produkte wurden in situ acetyliert und
durch Gasflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie
(GLC-MS) auf einer DB-5-Säule
analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6. Zusammenfassung von Reduktionsspaltungsanalyse
| Peak | Rest | Molprozent |
| 1 | terminales
Xylp | 23,27 |
| 2 | terminales
Araf | 16,95 |
| 3 | 3-gebundenes
Araf | 10,76 |
| 4 | 3-gebundenes
Xylp | 4,33 |
| 5 | terminales
Galp | 1,07 |
| 6 | 2,3-
oder 3,4-gebundenes Xylp | 11,84a |
| 7 | 2,3-gebundenes
Araf | 3,44 |
| 8 | 2,4-gebundenes
Xylp
3,5-gebundenes Araf | 21,41b
0,58b |
| 9 | 2,5-gebundenes
Xylf | 2,68 |
| 10 | nicht
identifiziert | |
| 11 | 3-gebundenes
Galp
2,3,4-gebundenes Xylp | 0,66b
3,01b |
- a Standardmethylierungsanalyse zeigte,
dass dieser Xylp-Rest 3,4-gebunden war.
- b Gemeinsam eluierende Komponenten wurden durch GLC auf einer
RTx-200-Säule
getrennt.
-
Die
Komponenten eines Reduktionsspaltungsverfahrens werden einfacher
aufgrund ihrer Identität
und Quantifizierung getrennt und stellen definitivere strukturelle
Information bereit als jene eines Standard-Methylierungs/Hydrolyse-Verfahrens.
Die in Tabelle 6 angeführten
Daten zeigen, dass das Polysaccharid von Anteil B ein höchst verzweigtes,
sehr komplexes Molekül
ist. Das Xylanrückgrat
enthält
zusätzlich
zu einzelnen Verzweigungen von Xylose und Arabinose Verzweigungen
einer unbestimmten Länge,
die beide Zucker enthalten können.
-
Das
Polysaccharid wurde auch einer zweidimensionalen NMR-Analyse unterworfen,
deren Ergebnisse zeigten, dass die Xylosereste betagebunden und
die Arabinosereste alphagebunden sind. Letztere Zuordnung wird durch
die Wirkung von Alpha-L-Arabinofuranosidase
auf das Polysaccharid gestützt.