DE60030884T2

DE60030884T2 - Transkriptionsfaktoren welche zwei potentielle dna bindende motive enthalten

Info

Publication number: DE60030884T2
Application number: DE60030884T
Authority: DE
Inventors: Hilary Alison Headington BANHAM; Loelia Jacqueline Headington CORDELL; University of Oxford Margaret Headington JONES
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1999-12-02
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2020-12-02
Also published as: US20030139330A1; JP2003515328A; CA2394996A1; ATE340188T1; WO2001040303A1; ES2272336T3; EP1246841A1; DE60030884D1; EP1246841B1; AU1539801A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Proteinfamilie, insbesondere eine Proteinfamilie, welche zwei potenzielle DNA-Bindungsmotive enthält, die allgemein in Transkriptionsfaktoren vorkommen; ein flügelförmiges Helixmotiv und ein Cys₂-His₂-Zinkfingermotiv.
Transkriptionsfaktoren spielen bei der Regulation der Entwicklung eines Organismus eine zentrale Rolle, da die Mehrheit der Genregulation bei Entwicklungsprozessen auf Transkriptionsebene stattfindet (Darnell, J. 1982. Nature 297: 365–371). Transkriptionelle Regulatoren werden in Familien eingeteilt, welche üblicherweise auf der konservierten Struktur ihrer DNA-Bindungsdomänen beruhen. Die Forkhead-Domäne (Gabelkopf-Domäne) wurde 1990 durch die Homologie zwischen den DNA-Bindungsdomänen des Leberzellkernfaktor (HNF-3) und dem Forkhead-Gen aus Drosophila bestimmt (Lai, E., V. R. Prezioso, E. Smith, O. Litvin, R. H. Costa und J. E. Darnell. 1990. Genes & Dev. 4: 1427–1436; Weigel, D. und H. Jackle. 1990. Cell 63: 455–456; Weigel, D., G. Jurgens, F. Kuttner, E. Seifert und H. Jackle. 1989. Cell 57: 645–658; Weigel, D., E. Seifert, D. Reuter und H. Jackle. 1990. EMBO J. 9: 1199–1207). Die Familie ist gegenwärtig als flügelförmige Helixfamilie bekannt, welche nach ihrer dreidimensionalen Struktur unter Bindung an DNA benannt wurde (Clark, K. L., E. D. Halay, E. Lai und S. K. Burley. 1993. Nature 364: 412–420). Mitglieder dieser Familie nehmen an einer großen Auswahl normaler entwicklungsbedingter Vorgänge einschließlich der Kontrolle von Zelldifferenzierung und -proliferation, Musterbildung und Signaltransduktion teil (Kaufmann, E. und W. Knochel. 1996. Mech. Dev. 57: 3–20; Lai, E., K. L. Clark, S. K. Burley, und J. E. Darnell Jr. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 10421–10423).
Zusätzlich zu ihren üblichen Rollen sind Mitglieder dieser Familie an Tumorbildung bei Säugern beteiligt. Qin ist ein retroviral transduziertes murines Onkogen (Li, J. und P. K. Vogt, 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4490–4494); eine Nacktratten- und Nacktmaus-Mutation unterbricht das flügelförmige Helixgen whn (Nehls, M., Pfeifer, D., Schorpp, M., Hedrich, H. und Boehm, T. (1994) Nature 372: 103–107; Reth, M. (1995) Curr. Biol. 5: 18–20). Es gibt auch drei flügelförmige Helix-Gene, welche an chromosomalen Translokationen humaner Malignome beteiligt sind: Es ist bestimmt worden, dass AFX und AF6q21 in Fällen von akuter Leukämie auf t (X; 11) (q13; 123) (Parry, P., Wei, Y. und Evans, G: (1994) Cancer 11: 79–84; Borkhardt, A., Repp, R., Haas, O. A., Leis, T., Harbott, J., Kreuder, J., Hammermann, J., Henn, T. und Lampert, F. (1997) Oncogene 14: 195–202) bzw. t (6; 11) (q21; q23) (Hillion, J., Le Coniat, M., Jonveaux, P., Berger, R. und Bernard, O. A. (1997) Blood 90: 3714–3719) an MLL fusioniert sind. Es wurde auch herausgefunden, dass FKHR als Folge von zwei Translokationen t (2; 13) und t (1; 13), die für alveolären Rhabdomyosarcom charakteristisch sind, an Mitglieder der Familie der Paired Box-Familie oder der PAX-Familie von Transkriptionsfaktoren, PAX3 und PAX7, fusioniert ist (Galili, N., Davis, R. J., Fredericks, W. J., Mukhopadhyay, S., Rauscher, F. J. I., Emanuel, B. S., Rovera, G. und Barr, F. G. (1993) Nat. Genet. 5: 230–235; Davis, R., D'Cruz, C., Lovell, M., Biegel, J. und Barr, F. (1994) Cancer Res. 54: 2869–2872). Vor kurzem sind Transkriptionsfaktoren dieser Familie als zusätzliche Zielstrukturen für den PI3K/PKB-Signalweg identifiziert worden, welcher mit Tumorgenizität in Verbindung gebracht worden ist. Zusammengefasst von Kops, G. J. & Burgering B. M. 1999. Forkhead transcription factors: new insights into protein kinase B(c-akt) signalling. J. Mol. Med 77: 656–65.
Die vorliegenden Erfinder haben ein neues Gen identifiziert, kloniert und sequenziert, welches für ein Protein kodiert, das ein flügelförmiges Helixmotiv enthält, welches sowohl in normalen als auch in neoplastischen humanen Zellen in großem Umfang exprimiert wird. Interessanterweise enthält das neue Protein zusätzlich zu der flügelförmigen Helix ein zweites mutmaßliches Nukleinsäure-Bindungsmotiv und stellt daher wahrscheinlich eine bisher unbekannte Unterklasse von flügelförmigen Helix-Transkriptionsfaktorproteinen dar.
Entsprechend stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt ein isoliertes Protein bereit, welches (i) ein flügelförmiges Helixmotiv, welches die potenzielle Fähigkeit aufweist, an DNA zu binden und (ii) ein Cys₂-His₂-Zinkfingermotiv, welches auch an Nukleinsäuren binden kann, umfasst. Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der flügelförmigen Helix-Familie von Proteinen, über die bisher berichtet worden ist, ist das Protein der Erfindung dahingehend einzigartig, dass es ein zweites DNA-Bindungsmotiv enthält, welches allgemein bei anderen Transkriptionsfaktoren vorkommt; ein Cys₂-His₂-Zinkfingermotiv. Das Protein der Erfindung kann daher hierin im Folgenden als flügelförmiges Helix-/Zinkfingerprotein bezeichnet werden.
Das Protein der Erfindung kann zusätzlich ein oder mehrere transkriptionelle Aktivierungsdomänen enthalten. Die Bezeichnung „transkriptionelle Aktivierungsdomänen" bezieht sich auf Aminosäuresequenzregionen, welche allgemein in Transkriptionsfaktoren vorkommen, die an der Regulation der Genexpression beteiligt sind und für welche vor kurzem gezeigt wurde, dass sie durch Wechselwirkung mit der basalen Transkriptionsmaschinerie in sowohl in vitro- als auch in vivo-Assays wirksam sind (Truant, R., Xiao, H., Ingles, C. J. und Greenblatt, J. (1993) J. Biol. Chem. 268, 2284–2287; Xiao, H., Pearson, A., Coulombe, B., Truant, R., Zhang, S., Regier, J. L., Triezenberg, S. J., Reinberg, D., Flores, O. und Ingles, C. J. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 7013–7024). Diese Regionen werden im Allgemeinen gemäß ihrem Aminosäuregehalt klassifiziert und umfassen Glutamin-, saure Aminosäure-, Prolin- oder Serin- und Threonin-reiche Domänen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Protein gemäß der Erfindung die in 2 dargelegte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, welche sich von derjenigen in 2 nur in den konservativen Aminosäureaustauschen unterscheidet. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, enthält dieses Protein zusätzlich zu den geschwungenen Helix- und Zinkfingermotiven weiterhin zwei potenzielle Zellkernlokalisierungssignale und eine Anzahl von transkriptionellen Aktivierungsdomänen. Das Vorliegen dieser Motive deutet darauf hin, dass das Protein der Erfindung als Transkriptionsfaktor wirksam sein kann.
Die Erfindung stellt weiterhin Varianten des oben beschriebenen flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins bereit, welche keine potenziellen funktionellen Domänen aufweisen. Demgemäß stellt die Erfindung ein isoliertes Protein bereit, welches die Aminosäuresequenz gemäß 3C oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich von derjenigen, die in 3C gezeigt ist, nur in konservativen Aminosäureaustauschen unterscheidet, sowie ein isoliertes Protein, das die Aminosäuresequenz gemäß 4B oder 4D oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich von der in 4B oder 4D gezeigten Aminosäuresequenz nur in konservativen Aminosäureaustauschen unterscheidet.
Eines der Proteine, die die Erfindung verkörpern, ist in Übereinstimmung mit einer neuen vereinheitlichten Nomenklatur für die flügelförmigen Helix-/Forkhead-Transkriptionsfaktoren als FOXP1 bezeichnet worden (Kaestner, K. H., W. Knüchel und D. E. Martínez, 2000. 14: 142–146). Dieser Name ist von Dr. Daniel Martínez vom Fox Nomenclature Commitee im Namen des HUGO Nomenclature Commitee bestimmt worden. Alle weiteren Bezugnahmen auf dieses Protein sind FOXP1 und dies ist der Name, welcher in den Genbank-Accessions AF146696–AF146698 und AF275309 erscheint. Die FOXP1-Homologen humaner cDNA-Klon YX52E07 (Accession AF086040) und Maus-QRF1 (Accession A49395) sind jeweils als FOXP2 und Foxp1 bezeichnet worden. Insgesamt bestimmen diese Gene eine neue Untergruppe von flügelförmigen Helixproteinen. Der Fox-Nomenklaturindex, der im Web unter http://www.biology.pomona.edu/foxindex.html verfügbar ist, bestimmt die FOXP1-Gensequenz, wie sie von A. Banham eingereicht wurde.
Wie in Beispiel 1 im Folgenden erörtert, enthält die native Nukleinsäuresequenz, die für das in 2 dargelegte Protein kodiert, zwei aufeinander folgende ATG-Startkodons im Leserahmen. Die Aminosäuresequenz gemäß 2 entspricht der Aminosäuresequenz eines translatierten Proteinprodukts, das am ersten (d.h. stromaufwärts gelegenen) ATG-Kodon beginnt. Es wird jedoch vorausgesetzt, dass die Mehrheit der Ribosomen die Translation tatsächlich am zweiten dieser Startkodons startet, da es eine bessere Kozak-Konsensussequenz aufweist. Demgemäß sind translatierte Proteinprodukte, welche am zweiten (d.h. stromabwärts gelegenen) ATG-Kodon starten und daher nur ein N-terminales Methionin besitzen, auch vom Umfang der Erfindung umfasst, einschließlich eines Proteins mit der in 2 dargelegten Aminosäuresequenz, jedoch ohne den äußersten N-terminalen Methioninrest.
Die Erfindung stellt weiterhin isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die für Proteine der Erfindung kodieren.
Ebenso stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenz umfasst, die von Position 264 oder Position 267 bis Position 2294 der Nukleinsäuresequenz gemäß 2 gezeigt ist, ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die vollständige Nukleotidsequenz gemäß 2 umfasst, ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenzen gemäß 3A und 3B umfasst, und ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenzen gemäß 4A oder 4C umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst Nukleinsäuren, die in der Lage sind, an die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung zu hybridisieren, und welche bevorzugt in der Lage sind, an die Nukleotidsequenz gemäß einer beliebigen der 2, 3A und 3B, 4A oder 4C unter Bedingungen von hoher Stringenz zu hybridisieren.
Hybridisierungsstringenz, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Bedingungen, unter welchen Polynukleinsäuren stabil sind. Die Stabilität von Hybriden wird durch die Schmelztemperatur (Tm) der Hybride wiedergegeben. Tm kann durch die Formel: 81,5°C + 16,6 (log10[Na+] + 0,41 (%G&C) – 600/1geschätzt werden,
wobei 1 die Länge der Hybride in den Nukleotiden darstellt. Die Tm nimmt mit jedem 1% Abnahme an Sequenzhomologie um etwa 1–1,5°C ab.
Die Bezeichnung „Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen, wobei sich eine einzelsträngige Nukleinsäure mit einem komplementären Strang zusammengefügt, wenn sich die Purin- oder Pyrimidinbasen darin durch Wasserstoffbindung mit ihrer entsprechenden Base paaren. Bedingungen von hoher Stringenz begünstigen homologe Basenpaarung, während Bedingungen von niedriger Stringenz nicht-homologe Basenpaarung begünstigen.
Bedingungen von „niedriger Stringenz" umfassen zum Beispiel eine Temperatur von etwa 37°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 50% und eine mäßige bis niedrige Salz (SSC)-Konzentration; oder alternativ eine Temperatur von etwa 50°C oder weniger, und eine mäßige bis hohe Salz (SSPE)-Konzentration, zum Beispiel 1 M NaCl.
Bedingungen von „hoher Stringenz" umfassen zum Beispiel eine Temperatur von etwa 42°C oder weniger, eine Formamid-Konzentration von weniger als etwa 20% und eine niedrige Salz (SSC)-Konzentration; oder alternativ eine Temperatur von etwa 65°C oder weniger, und eine niedrige Salz (SSPE)-Konzentration. Zum Beispiel umfassen Bedingungen von hoher Stringenz Hybridisierung in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C (Ausubel, F. M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, 1989; Green Inc. New York, unter 2.10.3).
„SSC" umfasst eine Hybridisierungs- und eine Waschlösung. Eine Stammlösung von 20 × SSC enthält 3 M Natriumchlorid, 0.3 M Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 7,0.
„SSPE" umfasst eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 1 × SSPE-Lösung enthält 180 mM NaCl, 9 mM Na₂HPO₄ und 1 mM EDTA mit einem pH-Wert von 7,4.
Die Nukleinsäure, die in der Lage ist, an die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung zu hybridisieren, ist im Allgemeinen mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80 oder 90% und stärker bevorzugt mindestens 95 zu der Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung homolog.
Ein Antisense-Molekül, das in der Lage ist, an die Nukleinsäure gemäß der Erfindung zu hybridisieren, kann als Sonde oder als Medikament verwendet werden, oder es kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel dafür enthalten sein.
Die Bezeichnung „homolog" beschreibt die Beziehung zwischen unterschiedlichen Nukleinsäuremolekülen oder Aminosäuresequenzen, wobei die Sequenzen oder Moleküle durch partielle Identität oder Ähnlichkeit in einem oder mehreren Blöcken oder Regionen innerhalb der Moleküle oder Sequenzen miteinander in Beziehung stehen. Homologie kann mittels im Fachbereich bekannter Computerprogramme bestimmt werden.
Beträchtliche Homologie bringt bevorzugt mit sich, dass die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des Proteins der Erfindung ein Nukleotid- bzw. Aminosäurefragment umfassen, welches einem bestimmten Grad an Sequenzidentität zu den Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen, die in den Figuren aufgezeigt sind, entspricht und dieses anzeigen. Bevorzugt haben sie eine Identität von mindestens 30%, bevorzugt 40%, stärker bevorzugt 50%, noch stärker bevorzugt 60%, am stärksten bevorzugt 70% gemeinsam, und insbesondere ist im Hinblick auf die in 2, 3A, 3B, 3C, 4A, 4B, 4C bzw. 4D abgebildeten gezeigten Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen eine Identität von mindestens 80%, bevorzugt mehr als 90% und noch stärker bevorzugt mehr als 95% gewünscht. Ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen der besten Gesamtübereinstimmung zwischen einer Anfrage-Sequenz (eine Sequenz der vorliegenden Erfindung) und einer Subjektsequenz von Interesse, auch als globales Sequenz-Alignment bezeichnet, kann z.B. unter Verwendung des FASTDB-Computerprogramms auf Grundlage des Algorithmus von Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237–245) bestimmt werden. In einem Sequenz-Alignment können die Anfrage-Sequenzen und die Subjekt-Sequenzen beide DNA-Sequenzen sein. Eine RNA-Sequenz kann durch Umwandeln der Us zu Ts verglichen werden. Das Ergebnis dieses globalen Sequenz-Alignments stellt die prozentuale Identität dar. Weitere Programme, die zur Bestimmung der Homologie/Identität verwendet werden können, sind im Folgenden und in den Beispielen beschrieben. Die Sequenzen, die zu den oben beschriebenen Sequenzen homolog sind, sind zum Beispiel Variationen der Sequenzen, welche Modifizierungen mit derselben biologischen Funktion darstellen, insbesondere welche für Proteine mit derselben oder im Wesentlichen derselben Spezifität, z.B. Bindungsspezifität, kodieren. Sie können natürlich vorkommende Variationen sein, wie zum Beispiel Sequenzen aus anderen Säugern, oder sie können Mutationen sein. Diese Mutationen können in Natur vorkommen oder sie können durch Mutagenesemethoden erhalten werden. Die Allelvariationen können natürlich vorkommende Allelvarianten sowie synthetisch hergestellte oder genetisch konstruierte Varianten sein. In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Sequenzen vom Menschen.
Die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können vorteilhafterweise in einem geeigneten Expressionsvektor enthalten sein, um die daraus kodierten Proteine in einem geeigneten Wirt zu exprimieren. Das Einbringen von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor zur anschließenden Transformation der Zelle und zur anschließenden Selektion der transformierten Zellen ist dem Fachmann wohlbekannt, wie Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, zu entnehmen ist.
Ein Expressionsvektor gemäß der Erfindung umfasst einen Vektor mit einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung, die operativ mit regulatorischen Sequenzen wie zum Beispiel Promotorregionen, die in der Lage sind, die Expression der DNA-Fragmente zu bewirken, verknüpft ist. Die Bezeichnung "operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, wobei die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, die ihnen ermöglichen, in ihrer beabsichtigten Art und Weise wirksam zu sein. Solche Vektoren können zur Bereitstellung der Expression eines Proteins gemäß der Erfindung in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden. Daher stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen gemäß der Erfindung bereit, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor wie oben beschrieben transformiert oder transfiziert ist, unter Bedingungen, die eine Expression durch den Vektor einer kodierenden Sequenz bereitstellen, die für das Protein kodiert, und Gewinnen des exprimierten Proteins umfasst. Wie in den beigefügten Beispielen veranschaulicht ist, ist das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein der Erfindung sowohl in bakteriellen als auch in eukaryotischen Wirtszellen erfolgreich exprimiert worden.
In dieser Hinsicht kann das Nukleinsäuremolekül für ein matures Protein oder ein Protein mit einer Prosequenz kodieren, wobei das Kodieren für eine Leader-Sequenz auf dem Präprotein, welches von der Wirtszelle unter Bildung eines maturen Proteins gespalten wird, mit umfasst ist.
Die Vektoren können zum Beispiel Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung und ggf. einem Promotor zur Expression des Nukleotids und ggf. einem Regulator des Promotors ausgestattet sind. Die Vektoren können einen oder mehrere selektierbare Marken, wie zum Beispiel Resistenz gegenüber Antibiotikum enthalten.
Zur Expression erforderliche regulatorische Elemente umfassen Promotorsequenzen, die RNA-Polymerase binden und eine geeignete Menge an Transkriptions-Start- und auch Translations-Start-Sequenzen zur Ribosomenbindung steuern. Zum Beispiel kann ein bakterieller Expressionsvektor einen Promotor umfassen, wie zum Beispiel den Lac-Promotor und zum Translations-Start die Shine-Dalgarno-Sequenz sowie das Startkodon AUG. Auf ähnliche Art und Weise kann ein eukaryotischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für RNA-Polymerase II, ein stromabwärts gelegenes Polyadenylierungssignal, das Startkodon AUG und ein Stopkodon zur Abtrennung des Ribosoms umfassen. Solche Vektoren können kommerziell erhalten werden oder aus Sequenzen zusammengesetzt werden, die durch im Fachbereich bekannte Verfahren beschrieben sind.
Transkription der DNA, die für Polypeptide von höheren Eukaryoten der vorliegenden Erfindung kodiert, wird durch Einbringen einer Enhancersequenz in den Vektor optimiert. Enhancer sind cis-aktive DNA-Elemente, die zur Erhöhung des Ausmaßes an Transkription auf einen Promotor einwirken. Vektoren umfassen im allgemeinen auch zusätzlich zu den selektierbaren Markern Replikationsursprünge.
Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können in die beschriebenen Vektoren zum Bereitstellen der Herstellung von Antisense-RNA in Antisense-Richtung in die Vektoren insertiert werden. Antisense-RNA oder andere Antisense-Nukleinsäuren, einschließlich Antisense-Peptidnukleinsäure (PNA), kann durch synthetische Mittel hergestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine bestimmte Nukleinsäure nicht nur die identische Nukleinsäure, sondern auch beliebige geringfügige Basenvariationen, die insbesondere aufgrund des degenerierten Codes bei konservativen Aminosäuresubstitutionen zu einem synonymen Kodon führen (ein unterschiedliches Kodon legt denselben Aminosäurerest fest), Substitutionen umfassen. Die Bezeichnung „Nukleinsäuresequenz" umfasst auch die zu einer beliebigen einzelsträngigen Sequenz im Hinblick auf Basenpaarvariationen komplementäre Sequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt auch vorteilhafterweise Oligonukleotide bereit, die mindestens 10 aufeinander folgende Nukleotide einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung und bevorzugt 10 bis 40 aufeinander folgende Nukleotide einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung umfassen. Diese Oligonukleotide können vorteilhafterweise als Sonden oder Primer zum Starten von Replikation oder dergleichen verwendet werden. Oligonukleotide mit einer bestimmten Sequenz können gemäß im Fachbereich wohl bekannten Methoden hergestellt werden, wie zum Beispiel durch rekombinante oder synthetische Mittel. Sie können auch in diagnostischen Kits oder dergleichen zum Nachweisen des Vorliegens einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung verwendet werden. Diese Tests umfassen im Allgemeinen das Inkontaktbringen der Sonde mit der Probe unter Hybridisierungsbedingungen und das Nachweisen des Vorliegens einer Duplex- oder Tripelxbildung zwischen der Sonde und einer beliebigen Nukleinsäure in der Probe.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Sonden mit einem festen Träger verankert sein. Bevorzugt liegen sie auf einem Array vor, so dass mehrere Sonden gleichzeitig mit einer einzelnen biologischen Probe hybridisieren. Die Sonden können auf den Array punktförmig aufgetragen oder in situ auf dem Array synthetisiert werden. (Siehe Lockhart et al., Nature Biotechnology, Bd. 14, Dezember 1996 „Expression monitoring by hybridisation to high density oligonucleotide arrays".
Die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung können unter Verwendung von rekombinanten oder synthetischen Methoden hergestellt werden, wie zum Beispiel unter Verwendung von PCR, welche im Allgemeinen das Bilden eines Primerpaars mit sich bringt, welche etwa 10 bis 50 Nukleotide von einer Region des Gens entfernt sein können, welche wünschenswerterweise zu klonieren ist, Inkontaktbringen der Primer mit cDNA oder genomischer DNA aus einer humanen Zelle, Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, welche Amplifizierung der gewünschten Region bewirkt, Isolieren der amplifizierten Region oder des Fragmentes und Gewinnen der amplifizierten DNA. Im Allgemeinen sind solche Methoden im Fachbereich wohlbekannt, wie zum Beispiel in Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989) beschrieben.
Die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide gemäß der Erfindung können eine erkennbare Markierung tragen. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope wie zum Beispiel ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie zum Beispiel Biotin oder Fluoreszenzmarker. Solche Markierungen können zu den Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden der Erfindung hinzugefügt werden und können unter Verwendung von per se bekannten Methoden nachgewiesen werden.
Vorteilhafterweise können humane Allelvarianten oder Polymorphismen der Nukleinsäure gemäß der Erfindung zum Beispiel durch Sondieren von cDNA oder genomischen Bibliotheken aus einer Auswahl von Individuen, zum Beispiel aus unterschiedlichen Populationen, identifiziert werden. Darüber hinaus können Nukleinsäuren und Sonden gemäß der Erfindung zur Sequenzierung von genomischer DNA aus Patienten unter Verwendung von im Fachbereich wohlbekannten Methoden verwendet werden, wie zum Beispiel dem Sanger-Dideoxy-Kettenabbruchverfahren, welches vorteilhafterweise eine beliebige Prädisposition eines Patienten für Erkrankungen feststellen kann, die mit Varianten des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in Zusammenhang stehen.
