PT1173476E - Nutracêuticos à base de proteína de soja - Google Patents

Description

Descrição

Nutracêuticos à base de proteína de soja

Introdução Campo da invenção O campo da invenção diz respeito às proteínas de soja com efeitos quimiopreventivos.

Antecedentes da invenção O conceito que factores dietéticos desempenham um papel importante na etiologia de tipos diferentes de cancro, é bem suportado por dados epidemiológicos (World Câncer Fund, 1997). Por exemplo, existem muitas evidências para sugerir que as dietas que contém uma grande quantidade de produtos de soja estão associados a baixas taxas de mortalidade total de cancro, particularmente para cancros do cólon, mama e próstata, o que dá um impulso na direcção para a identificação de componentes específicos em soja que podem ser responsáveis para os efeitos preventivos do seu cancro (Messina and Barnes, 1991; Kennedy, 1995).

Um inibídor de protease derivado do soja, inibidor Bowman-Birk (BBI), têm demonstrado ser um agente quimiopreventivo particularmente eficaz (Kennedy, 1998). 0 BBI foi caracterízado como uma proteína de 8 kD de sequência e estrutura definida (revista por Birk, 1985), contudo, a maioria dos estudos que demonstram a eficácia do BBI, têm usado BBIC, um extracto enriquecido de soja em BBI. 0 BBIC é altamente eficaz na supressão da carcinogénese (1) induzido 1/13 por vários carcinógenos diferentes, (2) em três sistemas modelo de animais diferentes (ratazanas, ratos e hamsters) e nos sistemas de transformação in vitro (Kennedy et al, 1993), (3) em vários tecidos/órgãos (cólon, fígado, pulmão, esófago e epitelio oral, (4) quando administrado a animais de várias formas diferentes (ip, iv, tópica, dietético), (5) envolvendo tipos diferentes de tumores (carcinomas de célula escamosa, adenocarcinomas, angiosarcomas, etc., (6) em tipos diferentes de célula (células epitelial no fígado, cólon, pulmão, esófago e bolsa bucal assim como células de tecido conectivo (fibroblastos tanto in vitro assim como no fígado) o que dá origem aos angiosarcomas. Deste modo, a capacidade quimiopreventíva de BBIC foi demonstrada numa variedade de sistemas de análise de carcinogéneses diferentes, atingindo um estatuto de Investigational New Drug da FDA em 1992 (IND n°34671) e agora em testes clínicos humanos.

Literatura citada

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Sumário da invenção A invenção providencia o uso de um polipeptídeo lunasin no fabrico de fórmulas para distribuir quantidades eficazes de lunasin como um nutracêutico. Em particular, a invenção providencia o uso de um polipeptídeo lunasin que compreende a sequência aminoácida de SEQ ID NO:1 ou um fragmento activo que compreende pelo menos o motivo Arg-Gly-Asp seguido de pelo menos um motivo hexa-Asp/Glu no fabrico de uma fórmula de quimioprevenção do cancro, em que a dita fórmula compreende pelo menos 50% do peso do polipeptídeo do dito polipeptídeo lunasin e menos que 10% do peso do polipeptídeo do polipeptídeo inibidor Bowman-Birk. Noutras realizações, a composição compreende pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 98%, o mais preferível 100% do peso do polipeptídeo do dito polipeptídeo lunasin e menos que 2%, preferivelmente menos de 0.5%, o mais preferível menos de 0.1%, o mais preferível 0% do peso do polipeptídeo do peptídeo inibidor Bowman-Birk. As fórmulas podem ser distribuídas ou administradas por qualquer uma da ampla variedade dos métodos de distribuição convenientes bem conhecidos da técnica, (ver por exemplo, Goodman and Gilman's The Pharmacologi cal Basis of Therapeutics, Ninth Edition) incluindo ingestão oral, ao contactar topicamente com a pele usando técnicas bem conhecidas para a distribuição cutânea, ao introduzir nos fluídos fisiológicos retidos tais como o sangue, fluído sinovial, fluído intersticial, etc. 5/13

