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EINLEITUNG
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Gebiet der
Erfindung
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Das
Gebiet der Erfindung sind Sojabohnenproteine mit chemopräventiven
Effekten.
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Hintergrund
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Das
Konzept, dass diätetische
Faktoren bei der Ätiologie
unterschiedlicher Arten von Krebs eine wichtige Rolle spielen, wird
von epidemiologischen Daten (World Cancer Fund, 1997) gut belegt.
So gibt es zum Beispiel viele Anzeichen, die nahe legen, dass Diäten, die
große
Mengen an Sojabohnenprodukten enthalten, mit insgesamt geringen
Krebssterberaten einhergehen, insbesondere für Dickdarm-, Brust- und Prostatakrebs, was
Anstöße verliehen
hat, spezifische Verbindungen in Sojabohnen zu identifizieren, die
für deren
krebspräventiven
Effekte verantwortlich sein könnten
(Messina und Barnes, 1991; Kennedy, 1995).
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Ein
aus Sojabohnen gewonnener Protease-Inhibitor, Bowman-Birk-Inhibitor (BBI),
hat sich als ein besonders effektiver chemopräventiver Wirkstoff erwiesen
(Kennedy, 1998). BBI ist als ein Protein von 8 kD mit definierter
Sequenz und Struktur charakterisiert worden (abgehandelt von Birk,
1985), doch die meisten Untersuchungen, die die Wirksamkeit von
BBI aufzeigen, haben BBIC, ein mit BBI angereichertes Sojabohnenextrakt,
verwendet. BBIC ist sehr effektiv darin, Krebsentstehung zu unterdrücken, (1)
die von mehreren unterschiedlichen Karzinogenen induziert wird,
(2) in drei unterschiedlichen Tiermodellsystemen (Ratte, Maus und Hamster)
und in In-vitro-Transformationssystemen (Kennedy et al., 1993),
(3) in mehreren Geweben/Organen (Dickdarm, Leber, Lunge, Speiseröhre und
oralem Epithel), (4) wenn Tieren über mehrere unterschiedliche Routen
verabreicht (i.p., i.v., topisch, diätetisch), (5) verschiedene
Arten von Tumoren involvierend (Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinome,
Angiosarkome usw.), (6) in unterschiedlichen Zelltypen (Epithelzellen
in Leber, Dickdarm, Lunge, Speiseröhre und Wangentasche sowie
Bindegewebezellen (Fibroblasten sowohl in vitro als auch in der
Leber), aus denen Angiosarkome entstehen. Somit ist die chemopräventive
Fähigkeit
von BBIC in einer Vielfalt von unterschiedlichen Krebsentstehungs-Assay-Systemen
aufgezeigt worden, so dass im Jahr 1992 der Status als „Investigational
New Drug" (neues
Arzneimittel im Forschungsstadium) der FDA (IND-Nr. 34671) erreicht
wurde und es sich nun in klinischen Studien mit Menschen befindet.
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Literaturverweise
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt die Verwendung eines Lunasin-Polypeptids bei der
Herstellung von Formulierungen zur Abgabe effektiver Mengen von
Lunasin als medizinischem Lebensmittel bereit. Genauer stellt die
Erfindung die Verwendung eines Lunasin-Polypeptids, umfassend die
Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 oder ein aktives Fragment davon, das zumindest
das Arg-Gly-Asp-Motiv, gefolgt von mindestens einem hexa-Asp/Glu-Motiv,
umfasst, bei der Herstellung einer Formulierung zur Krebs-Chemopräventation
bereit, wobei diese Formulierung mindestens 50% des Polypeptidgewichts
an dem Lunasin-Polypeptid und weniger als 10% des Polypeptidgewichts
an Bowman-Birk-Inhibitor-Polypeptid umfasst. In anderen Ausführungsformen
umfasst die Zusammensetzung mindestens 70%, vorzugsweise mindestens
90%, noch besser mindestens 98% und am besten 100% des Polypeptidgewichts
an dem Lunasin-Polypeptid und weniger als 2%, vorzugsweise weniger
als 0,5%, noch besser weniger als 0,1% und am besten 0% des Polypeptidgewichts
an Bowman-Birk-Inhibitor-Polypeptid. Die Formulierungen können durch
eine große
Vielfalt von zweckmäßigen Abgabeverfahren,
die auf dem Stand der Technik wohl bekannt sind (siehe z. B. The
Pharmacological Basis of Therapeutics, neunte Ausgabe, von Goodman
und Gilman), einschließlich
oraler Nahrungsaufnahme, durch topisches Inkontaktbringen mit Haut
unter Verwendung wohl bekannter Techniken zur dermalen Abgabe, durch Einführung in
einbehaltene physiologische Flüssigkeiten
wie etwa Blut, Gelenkschmiere, interstitielle Flüssigkeit usw., abgegeben oder
verabreicht werden.