Die hierin gemäß der Erfindung identifizierten Nukleotidsequenzen können als Reagens in vielfältiger Art und Weise verwendet werden. Die vorliegende Beschreibung soll lediglich beispielhaft sein und verwendet bekannte Methoden. Daher besteht ein fortlaufender Bedarf zur Identifizierung neuer Chromosomenmarker, da gegenwärtig wenige Chromosomen-markierende Reagenzien auf Grundlage von aktuellen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorphismen) verfügbar sind. Die FOXP1-Sequenz ist auf Chromosom 3 kartiert. Daher können Nukleotidsequenzen, die für FOXP1 kodieren, in einer Kopplungsanalyse als Marker für Chromosom 3 verwendet werden. Die Sequenz ist auf eine bestimmte Region zwischen Markern D351261–D351604 des Chromosoms unter Verwendung von wohlbekannten Methoden kartiert worden. Diese umfassen in situ-Hybridisierung mit Chromosomenregionen, „Flow-Sorted" chromosomale Präparationen oder künstliche Chromosomenkonstruktionen, wie zum Beispiel künstliche Hefechromosomen, künstliche Bakterienchromosomen, bakterielle P1-Konstruktionen oder einzelne Chromosomen-cDNA-Bibliotheken, wie in Price (Blood Rev. 7 (1993), 127–134) und Trask (Trends Genet. 7 (1991), 149–154) zusammengefasst. Die Methode der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung von Chromosomenregionen ist unter anderem in Verma, (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NY, beschrieben worden. Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung von Chromosomenpräparationen und anderen physikalischen Chromosomenkartierungsmethoden kann mit zusätzlichen Genkartendaten in Beziehung gesetzt werden. Beispiele von Genkartendaten können dem Fachbereich entnommen werden. Die Beziehung zwischen der Position des Gens, welches für ein FOXP1-Polypeptid kodiert, auf einer physikalischen Chromosomenmappe mit einem spezifischen Merkmal, z.B. eine Erkrankung, die mit der Dysfunktion des Gens in Beziehung steht, kann zum Einschränken der DNA-Region beitragen, die mit diesem Merkmal in Zusammenhang steht. Die Nukleotidsequenzen der betreffenden Erfindung können zum Nachweisen von Unterschieden in Gensequenzen zwischen normalen, Träger- oder erkrankten Individuen verwendet werden. Darüber hinaus können die hierin beschriebenen Mittel und Verfahren zur Marker-unterstützten Tierzüchtung verwendet werden.
In situ-Hybridisierung von chromosomalen Präparationen und physikalische Kartierungsmethoden, wie zum Beispiel Kopplungsanalyse unter Verwendung von bekannten Chromosomenmarkern, kann zum Erweitern der Genkarten verwendet werden. Zum Beispiel wurde kürzlich eine Karte des humanen Genoms auf Grundlage einer Sequenz-markierten Stelle vom Whitehead-MIT Center for Genomic Research (Hudson, Science 270 (1995), 1945–1954) veröffentlicht und ist auch im Internet verfügbar. Häufig kann die Position eines Gens auf dem Chromosom einer anderen Art miteinander zusammenhängende Marker deutlich machen, sogar wenn die Anzahl oder der Arm eines bestimmten Chromosoms nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können chromosomalen Armen oder Teilen davon durch physikalische Kartierung zugeordnet werden. Dies stellt wertvolle Information für Forscher bereit, die unter Verwendung von Positionsklonierung oder anderen Genentdeckungsmethoden nach in Wechselwirkung stehenden Genen forschen. Sobald ein solches Gen durch genetische Kopplung mit einer bestimmten genomischen Region grob lokalisiert worden ist, können beliebige Sequenzen, die in diesem Bereich kartiert sind, assoziierte oder regulatorische Gene zur weiteren Untersuchung darstellen. Die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung kann auch zum Nachweisen von Unterschieden in der chromosomalen Position aufgrund von Translokation, Inversion etc. unter normalen, Träger- oder erkrankten Individuen verwendet werden.
Zusammengefasst können Sequenzen auf Chromosomen durch Herstellung von PCR-Primern (bevorzugt 15–25 bp) der Sequenzen, die in einer der 2, 3A, 4A oder 4C gezeigt sind, kartiert werden. Primer können unter Verwendung von Computeranalyse so ausgewählt werden, dass die Primer sich nicht mehr als über ein vorhergesagtes Exon in der genomischen DNA erstrecken. Diese Primer werden anschließend zum Durchmustern von somatischen Zellhybriden, die einzelne humane Chromosome enthalten, mittels PCR verwendet. Nur diejenigen Hybride, die das humane Gen von Interesse enthalten, welches den obigen Sequenzen entspricht, ergeben ein amplifiziertes Fragment.
Auf ähnliche Art und Weise stellen somatische Hybride ein schnelles PCR-Verfahren zum Kartieren der Nukleotidsequenzen auf bestimmten Chromosomen bereit. Drei oder mehr Klone können pro Tag unter Verwendung eines einzelnen Thermocyclers zugeordnet werden. Darüber hinaus kann Sublokalisierung der Nukleotidsequenzen mit Panelen spezifischer Chromosomenfragmente erreicht werden. Andere Genkartierungsstrategien, die verwendet werden können, umfassen in situ-Hybridisierung, Prädurchmustern mit markierten „Flow-Sorted"-Chromosomen und Präselektion durch Hybridisierung zum Konstruieren von Chromosomen-spezifischen cDNA-Bibliotheken.
Genaue chromosomale Lokalisierung der Nukleotidsequenzen kann auch unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) einer chromosomalen Metaphasenregion erreicht werden. Diese Methode verwendet Nukleotidsequenzen, die 300 bis 600 Basen kurz sind; jedoch sind Nukleotidsequenzen von 1000–4000 bp bevorzugt. Für eine Übersicht dieser Methode siehe Verma et al., „Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques," Pergamon Press, New York (1988).
Zur Chromosomenkartierung können die Nukleotidsequenzen einzeln verwendet werden (zum Markieren eines einzelnen Chromosoms oder einer einzelnen Stelle auf dem Chromosom) oder in Panelen (zum Markieren mehrerer Stellen und/oder mehrerer Chromosomen).
Sobald eine Nukleotidsequenz auf einer genauen chromosomalen Position kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Nukleotidsequenz in Kopplungsanalysen verwendet werden. Kopplungsanalyse stellt gleichzeitige Vererbung zwischen einer chromosomalen Position und Präsentation einer bestimmten Erkrankung fest (Kartierungsdaten für Erkrankungen können zum Beispiel McKusick, Mendelian Inheritance in Man entnommen werden (online von Johns Hopkins University Welch Medical Library erhältlich). Unter der Annahme von 1 Megabase Kartierungsauflösung und einem Gen pro 20 kb, könnte eine cDNA, die genau auf einer chromosomalen Region, die mit der Erkrankung assoziiert ist, positioniert ist, eine von 50–500 potenziellen ursächlichen Genen sein.
Daher können Unterschiede in den Nukleotidsequenzen der Erfindung und dem entsprechenden Gen zwischen erkrankten und nicht-erkrankten Individuen untersucht werden, sobald gleichzeitige Vererbung festgestellt wird. Zunächst werden sichtbare strukturelle Veränderungen in den Chromosomen, wie zum Beispiel Deletionen oder Translokationen, in Chromosomenregionen oder mittels PCR untersucht. Wenn keine strukturellen Veränderungen bestehen, wird das Vorliegen von Punktmutationen ermittelt. Mutationen, die in einigen oder allen erkrankten Individuen, nicht jedoch in normalen Individuen beobachtet wurden, deuten darauf hin, dass die Mutation die Erkrankung verursachen kann. Zum Unterscheiden der Mutation von einem Polymorphismus ist jedoch das vollständige Sequenzieren des kodierten Polypeptids und des entsprechenden Gens von verschiedenen normalen Individuen erforderlich. Wenn ein neuer Polymorphismus identifiziert wird, kann dieses polymorphe Polypeptid zur weiteren Kopplungsanalyse verwendet werden. Allermindestens können die Nukleotidsequenzen als Molekulargewichtsmarker auf Southern-Gelen, als diagnostische Sonden für das Vorliegen einer spezifischen mRNA in einer bestimmten Zellart, als Sonde zum „Aussondern" von bekannten Sequenzen in dem Verfahren zur Entdeckung neuer Nukleotidsequenzen, zum Auswählen und Herstellen von Oligomeren, zum Anbringen an einen „Genchip" oder an einen anderen Träger, zum Erzeugen von Anti-DNA-Antikörpern unter Verwendung von DNA-Immunisierungsmethoden und als Antigen zum Auslösen einer Immunreaktion, verwendet werden.
Das Protein gemäß der Erfindung umfasst alle möglichen Aminosäurevarianten, die durch das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kodiert sind, einschließlich eines Proteins, welches von dem Molekül kodiert wird und konservative Aminosäureaustausche aufweist. Proteine oder Polypeptide gemäß der Erfindung umfassen weiterhin Varianten solcher Sequenzen, einschließlich natürlich vorkommende Allelvarianten, welche zu den Proteinen oder Polypeptiden im Wesentlichen homolog sind. In diesem Zusammenhang wird eine beträchtliche Homologie als eine Sequenz angesehen, welche mindestens 70%, bevorzugt 80 oder 90% und bevorzugt 95% Homologie mit den Proteinen oder Polypeptiden aufweist, die durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung kodiert sind. Das Protein gemäß der Erfindung kann rekombinant sein, synthetisch sein oder natürlich vorkommen, es ist jedoch bevorzugt rekombinant.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin das Hemmen der Expression der Proteine der Erfindung in vivo durch die Verwendung von Antisense-Technologie. Antisense-Technologie kann zur Kontrolle von Genexpression durch Tripel-Helixbildung von Antisense-DNA oder -RNA verwendet werden, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynukleotids an DNA oder RNA beruhen. Zum Beispiel wird der 5'-kodierende Abschnitt der maturen Proteinsequenz, welche für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, zum Entwerfen eines Antisense-RNA-Oligonukleotids, welches 10 bis 40 Basenpaare lang ist, verwendet. Das Antisense-RNA-Oligonukleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation eines mRNA-Moleküls in dem Protein (Antisense – Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Ein DNA-Oligonukleotid wird so entworfen, dass es zu einer Region des Gens, welches an der Transkription beteiligt ist, komplementär ist (Tripel-Helix – siehe Lee et al. Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991), wodurch die Transkription und die Produktion des Proteins verhindert wird.
Vom Umfang der Erfindung sind auch Hybrid- und modifizierte Formen des Proteins gemäß der Erfindung einschließlich Fusionsproteine und Fragmente umfasst. Die Hybrid- und modifizierten Formen umfassen zum Beispiel bestimmte Aminosäuren, die zum Teil Modifizierung oder Austausch unterzogen worden sind, wie zum Beispiel durch Punktmutation, und welche sogar zu einem Protein führen, welches dieselbe Funktion wie die Proteine der Erfindung aufweist.
Das oben beschriebene Antisense-Oligonukleotid kann durch Verfahren im Fachbereich so an die Zellen abgegeben werden, dass die Anti-Sense-RNA und -DNA in vivo zur Hemmung der Produktion des Proteins in der wie oben beschriebenen Art und Weise exprimiert werden kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Wirtszelle oder einen Organismus dar, der mit einem Expressionsvektor gemäß der Erfindung transformiert oder transfiziert ist. Die Wirtszelle oder der Organismus kann vorteilhafterweise in einem Verfahren zur Herstellung eines Proteins verwendet werden, wobei das Verfahren das Gewinnen eines beliebigen exprimierten Proteins aus dem Wirt oder dem Organismus umfasst, welcher mit dem Expressionsvektor transformiert oder transfiziert wurde.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist auch eine transgene Zelle, Gewebe oder Organismus bereitgestellt, der ein Transgen umfasst, das in der Lage ist, ein Protein gemäß der Erfindung zu exprimieren. Die Bezeichnung „Transgen, welches zum Exprimieren in der Lage ist", wie hierin verwendet, umfasst eine beliebige geeignete Nukleinsäuresequenz, welche zur Expression von Proteinen mit derselben Funktion und/oder Aktivität führt. Das Transgen kann zum Beispiel genomische Nukleinsäure, die aus humanen Zellen isoliert wurde, oder synthetische Nukleinsäure, einschließlich DNA, die in das Genom oder in einem extrachromosomalen Zustand integriert wurde, umfassen. Bevorzugt umfasst das Transgen die Nukleinsäuresequenz, die für die Proteine gemäß der Erfindung wie hierin beschrieben kodiert, oder ein funktionelles Fragment der Nukleinsäure. Ein funktionelles Fragment der Nukleinsäure sollte ein Fragment des Gens bedeuten, welches die Nukleinsäure umfasst, die für die Proteine gemäß der Erfindung oder für ein funktionelles Äquivalent, Derivat oder ein nicht-funktionelles Derivat wie zum Beispiel eine dominant-negative Mutante, oder Biovorläufer der Proteine kodiert.
Knock-Out-Mäuse können auch zur weiteren Untersuchung der Rolle von FOXP1 in vivo erzeugt werden. Darüber hinaus können transgene Tiere, wie zum Beispiel Mäuse, zum Überexprimieren des FOXP1-Proteins gemäß der Erfindung zur weiteren Untersuchung von dessen Rolle in vivo verwendet werden.
Das Protein, welches durch die transgene Zelle, Gewebe oder Organismus exprimiert wurde, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Biovorläufer des Proteins bildet auch einen Teil der vorliegenden Erfindung. Rekombinante Proteine können aus Wirtszellkulturen mittels im Fachbereich bekannter Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolausfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulose, Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxyapatitchromatographie und Lectinchromatographie.
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt von chemischen Syntheseverfahren sein oder durch rekombinante Methoden aus einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt hergestellt werden (zum Beispiel durch bakterielle Hefe, höhere Pflanzen, Insekten- und Säugerzellen in Kultur). In Abhängigkeit von dem in einem rekombinanten Herstellungsverfahren eingesetzten Wirt kann dem exprimierten Protein der Methioninstartrest als Folge von post-translationaler Spaltung fehlen. Proteine, welche auf diese Art und Weise modifiziert worden sind, sind ebenfalls vom Schutzbereich der Erfindung umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der in der Lage ist, an die flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteine der Erfindung oder an ein Epitop davon zu binden. Ein Antikörper gemäß der Erfindung kann gemäß dem Fachmann bekannten Standardmethoden unter Verwendung des Proteins der Erfindung oder eines Fragmentes oder eines einzelnen Epitops davon als bindendes Antigen erzeugt werden. Ein bevorzugter Antikörper ist der monoklonale Antikörper mit der Bezeichnung JC12, welcher aus einem Hybridom erhältlich ist, der gemäß den Regelungen des Budapester Vertrags von 1977 in der Europäischen Sammlung von Zellkulturen, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, UK, am 14. April 1999 unter der Accession Nr. 99041425 hinterlegt wurde.
Die vorliegende Erfindung umfasst nicht nur vollständige Antikörpermoleküle, sondern auch Fragmente davon. Antikörperfragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Methoden erzeugt werden, zum Beispiel umfassen solche Fragmente das F(ab')₂-Fragment, welches durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, welche durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente und der Fab-Fragmente erzeugt werden können, welche durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Chimäre humanisierte und vollständig humanisierte mAb können nun durch rekombinante Konstruktion hergestellt werden. Durch Hinzufügen der humanen konstanten Kette zu F(ab')₂-Fragmenten ist die Erzeugung eines humanisierten monoklonalen Antikörpers möglich, der für Immunotherapieanwendungen geeignet ist, bei welchen Patienten, die Antikörper gegen das Maus-Ig erzeugen, sonst einen Nachteil erleiden würden. Breedveld F. C. Therapeutic Monoclonal Antibodies. Lancet 2000 Feb 26; 335, S735–40.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Identifizieren eines Proteins der Erfindung in einer Probe bereit, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einem wie hierin beschriebenen Antikörper und Überwachen auf eine beliebige spezifische Bindung eines beliebigen Proteins mit dem Antikörper hin umfasst. Ein Kit zum Identifizieren des Vorliegens solcher Proteine in einer Probe, die einen Antikörper gemäß der Erfindung und Mittel zum Inkontaktbringen des Antikörpers mit der Probe umfasst, ist ebenso bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen der Expression eines Proteins bereit, welches ein flügelförmiges Helixmotiv und ein Cys₂-His₂-Zinkfingermotiv in einem Säugersubjekt umfasst, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe von Gewebe oder Zellen, die aus dem Säugersubjekt entnommen wurden, mit einem Antikörper umfasst, welcher in der Lage ist, an das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein der Erfindung oder ein Epitop davon zu binden, und Nachweisen der spezifischen Bindung des Antikörpers an dessen Zielprotein in dem Gewebe.
Bevorzugt wird das Verfahren der Erfindung an Zellen oder Geweben durchgeführt, welche einem menschlichen Subjekt entnommen wurden. Es liegt jedoch auch innerhalb des Umfangs der Erfindung, das Verfahren an Zellen oder Geweben durchzuführen, die aus nicht-humanen Säugern entfernt wurden, wie zum Beispiel aus Maus oder Affe unter Verwendung eines Antikörpers, welcher gegenüber einem homologen Protein, das in den nicht-humanen Säugerarten exprimiert wird, kreuzreaktiv ist.
Wie in Beispiel 2 unten gezeigt, kann Immunanfärbung mit einem Antikörper, der für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein spezifisch ist, wie zum Beispiel mit dem hierin beschriebenen monoklonalen Antikörper JC12, zum Nachweisen der Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in Proben von normalen und neoplastischen humanen Geweben verwendet werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens konnte gezeigt werden, dass das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein zunächst durch die Mehrheit der hämatopoietischen Tumore, einschließlich vieler Lymphome (die sowohl aus B-Zellen als auch aus T-Zellen stammen) und auch durch einige Karzinome exprimiert wird.
Interessanterweise wurde beobachtet, dass die sub-zelluläre Lokalisierung des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins (FOXP1) in unterschiedlichen Zellarten unterschiedlich ist. Wie in den hierin beigefügten Beispielen gezeigt, war die Anfärbung der drei diffusen großen B-Zell-Lymphome von anaplastischer Morphologie mit dem monoklonalen JC12-Antikörper stärker zytoplasmatisch als in anderen Fällen von diffusen großen B-Zell-Lymphomen beobachtet wurde, bei welchen die Anfärbung nahezu ausschließlich den Zellkern betraf. Jedoch wies die Expression dieses Proteins in nicht-hämatologischen Malignomen, die wiederum durch immunohistochemische Anfärbung mit monoklonalem JC12-Antikörper identifiziert wurde, ein stark unterschiedliches Expressionsmuster auf, wobei häufig eine wesentliche Abnahme an Expression oder ein wesentlicher Expressionsverlust in dem Zellkern beobachtet wurde oder alternativ Expression nur in dem Zytoplasma auftrat.
Anfärbung von Geweben mit einem Antikörper, welcher für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein immunologisch spezifisch ist, kann daher sowohl zur Diagnose von Lymphomen und Karzinomen und ebenso zum Unterscheiden zwischen unterschiedlichen Unterarten von diffusen großen B-Zell-Lymphomen und unterschiedlichen Unterarten von Mantelzelllymphomen geeignet sein. Letzteres kann sowohl zum Beurteilen der Prognose von Patienten mit diesen Lymphomen als auch zum Auswählen eines geeigneten Behandlungsablaufes von Bedeutung sein. Darüber hinaus kann die Expressionsmenge des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins mit dem Stadium des Tumors, d.h. wie aggressiv der Tumor ist, in Beziehung gesetzt werden. Die Bewertung der Expressionsmenge durch Anfärbung von Gewebeschnitten unter Verwendung eines Antikörpers, der für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein spezifisch ist, kann daher auch Folgen für die Prognose haben. Sowohl bei Magen- als auch bei Dickdarmtumoren ist die Veränderung der JC12-Anfärbung, welche zwischen normalen und malignen Zellen beobachtet wird, bei prämalignen Läsionen nachweisbar.
Immunanfärbung mit dem Antikörper, der für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein spezifisch ist, kann diagnostisch zum Identifizieren von frühen Veränderungen in Zellen geeignet sein, welche auftreten, bevor sie bösartig sind. Der Antikörper kann daher in Durchmusterungsprogrammen zum Nachweise von prämalignen Zellen geeignet sein.
Proteine, welche mit dem Polypeptid der Erfindung in Wechselwirkung stehen, können durch Identifizierung eines Proteins identifiziert werden, welches mit dem Protein der Erfindung unter Verwendung des monoklonalen JC12-Antikörpers coimmunopräzipitiert. Alternativ können solche in Wechselwirkung stehenden Proteine durch Untersuchen von Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung des Zwei-Hybrid-Vektorsystems identifiziert werden, welches als erstes von Chien et al (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578–9582 vorgeschlagen wurde.
Diese Methode beruht auf der funktionellen Wiederherstellung eines Transkriptionsfaktors in vivo, welcher ein Reportergen aktiviert. Insbesondere umfasst die Methode das Bereitstellen einer geeigneten Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, welches ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors umfasst, der durch einen Transkriptionsfaktor mit einer DNA-Bindungsdomäne in einer aktivierenden Domäne reguliert ist, Exprimieren einer ersten Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine erste Fusion eines Fragmentes oder für eine gesamte Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung sowie entweder die DNA-Bindungsdomäne oder die Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors in der Wirtszelle kodiert, Exprimieren mindestens einer zweiten Hybrid-DNA-Sequenz in dem Wirt, wie zum Beispiel einer Bibliothek oder dergleichen, welche für mutmaßliche Bindungsproteine kodiert, die mit der DNA-Bindungs- oder aktivierenden Domäne des Transkriptionsfaktors zu untersuchen ist, welcher in die erste Fusion nicht miteinbezogen ist; Nachweisen einer beliebigen Bindung der zu untersuchenden Proteine mit einem Protein gemäß der Erfindung durch Nachweisen des Vorliegens eines beliebigen Reportergenproduktes in der Wirtszelle; ggf. Isolieren der zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für das Bindungsprotein kodieren.
Die Nukleinsäuremoleküle und die Aminosäure- oder Proteinsequenzen können vorteilhafterweise zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder alternativ zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs verwendet werden. Sie können ebenso in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem beliebigen geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel dafür enthalten sein. Das Nukleinsäuremolekül oder die Aminosäuresequenz oder das Protein können mit geeigneten Trägern in festen Arzneiformen zur oralen Verabreichung verkapselt und/oder kombiniert sein, welche im Fachbereich bekannt sind oder alternativ mit geeigneten Trägern zur Verabreichung in einem Aerosolspray.
In der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung umfassen bevorzugte Zusammensetzungen pharmazeutisch annehmbare Träger, einschließlich zum Beispiel nicht-toxische Salze, steriles Wasser oder dergleichen. Ein geeigneter Puffer kann ebenso vorliegen, der ermöglicht, dass die Zusammensetzungen unter sterilen Bedingungen vor der Wiederherstellung durch das Hinzufügen von sterilem Wasser zur anschließenden Verabreichung lyophilisiert und gelagert werden. Der Träger kann auch weitere pharmazeutisch annehmbare Vehikel zum Modifizieren anderer Bedingungen, wie zum Beispiel pH-Wert, Osmolarität, Viskosität, Sterilität, Fettlöslichkeit, Löslichkeit oder dergleichen enthalten. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche anhaltende oder verzögerte Freisetzung im Anschluss an die Verabreichung ermöglichen, können auch verwendet werden. Darüber hinaus kann das spezifische Dosierungsschema gemäß der Körperoberfläche des Patienten oder dem Volumen des Körperraums, der zu behandeln ist, in Abhängigkeit von dem bestimmten zu verwendenden Verabreichungsweg berechnet werden, wie es von einem Fachmann anerkannt ist. Die Menge der Zusammensetzung, die tatsächlich verabreicht wird, wird jedoch durch einen praktischen Arzt auf Grundlage der Umstände, die die zu behandelnde Erkrankung betreffen, wie zum Beispiel die Stärke der Symptome, das Alter, Gewicht und das Ansprechen des Individuums bestimmt.
Ebenso wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem Patienten bereitgestellt, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Menge einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung oder eines Proteins gemäß der Erfindung oder eines Antikörpers JC12 oder eines humanisierten Derivates davon an den Patienten umfasst.
Es ist kürzlich von Boussiotis, V. A., et al., 2000, Nature Medicine 6 290–297 vorgeschlagen worden, dass bestimmte pharmakologische Mittel die Expression von p^27kip1 während der Antigenerkennung hochregulieren oder dessen Abbau verhindern. Daher kann es vorteilhafterweise möglich sein, die Mengen von FOXP1 in einer Zelle zur Kontrolle der p^27kip1-Expression zu modifizieren und so die Ansprechbarkeit auf Antigen-spezifische T-Zellen zu regulieren, welche insbesondere zum Beispiel beim Verhindern der Transplantat-Wirt-Reaktion in Transplantaten geeignet ist. Daher wird ein Verfahren zum Kontrollieren der T-Zell-Ansprechbarkeit in einem Säuger bereitgestellt, wobei das Verfahren das Steigern oder Vermindern der Menge an FOXP1-Expression/-Funktion umfasst, wobei hohe Expressionsmengen von FOXP1 das Nicht-Ansprechen auf Antigen-spezifische T-Zellen in dem Individuum auslösen oder vermitteln.
Darüber hinaus, wie ausführlicher in den bereitgestellten Beispielen gezeigt ist, kann der Verlust an FOXP1-Proteinexpression in dem Zellkern funktionell mit den Beobachtungen verknüpft sein, dass Verlust von Heterozygosität auf Chromosom 3p und Abnahme an p^27kip1-Proteinexpression dafür bekannt sind, dass sie früher Ereignisse bei der Entwicklung solider Tumoren sind und mit einer schlechten Prognose in Zusammenhang stehen. Daher konnte die Analyse der FOXP1-Gensequenz oder abweichender Muster, deren mRNA oder Proteinexpression zum Entwickeln von Durchmusterungsprogrammen auf frühen Nachweis von prämalignen Läsionen in einer Auswahl von Tumorarten hin, z.B. Zervikal-, Prostata-, Magen-, Dickdarm-, Kopf- und Nacken-, Nieren-, Brust- oder Lungentumor, verwendet werden. Daher stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Diagnostizieren der medizinischen Bedeutung von prämalignen Läsionen in einem Patienten bereit, wobei das Verfahren das Nachweisen einer Veränderung des normalen Expressionsmusters oder der Funktion eines Proteins gemäß der Erfindung in dem Patienten umfasst, wobei die Veränderung des Expressionsmusters oder der Funktion des Proteins auf die Wahrscheinlichkeit hindeutet, dass sich prämaligne Läsionen des Patienten zu einem malignen Tumor entwickeln. Der Verlust der normalen Funktion kann aufgrund von Veränderungen der Expressionsmenge und/oder Sublokalisierung des FOXP1-Proteins auftreten. Das Verfahren gemäß dem Aspekt der Erfindung wird vorzugsweise zum Nachweisen von nicht-hämatologischen Malignomen und bevorzugt von Zervikal-, Brust-, Prostata-, Magen-, Dickdarm-, Kopf- und Nacken-, Nieren- und Lungenmalignomen verwendet werden. Weiterhin ist ein Verfahren zum Durchmustern nach Prädisposition für Krebs in einem Individuum bereitgestellt, wobei das Verfahren das Durchmustern auf eine vererbte genetische Mutation in einer Nukleinsäuresequenz des Individuums umfasst, die für ein Protein gemäß der Erfindung kodiert.