Noutras realizações, a fórmula é para: - administração oral de um polipeptídeo de lunasin; administração tópica de um polipeptídeo de lunasin ao contactar com a pele com a dita fórmula; ou - introdução da dita fórmula no fluído fisiológico acumulado na administração de um peptídeo de lunasin. Métodos para fazer fórmulas sujeitas a purificar os polipeptídeos de lunasin para a pureza requerida, e combinando o dito polipeptídeo de lunasin com um excipiente farmaceuticamente aceitável numa dosagem de unidade oralmente activa, são aqui também descritos. 0 material fonte de lunasin pode ser soja, um sistema de expressão de polipeptídeo de lunasin recombinado, uma lunasin sinteticamente produzida, ou extracto ou fracção. Excipientes e dosagens adequados são prontamente determinados empiricamente como direccionados ao existir dados BBIC.

Descrição particular de realizações particulares da invenção

As seguintes descrições de realizações particulares e exemplos são oferecidos através de ilustração e não por limitação pelo contrário, e a menos que contra-indicados ou apontados, nestas descrições e através desta especificação, os termos "a" e "an" significam um ou mais, o termo "or" significa e/ou e sequências de polinucleótido são entendidas para rodear as margens opostas assim como partes mais importantes alternativas aqui descritas.

Foi mostrado que um pequeno peptídeo sub-unidade de albumina 2S isolado da semente da soja, ao qual foi chamado de lunasin, tem um efeito anti-mitótico quando expresso nas células 6/13 mamíferas (Galvez AAF and Lumen BO, 1999 and USSN 08/938,675). Ao contrário de outros agentes anti-mitóticos que interrompem a função do microtúbulo, foi mostrado que quando o gene lunasin é transfectado e expresso dentro da célula, o lunasin obriga preferencialmente à cromatina hipoacetilada em células transfectadas-1unasin, levando à deslocação de proteínas cinetocoro durante a mitose. O polipeptideo lunasin também contém um motivo funcional RGD (arg-gly-asp). Quando exogenicamente aplicado às culturas de células mamíferas, o lunasin através do tripeptídeo RGD liga às integrinas da membrana da célula e subsequentemente entra no citoplasma através de uma rotação na membrana. As quantidades relativamente pequenas de lunasin que entram no núcleo através de difusão passiva e na prometafase (quando o colapso da membrana nuclear ocorre) são suficientes para ligar efectivamente regiões de cromatina hipoacetilada. Contudo, ao contrário das células transfectadas de lunasin que expressam constitutivamente lunasin em altas quantidades, a lunasin interiorizada parece não afectar a união do cinetocoro à medida que as células suportam a mitose normal. Em vez disso, a lunasin inibe a transformação de células de fibroblasto de embrião normal em tumores cancerígenos através de agentes carcinogénicos. A afinidade ligante de lunasin a regiões de nucleossomas deacetilados é consistente com um papel anti-carcinogénico de lunasin como um supressor de tumor que é substituído ao prevenir a acetilação cromatina e activação oncogene em células como genes supressores de tumor mutante. A propriedade de adesão da célula de lunasin também confere um benefício adicionado de prevenção da expansão do cancro ao ligar competetivamente às integrinas da membrana requeridas pelas células metastáticas para anexo para a matriz extracelular e para proliferação. 7/13

Também se demonstrou que o inibidor protease Inibidor Bowman-Birk (BBIC) derivado do soja, que tem mostrado ser quimiopreventivo contra diferentes tipos de cancros em modelos animais in vitro e in vivo, contém como componente principal a lunasin. De facto, a remoção da lunasin do BBIC através de imuno-depleção, reduz significativamente a capacidade do BBIC para inibir a transformação carcinogénica-mediada de células C3H. Adicionalmente, usando quantidades equimolar, foi descoberto que a lunasin se mostrou mais eficaz que o BBIC na prevenção da formação do tumor induzido por carcinógeno. Essas descobertas indicam que a lunasin é um, se não mesmo o, componente activo anti-carcinogénico do BBIC.