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In
anderen Ausführungsformen
dient die Formulierung zur
- – oralen Verabreichung eines
Lunasin-Polypeptids,
- – topischen
Verabreichung eines Lunasin-Polypeptids durch Inkontaktbringen von
Haut mit der Formulierung oder
- – Einführung der
Formulierung in eine einbehaltene physiologische Flüssigkeit
zur Verabreichung eines Lunasin-Polypeptids.
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Verfahren
zur Fertigung der Gegenstandsformulierungen durch Reinigen von Lunasin-Polypeptiden auf
die erforderliche Reinheit und zum Kombinieren des Lunasin-Polypeptids
mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer oral aktiven Einnahmeeinheit
werden hier ebenfalls offenbart. Das Lunasin-Ausgangsmaterial können Sojabohnen, ein rekombinantes
Lunasin-Polypeptid-Expressionssystem,
ein synthetisch produziertes Lunasin oder Extrakte oder Fraktionen
davon sein. Geeignete Träger
und Dosierungen lassen sich, angeleitet durch die bestehenden BBIC-Daten, leicht empirisch
bestimmen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG BESTIMMTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG
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Die
folgenden Beschreibungen bestimmter Ausführungsformen und Beispiele
werden zur Veranschaulichung und nicht als Beschränkung geboten.
Außer
bei Gegenanzeige oder anderweitig angemerkt bedeuten die Begriffe "einer/eine/ein" in diesen Beschreibungen
und in dieser ganzen Patentschrift ein oder mehrere, der Begriff „oder" bedeutet und/oder
und Polynukleotid-Sequenzen sind so zu verstehen, dass sie gegenläufige Stränge sowie alternative
Grundgerüste,
die hier beschrieben werden, umgreifen.
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Wir
haben gezeigt, dass eine kleine Peptiduntereinheit eines 2S-Albumins, isoliert
aus Sojabohnensamen, die wir Lunasin genannt haben, bei Expression
in Säugetierzellen
einen mitosehemmenden Effekt hat (Galvez AF und de Lumen BO, 1999
und USSN 08/938,675). Anders als bei anderen mitosehemmenden Wirkstoffen,
die die Mikrotubulus-Funktion stören,
haben wir gezeigt, dass sich Lunasin nach Transfektion und Expression
des Lunasingens im Inneren der Zelle vorzugsweise an hypoacetyliertes
Chromatin in Lunasin-transfizierten
Zellen bindet, was zur Verdrängung
von Kinetochorproteinen während
der Mitose führt.
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Das
Lunasin-Polypeptid enthält
außerdem
ein funktionelles RGD-Motiv
(Arg-Gly-Asp). Wenn Lunasin von außen auf die Säugetierzellkulturen
angewendet wird, bindet es sich durch das RGD-Tripeptid an Integrine der
Zellmembran und gelangt anschließend durch Membran-Turnover
in das Zytoplasma. Die relativ kleinen Mengen an Lunasin, die durch
passive Diffusion und während
der Prometaphase (wenn ein Auflösen
der Nukleusmembran erfolgt) in den Nukleus gelangen, reichen aus,
um Regionen hypoacetylierten Chromatins effektiv zu binden. Anders
als bei Lunasin-transfizierten Zellen, die Lunasin in großen Mengen
konstitutiv exprimieren, scheint internalisiertes Lunasin jedoch
den Kinetochorzusammenbau nicht zu beeinträchtigen, da die Zellen die
normale Mitose durchlaufen. Stattdessen hemmt Lunasin die Transformation
normaler embryonaler Fibroblastenzellen zu Krebstumoren durch krebserregende
Wirkstoffe. Die Bindungsaffinität
von Lunasin an Regionen deacetylierter Nukleosome stimmt mit einer
krebshemmenden Rolle von Lunasin als Tumorsuppressorsurrogat überein,
indem es die Acetylierung von Chromatin und die Aktivierung von
Onkogenen in Zellen mit mutierten Tumorsuppressorgenen verhindert.