Methylierung als Mittel zum Kontrollieren von Genexpression wird gegenwärtig von vielen Gruppen, die an humanen Krebsarten arbeiten, untersucht. In Tumoren, welche eine methylierte, jedoch anderweitig funktionelle Kopie des Gens von Interesse beibehalten, kann die Verwendung von Methylierungsinhibitoren therapeutisch zur Wiederherstellung von Genexpression verwendet werden. Der Mangel an dem berichteten Verlust von Heterozygosität auf Chromosom 3p12–14 bei hämatologischen Malignomen deutet trotz dem häufigen Verlust von Expression des FOXP1-Proteins, welches wir bei DLBCL beobachtet haben, darauf hin, dass Methylierung dieses Gens ein Mechanismus für dessen Inaktivierung sein kann. Daher kann entweder Hyper- oder Hypo-Methylierung des FOXP1-Promotors zum diagnostischen Nachweis von Krankheitszuständen verwendet werden, die mit Veränderungen der FOXP1-Expressionsmengen in Zusammenhang stehen. Zum Beispiel konnte Methylierung des FOXP1-Promotors zum Beurteilen von neoplastischem Verlauf/neoplastischer Prognose verwendet werden. Current Topics in Microbiology and Immunology. Bd. 249: DNA Methylation and Cancer, herausgegeben von P. A. Jones und P. K. Vogt Springer-Verlag (2000) S. 170. ISBN 3-540-66608-7. Herman J. G. und Baylin S. B. Promotor-region hypermethylation and gene silencing in human cancer; Curr Top Microbiol Immunol. 2000; 249: 35–54. Momparler R. L., Bovenzi, V. DNA methylation and cancer. J Cell Physiol. 2000 May; 183 (2): 145–54; Herman, J. G. Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer. Semin Cancer Biol. 1999 Oct; 9 (5): 359–67.
Daher ist gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen von Krebs bereitgestellt, welches mit verminderten oder erhöhten Expressionsmengen eines FOXP1-Proteins gemäß der Erfindung in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das jeweilige Nachweisen von erhöhten oder verminderten Methylierungsmengen einer regulatorischen Region (Promotor) der genomischen FOXP1-DNA gemäß der Erfindung umfasst.
Darüber hinaus ist auch ein Verfahren zum Behandeln oder Lindern von Krebs bereitgestellt, welches mit verminderten Expressionsmengen des FOXP1-Proteins gemäß der Erfindung in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutischen Menge eines Methylierungsinhibitors an ein Individuum umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Nachweisen oder Diagnostizieren von Krebs in einem Individuum, welches mit erhöhten Expressionsmengen eines Proteins gemäß der Erfindung in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Untersuchen auf verminderte Methylierungsmengen einer regulatorischen Region eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein Protein gemäß der Erfindung kodiert, in einer Zelle des Individuums umfasst.
Auf ähnliche Art und Weise umfasst ein weiterer Aspekt ein Verfahren zum Behandeln einer Erkrankung oder eines Zustandes in einem Patienten, welche/welcher mit Überexpression eines FOXP1-Proteins gemäß der Erfindung in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutischen Menge eines Antisense-Moleküls gemäß der Erfindung oder eines Peptids des FOXP1-Proteins gemäß der Erfindung oder eines Antikörpers gemäß der Erfindung an ein Individuum umfasst.
Zelloberflächenmoleküle, die auf Immunotherapie abzielen, stellen in einer Vielfalt von klinischen Studien gegenwärtig eine anerkannte Methode dar. Peptidantigene, die von intrazellulären Proteinen stammen, können jedoch in Verbindung mit HLA-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden und von zytotoxischen Lymphozyten (CTLs) erkannt werden. Klinische Studien mit einigen dieser Moleküle werden laufend von Cebon, J. MacGregor, D, Scott, A. und DeBoer, R. 1997. Australas J. Dermatol. 38; S66–72 zusammengefasst. Daher können FOXP1-Peptide oder -antikörper gemäß der Erfindung vorteilhafterweise in Immuntherapie-Anwendungen verwendet werden.
Die Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf die folgenden experimentellen Beispiele zusammen mit den begleitenden Figuren verständlich, wobei:
1(A). Western-Blot von bakteriell exprimierten Proteinen unter Verwendung von monoklonalem Antikörper JC12. „Vektor" zeigt E. coli, die β-Galaktosidase aus dem 'leeren' Vektor pBK-CMV exprimiert. Andere Banden zeigen E. coli, das jeweils rekombinante Proteine aus Plasmiden pAB195–200 exprimiert. Alle sechs rekombinanten Proteine und ihre Abbauprodukte werden von dem JC12-Antikörper nach Expression in E. coli erkannt. PAB195 exprimiert das Protein mit dem höchsten Molekulargewicht, welches nach Expression in eukaryotischen Zellen durch den Antikörper erkannt wird. Molekulargewichtstandards sind links angezeigt (B). Antikörper JC12 weist ein Zellkernprotein von 85 kDa in Western-geblotteten Mandelextrakten nach.
2 zeigt die Nukleotidsequenz des Inserts pAB195 und die Aminosäuresequenz des humanen flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins, welches durch diese Sequenz kodiert wird. Proteindomänen von Interesse sind unterstrichen und markiert. NLS bezieht sich auf mutmaßliche Zellkernlokalisierungssignale, und diese Sequenzen sind mit Strichen unterstrichen. Potenzielle Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C (PKC), Caesinkinase II (CK II) und zyklische AMP-Proteinkinasen (cAMP) sind mit der Aminosäure-Erkennungsstelle in Kursivschrift angezeigt.
3A zeigt die Nukleotidsequenz von Plasmid pAB195.
3B zeigt die Nukleotidsequenz von Plasmid pAB196.
3C zeigt die entsprechende Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz von 3B kodiert wird.
4A zeigt die Nukleotidsequenz von Klon pAB199.
4B zeigt die entsprechende Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz von 4A kodiert wird.
4C zeigt die Nukleotidsequenz von Klon pAB200.
4D zeigt die entsprechende Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz von 4C kodiert wird.
5 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus dem Markieren von normalen humanen Geweben mittels Immunperoxidase für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein mit Antikörper JC12 erhalten wurden. (A) In einem routinemäßig fixierten Mandelschnitt sind die Zellkerne und das Zytoplasma einiger Zellen im Keimzentrum (GC) gefärbt, aber die umgebende Mantelschicht (MZ) ist stärker reaktiv und zeigt überwiegend ein Zellkernmuster (deutlicher in dem Abschnitt mit höherer Auflösung zu sehen). (B) In einem Cryostatschnitt von Hoden zeigen Spermatogonien zytoplasmatische Markierung (links unten von der Figur), während die Spermatozyten Markierung des Zellkerns und auch ein „kappenartiges" Muster zeigen, wie in dem vergrößerten Abschnitt gezeigt ist.
6 zeigt eine Abbildung der Ergebnisse, die durch Markieren von humanen Zelllinien mit Immunoperoxidase für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein erhalten wurden. (A) Eine Burkitt's Lymphom-B-Zelllinie (Namalwa) zeigt überwiegend Anfärbung des Zellkerns, welche in mitotischen Zellen (Pfeile) zytoplasmatisch wird. (B) Die Rhabdomyosarcom-Zelllinie Rh30 zeigt etwas zytoplasmatische Markierung zusammen mit punktierter Anfärbung des Zellkerns. Pfeile deuten auf ringkernförmige Strukturen in den Zellkernen einiger Zellen hin. (C) Heterogene Markierung von sowohl den Zellkernen als auch dem Zytoplasma in der A431-Karzinomzelllinie.
7 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die durch immunozytochemische Markierung von Tumorfällen für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein erhalten wurden. Ein Fall chronischer lymphozytischer Leukämie mit gefrorenen (A) und routinemäßig fixierten (B) Schnitten zeigt heterogene punktierte Markierung der Tumorzellen und das Fehlen von Markierung in umgebenden Zellen (Pfeile) in beiden Schnitten. Starke Markierung des Zellkerns der Tumorzellen ohne Markierung von umgebenden Zellen wird auch in Fällen von Follikellymphomen (C); Burkitt's-Lymphom beobachtet, wobei die apoptotischen Zellen ungefärbt sind (Pfeile) (D), und diffusem großem B-Zell-Lymphom (E). In Fällen von diffusem großem B-Zell-Lymphom von anaplastischer Morphologie (F & G) liegt eine beträchtliche Menge von zytoplasmatischer Markierung vor, und in einem Fall liegt die gesamte Markierung des Zellkerns in fokalen Strukturen vor, von welchen einige, wie in dem Abschnitt mit höherer Auflösung (Pfeile) gezeigt (G), ringkernförmig sind. Die Tumorzellen in einem T-Zell-Lymphom (H) zeigen auch ein punktiertes Anfärbungsmuster des Zellkerns, wobei die Kernkörperchen ungefärbt bleiben (Pfeile). (I) Ein Fall von anaplastischem großem Zelllymphom (T-Zell-Phänotyp) zeigt auch ringkernförmige Strukturen in den Zellkernen (Pfeile). (J) ein Fall von Gangkarzinom, der sowohl heterogene Zellkern- als auch zytoplasmatische Markierung der Tumorzellen zeigt. (K) Ein basales Zellkarzinom, welches starke Markierung des Zellkerns der Tumorzellen zeigt. (L) Ein Plattenepitelkarzinom, welches etwas nukleäre, jedoch überwiegend zytoplasmatische Markierung zeigt, die am deutlichsten in dem Abschnitt mit der hohen Auflösung ersichtlich ist.
8 zeigt eine schematische Abbildung des FOXP1-Proteins, welches durch das Plasmid pAB195 kodiert ist (flügelförmiges Helix-/Zinkfinger-Volllängenprotein).
9 ist ein mehrfaches Alignment von FOXP1 zusätzlich zu Proteinen mit Splice-Varianten, die durch Plasmide pAB196, pAB199 und pAB200 exprimiert werden.
10 ist eine Abbildung der aus dem Southern Blotting von FOXP1 erhaltenen Ergebnisse. 5 μg von jeder genomischen DNA-Probe wurde mit EcoRI verdaut und Southern Blotting wurde unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis, 1989.). Die FOXP1-Sonde wurde durch EcoRI-Verdau des pAB195-Plasmids hergestellt, und das 1,9 kb-Fragment wurde durch Gel gereinigt und durch zufällige Primeranlagerung mit ³²P markiert. Die genomische U2020-DNA war eine freundliche Gabe von Dr. Pamela Rabbitts (Cambridge, U.K.). U bezieht sich auf genomische DNA aus der Zelllinie U2020, C bezieht sich auf genomische DNA aus CML-Patienten und N bezieht sich auf genomische DNA aus normalen Individuen. Eine interne Rennin-Kontrollsonde wurde verwendet.
11 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus der immunohistochemischen Anfärbung von Hals-und-Nacken-Tumoren mit dem monoklonalen JC12-Antikörper erhalten wurden.
12A ist eine Abbildung der Ergebnisse, die von CLONTECH Matched Tumor/Normal Expression Array, der mit FOXP1-cDNA sondiert ist, erhalten wurden. Gewebequellen für cDNAs auf dem Array sind die folgenden: Normale Reihe A/Tumorenreihe B, Niere 1–14; normale Reihe D/Tumorenreihe E, Brust 1–9, Prostata 11–13; normale Reihe G/Tumorenreihe H, Gebärmutter 1–7, Eierstock 10–12, Cervix 14; normale Reihe J/Tumorenreihe K, Dickdarm 1–11, Lunge 13–18; normale Reihe M; Tumorenreihe N, Magen 1–8, Enddarm 10–16, Dünndarm 18. Reihe P humane Krebszelllinien: 1 HeLa, 2 Daudi, 3 K562, 4 HL-60, 5 G361, 6 A549, 7 MOLT-4, 8 SW480, 9 Raji.
12B ist eine Abbildung der Ergebnisse, die vom Clontech MTE Normal Tissue Expression Array erhalten wurden, der mit FOXP1-cDNA sondiert ist.
13 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die im Anschluss an die Transfektion von FOXP1 in COS-Zellen erhalten wurden. Plasmide pAB195, pAB196, pAB199, pAB200 oder der leere Vektor pBK-CMV wurden in COS-Zellen unter Verwendung von DEAE-Dextran transfiziert. Cytospins von transfizierten Zellen wurden hergestellt und entweder mit JC12- oder den p^27Kip1-Antikörpern wie in der Legende zu 14 beschrieben hergestellt und immungefärbt.
14 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus der immunohistochemischen Färbung der normalen Mandel und Niere erhalten wurden. In Paraffin eingebettete Schnitte von normaler Mandel und Niere wurden entweder mit JC12, dem monoklonalen Antikörper DAKO MIB-1, der 1/50 verdünnt wurde, oder den p^27Kip1-Antikörpern immungefärbt. Paraffinschnitte wurden entwachst und anschließend für 3 Minuten in DAKO^® Target Retrieval Buffer vor dem Anfärben gekocht. Anfärben wurde unter Verwendung des DAKO Envision^TM-Systems ausgeführt. Die Peroxidase-Blocklösung aus dem Kit wurde für 5 Minuten zu den Schnitten hinzugefügt und die Schnitte wurden anschließend für 2 Minuten in TBS gewaschen. Primärer Antikörper wurde zu dem Schnitt zugefügt (entweder JC12, welcher 1/80 in PBS + 10% normalem humanem Serum verdünnt wurde; DAKO p^27kip1-monoklonaler Antikörper SX53G8-Gewebekulturüberstand, oder Transduction Laboratories p^27Kip1-monoklonaler Antikörper K25020, welcher 1/500 verdünnt wurde) und in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend für 2 Minuten in TBS, vor der Inkubation mit Envision^TM HRP für 30 Minuten gewaschen. Die Schnitte wurden in TBS für 5 Minuten gewaschen und mit der chromogenen Substratlösung für 10 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin (Sigma-Gill's Nr. 3) gegengefärbt und in Aquamount (Merck/BDH) präpariert.
15 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus dem immunohistochemischen Anfärben von Brust- und Lungentumoren mit Antikörper JC12 erhalten wurden. In Paraffin eingebettete Tumorschnitte wurden, wie in der Legende zu 14 beschrieben, immungefärbt. Jede horizontale Reihe, die mit A–D markiert wurde, stellt einen einzelnen Fall dar, der entweder mit JC12- oder den p^27Kip1-Antikörpern, wie in der Figur angezeigt, angefärbt wurde.
16 ist eine Abbildung von Ergebnissen, die aus dem immunohistochemischen Anfärben von Nierentumoren und Mausmilz erhalten wurden. Zur Immunohistochemie unter Verwendung eines Mausantikörpers auf Mausgeweben wurde der InnoGenex^TM Iso-IHC-Fast Red-Kit gemäß den Herstellerangaben verwendet. Die Daten sind in der oberen rechten Ecke der Figur veranschaulicht. Die Nierentumore wurden wie in der Legende zu 14 beschrieben immungefärbt. Jede horizontale Reihe, die mit A–F markiert wurde, stellt einen individuellen Fall dar, der entweder mit JC12- oder den p^27Kip1-Antikörpern, wie in der Figur angezeigt, gefärbt wurde.
17 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus Experimenten erhalten wurden, die die Expressionsmengen von FOXP1-Protein in Pankreastumoren untersuchen.
18 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus einer Untersuchung der FOXP1-Expression von normalem Magen und von Magentumoren erhalten wurde. Zum Nachweisen der Expression des FOXP1-Proteins wurden in Paraffin eingebettete Schnitte unter Verwendung des monoklonalen JC12-Antikörpers immungefärbt. A) Links: Schwachstromfeld (ursprüngliche Vergrößerung ×40). Rechts: Starkstromfeld (ursprüngliche Vergrößerung ×200) mit Einzelheiten der unteren foveolären Auskleidung und des oberen Drüsenteils): Repräsentative normale Fundus-artige Schleimhaut, die starke zytoplasmatische und schwache bis nicht vorhandene Anfärbung des Zellkerns der foveolären Epithelauskleidung zeigt. Die Fundusdrüsen weisen eine schwache bis mäßige zytoplasmatische Anfärbung und eine schwache bis nicht vorhandene Expression im Zellkern auf (Probe aus dem normalen chirurgischen Überschuss eines Falls von frühem/intramukosalem Siegelringzellkarzinom (wie in 18L gezeigt). B) Starke Vergrößerung (×200) der foveolären Auskleidung. Zu beachten ist die mäßige bis starke Anfärbung des Zellkerns von wenigen kleinen Lymphozyten in der Lamina propria (innere positive Kontrolle). C) Links: Schwachstromfeld (×40). Rechts: Starkstromfeld (×200) mit Einzelheiten der Antrumdrüsen: Expression des FOXP1-Proteins in normaler antropylorisch-artiger Schleimhaut. Das Anfärbungsmuster der foveolären Auskleidung ist dasselbe wie in dem vorherigen Fall (A und B); die schleimabsondernden Antrumdrüsen weisen eine stärkere zytoplasmatische Expression als die Fundus-artigen Drüsen auf. Die Zellkernexpression ist dieselbe, z.B. schwach bis nicht vorhanden (Probe aus einer operativen Entfernung für PUD). D) (Ursprüngliche Vergrößerung ×200): Der Grund der Foveolae mit Metaplasie der Darmschleimhaut, die keine zytoplasmatische Anfärbung und schwache bis mäßige Zellkernexpression zeigt (normaler chirurgischer Überschuss aus einem Darm-artigen hochdifferenzierten Adenokarzinom – 18F). E) (×200): Hochdifferenzierter Adenokarzinom. Schwache Expression des FOXP1-Proteins in mehr als 50% der Zellkerne, keine zytoplasmatische Anfärbung. Linke obere Ecke: Basis von konservierten Foveolae. F) Zusammengesetztes Bild unterschiedlicher Mengen von FOXP1-Expression des Zellkerns in einem Fall von hochdifferenziertem Darm-artigen Adenokarzinom. Links: Bereich von schwacher bis nicht vorhandener Anfärbung des Zellkerns. Rechts: Mäßige Expression im Zellkern in mehr als 50% der wandständigen Zellen. G) Fokaler Bereich von starker Expression im Zellkern in einem Fall von mäßig differenziertem Darm-artigen Adenokarzinom (selber Fall wie in J). Schwache zytoplasmatische Anfärbung. H) Hochdifferenzierter Darm-artiger Adenokarzinom, schwache Expression im Zellkern und zytoplasmatische Expression. Rechte Seite: Normale Foveola (selber Fall wie E). I) Hochdifferenziertes Adenokarzinom vom Darmtyp mit starker Expression im Zellkern und schwacher zytoplasmatischer Anfärbung. J) Mäßig differenziertes Darm-artiges Adenokarzinom mit schwacher und mäßiger Expression im Zellkern in etwa 50% der Zellen und keiner zytoplasmatischen Anfärbung. K) Muzinöses hochdifferenziertes Adenokarzinom mit schwacher bis mäßiger Expression von FOXP1-Protein im Zellkern und mehr als 50% der Zellen. Schwache zytoplasmatische Anfärbung wurde in den meisten der Zellen beobachtet und Anfärbung von mäßiger Intensität in ein paar Zellen. L) (Frühes) Signet-Ringzellkarzinom der inneren Schleimhaut. Nicht vorhandene Expression im Zellkern und zytoplasmatische Expression in den Tumorzellen. M) Diffus-artiges (Signet-Ringzell)-Adenokarzinom. In den meisten der malignen Zellen schwache Expression im Zellkern. Keine zytoplasmatische Anfärbung.
19 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus der immunhistochemischen JC12-Anfärbung von DLBCL-Fällen erhalten wurden, welche dahingehend in Unterarten eingeteilt wurden, dass sie einen Phänotyp vom Keimzentrum (GC, oberste Reihe) oder einen Phänotyp vom post-germinalen Zentrum (post-GC, unterste Reihe) aufweisen.
20 veranschaulicht bei DLBCL-Fällen sowohl für das Gesamtüberleben als auch für Überleben ohne Erkrankung Kaplan-Meier Cumulative Survival Plots, welche kein FOXP1-Protein exprimieren (0,000) oder keine starke FOXP1-Expression zeigen (3,000).
21 ist eine Abbildung der Ergebnisse, die aus einer Studie über die FOXP1-Expression von normalem Dickdarm und Dickdarmtumoren erhalten wurden. Feld A) Links: Schwachstromfeld (ursprüngliche Vergrößerung ×100). Rechts: Starkstromfeld (ursprüngliche Vergrößerung ×400), das die Anfärbungsmuster der normalen Dickdarmmukosa zeigt (Kontrollfall aus einem Patienten ohne Krebs). Wir beobachteten schwache bis mäßige Anfärbung des Zellkerns von Zellen, die in dem basalen Teil der Krypten vorkommen, und schwache bis nicht vorhandene Zellkernexpression in den Zellen aus der oberen Region der Krypte in der Nähe des Oberflächenepithels. Die zytoplasmatische Anfärbung zeigte eine reziproke Verteilung mit schwacher bis nicht vorhandener zytoplasmatischer Anfärbung von Zellen in der Basis der Krypten und einer fortschreitenden Zunahme zu starker zytoplasmatischer Anfärbung von Zellen in Richtung des Oberflächenepithels hin. Feld B) Punkte (Pfeile) im Zellkern werden in wenigen Fällen innerhalb der Zellkerne der Epithelzellen aus normalen Krypten beobachtet (ursprüngliche Vergrößerung ×1000). Feld C) Normale Mucosa (chirurgischer Überschuss aus einem hochdifferenziertem Adenokarzinom mit muzinöser Differenzierung, selber Fall wie in Panel I), die starke zytoplasmatische Anfärbung des äußeren Teils der Krypten zeigt. Feld D) Zytoplasmatische, um einen Zellkern herum liegende Anfärbung (chirurgischer Überschuss aus einem Fall von hochdifferenziertem Adenokarzinom, selber Fall wie in Panel F gezeigt). Dieses Muster wurde selten beobachtet. Feld E) Wechsel (Pfeile) von normalem Epithel (links) zu neoplastischem Epithel (rechts) aus einem Tubulovillousadenom (mit Herden von in situ-Karzinomen, nicht in der Figur veranschaulicht). In diesem Fall haben wir einen Verlust von zytoplasmatischer und erhöhter Anfärbung des Zellkerns der neoplastischen Zellen beobachtet. Feld F) Hochdifferenziertes Adenokarzinom ohne Anfärbung des Zellkerns oder zytoplasmatische Anfärbung. Erwähnenswert ist der plötzliche Wechsel (Pfeile) zwischen dem normalen Epithel mit schwacher Anfärbung des Zellkerns und zytoplasmatischer Anfärbung und den negativen neoplastischen Zellen. Feld G) Hochdifferenziertes Adenokarzinom (rechts), welches schwache bis mäßige Anfärbung des Zellkerns in wenigen Zellen und schwache zytoplasmatische Anfärbung zeigt. Auf der linken Seite ist der Grund von nicht-neoplastischen Krypten mit starker Anfärbung des Zellkerns gezeigt. Feld H) Zusammengesetztes Bild eines hochdifferenzierten Adenokarzinoms mit muzinöser Differenzierung, welches die heterogene Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern von mäßiger JC12-Anfärbung des Zellkerns in den stärker differenzierten Bereichen des Tumors (oben) bis hin zu nicht vorhandener Anfärbung des Zellkerns in den weniger differenzierten Teilen (unten) zeigt. Das Zytoplasma ist nicht gefärbt. Feld I) Mäßig differenziertes Adenokarzinom: Starke Expression im Zellkern mit schwacher zytoplasmatischer Anfärbung. Feld J) Zusammengesetztes Bild: Heterogene Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern und im Zytoplasma in einem hochdifferenzierten Adenokarzinom mit muzinöser Differenzierung. Linkes Bild: Im oberen Teil des Bildes ist eine hochdifferenzierte neoplastische Schleimhaut mit schwacher bis mäßiger Anfärbung des Zellkerns und ohne zytoplasmatische Anfärbung gezeigt. Am unteren Ende befinden sich Streifen von schwach differenzierten neoplastischen Zellen mit starker zytoplasmatischer Anfärbung und ohne Anfärbung des Zellkerns. Rechtes Bild: Hochdifferenzierte neoplastische Drüse mit mäßiger Anfärbung des Zellkerns. Feld K) Schwach differenziertes Adenokarzinom: Keine Anfärbung des Zellkerns oder des Zytoplasmas in den Tumorzellen. Linke untere Ecke: Grund von nicht-neoplastischen Krypten, die schwache Anfärbung des Zellkerns zeigen.
22 ist eine Abbildung von JC12-Immunfärbung von Fällen von Mantelzelllymphomen (MCL, obere Reihe) oder der blastischen Variante von Mantelzelllymphom (MCL-blastisch, untere Reihe) zum Nachweisen der Expression des FOXP1-Proteins.