Consequentemente, como aqui usado, o termo lunasin refere-se a componentes que compreendem o polipeptídeo lunasin de soja natural (coincidentemente purificado e sequenciado por Odani et al., 1987 (Ser Lys Trp Gin His Gin Asp Ser Cys Arg Lys Gin Leu Gin Gly Vai Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His f |e Met Glu Lys | ie Gin Gly Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp, SEQ ID N0:1) e fragmentos activos que compreendem pelo menos o motivo Arg-Gly-Asp seguido por pelo menos um motivo hexa-Asp/Glu. Os polipeptídeos lunasin preferidos compreendem resíduos 33-43, preferivelmente 21-43, mais preferivelmente 10-43 e o mais preferível 1-43 da SEQ ID NO: 1. Componentes exemplares lunasin-del (usando outra vez a convenção de nomenclatura N-*C) mostrando ser eficaz em carcinogenese inibindo in vitro e modelos animais incluindo:

Lusanin-del-1:MRG-resíduos 32-43 de SEQ ID NO:1 fusão Lusanin-del-2: a-tubulina-resíduos 32-43 de SEQ ID NO:1 fusão Lusanin-del-3: β-tubulina-resíduos 27-42 de SEQ ID NO:1 fusão Lusanin-del-4: MAP2-resíduos 5-43 de SEQ ID NO:2 fusão Lusanin-del-5: Mapmodulína-resíduos 32-43 de SEQ ID NO:1 fusão 8/13

Lusanin-del-6: GFP-resIduos 32-43 de SEQ ID NO:1 fusão Lusanín-del-7: MAP4-resíduos 23-42 de SEQ ID N0:1 fusão Lusanin-del-8; FLAGG-resíduos 9-43 de SEQ ID NO:1 fusão Lusanin-del-9: ciclina A-residuos 32-43 de SEQ ID NG:1 fusão Lusanin-del-10: Ciclina Bl-resíduos 32-43 de SEQ ID NO:1 fusão Lusanin-del-H; ciclina B2-resíduos 19-42 de SEQ ID NO: 1 fusão Lusanin-del-12: Ciclina 33-resíduos 13-43 de SEQ ID NO:1 fusão Lusanin-del-13: SH2-octa-aspartático fusão Lusanin-del-14; SH3-octa-aspartático fusão

Lu3anin-del-15 : SEQ ID NO: 1, resíduos 27-34-MRG-octa-fusão aspartático Lusanin-del-16: SEQ ID NO: 1, resíduos 27-34-SEQ ID NO:l, resíduos 27-34-octa-fusão aspartático