Die Zelladhäsionseigenschaft
von Lunasin bringt auch den zusätzlichen
Vorteil, dass die Ausbreitung von Krebs verhindert wird, indem es
sich kompetitiv an Membranintegrine bindet, die von metastasischen
Zellen zum Anhaften an die extrazelluläre Matrix und zur Proliferation benötigt werden.
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Wir
haben ebenfalls aufgezeigt, dass der aus Sojabohnen gewonnene Protease-Inhibitor
Bowman-Birk-Inhibitor (BBIC), der sich als gegen verschiedene Arten
von Krebs in In-vitro- und In-vivo-Tiermodellen chemopräventiv erwiesen hat, Lunasin
als eine Hauptkomponente enthält.
Tatsächlich
reduzierte die Entfernung von Lunasin aus BBIC durch Immundepletion
die Fähigkeit
von BBIC, eine Karzinogen vermittelte Transformation von C3H-Zellen
zu hemmen, signifikant. Zusätzlich
dazu stellte sich heraus, dass Lunasin bei Verwendung equimolarer
Mengen bei der Verhinderung Karzinogen induzierter Tumorbildung
effektiver als BBIC war. Diese Beobachtungen weisen darauf hin,
dass Lunasin ein, wenn nicht der aktive krebshemmende Bestandteil
von BBIC ist.
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Demgemäß bezeichnet
der Begriff Lunasin in seiner Verwendung hier Verbindungen, die
das natürliche
Sojabohnen-Lunasin-Polypeptid (zufällig gereinigt und sequenziert
von Odani et al., 1987) (Ser Lys Trp Gln His Gln Gln Asp Ser Cys
Arg Lys Gln Leu Gln Gly Val Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His Ile
Met Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
Asp, SEQ ID NO: 1) umfassen, und aktive Fragmente davon, die mindestens
das Arg-Gly-Asp-Motiv, gefolgt von mindestens einem hexa-Asp/Glu-Motiv,
umfassen.
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Bevorzugte
Lunasin-Polypeptide umfassen die Reste 33–43, vorzugsweise 21–43, noch
besser 10–43 und
am besten 1–43
von SEQ ID NO: 1. Beispielhafte Lunasin-del-Verbindungen (wobei
wieder die N→C
Nomenklaturübereinkunft
verwendet wird), die sich beim Hemmen von Krebsentstehung in In-vitro-
und Tiermodellen als effektiv erwiesen haben, schließen folgende
ein:
Lunasin-del-1: Fusion von MRG und Resten 32–43 von
SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-2: Fusion von α-Tubulin und Resten 32–43 von
SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-3: Fusion von β-Tubulin und Resten 27–42 von
SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-4: Fusion von MAP2 und Resten 5–43 von
SEQ ID NO: 2
Lunasin-del-5: Fusion von Mapmodulin und Resten
32–43
von SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-6: Fusion von GFP und Resten 32–43 von
SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-7: Fusion von MAP4 und Resten 23–42 von
SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-8: Fusion von FLAGG und Resten 9–43 von
SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-9: Fusion von CYCLIN A und Resten
32–43
von SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-10: Fusion von CYCLIN B1 und Resten
32–43
von SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-11: Fusion von CYCLIN B2 und Resten
19–42
von SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-12: Fusion von CYCLIN B3 und Resten
13–43
von SEQ ID NO: 1
Lunasin-del-13: SH2-octa-Aspartat-Fusion
Lunasin-del-14:
SH3-octa-Aspartat-Fusion
Lunasin-del-15: Fusion von SEQ ID
NO: 1, Reste 27–34,
und MRG-octa-Aspartat
Lunasin-del-16:
Fusion von SEQ ID NO: 1, Reste 27–34, SEQ ID NO: 1, Reste 27–34, und
octa-Aspartat
Lunasin-del-17: MRG-tetra-Aspartat-tetra-Glutamat-Fusion
Lunasin-Peptid
hemmt die Karzinogen vermittelte Transformation von C3H 10T1/2-Maus-Fibroblastenzellen zu
Tumorzellen. Experimente, die unter Verwendung des gleichen In-vitro-Transformations-Assays
vorgenommen wurden, wie dem, der zum Bestimmen der chemopräventiven
Eigenschaft von BBIC verwendet wurde, zeigten, dass die Anwendung
des Lunasin-Peptids von außen
bis auf 10 nM hinab (10 nM bis 10 mM) die Transformation von normalen
embryonalen Maus-Fibroblastenzellen (C3H 10T1/2) zu Krebsfoci durch krebserregende
Wirkstoffe MCA (3-Methylcholanthren)
und DMBA (7,12-Dimethylbenzanthracen) hemmt.