23 ist eine Abbildung von Prostata und Prostatatumoren, die mit dem monoklonalen JC12-Antikörper angefärbt sind. A) Normales Epithel zeigt vereinzelte zytoplasmatische und Anfärbung des Zellkerns der oberen Epithelzellen, welche im Allgemeinen nicht in der unteren Myoepithelschicht vorliegen. B) In einigen normalen Prostata- (und anderen Geweben) liegen vereinzelte Zellen vor, welche in dem Zytoplasma sehr stark angefärbt sind (hier im linken Feld beobachtet) und welche eine ungewöhnliche Morphologie aufweisen. Diese können zum Beispiel entweder Makrophagen oder modifizierte Epithelzellen sein. Im rechten Feld befindet sich ein Prostatatumor aus demselben Patienten, der ausschließlich Markierung des Zellkerns der Tumorzellen zeigt. C) Hyperplastisches Prostatagewebe zeigt vereinzelte positive Zellkerne. D) Normaler Ductus, der bei der Mehrheit des oberen Epithels keine Anfärbung des Zellkerns zeigt. E) Gutartige Prostata zeigt vereinzelte positive Zellkerne. F) Hyperplasie zeigt fokale zytoplasmatische Anfärbung und einige positive Zellkerne. G) Papillenhyperplasie zeigt mäßig positive Zellkerne und etwas fokale zytoplasmatische Anfärbung in dem linken Feld. Schwach differenzierter Prostatatumor aus demselben Patienten zeigt Markierung des Zellkerns der Tumorzellen (rechtes Feld). H) Das linke Feld zeigt zytoplasmatische Anfärbung des oberen Epithels in einem Ductus, welcher darunter einen in situ-Tumor aufweist, welcher nicht immungefärbt ist. Das rechte Feld zeigt einen Tumorbereich aus demselben Patienten, welcher schwächer differenziert ist und welcher überwiegend fokale zytoplasmatische Anfärbung zeigt. I) Prostatatumor mit überwiegend starker zytoplasmatischer Anfärbung des Tumors, während, wenn überhaupt, in der normalen Drüse am oberen Ende des Feldes nur schwache zytoplasmatische Anfärbung beobachtet wurde. J) Prostatatumor, welcher für JC12-Anfärbung negativ ist. K) Linkes Feld zeigt große Anhäufung von Tumorzellen, welche weitgehend negativ sind. Das rechte Feld zeigt Zellen aus demselben Tumor, welche positive Anfärbung des Zellkerns zeigen.
Tabelle 1: Reaktivität des monoklonalen JC12-Antikörpers in normalen humanen Geweben.
Tabelle 2: Zusammenfassung der Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in humanen Zelllinien.
Tabelle 3: Zusammenfassung der Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in humanen neoplastischen Zellen.
Beispiel 1 – Klonieren eines neuen flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins.
Monoklonaler Antikörper JC12 aus der Maus wurde während einer Fusion erzeugt, die zur Herstellung von Antikörpern gegen ein Peptid (NAAAESRKGQERFNC) aus dem BcIx-Gen, welches an PPD (gereinigtes Proteinderivat) gekoppelt ist, beabsichtigt war. Der JC12-Antikörper erkannte das Bc1x-Immunogen nicht oder färbte keine Zellen an, die mit der Bc1x-cDNA transfiziert wurden, wodurch bestätigt wird, dass dieser Antikörper ein nicht-identifiziertes Antigen erkannte. Man hat herausgefunden, dass das Zellkernantigen, welches durch diesen Antikörper erkannt wurde, sowohl in normalen als auch in neoplastischen humanen Geweben in großem Umfang exprimiert wird. Der Hybridom-absondernde Antikörper JC12 ist gemäß den Regeln des Budapester Vertrags von 1977 mit der Europäischen Sammlung von Zellkulturen, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, UK, am 14. April 1999 unter der Accession-Nr. 99041425 hinterlegt worden.
Die für das Antigen kodierende cDNA, welche durch den JC12-Antikörper erkannt wurde, wurde anschließend durch Expressionsklonieren identifiziert. 100 000 Klone sowohl aus einer cDNA-Bibliothek aus zirkulierendem Blut als auch aus einer cDNA-Bibliothek aus Hoden in Lambda ZAF Express (Stratagene) wurden mit monoklonalem Antikörper JC12 durchmustert. 10 000 Plaques pro 15 cm Platte wurden auf Escherichia coli-Stamm XL1 Blue MRF (Stratagene) gezüchtet und Proteinexpression auf Filtern wurde wie zuvor beschrieben induziert (Banham, A. H., Turley, H., Pulford, K., Gatter, K. und Mason, D. Y. (1997) J. Clin. Pathol. 50: 485–489.). Filter wurden in PBST (PBS + 0,05% Tween 20) für 5 Minuten abgewaschen und anschließend vor dem Blocken in PBST + 5% Marvel bei Raumtemperatur für 30 Minuten in frischem PBST für 30 Minuten gewaschen. JC12-Gewebekulturüberstand wurde anschließend in einer 1/1000-Verdünnung bei Raumtemperatur für 30 Minuten hinzugefügt. Filter wurden abgewaschen und anschließend für 10 Minuten mit PBST gewaschen. Filter wurden für 30 Minuten mit einer 1/750-Verdünnung eines Anti-Maus-Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpers der Ziege (DAKO) in PBST vor vier 15-minütigen Waschschritten in PBST inkubiert. Antigen-Antikörper-Komplexe wurden unter Verwendung von Diaminobenzidin/H₂O₂ mit Metallionenanreicherung sichtbar gemacht (Harlow, E. und Lane, D. (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Eine zweite Durchmusterung wurde zum Isolieren von einzelnen positiven Klonen durchgeführt.
Die cDNAs, die für das JC12-Antigen in Plasmid pBK-CMV kodieren, wurden in vivo aus dem Lambda ZAP Express Vector (Stratagene) unter Verwendung der Herstellerangaben ausgeschnitten, um die Plasmide pAB195–200 zu ergeben. Insgesamt wurden sechs positive Klone isoliert, wobei zwei aus der Hodenbibliothek (als pA195 und pAB199 bezeichnet) und vier aus der Blutbibliothek (als pAB196–8 und pAB200 bezeichnet) isoliert wurden.
Zur Bestätigung, dass diese cDNAs für Proteine kodierten, die durch den JC12- Antikörper erkannt wurden, wurden die durch Plasmide pAB195–200 kodierten Proteine in E. coli exprimiert. Der pBK-CMV-Vektor enthält einen bakteriellen Promotor, der die Expression der klonierten cDNA in E. coli als eine Fusion mit β-Galaktosidase im Leserahmen ermöglicht. E. coli-Stamm XLOLR (Stratagene), der entweder Plasmide pAB195–200 oder den leeren Vektor pBK-CMV enthielt, wurde über Nacht in LB-Medium gezüchtet, das (100 μg/ml) Ampicillin bei 37°C enthielt. Am nächsten Tag wurden die Kulturen 1/10 in frisches Medium verdünnt und für weitere 1,5 Stunden zum Wachsen stehengelassen. Proteinexpression wurde durch das Hinzufügen von 1 mM IPTG induziert. Nach 3 Stunden bei 37°C wurden 1 ml Proben entfernt, und die Zellpellets wurden in 100 μl SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227: 680–685). Proben wurden für zwei Minuten gekocht und auf einem 12% SDS-PAGE-Gel (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press) entlang der Regenbogenmarker mit hohem Molekulargewicht (Amersham) laufen gelassen.
Das exprimierte Protein wurde anschließend mit Antikörper JC12 Western-geblottet. Zusammengefasst wurden Proteine unter Verwendung eines Semi-Phor (Hoeffer)-Gerätes auf PVDF-Membran (Millipore) elektrophoretisch übertragen. Der Filter wurde anschließend mit unverdünntem JC12-Hybridom (Accession-Nummer 99041425)-Kulturüberstand und anschließend durch sekundäres Anti-Maus-Peroxidase-Konjugat der Ziege wie oben inkubiert. Antikörper-Antigen-Komplexe wurden unter Verwendung eines ECL-Kits (Amersham) gemäß den Herstellerangaben nachgewiesen.
Die in 1A veranschaulichten bakteriellen Expressionsdaten zeigen, dass der JC12-Antikörper keine E. coli-Proteine oder die β-Galaktosidase, die durch den leeren" Vektor pBK-CMV exprimiert wurde, erkannte. Jedoch exprimierten alle sechs der klonierten cDNAs Proteine, welche durch den JC12-Antikörper erkannt wurden, wodurch deren Identität als positive Klone bestätigt wird. Als weitere Maßnahme zum Überprüfen der Gültigkeit der Klone wurden die Plasmide in eukaryotische Zellen transfiziert und auf JC12-Antigenexpression hin unter Verwendung von Immunohistochemie angefärbt (Daten nicht gezeigt). Zusammengefasst wurden Plasmide pAB195–200 in die Fibroblastenzelllinie WOP der Maus (freundlicherweise von Dr. C. Basilico bereitgestellt) unter Verwendung des DEAE-Dextranverfahrens transfiziert (Seed, B. und Aruffo, A. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 2427–2445). Zellen wurden zur Transfektion bei 75% Konfluenz verwendet, und 5 μg Plasmid-DNA wurde für jeden 25 cm²-Kolben verwendet. Nach 3 Tagen in Kultur wurden die Zellen durch EDTA-Behandlung für immunohistochemische Anfärbung gewonnen. Nur vier der Klone pAB195–6, pAB199 und pAB200 exprimierten ein Protein, welches durch den JC12-Antikörper erkannt wurde, wenn sie eukaryotisch exprimiert wurden. Alle durch den JC12-Antikörper erkannten vier eukaryotisch exprimierten Proteine waren im Zellkern lokalisiert (obwohl das Protein, welches durch pAB196 kodiert wurde, auch zytoplasmatisch war). Proteine, die durch Plasmide pAB197 und 198 kodiert waren, wurden nicht durch den JC12-Antikörper erkannt, wenn sie in eukaryotischen Zellen exprimiert und sachgerecht weiterverarbeitet wurden, und wurden nicht weiter untersucht. Partielles DNA-Sequenzieren dieser Plasmide zeigte jedoch, dass sie cDNAs enthielten, die für das mutmaßliche abgesonderte Protein SIG11 kodierten (Accession-Nr. AF 072733).
Das cDNA-Insert in Plasmid pAB195 wurde vollständig in beide Richtungen unter Verwendung von sowohl überlappenden Restriktionsfragment-Subklonen als auch inneren Oligonukleotiden sequenziert. DNA-Sequenzieren wurde unter Verwendung von entweder M13 Universal- und Reverse-Primern oder inneren Oligonukleotiden, eines Cy5-Autoread-Sequenzierungskits und eines ALF Express DNA-Sequenzierers (Pharmacia) durchgeführt. Dieser Klon wurde ausgewählt, da er das längste cDNA-Insert enthielt und das größte Protein von etwa 89 kDa (1A) exprimierte, welches ungefähr mit dem Molekulargewicht von 85 kDa vergleichbar ist, welches für das JC12-Antigen aus einem Mandelzellkernextrakt bestimmt wurde (1B). Die verbleibenden cDNAs wurden auch anschließend vollständig in beide Richtungen sequenziert, so dass ihre Identität mit derjenigen des pAB195-Klons verglichen werden konnte.
Alle vier Plasmidklone enthielten Sequenzen aus derselben cDNA, wodurch bestätigt wurde, dass dieses Gen für das JC12-Antigen kodiert. Keiner dieser drei kleineren Klone weist jedoch eine vollständige Homologie zu der pAB195-cDNA auf. Sowohl pAB196 als auch pAB199 enthielten innere Deletionen (nt 545–772 bzw. nt 679–942 der pAB195-Sequenz, die in 2 veranschaulicht ist), welche die Folge von alternativen Splicing-Ereignissen sein kann. Sicherlich stellt die 5'-Exon-Intron-Sequenz von pAB196, die AG/gt ist, die Konsensus-Splice-Junction-Sequenz dar, und die 3'-Sequenz von ag/CA ist nahe der Konsensussequenz ag/GC für die 3'-Exon-Intron-Junction gelegen. Die Splice-Stellen in dem pAB199-Klon sind 5' TC/aa und 3' ag/AA, welche weniger üblich sind, es ist jedoch berichtet worden, dass nur 5% der Donorstellen mit der strikten Konsensussequenz übereinstimmen (Smith, C. W. J., Patton, J. G. und Nadal-Ginard, B. (1989) Ann. Rev. Genet. 23: 527–577). Die pAB200-cDNA enthielt eine 3 bp-Deletion, die Aminosäure 450 entspricht. Nukleotidsequenzen für die cDNA-Inserts von pAB196, pAB199 und pAB200 sind jeweils in 3B und 4A und 4C gezeigt.
Ein potenzieller offener Leserahmen von 677 Aminosäuren, der durch Stopkodons an beiden 5'- und 3'-Seiten begrenzt wurde, wurde durch Nukleotide 264–2294 der pAB195-cDNA-Sequenz kodiert, welche in 2 mit der unten gezeigten Aminosäuresequenz veranschaulicht ist. Es gibt zwei potenzielle Methionin-ATG-Startkodons im Leserahmen, wobei das erste sowohl in Positionen –3 als auch +4 Purine aufweist und das zweite nur ein Purin an –3 aufweist. Das zweite ATG weist jedoch eine bessere Kozak-Konsensussequenz (GCCA/GCCATGG) (Kozak, M. (1987) J. Mol. Biol. 196: 947–950) aufgrund des Auftretens von A an Position –3 und G an Position –6 auf als die erste (Kozak, M. (1987) Nuc. Acids Res. 15: 8125–8148). Die stromaufwärts gelegene nicht-kodierende Region weist einen höheren GC-reichen Gehalt als die kodierende Sequenz auf, welche häufig mit dem 5'-Ende von Genen in Zusammenhang steht. Mindestens zwei weitere flügelförmige Helix-Proteine, WIN (Yao, K.-M., Sha, M., Lu, Z. und Wong, G. G. (1997) J. Biol. Chem. 272: 19827–19836) und AF6q21 (Hillion, J., Le Coniat, M., Jonveaux, P., Berger, R. und Bernard, O. A. (1997) Blood 90: 3714–3719) beginnen auch mit zwei ATG-Kodons und verwenden beide das zweite, wodurch weiter die Hypothese bestätigt ist, dass die Translation am zweiten ATG beginnt. Interessanterweise treten die stromaufwärts gelegenen ATG-Kodons insgesamt in weniger als 10% der Vertebraten-mRNAs auf, obwohl eine bemerkenswerte Ausnahme Onkogentranskripte sind, wobei zwei Drittel davon ATG-Kodons aufweisen, welche dem Beginn des offenen Hauptleserahmens vorhergehen (Kozak, M. (1987) Nuc. Acids Res. 15: 8125–8148).
Analyse der Sequenz des Proteins, welches durch das Insert von pAB195 kodiert ist (hierin im Folgenden als das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein bezeichnet), ergab die Anwesenheit einer flügelförmigen Helixdomäne an den Aminosäurepositionen 465–548. Diese Aminosäurekoordinaten und alle Aminosäurekoordinaten, die hierin zum Beschreiben von Regionen des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins verwendet wurden, welches durch die in 2 gezeigte Nukleinsäuresequenz kodiert ist, beziehen sich auf die in 2 dargelegte Aminosäuresequenz, welche einem translatierten Proteinprodukt entspricht, welches an dem ersten (d.h. stromaufwärts gelegenen) ATG-Kodon beginnt. Es wurde herausgefunden, dass Aminosäuren 308–331 eine perfekte Übereinstimmung mit der Cys₂-His₂-Zinkfingerkonsensussequenz aufweisen, welche Cx{2,4}Cx3(L,I,V,M,F,Y,W,C)x8Hx{3,5}H darstellt.
Die Sequenz des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins wurde weiter unter Verwendung des PSORT II-Programms zum Vorhersagen des Vorliegens von subzellulären Lokalisierungsstellen analysiert. Dieses Programm identifizierte zwei potenzielle Zellkernlokalisierungssignale (NLS) innerhalb des Proteins, die PIRRYS-Sequenz bei Aminosäure 434–440 und die KRRP-Sequenz bei Aminosäure 543–546 (Nakai, K. und Kanehisa, M. (1992) Genomics 14: 897–911). Obwohl es kein definitives strukturelles Motiv für ein NLS gibt (zusammengefasst von Garcia-Bustos, J., Heitman, J. und Hall, M. N. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1071: 83–101; Jans, D. A. und Hübner, S. (1996) Physiol. Rev. 76: 651–685), sind es üblicherweise kurze Sequenzen, die gewöhnlich reich an Lysin- und Argininresten sind und häufig Prolin enthalten. Die JC12-Antikörperanfärbung, welche zeigt, dass das durch JC12 erkannte Antigen in dem Zellkern vorliegt, unterstützt die Prognose, dass das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein ein Protein des Zellkerns ist. Die KRRP-Sequenz tritt am Ende des zweiten Flügels der Forkhead-Domäne in einer Region auf, von welcher gezeigt worden ist, dass sie in anderen Familienmitgliedern, z.B. HNF-3, für ein NLS kodiert (Qian, X. und Costa, R. H. (1995) Nuc. Acids Res. 23: 1184–1191). Obwohl die zweite NLS in vielen anderen flügelförmigen Helixgenen in Helix Eins der Forkhead-Domäne vorkommt (Qian, X. und Costa, R. H. (1995) Nuc. Acids Res. 23: 1184–1191), ist diese Region in dem neuen flügelförmigen Helix-/Zinkfingerprotein nicht konserviert und es wird prognostiziert, dass das NLS stromaufwärts dieser Domäne vorliegt, wie es für das FKHL15 flügelförmige Helixgen vorhergesagt wurde (Chadwick, B. P., Obermayr, F. und Frischauf, A.-M. (1997) Genomics 41: 390–396).
Das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein enthält auch Regionen, welche in vielen transkriptionellen Aktivatoren vorkommen, die an Genexpression beteiligt sind. Diese Aktivierungsdomänen können auf Grundlage ihres Aminosäuregehalts, einschließlich Glutamin-, saure, Prolin-, Serin- und Threonin-reiche Domänen kopiert werden. Es ist sowohl mittels in vitro- als auch in vivo-Assays gezeigt worden, dass diese Domänen durch Wechselwirkung mit der basalen Transkriptionsmaschinerie wirksam sind (Truant, R., Xiao, H., Ingles, C. J. und Greenblatt, J. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2284–2287; Xiao, N., Pearson, A., Coulombe, B., Truant, R., Zhang, S., Regier, J. L., Triezenberg, S. J., Reinberg, D., Flores, O. und Ingles, C. J. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7013–7024). Der N-Terminus des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins enthält zwei Glutamin-reiche Domänen zwischen AS 55–77 und AS 110–194, die 65% bzw. 49% Glutaminreste und eine 52% Serin-/Threonin-reiche Region zwischen AS 244–268 enthalten. Während der C-Terminus zwei Serin-/Threonin-/Prolin-reiche Regionen AS 387–431 und AS 613–626 enthält, die 60% bzw. 57% S/T/P-Reste enthalten, sowie eine saure Domäne an dem äußersten C-Terminus AS 637–677, die 39% Aspartat- und Glutamatreste enthalten. Bedeutsamerweise enthalten beide Glutamin-reichen Regionen angrenzend sperrige hydrophobe Gruppen, von welchen gezeigt worden ist, dass sie in anderen Proteinen, z.B. Sp1 (Gill, G., Pascal, E., Tseng, Z. H. und Tijian, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 192–196) und Oct-2 (Tanaka, M. und Herr, W. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 6056–6067) für die Funktion dieser Transaktivierungsdomänen wichtig sind. Das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein enthält auch zwei potenzielle PEST-Sequenzen in dessen C-Terminus (AS 612–623 und 636–656), wie durch das PEST Find Program, welches von Rechsteiner, M. C., und Rogers, S. W. PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem. Sci., 1996. 21: S. 267–271, vorhergesagt wurde. Diese Regionen sind reich an Prolin-, Glutamat-, Serin- und Threoninresten, sie sind 12–60 Aminosäuren lang und werden oft von geladenen Resten flankiert. Funktionell sind sie dafür bekannt, dass sie schnellen Proteinabbau von Enzymen, Transkriptionsfaktoren und Komponenten des Rezeptorsignalwegs vermitteln, zum Beispiel vermitteln sie Proteinabbau bei Sofort-Früh-Reaktionen von AP-1-Transkriptionsfaktoren (Rechsteiner, M. und Rogers, S. W. (1996) Trends Biochem. Sci. 21: 267–271.) Eine Überlappung zwischen sauren Aktivierungsdomänen und Zerstörungselementen ist für andere unstabile Transkriptionsfaktoren, die durch Ubiquitin-vermittelte Proteolyse zerstört werden, beschrieben worden (Salgetti, S. E., Muratani, M., W. Jnen H., Futcher, B., Tansey, W. P., 2000 PNAS 97 3118–23). Daher konnte die Hemmung des Proteosoms zum Hochregulieren von FOXP1-Mengen verwendet werden.
Ein weiteres interessantes Merkmal des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins stellt die Prognose dar, dass es zwei Regionen zwischen AS 124–155 und AS 344–369 gibt, welche das Potenzial zur Bildung von ungeordneten Knäuels aufweisen (Lupas, A., Van Dyke, M. und Stock, J. (1991) Science 252: 1162–1164). Diese Motive sind für eine große Auswahl von Transkriptionsfaktoren (und andere Proteine) wichtig, bei welchen sie Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln und als Dimerisierungsmotive fungieren (zusammengefasst in Baxevanis, A. D. und Vinson, C. R. (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 278–285). Die ungeordneten Knäuelmotive, die in diesen flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteinen identifiziert wurden, sind für die flügelförmige Helixfamilie im Allgemeinen nicht charakteristisch, da unsere Analyse eine Vielzahl von anderen flügelförmigen Helixproteinen (HNF-3α, Genesis, FKHRLI, FREAC-1 und HFH-4) nicht das Vorliegen dieser Motive vorhersagte.
Analyse der FOXP1-Sequenz bringt dieses Protein auch mit dem Zellzyklus in Verbindung. Die vorliegenden Erfinder haben innerhalb des FOXP1-Proteins zwei potenzielle cdk-Phosphorylierungsstellen identifiziert (beginnend bei AS 83 bzw. 481). Diese bestehen aus einer Serin/Threonin-Prolin (S/T-P)-Phosphorakzeptorstelle und einer Bevorzugung für einen basischen Rest an Position +3 (an welchen S/T Position 0 ist). Zhang, J., R. J. Sanchez, S. Wang, C. Guarnaccia, A. Tossi, S. Zahariev, und S. Pongor. Biophys., 1994. 315: S. 415–424; Srinivasan, J., M. Koszelak, M. Mendelow, Y.-G. Kwon, und D. S. Lawrence. Biochem. J., 1995. 309: S. 927–931). Physikalischer Zusammenhang zur cdk-Kinase kann auch beim Begründen von Substratspezifität eine Rolle spielen, und Cyclin-cdk2-Komplexe binden stabil an eine Vielzahl von regulatorischen Proteinen des Zellzyklus. Die ZRXL- Sequenz (bei welcher Z und X üblicherweise basisch sind), einschließlich E2F1, p107 und p21, ist bei einer Vielzahl dieser Proteine als das Cyclin-cdk2-Bindungsmotiv identifiziert worden (Zhu, L., E. Harlow, und B. D., Genes Dev., 1995. 9: S. 1740–1752; Adams, P. D., W. R. Sellers, S. K. Sharma, A. D. Wu, C. M. Nalin, und W. G. Kaelin Jr. Mol. Cell. Biol., 1996. 16: S. 6623–6633; Schulman, B., D. Lindstrom, und E. Harlow. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. 95: S. 10453–10458. Sowohl in p45/Skp2 als auch in pRB wird die Sequenz KXL anstelle von RXL verwendet (Lisztwan, J., A. Marti, H. Sutterluty, M. Gstaiger, C. Wirbelauer, und W. EMBO J., 1998. 17: S. 368–383; Adams, P. D., X. Li, W. R. Sellers, K. B. Baker, X. Leng, J. W. Harper, Y. Taya, und W. G. Kaelin Jr. Mol. Cell. Biol., 1999. 19: S. 1068–1080). Die Erfinder haben das Vorliegen von sowohl potenziellen RXL- als auch KXL-Motiven innerhalb der FOXP1-Proteinsequenz identifiziert, welche bei AS 66, 325 bzw. 484 startet. Diese Daten legen einen Mechanismus nahe, über den bisher nicht berichtet wurde, bei welchem flügelförmige Helixtranskriptionsfaktoren eine Rolle spielen können, die mit dem Zellzyklus in Beziehung stehen.
Wie zuvor erwähnt, identifizierte das Sequenzieren der zusätzlichen cDNAs, die während des Expressionsklonierens unter Verwendung von JC12 isoliert wurden, zwei Varianten von cDNAs (pAB196 und pAB199), welche möglicherweise die Folge von alternativem Splicen sind. Diese Varianten kodieren für Proteine mit Deletionen im Leserahmen im N-Terminus des Proteins.
Eine Anzahl von Proteinen mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten wird im Allgemeinen durch alternatives Splicen aus einem einzelnen Gen erzeugt, und Splice-Varianten für eine Vielzahl von anderen flügelförmigen Helixgenen sind auch identifiziert worden (Cockell, M., D. Stolarczyk, S. Frutiger, G. J. Hughes, O. Hagenbüchle, und Wellauer P. K. Mol. Cell. Biol., 1995. 15: S. 1933–1941; Ye, H., T. F. Kelly, U. Samadani, L. Lim, S. Rubio, D. G. Overdier, K. A. Roebuck, und R. H. Costa. Mol. Cell. Biol., 1997. 17: S. 1626–1641; Yang, Q., R. Bassel-Duby, und R. S. Mol. Cell. Biol., 1997. 17: S. 5236–5243).