Lusanin-del-17: fusão MRG-tetra-aspartático-tetra glutamato

Lusanin Peptíde Inhibits Carcinogen-mediated Transformation de C3H 10T1/2 Mouse fibroblast Cells Into Tumor Cells. Experiências feitas usando o mesmo exame de transformação in vitro usado para determinar a propriedade quimiopreventiva do BBIC, mostraram que a aplicação exógena do peptídeo lunasin para tão baixo como 10 nM (lOnM para lOmM) inibe a transformação das células fibroblasto do embrião do rato normal (C3H 10T1/2) no focos tumoroso através de agentes carcinogénicos, MCA (3-methylcholanthrene} e DMBA (7,12- dimethylbenz [a] anthracene). Supressão da extremidade carboxil acídica (lunasin-del-C) e o motivo de adesão da célula RGD (lunasin-GRG), remove o efeito de inibição indicando que esses domínios são essenciais. A Lunasin é o principal componente do inibidor Bowman-Bírk de Protease (BBIC) de soja, a uma substância conhecida na prevenção do Cancro. Os inibidores protease, ao contrário de outras classes potenciais de prevenção de cancro que foram 9/13 estudados, têm vários aspectos que foram vistos que também são verdadeiros para lunasin. A diferença mais dramática é a sua capacidade de afectar a carcinogenese numa maneira irreversível. Quando a administração do BBIC é parada nas experiências in vitro ou in vivo, as células malignas ou tumores não surgem nos sistemas dos exames usados (Kennedy, 1994). Em contraste, agentes quimiopreventivos tais como vitamina E, b-caroteno e retinóides têm um efeito reversível em sistemas in vitro- células transformadas surgem quando estes agentes quimiopreventivos são removidos das células de cultura tratadas com carcinógeno. Os inibidores protease também são ao contrário de outros agentes quimiopreventivos em que eles são eficazes em níveis extremamente baixos (nM) enquanto que outros agentes só são eficazes em níveis muito altos (mM). A resposta dose da supressão BBIC de carcinogenese não é usual em que os níveis dose do BBIC tem os mesmos efeitos supressores sobre uma extensão que varia em várias ordens de magnitude. Em terceiro lugar, a capacidade de enganar dos inibidores protease para suprimir tantos cancros diferentes, fá-los diferentes da maioria dos agentes quimiopreventivos. As suas propriedades anti-cancerígenas não são restritas a órgãos/tecidos específicos. A Lunasin, como o BBIC, pertence à mesma classe da família de albuminas 2S e são ambos preparados de formas similares. Foi descoberto que as análises Western blot que a lunasin é o componente principal das preparações de BBIC comercialmente disponíveis (Sigma). Num blot exemplar, a opção 3 que contém uma preparação crua de inibidor de Tripsina (Sigma T 9128,

tipo II_S pó solúvel de soja) mostrou uma banda de proteína principal a 16kDa que ilumina no Western Blot. 0 BBI é uma proteína 8 kDa que é conhecida para dimerizar em solução. A opção 4 que contém BBIC (Sigma T9777, Inibidor Bowman-Birk, do 10/13 pó liofilizado de soja) mostrou duas bandas de proteínas, 8 kDa e 16 kDa, que iluminam no Western Blot. A Lunasin que tem 2 resíduos de cistina, pode formar ligações de disulfido com BBI (como um monómero e um dímero) que tem 14 resíduos de cistina. Isto mostra claramente que a lunasin é encontrada no BBIC como o componente principal. Além disso, é mostrado que a remoção da lunasin do BBIC através da coluna de afinidade do anticorpo de lunasin e por tratamento de resina, reduz significativamente a capacidade do BBIC de inibir a transformação de células C3H. Esta prova juntamente com a capacidade da lunasin para inibir a transformação carcinógeno-mediado das células C3H indicam que a lunasin é uma principal, senão mesmo a molécula quimiopreventiva activa no BBIC. De facto, os dados Indicam que o BBIC pode agir para proteger que a lunasin seja digerida no tracto gastrointestinal. A capacidade que a lunasin tem de entrar nas células mamíferas, modulando depois a função cromatina, providencia agora um mecanismo racional para explicar a propriedade quimiopreventiva do BBIC assim como orientação para o uso na lunasin como um suplemento nutracêutico ou nutricional, em particular como agente anti-carcinogénico. Por exemplo, substituir a lunasin por BBI em doses comparáveis e vias de administração, providencia eficácia nos estudos da célula e de animais (ver, US Pat N°s 5,618,679; 5,616,492; 5,614,198; 5,505,946; 5,376,373; 5,338,547).