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Die
Beseitigung des sauren Carboxylendes (Lunasin-del-C) und des RGD-Zelladhäsionsmotivs
(Lunasin-GRG) hebt den Hemmeffekt auf, was darauf hinweist, dass
diese Domänen
essenziell sind.
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Lunasin
ist eine Hauptkomponente des Bowman-Birk-Protease-Inhibitors (BBIC)
aus Sojabohnen, einer bekannten krebspräventiven Substanz. Protease-Inhibitoren
weisen, anders als andere mögliche
Klassen von krebspräventiven
Substanzen, die untersucht worden sind, mehrere Merkmale auf, die
wir als ebenfalls auf Lunasin zutreffend beobachtet haben. Der auffälligste
Unterschied besteht in ihrer Fähigkeit,
Krebsentstehung auf eine irreversible Weise zu beeinflussen. Wenn
die Verabreichung von BBIC beendet wird, sei es in In-vitro- oder
In-vivo-Experimenten, treten in den verwendeten Assay-Systemen keine
bösartigen
Zellen oder Tumore auf (Kennedy, 1994). Chemopräventive Wirkstoffe wie etwa
Vitamin E, b-Carotin und Retinoide haben im Gegensatz dazu einen
reversiblen Effekt auf In-vitro-Systeme – transformierte
Zellen treten auf, nachdem diese chemopräventiven Wirkstoffe aus Karzinogen
behandelten Kulturzellen entfernt worden sind. Protease-Inhibitoren
sind außerdem
darin anders als andere chemopräventive
Wirkstoffe, dass sie bei extrem niedrigen Pegeln (nM) effektiv sind,
während
die anderen Wirkstoffe nur bei sehr hohen Pegeln (mM) effektiv sind. Die
Dosis-Wirkung der BBIC-Suppression von Krebsentstehung ist deshalb
außergewöhnlich,
da die Dosispegel von BBIC über
einen Bereich, der über
mehrere Größenordnungen
variiert, die gleichen Unterdrückungsseffekte
haben. Drittens unterscheidet die auffällige Fähigkeit der Protease-Inhibitoren,
so viele unterschiedliche Krebsarten zu unterdrücken, diese von den meisten
chemopräventiven
Wirkstoffen. Ihre antineoplastischen Eigenschaften sind nicht auf
spezifische Organe/Gewebe beschränkt.
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Lunasin
gehört,
wie BBIC, zu derselben Klasse der 2S-Albumin-Familie, und beide werden auf ähnliche
Weisen zubereitet. Wir haben mittels Western-Blot-Analyse herausgefunden,
dass Lunasin eine Hauptkomponente von im Handel erhältlichen
BBIC-Präparaten
(Sigma) ist. In einem beispielhaften Blot zeigte Spur 3, die ein
Rohpräparat
des Trypsininhibitors (Sigma T 9128, lösliches Sojabohnenpulver des
Typs II-S) enthielt, eine Hauptproteinbande bei 16 kDa, die in dem
Immunoblot hervorgehoben wurde. BBI ist ein Protein von 8 kDa, von
dem bekannt ist, dass es in Lösung
dimerisiert. Spur 4, die BBIC (Sigma T9777, Bowman-Birk-Inhibitor,
aus gefriergetrocknetem Sojabohnenpulver) enthielt, zeigte zwei
Proteinbanden, 8 kDa und 16 kDa, die beide im Immunoblot hervorgehoben
wurden. Lunasin, das 2 Cystein-Reste aufweist, kann mit BBI (als
ein Monomer und ein Dimer), das 14 Cystein-Reste aufweist, Disulfidbindungen
bilden. Dies zeigt deutlich, dass Lunasin in BBIC als eine Hauptkomponente
zu finden ist. Des Weiteren haben wir gezeigt, dass die Entfernung von
Lunasin aus BBIC durch eine Lunasin-Antikörper-Affinitätssäule und
durch Harzbehandlung die Fähigkeit des
BBIC, die Transformation von C3H-Zellen zu hemmen, signifikant reduzierte.