Beiden Varianten fehlt das N-terminale ungeordnete Knäuel und ein großer Anteil der gesamten zweiten Glutamin-reichen Domänen. Diese Regionen können zum Vermitteln von entweder Protein-Protein-Wechselwirkungen bzw. transkriptioneller Aktivierung funktionell von Bedeutung sein, so dass es möglich ist, dass sich diese Deletionsvarianten funktionell von dem Volllängenprotein unterscheiden. Bei Transfektion in COS-Zellen weist das FOXP1-Protein, welches durch Plasmid pAB196 exprimiert wurde, eine weitgehende zytoplasmatische Lokalisierung auf (13). Diese Splicevariante stellt einen potenziellen Mechanismus zur zytoplasmatischen Expression des FOXP1-Proteins bereit. Vorläufige Experimente, die die transkriptionelle Aktivität unterschiedlicher Regionen des FOXP1-Proteins untersuchen, legen nahe, dass die N-terminate Glutamin-reiche Domäne funktionell Transkription unterdrücken kann. Die folgenden Plasmide wurden zum Fusionieren von Abschnitten des FOXP1-Gens mit der Hefe-GAL4-DNA-Bindungsdomäne konstruiert. PAB373; 482 bp PvuII-SmaI-Fragment aus pAB195, welches für AS 50–210 kodiert, wurde in den Vektor p13H kloniert, der mit SmaI geschnitten wurde. pAB34; das 500 bp EcoRI-XhoI-Fragment aus pAB195, welches für AS 540–677 kodiert, wurde in den Vektor p13H kloniert, der mit EcoRI und SalI geschnitten wurde. pAB375; das 1,99 kb PvuII-XhoI-Fragment, welches für AS 50–677 kodiert, wurde in den Vektor p13H kloniert, der mit SmaI und SalI geschnitten wurde. Diese Plasmide und der p12H-Vektor wurden anschließend in Saccharomyces cerevisiae-Stämme GGY1 transformiert: 171, SS19-8 oder SS38-G4, und die Fähigkeit der exprimierten GAL4-FOXP1-Fusionsproteine, die Transkription des β-Galaktosidase-Reportergens in diesen Stämmen entweder zu aktivieren oder zu unterdrücken, wurde durch Ausstreichen der Transformanten auf X-Gal-Platten beurteilt. Die Theorie hinter dieser Methode, die Methodik, der p13H-Vektor und die Hefezelllinien sind in Asante-Owuso et al. 1996. Gene 172: 25–31 beschrieben. Die Ergebnisse des Rohplatten-Assays zeigten an, dass keines der Plasmide β-Galaktosidaseexpression aktivierte, wenn sie in die GGY1:171-Zelllinie transformiert wurden, während Plasmid pAB373 scheinbar teilweise die konstitutive Expression von β-Galaktosidase unterdrückte, wenn es in Stämme SS19-8 oder SS38-G4 transformiert wurde, wie durch eine leicht blaue Farbe auf X-Gal-Platten angezeigt. Diese Daten sind vorläufig und müssen durch einen genauen Enyzmassay von β-Galaktosidaseaktivität in den transformierten Zellen bestätigt werden. Unsere Daten legen jedoch nahe, dass die N-terminale Region des FOXP1-Proteins zwischen AS 50–210 eine funktionelle Domäne enthalten kann, die in der Lage ist, Transkription zu unterdrücken. Die varianten FOXP1-Proteine, die durch pAB196 und pAB199 kodiert wurden, weisen keine Abschnitte dieser Region auf, welche die Fähigkeit dieser Proteine zum Unterdrücken der Transkription von FOXP1-Zielgenen verändern oder verhindern können. In dem C-Terminus des pAB200-Proteins ist die Aminosäure 450 des FOXP1-Proteins deletiert. Diese Aminosäure ist Teil einer Konsensus-Stelle für CK2-Phosphorylierung innerhalb des Proteins und es ist möglich, dass diese Deletion das Verhalten dieser Form des Proteins in Reaktion auf Proteinkinase-Regulation im Vergleich zu denjenigen, welche diese Phosphorylierungsstelle beibehalten, verändern kann. Es ist daher möglich, dass sich alle diese Proteine (wenn in vivo translatiert) in ihrer (ihren) Funktionen) des Volllängenproteins unterscheiden.
Beispiel 2-Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in normalen Geweben, humanen Zelllinien und neoplastischen Geweben
(1) Präparation von Geweben und Zelllinien.
Aus der Histopathologieabteilung des John Radcliffe-Krankenhauses erhaltene Gewebe wurden sofort in flüssigem Stickstoff schnell gefroren und bei –70°C gelagert. Humane Zelllinien wurden entweder von der Sir William Dunn School of Pathology, Oxford oder der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten, während die JOK-1-Zelllinie eine freundliche Gabe von Dr. Leif Anderson war. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, das 10% fötales Kälberserum (GIBCO Biocult Ltd) enthielt, bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert.
Cryostatgewebeschnitte (5–8 μm) auf Glasobjekträgern wurden über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet, in Aceton für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und anschließend gelagert, und bei –20°C vor der Verwendung in Aluminiumfolie eingewickelt. Formalin-fixierte, in Paraffinwachs eingebettete Schnitte wurden zu etwa 5 μm geschnitten und auf Superfrost Plus-Glasobjektträgern (Speci-microsystems) gesammelt. Cytozentrifugenpräparationen von Zelllinien wurden wie zuvor beschrieben präpariert (Erber, W. N., A. J., Pinching, und D. Y. Mason, 1984. Lancet 1: 1024–1046) und anschließend bei –20°C vor der Verwendung in Aluminiumfolie eingewickelt gelagert.
(2) Zwei-Schritt-Immunoperoxidase-Anfärbung von Zelllinien
Cytozentrifugen-Zellpräparationen wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur in Aceton fixiert, und vor der Inkubation mit dem primären Antikörper für 30 Minuten luftgetrocknet. Die Schnitte wurden anschließend in PBS gewaschen, mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Maus-sekundärem Antikörper der Ziege (DAKO, Kopenhagen, Dänemark) inkubiert, wiederum gewaschen und anschließend unter Verwendung von Diaminobenzidin/H₂O₂ entwickelt. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und in Aquamount (Merk Ltd, Poole, U.K.) präpariert.
(3) Immunfärbung von Gewebeschnitten.
Anfärben wurde unter Verwendung des DAKO Envision^TM-Systems ausgeführt. Die Peroxidase-Blocklösung aus dem Kit wurde für 5 Minuten zu den Schnitten hinzugefügt, und die Schnitte wurden anschließend für 2 Minuten in TBS oder PBS gewaschen, diese Schritte wurden jedoch ausgelassen, wenn Cryostatschnitte markiert wurden. Antikörper-JC12, welcher 1/80 in PBS verdünnt wurde, wurde zu dem Schnitt hinzugefügt und in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend für zwei Minuten vor der Inkubation mit Envision^TM-HRP für 30 Minuten gewaschen. Die Schnitte wurden für 5 Minuten in TBS gewaschen und mit der chromogenen Substratlösung für 10 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxolin (Sigma-Gills Nr. 3) gegengefärbt und in Aquamount (Merck/BDH) präpariert.
Ergebnisse.
Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in normalen Geweben.
Die Verteilung des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins wurde durch immunozytochemische Markierung von gefrorenen und in Paraffin eingebetteten Geweben unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers JC12 analysiert. Es wurde herausgefunden, dass das Protein in großem Umfang exprimiert wird, wobei die Verteilung überwiegend im Zellkern, sowie in normalen Geweben einschließlich Mandel (5A), Milz, Blut, Thymus, Hoden, Niere, Leber, Dickdarm, Kleinhirn, Haut und Eierstock vorkam. Zytoplasmatische Markierung wurde jedoch auch in einigen Zellen beobachtet, insbesondere in Epithelgeweben, Lungenmakrophagen und in Spermatogonien in den Hoden (5B). In der letzteren Gewebeart zeigten die Spermatozytenzellkerne für das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein auch ein ungewöhnliches „kappenartiges" Muster der Immunfärbung (5B).
Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in humanen Zelllinien.
Das Protein kam in allen untersuchten Zelllinien vor (Tabelle 1), wobei es in normalen Geweben seine breite Verteilung beibehielt. Die intrazelluläre Lokalisierung des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins lag in hämatopoietischen Zelllinien überwiegend im Zellkern vor (6A) und in einigen Zelllinien, z.B. der Rhabdomyosarcom-Zelllinie Rh30 (6B), wobei diese Immunfärbung intranukleäre Strukturen identifizierte, von welchen einige Ring-artig oder ringkernförmig waren. Zytoplasmatische Anfärbung, welche im Allgemeinen schwächer war, wurde auch in den meisten Zelllinien beobachtet. In Epithelzelllinien, wie zum Beispiel A431 (6C), wurde sowohl starke Anfärbung des Zellkerns als auch des Zytoplasmas beobachtet, welche in ihrer Intensität von Zelle zu Zelle variierte. Zytoplasmatische Markierung in diesen Zellen (6C) war beträchtlich stärker als in den hämatopoietischen Zelllinien.
Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins in neoplastischen Geweben.
Das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein wurde von nahezu allen hämatopoietischen Malignomen exprimiert (Tabelle 2), obwohl sowohl die Intensität als auch das Ausmaß der Zell-zu-Zell-Heterogenität der Expression von Fall zu Fall variierte. In nur zwei von fünf Fällen waren jedoch die Tumorzellen der Lymphozyt-prädominanten Hodgkin-Erkrankung in Bezug auf das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein immungefärbt (und Zellkernexpression des Proteins in den umgebenden reaktiven Lymphozyten bestätigte, dass dies keine falsch-negative Reaktion war).
Sowohl gefrorene (7A) als auch routinemäßig fixierte (7B) Schnitte der meisten Tumoren (insbesondere derjenigen mit starker Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins im Zellkern), die reaktive lymphoide Zellen umgeben, waren im Hinblick auf das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein nahezu negativ, und schwächer angefärbt als diese Zellen in normalen Geweben. Starke Expression des flügelförmigen Helix-/Zinkfingerproteins von den malignen Zellen im Zellkern wurde in einer Reihe von anderen B-Zell-Tumoren einschließlich großfollikulärem Lymphom (7C), Burkitt's Lymphom (7D) und diffusem großem B-Zell-Lymphom (7E) beobachtet.
Die Anfärbung von drei diffusen großen B-Zell-Lymphomen von anaplastischer Morphologie war stärker zytoplasmatisch (7F & G) als in anderen Fällen von diffusen großen B-Zell-Lymphomen beobachtet, in welchen Anfärbung nahezu ausschließlich im Zellkern vorkam (7E). In einem dieser drei Fälle (7G), war die Anfärbung des Zellkerns ausschließlich fokal, und die ringkernförmigen Strukturen, die in einigen Zelllinien und in einigen T-Zell-ALCLs (7I) gesehen wurden, wurden beobachtet. Das flügelförmige Helix-/Zinkfingerprotein wurde auch von anderen T-Zell-Lymphomen stark exprimiert (7H), wobei sowohl zytoplasmatische als auch Markierung des Zellkerns beobachtet werden konnte.
Lokalisierung des FOXP1-Gens auf der Genomischen Karte
Der TIGR-Genindex enthielt einen theoretischen Klon THC300432, welcher dem 3'-Ende des FOXP1-cDNA-Klons pAB195 (Nukleotide 1023–2338) der Sequenz gemäß 2 entspricht). Der theoretische Klon THC353343 des entgegengesetzten Endes lagerte sich nicht an einen beliebigen der FOXP1-cDNA-Klone an. Die exprimierten Sequenz-markierten Stellen (ESTs), welche den Klon THC300432 bilden, bildeten ursprünglich das UniGene-Cluster Hs. 7891, ESTs, welches in der NCBI-Datenbank dem JM2 [H. Sapiens] etwas ähnlich war. Eine Anzahl der cDNAs in dem Cluster enthielt eine kartierte Sequenz-markierte Stelle (STS) sts-W89007, welche sie auf Chromosom 3 in dem Bereich zwischen D3S1261–D3S1604 auf der Genkarte 98 kartierten.
Diese EST-Sequenzen wurden anschließend in Unigene-Cluster Hs. 8997 für das 70 kD Hitzeschockprotein 1 eingebracht, obwohl die mRNA-Sequenz für dieses Gen nicht derjenigen für FOXP1 entspricht. Folglich ist noch ein weiteres Unigene Cluster (HS. 274344) für die FOXP1-ESTs, welche LOC51245 genannt werden, erzeugt worden. Es ist über die „Volllängen"-Proteinsequenz berichtet worden (NM_016477), diese beginnt jedoch bei AS 559 der FOXP1-Sequenz, welche wir isoliert haben, ist nur 118 AS lang und weist keine flügelförmige Helixdomäne auf.
Alignment verschiedener EST-Sequenzen, die sts-W89007 der FOXP1-cDNA enthalten, bestätigt, dass sie gleich sind. Der FOXP1-C-Terminus enthält daher die kartierten Sequenz-markierten sts-W89007, die dieses Gen zwischen den Markern D3S1261–D3S1604 kartieren, welche in etwa den Chromosomenbanden 3p12.3–3p14.1 entsprechen (Todd, S., W. A. Franklin, M. Varella-Garcia, T. Kennedy, C. E. Hilliker Jr., L. Hahner, M. Anderson, J. S. Wiest, H. A. Drabkin und R. M. Gemmill, 1997. Cancer Res. 57: 1344–1352).
(Ein) nicht-identifizierte(s) Tumorsuppressorgen(e) ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 lokalisiert.
Die Kenntnis über chromosomale Deletionen hat einen wesentlichen Beitrag zum Nachweis von Tumorsuppressorgenen geleistet. Gemäß der Zwei-Hit-Hypothese ergibt sich die Inaktivierung eines Allels häufig aus einer Deletion auf Chromosomenebene; während die andere Kopie durch Punktmutation, Methylierungsveränderungen oder kleine Deletionen inaktiviert werden kann (Knudson, A. G., 1971. PNAS 68: 820–823). Die CCAP-(Cancer Chromosome Aberration Project)Karte mit Bruchstellen von immer wiederkehrenden Chromosomenaberrationen hat den kurzen Arm von Chromosom 3 als eine Region identifiziert, über die man herausgefunden hat, dass sie in einer Vielzahl von Krebsarten deletiert ist (Mitelman, F., F. Mertens und B. Johansson, 1997. Nat. Genet. 15: 417–474). Es ist berichtet worden, dass Deletionen auf Chromosom 3 die dritthäufigste aller bekannter Deletionen bei menschlichen Tumoren sind (Sezinger, B. R. et al., 1991. Cytogenet. Cell. Genet. 58: 1080–1096).
Die am zweithäufigsten allgemein verwendeten Ansätze zum Bestimmen der Lokalisierung eines Tumorsuppressorgens sind das Bestimmen des Karyotyps und die Analyse des Verlustes von Heterozygosität (LOH) von kartierten polymorphen Markern, währen die grundlegenden Kriterien, welche die Tumorsuppressorgene definieren, sind: –

1) Das Vorkommen des Verlusts funktioneller Mutationen
2) Inaktivierung sowohl bei familiären als auch bei sporadischen Tumoren
3) Die Tatsache, dass der Tumorphänotyp durch das Wildallel verborgen sein kann.

Kartierungsstudien zur Hemizygosität und Homozygosität zeigen, dass viele häufige sporadische Krebsarten einschließlich Lungen- (Brauch, H., et al. 1990. Genes Chrm. Cancer. 1: 240–246), Brust- (Devillee, P., et al., 1989. Genomics 5: 554–560), Nieren- (Foster, K., et al., 1994. Br. J. Cancer 69: 230–234), Zervikal- (Jones, M. H. und Y. Nakamura, 1992. 7: 1631–1634; Yokata, J. et al., 1989. Cancer Res. 49: 3598–3601), Pankreas- (Gorunova, L., et al., 1998. Genes Chrm. Cancer 23: 81–99), Eierstock- (Sato, T., et al., 1991. Cancer Res. 51: 5118–5122) und Kopf- und Nacken-Krebs (Maestro, R., et al., 1993. Cancer Res. 53: 5775–5779) auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 Deletionen aufweisen. Studien unter Verwendung von zytogenetischen Methoden sowie Methoden des Verlustes der Heterozygosität (LOH) haben vier Regionen auf 3p identifiziert, welche Tumorsuppressorgene enthalten können. Sie umfassen Chromosom 3-Banden p12, p14.2, p21.3 und p25 (zusammengefasst von (Kok, K., S. L. Naylor und C. H. Buys, 1997. Cancer Res. 71: 27–92; Le Beau, M. M. et al., 1998. Genes Chrm. Cancer 21: 281–289)).
Das von Hippel-Lindau (VHL)-Tumorsuppressorgen ist auf 3p25–p26 positioniert, und Mutationen in diesem Gen definieren ein familiäres Krebssyndrom mit Prädisposition gegenüber der Entwicklung verschiedener Neoplasmen, wie zum Beispiel Nierenzellkarzinom (Béroud, C. et al., 1998. NAR 26: 256–258). VHL-Mutationen sind bei sporadischen Nierenzellkarzinomen besonders aussagekräftig, wobei sie 30–60% Verlust an homozygoten Genen aufweisen (zusammengefasst von (Decker, H. J., E. J. Weidt und J. Brieger, 1997. Cancer Genet. Cytogenet 93: 74–83)). Das DNA-Reparaturgen XPC ist auch auf 3p25 positioniert. Eine Region, die in einem Brustkrebsfall homozygot deletiert ist, ist auf 3p21.3 kartiert (Sekido, Y., et al., 1998. Oncogene 16: 3151–3157) und das DNA-Mismatch-Reparaturgen MLH1 befindet sich auf 3p21.3–p23. Das FHIT-Gen erstreckt sich über die fragile Stelle FRA3B auf 3p14.2 und ist auch ein Tumorsuppressor-Kandidatengen (Le Beau, M. M., N. Drabkin, T. W. Glover, R. Gemmill, F. V. Rassool, T. W. McKeithan und D. I. Smith, 1998. Genes Chrm. Cancer 21: 281–289).
Homozygote Deletionen sind relativ selten, und es wird angenommen, dass sie sich aus der zweiten Alleldeletion einer Chromosomenregion ergeben, die bereits hemizygotem Verlust ausgesetzt war. Sie sind jedoch für die genaue Lokalisierung von Tumorsuppressorgenen wie zum Beispiel CDKN2 (9p21), PTEN oder MMAC1 (10q23.3) und DPC4 (18q21.1) zentral gewesen (Cairns, P. et al., 1995. Nat. Genet. 11: 210–212; Hahn, S. A., et al., 1997. Science 15: 356–362). In der 3p12–p14-Region ist über verschiedenen homozygote Deletionen berichtet worden. Es ist berichtet worden, dass eine homozygote Deletion in dieser Region in Zelllinien in einer kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinie (U2020) (Rabbitts, P. et al., 1990. Genes Chrm. Cancer 2: 231–238), einer nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinie NCI-H2195 (Virmani, A. et al., 1998. Genes Chrm. Cancer 21: 308–319) und der primären HCC38-Brust-Gangkarzinomzelllinie (Gazdar, A. F., et al., 1998. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 78: 766–774) vorkommen. Diese Beobachtung ist nicht auf Zelllinien beschränkt, da über homozygote Deletionen innerhalb 3p12–p14 in einer unkultivierten Kleinzell-Lungentumorprobe (Todd, S., et al., 1997. Cancer Res. 57: 1344–1352), einer zervikalen Krebsprobe (Aburent, H., Y. Wang, Y. Shibata, T. Noda, D. Schwartz und H. D., 1994. Am. J. Hum. Genet. 55 Erg.:269) einer Kurzzeitkultur, die aus scheinbar normalem Bronchialepithel eines unter Lungentumor leidenden Patienten isoliert wurde (Sundaresan, V. et al., 1995. Ann. Oncol. 6 (Ergänzung 1): S27–S32), Kurzzeitkulturen aus verschiedenen Brustkarzinomen (Pandis, N., et al., 1993. Genes Chrm. Cancer 6: 151–155) und einem Fall von Brustkrebs (Chen, L. et al., 1994. Cancer Res. 54: 3021–3024) berichtet worden ist. Interessanterweise lag eine beträchtliche Heterogenität innerhalb des Tumors mit einer Subpopulation von Zellen vor, die in dieser Region nur LOH aufweisen, obwohl der Lungentumorfall eine homozygote Deletion innerhalb 3p12 enthielt (Todd, S. et al., 1997. Cancer Res. 57: 1344–1352).
FOXP1 befindet sich nicht auf der Region von Chromosom 3p, welche in der U2020-Zelllinie homozygot deletiert ist.
Zur Untersuchung, ob das FOXP1-Gen, welches auf der DNA-Region lokalisiert war, in der U2020-Lungenkrebs-Zelllinie homozygot deletiert war, führten wir einen Southern Blot unter Verwendung von genomischer DNA aus der U2020-Zelllinie und genomische DNA-Kontrollproben aus zwei Patienten mit CML und aus zwei normalen Individuen durch. Alle fünf Proben zeigten dasselbe Bandenmuster, wenn sie mit der FOXP1-cDNA und einer Rennin-Kontrollprobe sondiert wurden (10), wodurch bestätigt wurde, dass dieses Gen in der U2020-Zelllinie nicht deletiert war. Diese Deletion innerhalb der Zelllinien NCIH-2195 und HCC38 kommen innerhalb dieser Region vor, und daher umfasst keine dieser homozygoten Deletionen das FOXP1-Gen. Diese Information legt weiterhin die Chromosomenlokalisierung für FOXP1 zwischen den Markern D3S2583 und D3S1261 fest. Wir haben in der U2020-Zelllinie durch Immunohistochemie auch sehr geringe FOXP1-Proteinmengen nachgewiesen, was dessen Expression bestätigt.
Allelverlust auf 3p ist kein gewöhnliches Ereignis bei hämatologischen Malignomen.
Die oben beschriebene anfängliche immunohistochemische Studie zeigte, dass bei hämatologischen Malignomen immer etwas Anfärbung des Zellkerns mit JC12 beobachtet wurde, wobei die mögliche Ausnahme Lymphozyten-prädominante Hodgkin-Erkrankung darstellt. In einer großen Anzahl von Fällen wurde Überexpression des FOXP1-Proteins tatsächlich beobachtet. Eine genaue Betrachtung von 3p-Deletionen bei hämatologischen Malignomen führte zur Schlussfolgerung, dass diese keine allgemeine Eigenschaft darstellten und es wurde gefolgert, dass viele sekundäre Aberrationen darstellten und distaler (3p25–3p26) positioniert waren als diejenigen, die in soliden Tumoren beobachtet wurden (Johansson, B., et al., 1997. 11: 1207–1213). Dies stand in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorläufigen hämatologischen Immunohistochemie-Studie, die den Verlust von FOXP1-Proteinexpression bei der Mehrzahl dieser Neoplasmen nicht einbezog. Weitere Studien haben jedoch den Verlust der FOXP1-Proteinexpression sowohl in Zellen diffuser großer B-Zell-Lymphome und Mantelzelllymphome identifiziert, was darauf hindeutet, dass dieses Phänomen weit verbreitet ist.
Expression des FOXP1-Proteins in Tumoren.
Die vorliegenden Erfinder haben weiterhin durch Immunohistochemie mit dem JC12-Antikörper die Expression des FOXP1-Proteins in nicht-hämatologischen Malignomen untersucht. Die Ergebnisse sind zu dem Expressionsmuster des Proteins bei hämatologischen Malignomen stark unterschiedlich. Eine verminderte Menge des FOXP1-Proteins wurde häufig in dem Zellkern beobachtet. Es wurde auch eine beträchtliche Anzahl an Zellen identifiziert, in welchen das FOXP1-Protein entweder nur in dem Zytoplasma vorliegt oder in welchen die Tumorzellen FOXP1 nicht vollständig exprimieren.
Kopf-und-Nacken-Karzinome
LOH-Studien von Kopf-und-Nacken-Plattenepithelkarzinomen (HNSCC) haben in bis zu 70–75% von HNSCC-Fällen Verlust auf Chromosom 3p identifiziert (Maestro, R., et al., 1993. Cancer Res. 53: 5775–5779). Verlust auf Chromosom 3p12–3p21 war in Zelllinien stark, die von HNSCCs stammten (Buchhagen, D. L., et al., 1996. Head Neck 18: 529–537) und eine Studie, die sowohl LOH- als auch Mikrosatelliteninstabilität verwendete, identifizierte auf 3p12 LOH in 61,5 der Fälle von Mund- und Mundrachenepithelkarzinomen (Grati, F. R., et al., 2000. Cancer Genet. Cytogenet. 118: 57–61). Durch Untersuchen der Tumorgenizität von Mikrozellhybridklonen, die Fragmente enthalten, die von 3p abstammen, wurde gezeigt, dass die proximale 3p13-Region funktionell den Tumorphänotyp bei SCC-tumorgenen Zelllinien unterdrückt (Uzawa, N., et al., 1998. Cancer Genet. Cytogenet. 107: 125–131).