Chromatin Modification and Tumor Suppression. A hipótese é que a capacidade de ligação da cromatina de lunasin seja o mecanismo subjacente por detrás da propriedade anti-mitótica do gene lunasin e a propriedade preventiva de cancro do peptídeo lunasin. Uma série de estudos sugere fortemente que a modificação cromatina está ligada com as vias de supressão do tumor. (DePinho, 1998; Brehm et al, 1998; Magnaghi-Jaulin, 11/13 1998; Pazin and Kadonaga, 1997; Hassíg et al, 1997; Laherty et al, 1997). Por exemplo, a proteína retinoblastoma Rb é complexada com E2F (uma família de factores de transcrição controlada por Rb) e HDAC1 (a deacetiiase histona mamífera principal que modula a estrutura cromatina) em células mamíferas. 0 Rb reprime o promotor regulado E2F ao alcançar HDACl que deacetilata núcleos das histonas provocando uma associação mais estreita entre o ADN e nucleossomas, prejudicando deste modo a ligação de factores de transcrição para elementos de reconhecimento no ADN. 0 complexo Rb/HDAC/E2F pode ser o alvo para transformar vírus que levam à libertação da supressão e um estado completamente transformado. A ligação de lunasin para a região hipoacetilada de cromatina pode suprimir tumorigenese num diferente contexto. Enquanto a deacetilação provoca uma associação mais estreita de ADN com nucleossomas em cromossomas condensados que levam à mudança numa estrutura de ordem maior, também expõe cargas positivas nos resíduos lisina que vão permitir que a lunasin ligue para as sequências terminais de histona e evite o processo reversível de acetilação/deacetilação. Consequentemente, a expressão do gene é mais ou menos permanentemente reprimida. Estudos animais mostram que a lunasin efectivamente sobrevive à digestão, é absorvida e acaba nos tecidos. Esta prova mostra que a lunasin é internalizada na célula via o motivo RGD (isto é não há internalização quando o motivo -RGD- é apagado) e entra dentro do núcleo através de difusão passiva devido ao seu tamanho de 4kDa e na prometafase quando o revestimento nuclear colapsa. Eventualmente, a lunasin liga com o centro das histonas dos nucleossomas e inibe a transformação da célula na presença de carcinógenos ao reprimir a transcrição como descrito acima.

Listagem de sequência 12/13 <110> de Lumeη, Beníto 0.

Galvez, Alfredo F. <120> Nutracêuticos de proteína de Soja <130> B99-089 <140> 09/303,814 <141> 1999-04-30 <160> 1 <170> Patente In Ver. 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> soja <400> 1

Ser Lys Trp Gin His Gin Gin Asp Ser Cys Arg Lys Gin Leu Gin Gly 1 5 10 15

Vai Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His Ile Met Giu Lys Ile Gin Gly 20 25 30

Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 35 40

Lisboa, 05 de Dezembro de 2006 13/13

Claims (10)

1. Reivindicações 1. Uso de um polipeptideo lunasin que compreende a sequência aminoácido de SEQ ID NO:i ou um fragmento activo que compreende pelo menos o motivo Arg-Gly-Asp seguido de pelo menos um motivo hexa-Asp/Glu no fabrico de uma fórmula para a quimioprevenção do cancro, em que a dita fórmula compreende pelo menos 50% do peso do polipeptideo do dito polipeptideo de lunasin e menos que 10% do peso do polipeptideo do polipeptideo iníbidor Bowman-Birk.
2. 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende pelo menos 90% do peso de polipeptideo do dito polipeptideo lunasin e menos que 1% do peso do polipeptideo do polipeptideo iníbidor Bowman-Birk.
3. 3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o polipeptideo lunasin compreende 33-43 de SEQ ID NO:l.
4. 4. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o polipeptideo lunasin compreende resíduos 21-43 de SEQ ID NO:l.
5. 5. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o polipeptideo lunasin compreende resíduos 10-43 de SEQ ID NO:l.
6. 6. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o polipeptideo lunasin compreende resíduos 1-43 de SEQ ID N0:1.
7. 7. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o polipeptideo lunasin consiste de resíduos 1-43 de SEQ ID NO:1.
8. 8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em que a dita fórmula serve para a administração orai de um 1/2 poiípeptídeo lunasin.
9. 9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações i ou 7, em que a dita fórmula serve para a administração tópica de um poiípeptídeo lunasin ao contactar a pele com a dita fórmula.
10. 10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a dita fórmula serve para a introdução da dita fórmula num fluído fisiológico acumulado para a administração de um poiípeptídeo lunasin. Lisboa, 05 de Dezembro de 2006 2/2