Diese Anzeichen weisen, zusammen mit der Fähigkeit des Lunasin, die Karzinogen
vermittelte Transformation von C3H-Zellen zu hemmen, darauf hin,
dass Lunasin ein, wenn nicht das aktive chemopräventive Hauptmolekül in BBIC
ist. Unsere Daten weisen vielmehr darauf hin, dass BBIC dahingehend
wirken kann, Lunasin vor der Verdauung im Magen-Darm-Trakt zu schützen. Die
Fähigkeit
von Lunasin, in das Innere von Säugetierzellen
zu gelangen, dann die Chromatinfunktion zu modifizieren, bietet
nun einen rationalen Mechanismus, um die chemopräventive Eigenschaft von BBIC
zu erklären,
sowie eine Anleitung für
die Verwendung von Lunasin als Nahrungstherapeutika oder Nahrungsergänzungsmittel, insbesondere
als krebshemmender Wirkstoff. Das Ersetzen von BBI durch Lunasin
bei vergleichbaren Dosierungen und Verabreichungsrouten zum Beispiel
bietet Wirksamkeit in Zell- und Tieruntersuchungen (siehe US-Patente
Nr. 5,618,679; 5,616,492; 5,614,198; 5,505,946; 5,376,373; 5,338,547).
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Chromatinabwandlung
und Tumorsuppression. Wir vermuten, dass die Chromatinbindungsfähigkeit von
Lunasin der zugrunde liegende Mechanismus hinter der mitosehemmenden
Eigenschaft des Lunasin-Gens und der krebspräventiven Eigenschaft des Lunasin-Peptids ist. Eine
Reihe von Untersuchungen weist nachdrücklich darauf hin, dass die
Chromatinabwandlung mit Tumorsuppressionswegen verknüpft ist. (DePinho,
1998; Brehm et al., 1998; Magnaghi-Jaulin, 1998; Pazin und Kadonaga,
1997; Hassig et al., 1997; Laherty et al., 1997). Das Retinoblastomprotein
Rb ist zum Beispiel mit E2F (einer Familie von Transkriptionsfaktoren,
die von Rb gesteuert werden) und HDAC1 (der Haupt-Säugetier-Histondeacetylase,
die die Chromatinstruktur modifiziert) in Säugetierzellen zu einem Komplex
geformt. Rb unterdrückt
E2F regulierte Promotoren, indem es HDAC1 heranzieht, das Kernhistone
deacetyliert, was eine engere Assoziation zwischen DNA und Nukleosomen
bewirkt, so dass die Bindung von Transkriptionsfaktoren an Erkennungselemente
in der DNA erschwert wird. Der Rb/HDAC/E2F-Komplex könnte ein
Ziel für
transformierende Viren sein, was zur Freigabe der Suppression und
einem vollständig
transformierten Zustand führen
könnte.
Die Bindung von Lunasin an die hypoacetylierte Region des Chromatins
kann die Tumorgenese in einem anderen Kontext unterdrücken. Während die
Deacetylierung eine engere Assoziation der DNA mit den Nukleosomen
in kondensierten Chromosomen bewirkt, was zu einer Änderung
der Struktur höherer
Ordnung führt,
legt sie auch positive Ladungen auf Lysinresten frei, die es dem
Lunasin ermöglichen
würden,
an Histonendsequenzen zu binden und den reversiblen Acetylierungs-/Deacetylierungsprozess
zu verhindern. Folglich wird die Genexpression mehr oder weniger
permanent unterbunden. Untersuchungen an Tieren zeigen, dass Lunasin
die Verdauung effektiv überlebt,
absorbiert wird und in die Gewebe gelangt. Unsere Anzeichen zeigen,
dass Lunasin in der Zelle über das
RGD-Motiv internalisiert wird (d. h. es gibt keine Internalisierung,
wenn das RGD-Motiv beseitigt wird) und aufgrund seiner Größe von 4
kDa durch passive Diffusion und während der Prometaphase, wenn
die Kernhülle aufgelöst wird,
in das Innere des Nukleus gelangt. Letztlich bindet sich Lunasin
an die Kernhistone der Nukleosomen und hemmt die Transformation
der Zelle in der Gegenwart von Karzinogenen, indem es die Transkription
wie oben beschrieben unterbindet.
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