LOH auf 3p ist mit einer schlechten Prognose für Kopf-und-Nacken-Karzinome in Verbindung gebracht worden (Li, X., et al., 1994. J. Natl. Cancer Inst. 6: 1524–1529). Eine jüngere Studie von 48 primären oralen Plattenepithelkarzinomen (SCC) zeigte, dass Patienten mit LOH an einer Vielzahl von Genorten, einschließlich 3p13, eine 25-mal höhere Sterberate aufwiesen als ein Patient ohne diese Verluste (Partridge, M., et al., 1999. Br. J. Cancer 79: 1821–1827).
Die immunohistochemischen Daten zeigen, dass nur 3/10 der Fälle von Kopf-und-Nacken-Karzinomen normale Mengen von FOXP1-Protein des Zellkerns exprimierten; 1/10 der Fälle zeigen Verlust von Proteinexpression, 4/10 der Fälle zeigen nur schwache Expression im Zellkern und 2/10 der Fälle zeigen zytoplasmatische Lokalisierung des Proteins. Diese vorläufige Studie zeigte in 70% der Fälle anomale FOXP1-Expression. Beide der hochdifferenzierten SCC-Fälle zeigten in einigen Tumorzellen nur sehr schwache Expression im Zellkern, was mit einer Studie in Übereinstimmung steht, die zeigt, dass hochdifferenzierte Kopf-und-Nacken-Karzinome durch die Deletion von 3p (auch 5q und 9p) definiert sind, wodurch nahegelegt ist, dass diese Deletion mit früher Tumorentwicklung in Zusammenhang steht (Bockmühl, U., et al., 1998. Head & Neck 20: 145–151).
Beispiele des Expressionsmusters des FOXP1-Proteins in Kopf-und-Nacken-Krebsarten sind in 11 gezeigt. Ein mittelgradig differenziertes SCC zeigt Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern (A), während andere nur zytoplasmatische Expression (D) zeigen. Zytoplasmatische Expression wird auch in einem weiteren SCC-Fall (C) beobachtet, und einige Tumoren scheinen sowohl Expression im Zellkern als auch zytoplasmatische Expression des FOXP1-Proteins zu zeigen (B).
Nierenkarzinome
LOH-Studien haben 3p als eine wichtige Region identifiziert, die häufig bei Nierentumoren verloren ging. Während gezeigt worden ist, dass bei vielen dieser Deletionen das VHL-Gen, das FHIT-Gen und die familiäre Nierenzellkarzinom-(RCC)-Bruchstelle beteiligt ist, besteht überzeugender Nachweis für die Beteiligung von noch einem weiteren nicht-identifizierten Tumorsuppressorgen auf 3p12–3p14 in einigen nicht-papillaren Nierenzellkarzinomen (Bugert, P., et al., 1996. Int. J. Cancer 68: 723–726; Chino, K., et al., 1999. J. Urol. 162: 614–618; Lovell, M., et al., 1999. Cancer Res. 59: 2182–2189; Lubinski, J., et al., 1994. Cancer Res. 54: 3710–3713; Willers, C. et al., 1996. Br. J. Urol. 77: 524–529). Das FHIT-Gen und die FRA3B-Stelle sind nunmehr von der Genetik der Nierenzellkarzinome ausgeschlossen worden (Bugert, P. et al., 1997. Genes Chrm. Cancer 20: 9–15).
Obwohl Studien zur Bestimmung des Karyotyps nahegelegt haben, dass, im Gegensatz zu nicht-papillären RCC-Tumoren, papilläre RCC-Tumoren üblicherweise keine 3p-Deletionen aufweisen (Hughson, M. et al., 1993. Cancer Genet. Cytogenet. 62: 89–124), hat die Verwendung von molekulargenetischen Methoden LOH auf drei verschiedenen 3p-Genorten identifiziert (Hazaczek, P., et al., 1996. Virchows Arch. 429: 37–42; Mehle, C., et al., 1998. Int. J. Oncol. 13: 289–295; Presti Jr., J. C. et al., 1993. Cancer Res. 53: 5780–5783). Unter Verwendung dieses Ansatzes hat man keinen deutlichen Unterschied in der Häufigkeit einer beliebigen 3p-Deletion zwischen nicht-papillären und papillären Tumoren nachgewiesen (Mehle, C., et al., 1998. Int. J. Oncol. 13: 289–295). Es ist vorgeschlagen worden, dass der LOH auf 3p12–14 bisher bei papillären RCCs unterschätzt worden ist, vermutlich, da die Deletionen häufig zum Nachweis von Mitteln zur Bestimmung des Karyotyps zu klein sind (Mehle, C., et al., 1998. Int. J. Oncol. 13: 289–295). Chromophobe Tumoren weisen jedoch eine niedrigere Häufigkeit von 3p-Deletionen auf, z.B. 4–5% (Kovacs, G., 1993. Histpath 22: 1–8).
Studien über einen neuen genetischen Genort NRC-1 (nicht-papilläres renales Zellkarzinom 1) haben einen Tumorsuppressor-Genort auf 3p12 in einer Region identifiziert, welche das FHIT-Gen, FRA3B und die familiäre RCC-Bruchstellen-Region ausschließt (Lott, S. T., et al., 1998. Cancer Res. 58: 3533–3537). Dieser Genort kontrolliert das Wachstum von RCC-Zellen durch Induktion von schnellem Zelltod in vivo (Sanchez, Y., et al., 1994. PNAS 91: 3383–3387). Weitere Studien zeigen, dass NRC-1 nicht nur an unterschiedlichen Zelltypen von RCC beteiligt ist, sondern auch an papillärem RCC. Dieser Bericht behauptet, den ersten funktionellen Nachweis für einen VHL-unabhängigen Weg in der Tumorgenese in der Niere zu zeigen (Lovell, M., et al., 1999. Cancer Res. 59: 2182–2189).
Unsere immunhistochemischen Daten stehen mit den Ergebnissen dieser jüngsten Studien in Übereinstimmung: 3/10 der Fälle von nicht-papillären RCC zeigten eine Verminderung oder einen Verlust von FOXP1-Protein des Zellkerns, 1/1 der Fälle von papillärem RCC zeigten zytoplasmatische FOXP1-Proteinexpression, während 2/3 der chromophoben Fälle verminderte Expression von FOXP1 oder dessen Verlust im Zellkern zeigten.
Zusätzliche Information über den VHL-Zustand von nicht-papillären RCCs kann ebenso wesentlich sein, da 3/4 der Fälle von RCC, welche entweder dafür bekannt sind, dass sie Mutationen in dem VHL-Gen aufweisen oder dass sie eine VHL-Erkrankung aufweisen, normale positive Zellkerne für FOXP1 zeigten.
Lungenkrebs
Lungenkrebs ist die Hauptursache von Krebstoten in den Vereinigten Staaten (Ginsberg, R. J., et al., 1993. Cancer: Principles & Practise of Oncol. 673–723) und weist üblicherweise eine sehr schlechte Prognose auf. Es ist gezeigt worden, dass Deletionen von Chromosom 3p bei allen Lungenkrebsformen mit einer hohen Häufigkeit auftreten (Gazdar, A., et al., 1994. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59: 565–572). LOH-Studien haben vier nicht-überlappende minimale Deletionsregionen (OCLOHRs) bei Lungentumoren bestimmt. OCLOHR-4 wurde zwischen D3S1284 und D3S1274 auf 3p12–13 kartiert (Fullwood, P., et al., 1999. Cancer Res. 59: 4662–4667). Alleltypisierungsstudien von 215 Lungenkrebs-Zelllinien haben gezeigt, dass die 3p-Chromosomregion in der Nähe des D3S3-Genorts (3p12–p13) an allen Formen von Lungenkrebs beteiligt zu sein scheint (Buchhagen, D. L., 1996. J. Cell Biochem. Ergänzung 24: 198–209). Es haben erhebliche Diskussionen über die Häufigkeit von 3p LOH beim Vergleichen der kleinzelligen Lungenkarzinome (SCLC) und der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome (NSCLC) stattgefunden (Brauch, H., et al., 1987. N. Engl. J. Med. 317: 1109–1113; Brauch, H., et al., 1990. Genes Chrm. Cancer 1: 240–246; Hibi, K., et al., 1992. Oncogene 7: 445–449) und es ist berichtet worden, dass LOH auf 3p12 eine wesentlich höhere Häufigkeit bei SCLC aufweist (Virmani, A. K., et al., 1998. Genes Chrm. Cancer 21: 308–319).
Unsere immunohistochemische Anfärbung des FOXP1-Proteins zeigte, dass keine der sechs untersuchten NSCLC-Fälle dieses Protein im Zellkern zu exprimieren schien, 4/6 der Fälle zeigte keine FOXP1-Expression in den Tumorzellen, während die verbleibenden 2/6 der Fälle zeigten, dass FOXP1-Protein in dem Zytoplasma vorlag. Diese Daten unterstützen die Beteiligung des Verlustes des FOXP1-Proteins im Zellkern in den meisten, wenn nicht allen NSCLC-Fällen und stehen mit der häufigen Deletion von 3p in Übereinstimmung, welche in diesem Malignom beobachtet wurde (Buchhagen, D. L., 1996. J. Cell. Biochem. Suppl. 24: 198–209). Die SCLC-Fälle zeigten in 4/6 der Fälle auch einen nahezu vollständigen Verlust von FOXP1-Expression im Zellkern, während 2/6 der Fälle schwache Anfärbung des Zellkerns für FOXP1 zeigten.
Brust
Eine Anzahl von Tumorsuppressorgenen einschließlich p53 und BRCA2 waren LOH in Brustkrebs ausgesetzt, und diese stehen beide mit einer höheren Häufigkeit von LOH an nicht miteinander in Beziehung stehenden Genorten in Zusammenhang (Bergthorsson J. T., et al., 1998. Eur. J. Cancer 34: 142–147; Eiriksdottir, G., et al., 1998. Oncogene 16: 21–26; Eyfjord, J. E., et al., 1995. Cancer Res 55: 646–651; Tseng, S.-L., et al., 1997. Genes Chrm. Cancer 20: 377–382). Die am gründlichsten untersuchte Stelle für mit BRCA2 in Zusammenhang stehendem LOH ist 3p13–p14 (Euhus, D. M., et al., 1999. J. Surg. Res. 83: 13–18). LOH auf 3p12–14 ist in einer Vielzahl von anderen Studien identifiziert worden, zum Beispiel (Chen, L. C., et al., 1994. Cancer Res. 54: 3021–3024; Devillee, P., et al., 1989. Genomics 5: 554–560). Verminderte Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern ist bei 6/9 der Brustkrebsfälle durch die vorliegenden Erfinder beobachtet worden.
Dickdarm
Wie bei anderen soliden Tumorarten ist LOH auf 3p-Genorten in Dickdarmkrebsarten beschrieben worden (Devilee, P. et al., 1991. Int. J. Cancer 47: 817–821). Unsere immunohistochemische Anfärbung mit dem JC12-Antikörper zeigte einen Fall mit einer zytoplasmatischen Verteilung von FOXP1, und die verbleibenden drei Fälle zeigten nur schwache Anfärbung des Zellkerns der Tumorzellen. Eine ausführlichere Analyse von Dickdarmtumoren ist im Folgenden dargestellt.
Immunohistochemische Anfärbungsstudien unter Verwendung des monoklonalen JC12-Antikörpers zeigen häufig in einer großen Auswahl von nicht-hämatopoietischen Tumoren eine verminderte FOXP1-Expression im Zellkern oder weisen überhaupt keine FOXP1-Expression im Zellkern auf.
Expression von FOXP1-mRNA in Tumoren
Das 1.9 kb EcoRI-Fragment, welches das 5'-Ende der FOXP1-cDNA aus pAB195 enthält, wurde mit ³²P markiert und zum Sondieren von CLONTECHs Matched Tumor/Normal Expression Array (12A) gemäß den Herstellerangaben verwendet. Der Array enthält cDNA aus 68 humanen Tumoren und entsprechendes normales Gewebe aus demselben Individuum, welches auf einer Nylonmembran immobilisiert ist. Die cDNA-Paare sind jeweils unter Verwendung der Expressionsmengen von drei konstitutiven Genen so normiert worden, dass mengenmäßige Vergleiche zwischen den Expressionsmengen der mRNAs der normalen versus bösartigen Gewebeproben durchgeführt werden können. Die cDNA-Paare werden auch in verhältnismäßig gleichen Mengen so beladen, dass Vergleiche zwischen unterschiedlichen Patienten und unterschiedlichen Geweben durchgeführt werden können. Weitere Informationen über Gewebe auf dem Array können von der CLONTECH-Webseite erhalten werden.
Beliebige Schlussfolgerungen, die aus den Arraydaten gezogen werden können, müssen innerhalb der Grenzen dieser Methode gezogen werden. Obwohl der Kontrollarray zur Bestimmung der relativen Genexpressionsmengen geeignet ist, kann er nicht zwischen nahe miteinander in Beziehung stehenden oder polymorphen mRNAs von unterschiedlichen Größen unterscheiden. Obwohl das normale Kontrollgewebe auch phänotypisch normal erscheint, ist es aus einem erkrankten Organ entnommen worden. Darüber hinaus enthalten Tumorproben etwas Normalgewebe, so dass ein negativer Tumor immer noch ein positives Signal ergeben kann.
Das deutlichste Merkmal des Arrays besteht darin, dass im allgemeinen Niere, Brust, Gebärmutter, Eierstock, Lunge und Dünndarm niedrigere mRNA-Mengen für FOXP1 zeigen als die Prostata-, Cervix-, Dickdarm-, Enddarm- und Magen-cDNA-Proben. Deutlich ist auch die Tendenz zu niedrigeren Mengen von FOXP1-mRNA hin in den Dickdarmtumorproben im Vergleich zu deren normalen Gegenstücken und die Tendenz zu höheren Mengen von FOXP1-mRNA hin in den Magentumorproben. Differentielle Expression zwischen normalen und Tumorproben wurde in nahezu der Hälfte der Fälle auf diesem Array beobachtet. Die humanen Krebszellliniendaten deuten darauf hin, dass die zwei Burkitt's-Lymphomzelllinien (12A, 2P und 9P) und die Promyelozytenleukämie-Linie HL-60 (12, 4P) hohe Expressionsmengen des FOXP1-Gens zeigt.
Man ist leicht geneigt, darüber Vermutungen anzustellen, dass die niedrigen FOXP1-Expressionsmengen, die sowohl in normalen als auch in Tumor-cDNAs von bestimmten Geweben beobachtet wurden, darauf hindeuten, dass ein Teil des phänotypischen normalen Gewebes bei der Expression dieses Gens bereits Veränderungen aufweist. Es ist berichtet worden, dass LOH auf 3p ein frühes Ereignis darstellt, welches in präneoplastischen Geweben aus Patienten mit sowohl Brust- (Dietrich, C. U., et al., 1995. Int. J. Cancer 60: 49–53; Euhus, D. M., et al., 1999. J. Surg. Res. 83: 13–18) als auch Lungenkrebs (Wistuba, I. I., et al., 2000. Cancer Res. 60: 1949–1960) nachgewiesen werden kann.
Um dem Problem der „Normal"-Gewebe auf dem abgestimmten Tumor-/ Normal-Array zu begegnen, haben die Erfinder dasselbe EcoRI-Fragment aus dem FOXP1-Gen als Sonde auf Clontech's Multiple Tissue Array gemäß den Herstellerangaben verwendet (12B). Die normalen Gewebe auf diesem Array stammen aus nicht-erkrankten Opfern von plötzlichem Tod/Trauma und sind aus einer Anzahl von Individuen zusammengefasst.
Die FOXP1-mRNA wird in normalen Geweben in großem Umfang exprimiert, und keine Proben waren für die Expression dieses Gens vollständig negativ. Höhere mRNA-Mengen wurden in einigen Proben beobachtet, insbesondere in denjenigen aus lymphatischen und gastrointestinalen Geweben. Insbesondere interessant ist die Tatsache, dass die meisten der normalen Gewebe höhere Expression aufweisen als in einigen der Krebszelllinien beobachtet wird. Dies bestätigt die ursprüngliche Hypothese, dass phänotypisch normale Gewebe aus Patienten mit Krebs bereits veränderte Expression des FOXP1-mRNA-Gens aufweisen können. Auch die FOXP1-mRNA war in fötalen Geweben zusätzlich zu denjenigen aus Erwachsenen in großem Umfang exprimiert, was darauf hindeutet, dass sie während der Entwicklung eine wesentliche Rolle spielt. Diese zwei Experimente bestätigen, dass die FOXP1-mRNA in einer Reihe von Tumorarten in anomaler Weise entweder unter- oder überexprimiert ist. Zusätzliche Informationen über die Fälle und Gewebe auf diesen Arrays können der Firmenwebseite unter www.clontech.com entnommen werden.
AFX-artige flügelförmige Helixtranskriptionsfaktoren regulieren die Expression von p27^Kip1 hoch.
Eine jüngste Veröffentlichung in dem Journal Nature, von Medema et al., zeigte, dass Überexpression der AFX-artigen (FOXO-Familie) Forkhead-Transkriptionsfaktoren bei einer Vielfalt von Zelllinien Wachstumsunterdrückung verursachten; wobei Regulation des Zellzyklus durch Ras und PKB über p27^kip1 vermittelt wurde. Sie zeigten auch, dass AFX die Transkription des p27^kip1-Gens hochregulieren konnte. Sie vermuteten, dass die bekanntgemachte Rolle von PI(3)K/PKB-Signalen in der Tumorgenese zu konkretisieren ist, da die Unterbrechung des P(I)3/K/PKB/Forkhead-Transkriptionsfaktorweges während der Tumorgenese eher einen Zellzyklusblock übergeht als Schutz vor Apoptose verleiht. Sie folgerten, dass die Inaktivierung dieser Proteine ein wichtiger Schritt bei der onkogenen Transformation darstellt (Medema, R. H., G. J. P. L. Kops, J. L. Bos und B. M. T. Burgering, 2000. Nature 404: 782–787).
Die Erfinder haben bestätigt, dass keines der AFX-artigen Transkriptionsfaktoren auf Chromosom 3 lokalisiert ist.
Diese Daten legen einen Mechanismus nahe, durch welchen Verlust des FOXP1-Proteins bei der Entwicklung von Malignomen durch dessen Verlust die Expression von p27^kip1 beeinträchtigen kann.
Überexpression des Volllängen-FOXP1-Proteins in COS-Zellen führte zu erhöhter Expression von p27^kip1 im Zellkern.
Plasmide pAB195, pAB196, pAB199, pAB200 und der leere Vektor pBK-CMV wurden in die COS-Zelllinie transfiziert. Cytospins dieser transfizierten Zellen wurden entweder mit dem JC12-Antikörper, der FOXP1 erkennt, oder mit zwei MoAbs gegen p27^kip1 (Dako and Transduction Laboratories) immungefärbt, von denen einige Ergebnisse in 7 dargestellt sind.
Eine Teilmenge von Zellen der FOXP1-Transfektionen zeigte verstärkte Anfärbung des Zellkerns (pAB195 und pAB196/JC12) zusätzlich zur Hintergrundanfärbung des endogenen FOXP1-Proteins (Vektor/JC12), was darauf hindeutet, dass Transfektionen erfolgreich gewesen waren. Anfärbung mit beiden der p27^kip1-Antikörper zeigte, dass die Transfektion mit der Volllängen-FOXP1-cDNA, die von Plasmid pAB195 kodiert wurde, zu einer erhöhten Expression des p27^kip1-Proteins im Zellkern führte (pAB195/p27 DAKO und pAB195/p27 TL). Die Splice-Varianten von FOXP1, die durch pAB196 und pAB199 und pAB200 kodiert wurden, schienen diese Beeinträchtigung auf die Expression von p27^kip1 nicht aufzuweisen (Daten, die für pAB196/p27 DAKO und pAB196/p27 TL dargestellt sind). Die N-terminale Region des FOXP1-Proteins, welche potenzielle Transaktivierungs- und Protein:Protein-Wechselwirkungsdomänen enthält, liegt von diesen Varianten entfernt und diese Region kann daher bei der Regulation der Expression von p27^kip1 funktionell wichtig sein.
Andere Tumorsuppressorgene weisen variante Formen auf, die bei Malignomen unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel wird das RIZ-Protein, welches an das Retinoblastom-Tumorsuppressorprotein bindet, als zwei Formen des Proteins exprimiert, welche durch dasselbe Gen kodiert werden. RIZ1 ist die Volllängen-Form, welche im Allgemeinen in Tumoren verlorengegangen oder unterexprimiert ist (Lunge, Brust und Neuroblastom) und RIZ2, welches keine PR-Domäne aufweist (welche Protein-Protein-Wechselwirkung vermittelt) ist immer vorhanden (Jiang, G. L., et al., 1999. Int. J. Cancer 83: 541–546). Einige der varianten Formen zeigen eher erhöhte statt verminderte Expression, zum Beispiel wird bei der RBM6-mRNA eine erhöhte Menge des kürzeren Transkripts in Lungentumor-Zelllinien beobachtet (Timmer, T., P., et al., 1999. Eur. J. Hum. Genet. 7: 478–486).
Da der JC12-Antikörper die C-terminale Region des Proteins erkennt, welche in allen varianten Formen konserviert ist, die durch pAB196, pAB199, pAB200 kodiert sind, ist unsere immunohistochemische Studie nicht in der Lage, zwischen diesen unterschiedlichen FOXP1-Proteinen zu unterscheiden. Die auf dem CLONTECH-Array verwendete FOXP1-cDNA-Sonde hybridisiert auch an alle diese cDNAs. Es ist daher möglich, dass diese FOXP1-mRNAs und die Proteine, für die sie kodieren, in Tumoren unterschiedlich exprimiert sind und in Malignomen unterschiedliche Rollen spielen. Antikörper, welche zwischen diesen unterschiedlichen Proteinen unterscheiden können, stellen wahrscheinlich bessere Diagnosereagenzien dar.
INK- und CIP/KIP-Familien regulieren den Eintritt in die Zelle in S durch Hemmung der Cyclin/Cyclin-abhängigen Kinasekomplexe.
Der Verlauf der Zellen durch Zellzykluskontrolle wird durch Cyclin/Cyclin-abhängige Kinase (CDK)-Komplexe positiv kontrolliert und durch spezifische CDK-Inhibitoren (CKI) negativ kontrolliert. Es gibt zwei CKI-Familien CIP/KIP einschließlich p21^Cip1/Waf1, p27^kip1 und p57^Kip2, welche Cyclin E/cdk2- und Cyclin A/cdk2-Komplexe binden und diese hemmen (Sherr, C. J. und J. M. Roberts, 1995. Science 9: 1149–1163) sowie die INK4-Familie einschließlich p16^INK4, p15^INK4b, p18^INK4c und p19^INK4d, welche Cyclin D-assoziierte Kinasen hemmen (Parry, D., S. Bates, D. J. Mann und G. Peters, 1995. EMBO J. 14: 503–511; Sandhu, C., J. Garbe, J. Daksis et al., 1997. Mol. Cell. Biol. 17: 2458–2467).
Die D-artigen Cycline stehen unter der Kontrolle des Zellzyklus, während Cyclin E in allen Geweben exprimiert wird. Gegenwärtige Beweise legen nahe, dass die S-Phase fördernde Funktionen von Cyclin D- und Cyclin E-assoziierten Kinasen durch deren Fähigkeit zur Phosphorylierung von pRb- und Freisetzung der E2F-Transkriptionsfaktoren aus einem inaktiven oder repressiven pRb-E2F-Komplex übertragen werden (zusammengefasst von (Yamasaki, L., 1998. Results Probl. Cell Differ. 22: 199–227)).
Die Expression von Cyclinen, cdks und cdk-Inhibitoren sind in Krebsarten häufig dereguliert (zusammengefasst von Tsihlias, J., L. Kapusta und J. Slingerland, 1999. Ann. Rev. Med. 50: 401–423), unter allen CKIs kann jedoch nur p16^INK4a durch die genetischen Kriterien von LOH als Tumorsuppressor klassifiziert werden (Ruas, M. und G. Peters, 1998. Biochem. Biophys. Acta. 1378: F115–177).
Fall für p27^kip1 als Kandidaten-Tumorsuppressorgen.
p27^kip1 wurde zunächst als ein Inhibitor in Zellen identifiziert, die durch das Transformieren des Wachstumsfaktors β (TGF-β) zum Stillstand gebracht wurden, und p27^kip1 wird sowohl durch wachstumshemmende Cytokine als auch durch Kontakthemmung reguliert (Hengst, L., et al., 1994. PNAS 91: 5291–5294; Koff, A., et al., 1993. Science 260: 536–539; Polyak, C., et al., 1994. Cell 78: 59–66; Polyak, K., et al., 1994. Genes Dev. 8: 9–22 und Slingerland, J. M., et al., 1994. Mol. Cell Biol. 14: 3683–3694). In den meisten normalen Geweben besteht sowohl während fötaler Entwicklung als auch bei Erwachsenen eine negative Beziehung zwischen p27^kip1-Expression und -proliferation (Fredersdorf, S., et al., 1997. PNAS 94: 6380–6385; Yatabe, Y., et al., 1998. Cancer Res. 58: 1042–1047). Während das p27^kip1-Protein in nicht-proliferierenden Zellen stark exprimiert ist, nehmen seine Mengen ab, wenn die Zellen durch Wachstumsfaktoren stimuliert werden (Kato, J.-Y., et al., 1994. Cell 79: 487–496; Nourse, J., et al., 1994. Nature 372: 570–573). Jüngste Studien legen nahe, dass p27^kip1 bei der Zelldifferenzierung und -entwicklung (Hengst, L. und S. I. Reed, 1996. Science 271: 1861–1864), Apoptoseinduktion (Wang, X., M. Gorospe, Y. Huang und N. J. Holbrook 1997. Oncogene 15: 2991–2997) und Resistenz gegenüber Chemotherapie (St Croix, B., et al., 1996. Nat. Med. 2: 1204–1210) eine Funktion erfüllt. p27^kip1-Knockout-Mäuse offenbaren veränderte Differenzierungsprogramme (Casaccia-Bonnefil, P., et al., 1997. Genes Dev. 11: 2335–2346) und p27^kip1-Expression nimmt während Differenzierung in vielen Zellarten sowohl in Gewebekultur als auch in vivo zu (Durand, B., et al., 1997. EMBO J. 16: 306–317; Koyama, H., et al., 1996. Cell 87: 1069–1078). Es bestehen einige Unstimmigkeiten über den Zusammenhang zwischen p27^kip1 und Proliferation bei humanem Krebs. Das Vorliegen von erhöhten p27^kip1-Proteinexpressionsmengen in Teilmengen von Tumoren mit einem hohen Proliferationsindex ist durch die Vermutung erklärt worden, dass das abnormal exprimierte Protein keine funktionelle Fähigkeit zur Hemmung des Fortschreitens des Zellzyklus aufweist (Fredersdorf, S., et al., 1997. PNAS 94: 6380–6385; Quintanilla-Martinez, L. et al., 1998. Am. J. Path. 153: 175–182; Sgambata, A., et al., 1997. Clin. Cancer Res. 3: 1879–1887; Yatabe, Y., et al., 1988. Cancer Res. 58: 1042–1047).
Der Beweis, dass p27^kip1 beim Fortschreiten von humanen Tumoren beteiligt sein kann, rührt größtenteils von Studien her, die die Expression des p27^kip1-Proteins von klinischen Tumorproben unter Verwendung von immunohistochemischen Assays direkt gemessen haben. Nicht vorhandene oder niedrige Mengen von p27^kip1-Expression in einer Teilmenge von Krebsarten von Dickdarm- (Loda, M., et al., 1997. Nat. Med. 3: 231–234; Tenjo, T., et al., 2000. Oncol. 58: 45–51), Brust- (Catzavelos, C., et al., 1997. Nat Med. 3: 227–230; Porter, P. L., et al., 1997. Nat. Med. 3: 222–225; Tan, P., et al., 1997. Cancer Res. 57: 1259–1263), Lungen- (Catzavelos, C., et al., 1999. 59: 684–688; Esposito, V., et al., 1997. Cancer Res. 57: 3381–3385), Barrett's-Speiseröhren- (Singh, S. P., et al., 1998. Cancer Res. 58: 1730–1735), Melanom- (Flørenes, V. A., et al., 1998. Am. J. Path. 153: 305–312), Magen- (Mori, M., et al., 1997. Nat. Med. 3: 593), Hypopharynxkrebs (Mineta, H., et al., 1999. Anticancer Res. 19: 4407–4412), oraler Plattenepithelkarzinom (Ito, R., et al., 1999. Pathobiol. 67: 169–173), Magen- (Mori, M., et al., 1997. Nat. Med. 3: 593) und Prostata- (Cote, R. J., et al., 1998. J. Natl. Cancer. Inst. 90: 916–920; Tsihlias, J., et al., 1998. Cancer Res. 58: 542–548; Yang, R. M., et al., 1998. J. Urol. 159: 941–945) Krebsarten stehen mit Fällen in Zusammenhang, die eine schlechte Prognose aufweisen. Verlust von p27^kip1-Protein konnte zu Resistenz gegenüber Wachstumshemmungsfaktoren (Sandhu, C. et al. 1997. Mol. Cell Biol. 17: 2458–2467; Koff, A., et al. 1993 Science 260, 536–539; Polyak, K., et al. 1994 Genes Dev. 8 9–22; Slingerland J. et al. 1994 Mol Cell Biol. 14: 3683–3694; Kato, J-Y., et al. 1994 Cell 79: 487–496; Hunter, T. und Pines, 1994. Cell 79: 573–582), Deregulierung von Zellproliferation, und onkogene Veränderung (Hunter, T., und Pines, J., 1994. Cell 79 573–582, Sherr, J. S., 1996. Science 274: 1672–1677) beitragen. Daher stellt es ein übliches Merkmal dar, dass niedrige Mengen von p27^kip1-Protein mit einer schlechten Prognose bei Krebsarten in Zusammenhang stehen (zusammengefasst in (Clurman, B. E. und P. Porter, 1998. PNAS 95: 15158–15160)), und p27^kip1 wird ein wichtiger klinischer Marker für das Fortschreiten von Tumoren. Da berichtet worden ist, dass die Herunterregulation von p27^kip1 die Empfindlichkeit gegenüber Antikrebsmitteln erhöht (St Croix, B. et al. 1996. Nat. Med. 2: 1204–1210) ist in Anbetracht ihrer schlechten Prognose vorgeschlagen worden, dass Patienten mit schwacher p27^kip1-Expression in deren Tumoren die besten Kandidaten für adjuvante Chemostrahlentherapie sind (Shamma, A., et al., 2000, Oncol 58: 152–158).
Der einzige direkte Nachweis, dass p27^Kip1 ein Tumorsuppressor ist, stammt aus den Studien von p27^Kip1-Nullmäusen. p27^Kip1-defiziente Mäuse weisen eine allgemeine Zunahme an Körpergröße, Hypophysentumoren und multipler Organhyperplasie auf (Kiyokawa, H., R. D. Kineman, K. O. Manova-Todorova, V. C. Soares, E. S. Hoffman, M. Ono, D. Khanam, A. C. Hayday, L. A. Frohman und A. Koff, 1996. Cell 85: 721–732). Im Gegensatz zu anderen klassischen Tumorsuppressoren ist bei diesen Mäusen nur eine Verminderung der p27^Kip1-Mengen notwendig, um Gewebe gegenüber sekundären Tumoren zu prädisponieren (Texeira, L. T., H. Kiyokawa, X. D. Peng, K. T. Christov, L. A. Frohman und R. D. Kineman, 2000. Oncogene 19: 1875–1884). Daher könnten verminderte Mengen von FOXP1-Proteinexpression im Zellkern auch für die Entwicklung von Malignomen wichtig sein.
Obwohl es ein mutmaßliches Tumorsuppressorgen darstellt, treten Mutationen oder Deletionen in dem p27^kip1-Gen nur selten bei humanen Krebsarten auf (Kawamata, N., R. Morosettie, C. W. Miller, D. Park, K. S. Spirin, T. Nakamaki, S. Takeuchi, Y. Hatta, J. Simpson und S. Wilczynski, 1995. Cancer Res 55: 2266–2269; Morosetti, R., N., Kawamata, A. F. Gombart, C. W. Miller, Y. Hatta, T. Hirama, J. W. Said, M. Tomonaga und H. P. Koeffler, 1995. Blood 86: 1924–1930; Pietenpol, J. A., S. K. Bohlander, Y. Sato, N. Papadopoulos, B. Liu, C. Friedman, B. J. Trask, J. M. Roberts, K. W. Kinzler, J. D. Rowly und B. Vogelstein, 1995. Cancer Res. 55: 1206–1210), während ein weiteres CKI, p16^INK4a, mit p53 um das am häufigsten veränderte Gen bei humanen Krebsarten konkurriert. Regulation von p27^kip1 ist kompliziert und Berichte über transkriptionelle (Kolluri, S. K., C. Weiss, A. Koff und M. Gottlicher, 1999. Genes Dev. 13: 1742–1753), translationale (Hengst, L. und S. I. Reed, 1996. Science 271: 1861–1864; Millard, S. S., J. S. Yan, H. Nguyen, M. Pagano, H. Kiyokawa und A. Koff, 1997. J. Biol. Chem. 272: 7093–7098), proteolytische (Catzavelos, C., N. Bhattacharya, Y. C. Ung, J. A. Wilson, L. Roncari, C. Sandhu, H. Yeger, I. Morava-Protzner, L. Kapusta, E. Franssen, K. I. Pritchard und J. M. Slingerland, 1997. Nature Med. 3: 227–230; Loda, M., B. Cukor, S. W. Tam, P. Lavin, M. Fiorentino, G. F. Draetta, J. M. Jessup und M. Pagano, 1997. Nature Med. 3: 231–234; Nguyen, H., D. M. Gitig und A. Koff, 1999. Mol. Cell biol. 19: 1190–1201; Pagano, M., S. W. Tam, A. M. Theodoras, P. B. Romero, G. D. Sal, V. Chau, P. R. Yew, G. F. Draetta und M. Rolfe, 1995. Science 269: 282–685) und Fehllokalisierungs- (Orend, G., T. Hunter und E. Ruoslanhti, 1998. Oncogene 16: 2575–2583; Soucek, T., R. S. Yeung und M. Hengstschlager, 1998. PNAS 95: 15653–15658) Mechanismen werden berichtet.
Es ist jedoch vorgeschlagen worden, dass p27^kip1 ein nützliches klinisches Mittel darstellen kann, sogar noch bevor die Mechanismen der p27^kip1-Inaktivierung vollständig verstanden werden, und es ist die routinemäßige Verwendung von p27^kip1 als ein prognostischer Indikator für Krebs empfohlen worden (Moller, M. B., K. Skjodt, L. S. Mortensen und N. T. Pedersen, 1999. Br. J. Haematol. 105: 730–736).
Immunohistochemische Anfärbungsstudien unter Verwendung der JC12- und p27^Kip1-Antikörper (14) haben gezeigt, dass in normalen Mandeln beide Proteine ein sehr ähnliches Verteilungsmuster aufweisen, wobei die Zellen des Keimzentrums weitgehend negativ sind und die umgebenden Zellen der Mantelschicht und kleine Hürthle-Lymphozyten weitaus höhere Expressionsmengen aufweisen als zuvor für p27^kip1 beschrieben worden ist (Fredersdorf, S., J. Burns, A. M. Milne, G. Packham, L. Fallis, C. E. Gillett, J. A. Royds, D. Peston, P. A. Hall, A. M. Hanby, D. M. Barnes, S. Shousha, M. J. O-Hare und X. Lu, 1997. PNAS 94: 6380–6385; Sánchez-Beato, M., A. I. Sáez, J. C. Martinez-Montero, M. S. Mateo, L. Sánchez-Verde, R. Villuendas, G. Troncone und M. A. Piris, 1997. Am. J. Path. 151: 151–160). Anfärbung mit dem MIB-1-Antikörper bestätigt, dass es die Zellen im Ruhezustand sind, die hohe Mengen von sowohl p27^kip1- als auch FOXP1-Proteinen exprimieren. Weder in den hellen noch in den dunklen Bereichen des Keimzentrums gab es einen deutlichen Unterschied zwischen der FOXP1-Proteinexpression. Die FOXP1- und p27^Kip1-Proteine weisen auch eine ähnliche Verteilung in anderen normalen Geweben auf; zum Beispiel sind in der normalen Niere beide Proteine im Zytoplasma der proximalen Tubuluszellen lokalisiert und werden in den Zellkernen der distalen Tubuli exprimiert (14).
Bei hämatologischen Malignomen steht die schlechte Prognose allgemein mit Überexpression von p27^kip1 in Zusammenhang.
Das Überexpressionsmuster von p27^kip1 in Teilmengen hämatologischer Malignome steht mit dem Anfärbungsmuster in Zusammenhang, welches für das FOXP1-Protein beobachtet wurde. Dieses könnte eine Erklärung für das Fehlen von 3p-Deletionen bereitstellen, die bei hämatologischen Malignomen beobachtet wurden (Johansson, B., R. Billström, U. Kristofferssson, M. Åkerman, S. Garwicz, T. Ahlgren, C. Malm und F. Mitelman, 1997. Leukemia 11: 1207–1213), wobei die Überexpression des FOXP1-Genprodukts zum Hochregulieren der Expression von p27^kip1 erforderlich ist. Spätere Versuchsdaten, die von den Erfindern bereitgestellt wurden, identifizierten jedoch in einer Studie über diffuses großes B-Zell-Lymphom keine signifikante Beziehung zwischen der Expression des FOXP1- und p27^kip1-Proteins. Es ist auch bei Mäusen gezeigt worden, dass Überexpression von bmi-1 (welches ink4a hochreguliert) Lymphome induziert (Alkema, M. J., H. Jacobs, M. van Lohuizen und A. Berns, 1997. Oncogene 15: 899–910; van der Lugt, N. M. T., J. Domen, K. Linders, M. van Roon, E. Robanus-Mandaag, H. te Riele, M. van der Valk, J. Deschamps, M. Sofroniew, M. van Lohuizen und et al., 1994. Genes Dev. 8: 757–769).
Im Allgemeinen steht dieses Muster von p27^kip1-Überexpression bei einer Vielzahl hämatologischer Malignome einschließlich diffusen großen B-Zell-Lymphomen (DLBCL) (Sáez, A., E. Sánchez, M. Sánchez-Beato, M. A. Cruz, I. Chacón, E. Muñoz, F. I. Camacho, J. C. Martínez-Montero, M. Mollejo, J. F. García und M. A. Piris, 1999. Br. J. Cancer 80: 1427–1434; Sanchez-Beato, M., F. I. Camacho, J. C. Martínez-Montero, A. I. Saez, R. Villuendas, L. Sanchez-Verde, J. F. Garcia und M. A. Piris, 1999. Blood 94: 765–772), Burkitts-Lymphom (BL) (Sanchez-Beato, M., F. I. Camacho, J. C. Martinez-Montero, A. I. Saez, R. Villuendas, L. Sanchez-Verde, J. F. Garcia und M. A. Piris, 1999. Blood 94: 765–772) und die chronische lymphatische B-Zell-Leukämie (B-CLL) (Vrhorac, R., A. Delmer, R. Tang, J. P. Marie, R. Zittoun und F. Ajchenbaum-Cymbalista, 1998. Blood 91: 4694–4700) mit schlechter Prognose in Zusammenhang. Sequestrierung und Inaktivierung von p27^kip1 durch c-myc (Vlach, J., S. Hennecke, K. Alevizopoulos, D. Conti und B. Amati, 1996. EMBO J. 15: 6595–6604), welches bei aggressiven Lymphomen häufig überexprimiert ist (Hernandez, S., L. Hernandez, S. Bea, M. Cazorla, P. L. Fernandez, A. Nadal, J. Muntane, C. Mallofre, E. Montserrat, A. Cardesa und E. Campo, 1998. Cancer Res. 58: 1762–1767) ist als Mechanismus zur Erklärung einer hohen Proliferationsrate trotz gleichzeitiger erhöhter intranukleärer p27^kip1-Mengen (Moller, M. B., K. Skjodt, L. S. Mortensen und N. T. Pedersen, 1999. Br. J. Haematol. 105: 730–736) vorgeschlagen worden.
Es gibt auch einige Berichte über verminderte p27^kip1-Expression, die mit einer schlechten Prognose bei DLBCL (Moller, M. B., K. Skjodt, L. S. Mortensen und N. T. Pedersen, 1999. Br. J. Haematol. 105: 730–736) und akuter granulozytärer Leukämie (AML) in Beziehung steht (Yokozawa, T., M. Towatari, H. Iida, K. Takeyama, M. Tanimoto, H. Kiyoi, T. Motoji, N. Asou, K. Saito, M. Takeuchi, Y. Kobayashi, S. Miyawaki, Y. Kodera, R. Ohno, H. Saito und T. Naoe, 2000. Leuk. 14: 28–33).
Allelverlust auf 3p und Verlust von p27^kip1-Expression ist ein frühes Ereignis bei der Entstehung von Malignomen.
Eine Vielzahl von Studien identifizierte entweder auf 3p oder auf 3p12–14 Allelverlust bei prämalignen Läsionen von Kopf-und-Nacken-Krebsarten (Califano, J., P. van der Riet, W. Westra, H. Nawroz, G. Clayman, S. Piantadosi, R. Corio, D. Lee, B. Greenberg, W. Koch und D. Sidransky, 1996. Cancer Res. 56: 2488–2492; Emilion, G., J. D. Langdon, P. Speight und M. Partridge, 1996. Br. J. Cancer 73: 809–813; Roz, L., C. L. Wu, S. Porter, C. Scully, P. Speight, A. Read, P. Sloan und N. Thakker, 1996. Cancer Res. 56: 1288–1231), Zervikalkrebs (Fouret, P. J., D. Dabit, J.-L. Mergui und S. Uzan, 1998. Pathobiol. 66: 306–310), Brustkrebs (Dietrich, C. U., N. Pandis, M. R. Teixeira, G. Bardi, A. M. Gerdes, J. A. Anderson und S. Heim, 1995. Int. J. Cancer 60: 49–53; Euhus, D. M., A. Maitra, I. I. Wistuba, A. Alberts, J. Albores-Saavedra und A. F. Gazdar, 1999. J. Surg. Res. 83: 13–18) und präneoplastisches/präinvasives Bronchialepithel (Wistuba, I. I., C. Behrens, A. K. Virmani, G. Mele, S. Milchgrub, L. Girard, J. W. 3. Fondon, H. R. Garner, B. McKay, F. Latif, M. I. Lerman, S. Lam, A. F. Gazdar und J. D. Minna, 2000. Cancer Res. 60: 1949–1960). In Studien über orale, Brust- und mit Barrett's- in Zusammenhang stehende präinvasive und invasive Krebsarten steht die Verminderung der Menge an p27^kip1 mit einem erhöhten Ausmaß an Malignomen in Zusammenhang (Catzavelos, C., N. Bhattacharya, Y. C. Ung, J. A. Wilson, L. Roncari, C. Sandhu, H. Yeger, I. Morava-Protzner, L. Kapusta, E. Franssen, K. I. Pritchard und J. M. Slingerland, 1997. Nature Med. 3: 227–230; Jordan, R. C., G. Bradley und J. Slingerland, 1998. Am. J. Pathol. 152: 585–590; Loda, M., B. Cukor, S. W. Tam, P. Lavin, M. Fiorentino, G. F. Draetta, J. M. Jessup und M. Pagano, 1997. Nature Med. 3: 231–234; Porter, P. L., K. E. Malone, P. J. Heagerty, G. M. Alexander, L. A. Gatti, E. J. Firpo, J. R. Daling und J. M. Roberts, 1997. Nat. Med. 3: 222–225; Tan, P., B. Cady, M. Wanner, P. Worland, B. Cukor, C. Magi-Galluzzi, P. Lavin, G. Draetta, M. Pagano und M. Loda, 1997. Cancer Res. 57: 1259–1263). Es ist vorgeschlagen worden, dass bei Krebsarten, in welchen sowohl invasive als auch nicht-invasive Tumoren gleichzeitig vorkommen, Verlust von p27^Kip-Protein sowohl bei in situ- als auch bei invasiven Komponenten beobachtet wird, wodurch nahegelegt ist, dass Ereignisse, die zur Deregulierung von p27^Kip1 führen, Invasion vorhergehen; dies ist zusammengefasst in (Tsihlias, J., L. Kapusta und J. Slingerland, 1999. Am. Res. Med. 50: 401–423).
Dafür ist eine mögliche Erklärung vorgeschlagen worden (Vidal, A. und A. Koff, 2000. Gene 247: 1–15), wonach Änderungen, die nur eine Abnahme an p27^kip1-Protein verursachen, nicht notwendigerweise den pRb-Weg beeinträchtigen, so dass Verlust von p27^Kip1 nur Malignome verursacht, wenn ein zweites kanzerogenes Ereignis auftritt. Der Verlust von FOXP1-mRNA-Expression bei einigen phänotypisch normalen Gewebeproben auf dem CLONTECH-Array (6) steht in Übereinstimmung mit der Hypothese, dass der Verlust oder die Verminderung der Expression dieses Gens ein frühes Ereignis bei der Entwicklung von Malignomen sein kann. Diese Hypothese wurde weiterhin durch die JC12-Immunfärbung von Magen- und Dickdarmtumoren unterstützt, wobei Veränderungen der FOXP1-Proteinexpression in präneoplastischen Zellen nachgewiesen wurden.
Beziehung zwischen LOH auf 3p12–14 und Expressionsmustern von FOXP1 und p27^kip1.
Beispiele der immunohistochemischen Anfärbungsstudien, die die Expressionsmuster von FOXP1-Protein (unter Verwendung von JC12) und p27^kip1-Protein (unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern sowohl von DAKO als auch von Transduction Laboratories) werden in 15 und 16 dargestellt.
Der in situ-Brustkrebsfall, der in 15A dargestellt ist, zeigt, dass die meisten Tumorbereiche FOXP1- und p27^kip1-Proteine im Zellkern stark exprimieren. Einige Tumorbereiche zeigen jedoch sowohl einen Verlust von sowohl FOXP1- als auch p27^Kip1-Proteinexpression, wodurch die Heterogenität der Expression beider dieser Proteine veranschaulicht wird, welche oft innerhalb eines Tumors auftritt. Die SCLC- und NSCLC-Lungenkarzinomfälle zeigen den Verlust von JC12-Proteinen im Zellkern dieser Tumorzellen, was in allen Fällen nachgewiesen wurde, die wir untersucht haben. Diese Figur zeigt auch, dass bei beiden Antikörpern ähnliche Zellkernanfärbungsmuster beobachtet wurden, obwohl der DAKO p27^Kip1-Antikörper häufig eine höhere Menge an zytoplasmatischer Anfärbung aufweist als bei dem Antikörper der Transduction Laboratories beobachtet wurde. Einem früheren Bericht über die Expression von p27^Kip1 bei Lungenkrebsarten konnte entnommen werden, dass NSCLC-Tumoren verminderte Expression dieses Proteins zeigten, während es SCLC-Tumoren erhöhte Expression des p27^Kip1-Proteins aufwiesen (Yatabe, Y., et al., 1998. Cancer Res. 58: 1042–1047). Wir haben herausgefunden, dass in allen untersuchten SCLC-Fällen ein variabler Anteil der Tumorzellen sehr hohe Expressionsmengen von p27^Kip1 zeigte, während andere Zellen nahezu keine Expression von p27^Kip1-Protein im Zellkern zu zeigen schienen.
Die Nierenzellkarzinomfälle, die in 16 dargestellt wurden, zeigen die Auswahl von Anfärbungsmustern, die sowohl für FOXP1- als auch für p27^Kip1- Proteine beobachtet wurden, wodurch die Beziehung zwischen Tumoren bestätigt wird, die FOXP1-Protein des Zellkerns verloren haben, mit deren Verlust von p27^Kip1-Protein im Zellkern, wodurch das Ausmaß an Heterogenität die Expressionsmengen unter den Tumorzellen darstellt. Obwohl wiederum einige Unterschiede zwischen den zwei monoklonalen p27^Kip1-Antikörpern bestehen, wird die zytoplasmatische Anfärbung in einigen Fällen bei beiden Antikörpern beobachtet (16C und D), wodurch angezeigt wird, dass wir auch die bisher berichtete zytoplasmatische Fehllokalisierung des p27^Kip1-Proteins beobachtet haben (Orend, G., T. Hunter und E. Ruoslanhti, 1998. Oncogene 16: 2575–2583; Soucek, T., R. S. Yeung und M. Hengstschlager, 1998. PNAS 95: 15653–15658). In beiden Nierenfällen (16C und D), in welchen wir zytoplasmatisches p27^Kip1-Protein unter Verwendung von beiden p27^Kip1-Antikörpern zeigen, beobachten wir auch eine zytoplasmatische Verteilung des FOXP1-Proteins.
Die Beziehung zwischen LOH auf 3p und Verlust von Expression der p27^Kip1- und FOXP1-Proteine im Zellkern bei soliden Tumoren zusammen mit dem berichteten Verlust von 3p LOH und Überexpression von sowohl p27^Kip1- als auch FOXP1-Proteinen in Teilmengen bestimmter hämatologischer Neoplasmen legt nahe, dass die drei Ereignisse miteinander in Beziehung stehen. Es ist einleuchtend, dass LOH auf 3p zur Unterbrechung der FOXP1-Genexpression führt, was zu Verlust von FOXP1-Protein des Zellkerns und anschließender Abnahme der Expression des p27^kip1-Proteins im Zellkern in Fällen führt, welche die Expression beider Proteine verloren haben.
Das FOXP1-Protein enthält ein potenzielles Cyclin-Erkennungsmotiv und cdk-Phosphorylierungsstellen.
Das FOXP1-Protein enthält wie p27^Kip1 potenzielle Cyclin-Bindungsmotive (oder RXL-Motiv), bei AS 66–68, 325–7 und 484–6. Obwohl die Mehrheit dieser Stellen einen basischen Rest oder Cystein vor dem Arginin aufweist, weist die FOXP1- RXL-Sequenz einen Alaninrest auf, wie für C. elegans 2 vorhergesagt wurden (Vlach, J., S. Hennecke und B. Amati, 1997. EMBO J. 16: 5334–5344). Dieses Motiv ist bei Proteinen nachgewiesen worden, mit Ausnahme von CKIs einschließlich den Proteinen p107 und p130 der Retinoblastomfamilie sowie den E2F-1-, -2- und -3-Transkriptionsfaktoren (Adams, P. D., W. R. Sellers, S. K. Sharma, A. D. Wu, C. M. Nalin und W. G. Kaelin Jr., 1996. Mol. Cell. Biol. 16: 6623–6633; Zhu, L., E. Harlow und B. D. Dynlacht, 1995. Genes Dev. 9: 1740–1752), und es ist vermutlich durch Ansteuern von Substraten zur Aktivierung von Cyclin-CDK-Komplexen wirksam. Das FOXP1-Protein enthält auch eine Erkennungsstelle für die p70S6-Kinase (RRYS), welche durch die PI3-Kinase reguliert wird. Die biologische Aktivität des FOXP1-Proteins kann daher durch den PI3-Kinasesignalweg wie andere Mitglieder der flügelförmigen Helixfamilie beeinträchtigt werden (Kops, G. J., und Burgering, B. M., 1999. J. Mol. Med. 77 656–665). Das FOXP1-Protein enthält auch verschiedene Versionen einer bevorzugten cdk-Phosphorylierungsstelle (S/T-P-X-Z, wobei Z üblicherweise ein basischer Rest ist) (Nigg, E., 1991. Semin. Cell. Biol. 2: 261–270; Songyang, Z., S. Blechner, N. Hoagland, M. F. Hoekstra, H. Piwnica-Worms und L. C. Cantley, 1994. Curr. Biol. 4: 973–982; Srinivasan, J., M. Koszelak, M. Mendelow, Y.-G. Kwon und D. S. Lawrence, 1995. Biochem. J. 309: 927–931; Zhang, J., R. J. Sanchez, S. Wang, C. Guarnaccia, A. Tossi, S. Zahariev und S. Pongor, 1994. Biophys. 315: 415–424), was darauf hindeutet, dass es für die Cyclin-abhängige Proteinkinase ein Substrat sein kann.
Immunfärbung von Mausgeweben mit dem JC12-Antikörper.
Das humane FOXP1-Protein weist eine nahezu vollständige Homologie innerhalb der veröffentlichten flügelförmigen Helixdomäne mit dem FOXp1-Protein der Maus auf. Zur Untersuchung der Möglichkeit, dass der FOXp1-spezifische Antikörper JC12 auch das Mausprotein erkennen kann, färbten wir die Milz der Maus mit diesem Antikörper an (wie in Materialien und Methoden beschrieben). Wir waren in der Lage, mit unserem JC12-Antikörper ein Zellkernprotein der Mausmilz schwach nachzuweisen (in 16 oben rechts gezeigt), wodurch gezeigt wird, dass das durch diesen Antikörper erkannte Epitop zwischen den FOXP1-Proteinen der Maus und des Menschen konserviert ist.
Es wird daher vorausgesetzt, dass FOXP1 ein Kandidatentumorsuppressorgen ist, welches auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 in einer Region lokalisiert ist, die im Allgemeinen bei einer Auswahl von soliden Tumorarten Verlust von Heterozygosität zeigt. Unsere Immunfärbungsstudien zeigen, dass eine Vielzahl von soliden Tumorarten, die dafür bekannt sind, dass sie mit LOH auf 3p in Zusammenhang stehen, häufig verminderte oder fehllokalisierte Expression des FOXP1-Proteins zeigen. Wir zeigen, dass das Expressionsmuster des FOXP1-Proteins von normaler Mandel und Niere eine ähnliche Verteilung wie diejenige des p27^Kip1-Proteins aufweist, und dass beide ein reziprokes Expressionsmuster mit dem MIB-1-Antigen bei Mandel aufweisen. Wir haben herausgefunden, dass in der Mehrheit der Fälle, in welchen die soliden Tumorzellen verminderte oder zytoplasmatische Expression des FOXP1-Proteins zeigen, diese auch für p27^Kip1 anomale Expressionsmuster zeigen. Ebenso zeigen sie auch in der Mehrheit der Fälle, in welchen die Tumorzellen 'normale' Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern zeigen, Expression des p27^Kip1-Proteins im Zellkern. Überexpression des Volllängen-FOXP1-Proteins führt zu einer Anhäufung von p27^Kip1-Protein im Zellkern von transfizierten COS-Zellen, wodurch gezeigt wird, dass die Expressionsmenge des FOXP1-Proteins direkt die Expressionsmengen des p27^Kip1-Proteins beeinträchtigen können. Interessanterweise haben wir Fälle von Diffusem Großem B-Zell-Lymphom (DLBCL) identifiziert, welche FOXP1-Protein des Zellkerns überexprimieren, jedoch kein p27^Kip1-Protein des Zellkerns aufweisen. Eine kürzliche Studie über DLBCL unter Verwendung von Mikroarrays zeigt, dass die mRNA für p27^Kip1 bei einer aktivierten B-artigen Unterart, die mit einer schlechten Prognose in Zusammenhang steht, im Vergleich zu einer Keimzentrum-artigen Untergruppe, welche für p27^Kip1 weniger mRNA-Expression zeigt, hochreguliert ist (Alizadeh, A. A., M. B. Eisen, R. E. Davis, C. Ma, I. S. Lossos, A. Rosenwald, J. C. Boldrick, H. Sabet, T. Tran, X. Yu, J. I. Powell, L. Yang, G. E. Marti, T. Moore, J. Hudson Jr, L. Lu, D. B. Lewis, R. Tibshirani, G. Sherlock, W. C. Chan, T. C. Greiner, D. D. Weisenburger, J. O. Armitage, R. Warnke, R. Levy, W. Wilson, M. R. Grever, J. C. Byrd, D. Botstein, P. O. Brown und L. M. Staudt, 2000. Nature 403: 503–511), was darauf hindeutet, dass transkriptionelle Regulierung von p27^Kip1-Expression bei diesen Malignomen auftritt. Wir schlagen vor, dass das FOXP1-Protein eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Malignomen spielen kann, wobei ein möglicher Mechanismus dessen Wirkung auf die Expression des p27^kip1-Proteins darstellt.
Expression von FOXP1 bei Pankreastumoren
Zur Bereitstellung von experimentellem Nachweis betreffend die Expression des FOXP1-Proteins bei Pankreastumoren haben die vorliegenden Erfinder Paraffin-eingebettete normale und Pankreastumorgewebe, die sie vom John Radcliffe Hospital, Oxford, erhalten haben, mit dem monoklonalen JC12-Antikörper immungefärbt. Die Daten sind in 17 dargestellt. Zunächst wurde die Expression des FOXP1-Proteins im Pankreas eines Patienten ohne Tumoren zur Bestätigung untersucht, dass die Expressionsmengen des Proteins denjenigen des „normalen" Pankreas, der Krebspatienten entnommen wurde, ähnlich war. Bei normalem Pankreas zeigen etwa 80–90% der Zellen in dem Ausführungsgang mäßige bis starke FOXP1-Expression des Zellkerns; exokrine Drüsen zeigen die meisten Zellen mit mäßiger FOXP1-Expression des Zellkerns und die Mehrheit der übrigen Zellen zeigt ein wenig Proteinexpression des Zellkerns. Gänge zeigen FOXP1-Proteinexpression des Zellkerns und mehr zytoplasmatische Proteinexpression als die endokrinen Zellen, obwohl diese Mengen ziemlich variabel sind. Im Fall A zeigen die Tumorzellen keine erhöhte Expression des FOXP1-Proteins bei Vergleich mit normalem Gewebe, und der Tumor enthält einen Anteil negativer Zellkerne. In den Fällen B, C und E zeigt der Tumor Verlust der FOXP1-Expression im Zellkern und sehr starke zytoplasmatische Expression dieses Proteins. In Fall E zeigt der Pfeil einen Bereich des Tumors, in welchem die bösartigen Zellen nukleäre Expression des FOXP1-Proteins zeigen, während andere Bereiche zytoplasmatische Expression zeigen, was darauf hindeutet, dass Variation in der FOXP1-Proteinexpression innerhalb eines Tumors auftreten kann. In Fall D sind die Tumorzellen mit Pfeilen angezeigt, und diese zeigen sehr niedrige Mengen des FOXP1-Proteins im Zellkern. Zusammenfassend zeigte keiner der fünf Pankreastumor-Fälle Überexpression des FOXP1-Proteins im Zellkern. Während 3/5 der Fälle einen Verlust von FOXP1-Proteinexpression im Zellkern und hohe Mengen von zytoplasmatischer Proteinexpression zeigten, zeigten die übrigen zwei Fälle Verlust von Proteinexpression im Zellkern ohne hohe Mengen von zytoplasmatischem Protein. FOXP1-Überexpression war für alle Pankreastumoren nicht charakteristisch, und es gab in keinem dieser fünf Fälle einen Beweis für eine erhöhte Expression eines FOXP1-Proteins im Zellkern. Die erhöhte zytoplasmatische FOXP1-Proteinexpression in drei dieser Tumoren kann das Ergebnis von erhöhten mRNA-Mengen oder alternativ von erhöhter Stabilität des Proteins sein. Die anomale Lokalisierung dieses Proteins entspricht jedoch nicht der funktionellen Überexpression dieses normalen Proteins im Zellkern. In den Fällen, welche starke zytoplasmatische Anfärbung zeigten, war dies ein sehr guter Marker für Pankreastumorzellen, und sogar vereinzelte neoplastische Zellen waren nach JC12-Immunfärbung leicht sichtbar zu machen. Folglich konnte die vorliegenden Erfinder keine Überexpression des FOXP1-Proteins im Zellkern in Pankreastumoren nachweisen und Verlust von FOXP1-Expression im Zellkern war eher die allgemeine Regel.
Expression von FOXP1 in Magentumoren.
Daten, die von Clontechs abgestimmtem Tumor/Normal-Array erhalten wurden, der mit der FOXP1-cDNA sondiert ist, deuteten darauf hin, dass Magentumoren höhere Mengen von FOXP1-mRNA exprimierten als das angrenzende phänotypisch normale Gewebe aus demselben Patienten. Zur Untersuchung der Expression des FOXP1-Proteins in diesen Tumoren wurden Fälle aus den Routinekarteien des Histopathology Department of the Emek Medical Centre (Afula-Israel) erhalten. Zum Nachweisen der Expression des FOXP1-Proteins wurden in Paraffin-eingebettete Schnitte unter Verwendung des monoklonalen JC12-Antikörpers immungefärbt. Diese Studie umfasste 43 Proben, die dem operativ entfernten Magen entnommen wurden, einschließlich 20 Adenokarzinomen, und 27 Proben von normaler Magenschleimhaut (14 Fälle von normalem chirurgischen Überschuss von Magenkarzinomen und 13 Fälle von Magenresektionen in gutartigem Zustand, hauptsächlich Ulcus-Krankheit-PUD). Typische Ergebnisse sind in 18 veranschaulicht und in der Figurenlegende beschrieben.
Die Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern in den unterschiedlichen Klassen von Karzinomen schwankt zwischen denjenigen, die keine nachweisbare FOXP1-Proteinexpression im Zellkern aufweisen und denjenigen mit starker Proteinexpression im Zellkern. Die Mehrheit der Fälle exprimiert das FOXP1-Protein im Zellkern schwach. In den meisten der Fälle ist die FOXP1-Expression im Zellkern bei den unterschiedlichen Anfärbungsintensitäten, die in den Bereichen desselben Tumors beobachtet wurden, heterogen (Beispiele sind in F und Vergleiche zu E & H oder G & J veranschaulicht). Den deutlichsten Unterschied zwischen normalen und Tumorzellen stellt die zytoplasmatische Anfärbung dar. Daher besteht bei den malignen Zellen eine deutlich verminderte Expression von zytoplasmatischem FOXP1 im Vergleich zu deren normalem Gegenstück (welche üblicherweise nur niedrige Mengen, wenn überhaupt eine FOXP1-Proteinexpression im Zellkern aufweisen). Nur in wenigen Fällen oder in fokalen Bereichen innerhalb eines Falls wurde starke zytoplasmatische Expression beobachtet. Diese Veränderung der zytoplasmatischen Anfärbung wurde auch in metaplastischen Zellen (D) beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Veränderung früh auftritt und nachweisbar ist, bevor die Zellen bösartig werden.
Expression von FOXP1 bei Diffusen Großen B-Zell-Lymphomen (DLBCL)
Diffuses Großes B-Zell-Lymphom (DLBCL) macht 30–40% aller adulten Non-Hodgkin's-Lymphome aus und ist im Hinblick auf deren Morphologie und klinischen Merkmale heterogen (Harris, et al., 1994. 84: 1361–1392). Etwa 50 der Patienten erleiden nach der Behandlung einen Rückfall (The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification Project. 1997. Blood 89: 3909–3918) und ihre Tumoren werden häufig gegenüber Therapie resistent. Die genetischen Anomalien, die DLBCL zugrunde liegen, werden nur wenig verstanden und im Gegensatz zu anderen Lymphomarten (z.B. großfollikuläres Lymphom oder Burkitt's-Lymphom) ist keine einzige charakteristische genetische Veränderung nachgewiesen worden.
Es sind Studien durchgeführt worden, die nahelegen, dass DLBCL in Unterarten eingeteilt werden kann. Das Kiel-Klassifizierungsschema hat auf Grundlage morphologischer Kriterien vorgeschlagen, dass einige DLBCL aus B-Zellen des Keimzentrums und andere aus extrazellulären B-Zellen hervorgehen („zentroblastische" bzw. „immunoblastische" Lymphome) (Lennert, et al. 1975. Br. J. Haemolol., 31 (Ergänzung): 193–203). Es besteht jedoch Uneinigkeit darüber, ob sich Unterarten im Hinblick auf ihr klinisches Verhalten unterscheiden (Stein und Dallenbach. 1992. In D. M. Knowles (Hrgs.), Neoplastic Hematopathology. (S. 675–714). Baltimore: Williams & Wilkins; Baars, et al. 1991. Cancer 68: 1988–1993). Das Fehlen objektiver Kriterien für diese Kategorien (zum Beispiel immunphänotypische Einzelheiten) zusammen mit dem Mangel an Reproduzierbarkeit in deren Diagnose bedeutet, dass einige wenige Zentren versuchen, DLBCL morphologisch einzuteilen, und eine solche Unterteilung ist in der „WIRKLICHEN" Klassifizierung nicht beschrieben (Harris, et al. 1994. Blood, 84: 1361–1392). Jüngste genetische Studien haben den Beweis für die Möglichkeit von mindestens zwei Unterkategorien von DLBCL bereitgestellt. Das Vorliegen der (14; 18) Translokation bei einer Minderheit der Fälle legt nahe, dass einige DLBCL transformierte/diffuse großfollikuläre Lymphome darstellen (möglicherweise im Zusammenhang mit dem Erwerb von MYC- und p53-Anomalien), im Gegensatz zu den allgemeineren „de novo"-Fällen (an welchen das BCL-6-Gen beteiligt sein kann (Dalla-Favera, et al. 1994. Ann. Oncol., 5 Ergänzung: S55–S60). Eine kürzliche Studie unter Verwendung von Methoden auf Grundlage von Mikroarrays zur Untersuchung der DLBCL-Genexpression behauptet ebenfalls, zwei Untergruppen von DLBCL identifiziert zu haben, wobei diejenigen mit einem Keimzentrum-artigen Profil eine bessere Prognose aufweisen als diejenigen mit einem aktivierten B-artigen Profil (Alizadeh, et al. 2000. Nature 403: 503–511). Dieser Ansatz ist jedoch im klinischen Tagesablauf noch nicht zweckmäßig und stellt darüber hinaus keinen Beweis für die Expression von funktionellen Proteinen bereit. Es besteht daher ein deutlicher Bedarf zur Identifizierung von genetischen Veränderungen, die mit DLBCL in Zusammenhang stehen, und zu deren Einsatz, wenn diese klinisch relevante Untergruppen definieren.
Expression des FOXP1-Proteins in Fällen von DLBCL, welche unter Verwendung von genetischen Merkmalen unterteilt worden sind.
Fälle von DLBCL, welche auf Grundlage eines allgemeinen genetischen Hintergrundes dahingehend unterteilt worden sind, dass sie entweder vom Keimzentrum- (CD10+, BCL-6 > 70% Zellen positiv, 14q32 Translokation vorhanden, clg negativ) oder post-germinalem Zentrum- (CD10–, BCL-6 < 50% Zellen positiv, 14q32 negativ, clg positiv) Phänotyp stammen, wurden von Dr. German Ott, (Würzburg) bereitgestellt. Immunoanfärbung dieser Fälle mit dem JC12-Antikörper (ohne vorheriges Wissen über die Untergruppierung) identifizierte in 4/6 der Fälle von Keimzentrum-Phänotyp entweder schwache oder keine FOXP1-Proteinexpression (GC obere Reihe, Fig. Z) und mäßig hohe Expression des FOXP1-Proteins in 6/8 der Fälle vom Phänotyp des post-germinalen Zentrums (postGC untere Reihe, 19). Diese Untergruppen sind nicht notwendigerweise dieselben wie diejenigen in der Mikroarray-Studie, aber dieses Verfahren war für die Analyse dieser Fälle nicht verfügbar. Diese Daten zeigen jedoch an, dass die Expression des FOXP1-Proteins eine diagnostische Verwendung bei der Untergruppierung dieser Erkrankung aufweisen kann.
Beziehung zwischen FOXP1-Expression, regulatorischen Proteinen des Zellzyklus und der klinischen Folge von DLBCL.
Zwei vorher veröffentlichte Studien haben die Expression der regulatorischen Proteine des Zellzyklus bei DLBCL-Fällen untersucht, die von dem „Virgin de la Salud"-Krankenhaus, Toledo, Spanien, erhalten wurden (Sanchez E., et al. J Clin Oncol. 1998; 16 (5): 1931–9; Saez A., et al. Br. J. Cancer. 1999; 80 (9): 1427–34). Immunfärbung dieser Fälle ermöglichte den Vergleich von FOXP1-Proteinexpression mit der Expression anderer Moleküle, wie zum Beispiel p27^kip1, MIB-1, P53, BCL-2, p21^Waf1, MDM2, Rb und klinischer Information wie zum Beispiel Gesamtüberleben, Überleben ohne Erkrankung, Ende des Überlebens ohne Erkrankung, Ende des Gesamtüberlebens, Stadium, LDH, extranodaler Ursprung, Patientenalter, und IPI-Auswertung.
Immunfärbung von 96 dieser Fälle mit dem JC12-Antikörper wurde durch einen qualifizierten Pathologen ausgewertet, der die Diagnose von DLBCL auch bestätigte. Die immunohistochemische Anfärbung wurde für jeden Fall beurteilt nach: –

1. positiv (68 Fälle) oder negativ (28 Fälle)
2. Anzahl positiver Zellen
3. Stärke der Anfärbung

Vorläufige statistische Analysen dieser Daten wurden unter Verwendung des Programms Statview durchgeführt. Nominelle und kontinuierliche Kategorien wurden unter Verwendung von nicht-parametrischen Tests (entweder Mann-Whitney oder Kruskal-Wallis) verglichen und nominelle Kategorien wurden unter Verwendung von Kontingenztabellen verglichen. Ergebnisse der JC-12-Markierung wurden in statistischen Analysen als nominelle Kategorien behandelt. Überlebensdiagramme wurden unter Verwendung von Kaplan-Meier-Diagrammen hergestellt.
Eine interessante Eigenschaft der FOXP1-Expression von DLBCL war diejenige, dass eine signifikante Beziehung zwischen der Stärke der Anfärbung und dem prozentualen Anteil positiver Zellen (P-Wert, 0,0001) bestand. Es gab keine Fälle, die eine starke Intensität der Anfärbung zeigten, wobei weniger als 10% JC12-positive Zellen vorlagen.
Beim Untersuchen der Signifikanz positiver oder negativer FOXP1-Expression in Analysen mit einem Freiheitsgrad identifizierten wir eine Beziehung zwischen der Expression von FOXP1- und Retinoblastom-(Rb)Proteinen mit FOXP1-negativen Fällen, die einen niedrigeren prozentualen Anteil von Rb-positiven Zellen enthielten (P-Wert 0,0015).
Vergleiche unter Verwendung des prozentualen Anteils von FOXP1-positiven Tumorzellen identifizierten diese Beziehung wiederum mit Expression des Rb-Proteins (P-Wert 0,0061) und einer Beziehung mit dem Alter der Patienten (P-Wert 0,0381). Wenn Fälle mit mehr als 50% positiven Zellen (Gruppe 3) mit allen anderen verglichen wurden, wurde diese Beziehung für Retinoblastomexpression (P-Wert 0,0064) beibehalten und es bestand eine zusätzliche signifikante Beziehung mit MIB-1-Positivität (P-Wert 0,0312), was auf eine höhere Zellproliferationsrate in dieser Teilmenge von Fällen hindeutet. Dies war unerwartet, da die MIB-1-Anfärbung von normalen Mandeln angezeigt hat, dass FOXP1-Proteinexpression normalerweise in Zellen im Ruhezustand höher war.
Vergleiche unter Verwendung der Intensität von FOXP1-Expression identifizierten wiederum die Beziehung zwischen ansteigenden FOXP1-Mengen, die erhöhte Mengen des Rb-Proteins wiederspiegeln (P-Wert 0,0508), und wiederum bestand eine Beziehung zu dem Alter der Patienten (P-Wert 0,0104). Es bestand auch eine zusätzliche Beziehung zwischen der Intensität der FOXP1-Expression und der Expression des P53-Tumorsuppressorgens (P-Wert 0,0215) mit der stärksten angefärbten FOXP1-Gruppe, die niedrigere p53-Expression als die anderen zeigt. Beim Vergleichen der stärksten angefärbten Gruppe (Gruppe 3) mit allen anderen Gruppen bestand immer noch eine signifikante Beziehung zwischen der Expression von Rb (P-Wert 0,0241), dem Alter der Patienten (P-Wert 0,0169) und P53 (P-Wert 0,0037)-Proteinen.
Der Verlust von Retinoblastomprotein hat eine nachteilige Wirkung auf das Überleben von Tumoren unterschiedlicher Abstammungen ergeben (Cance WG, Brennan MF, Dudas ME, et al. N Engl. J. Med. 323: 1457–1462, 1990). Diese Beziehung wurde durch die veröffentlichte Studie über die DLBCL-Fallserien sowohl in Analysen mit einem Freiheitsgrad als auch in Analysen mit mehreren Freiheitsgraden bestätigt (Sanchez E., et al. J. Clin. Oncol. 1998; 16 (5): 1931–9). In unserer vorläufigen Analyse mit einem Freiheitsgrad haben wir bestimmt, dass es eine signifikante Beziehung zwischen sowohl der Anzahl der Zellen, die FOXP1 exprimieren, als auch der Intensität dieser FOXP1-Expression besteht, wenn diese mit der Expression des Retinoblastomproteins verglichen wird, welche darauf hindeutet, dass FOXP1-Proteinexpression einen prognostischen Wert für DLBCL aufweist. Dies ist insbesondere im Hinblick auf unsere Sequenzanalyse des FOXP1-Proteins signifikant, welche cdk-Phosphorylierungsstellen und -motive identifiziert hat, welche an der Cyclinbindung in diesem Protein beteiligt sein können. Diese Domänen liegen auch in dem Retinoblastomprotein vor, welches wichtige Rollen bei der Kontrolle des Zellzyklus und Schutz vor Apoptose spielt.
Zusammenfassend haben wir die unterschiedliche Expression des FOXP1-Proteins bei DLBCL identifiziert und unsere vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass die Expression von FOXP1 einen prognostischen Wert bei diesen Malignomen aufweisen kann. Obwohl unsere Analyse mit einem Freiheitsgrad keine signifikante Beziehung zwischen FOXP1-Expression und klinischer Folge identifizierten, legen die Kaplan Meier-Diagramme (20) nahe, dass ein Unterschied zwischen dem Überleben in Fällen ohne FOXP1-Expression und denjenigen mit entweder hoher Intensität oder hohem prozentualen Anteil positiver FOXP1-Expression bestehen kann.
Expression von FOXP1 in Dickdarmtumoren
Die Studie umfasste 40 in Paraffin eingebettete Schnitte, die 28 operativ entfernten Dickdarmproben entnommen wurden. Diese umfassten 20 Tumore, die 19 Patienten entnommen wurden, zusammen mit 11 Schnitten aus normalem chirurgischen Überschuss und 6 Schnitten, die Dickdarmentfernung entnommen wurden, welche auf gutartige Zustände hin (Divertikulose, Darmverschlingung, traumatische Perforation, ischämische Darmerkrankung und Crohn's-Erkrankung) als normale Kontrollen durchgeführt wurden. Die Fälle wurden aus den Akten des Histopathology Department of the Emek Medical Centre (Afula-Israel) erhalten. Die routinemäßig verarbeiteten Paraffinschnitte wurden unter Verwendung des monoklonalen JC12-Antikörpers zum Nachweis der Expression des FOXP1-Proteins immungefärbt. Die Ergebnisse sind in 21 veranschaulicht.
Zusammenfassend ist die Anfärbung des Zellkerns und in einem geringeren Ausmaß die zytoplasmatische Anfärbung mit dem monoklonalen JC12-Antikörper (entsprechend der Expression des FOXP1-Proteins) heterogen, sowohl bei Vergleich unterschiedlicher Tumoren als auch innerhalb der Bereiche desselben Tumors. Es besteht bei den Karzinomen (18/20) im Vergleich zu der nicht-neoplastischen Schleimhaut (Kontrollen und chirurgischer Überschuss von Tumor) eine eindeutige Tendenz im Hinblick auf verminderte zytoplasmatische FOXP1-Expression. Die Mehrheit der Dickdarmkarzinome (15/20) zeigen auch schwache bis nicht-vorhandene FOXP1-Expression des Zellkerns. Diese JC12-Immunoanfärbungsdaten unterstützen unsere Ergebnisse, die wir durch die Untersuchung der FOXP1-mRNA-Expression von Dickdarmtumoren unter Verwendung des abgestimmtem Clontech's Tumor/Normal-Expressionsarrays erhalten haben. Unser Daten zeigen, dass die Mehrheit der Dickdarmtumoren, welche wir untersucht haben, einen Verlust der FOXP1-Expression sowohl auf Ebene der mRNA- als auch der Proteinexpression zeigen.
FOXP1-Expression bei Mantelzell-Lymphomen (MCL)
Mantelzelllymphom-Fälle wurden von Dr. Elias Campo aus Barcelona, Spanien, bereitgestellt, der eine Studie veröffentlicht hat, die zu dem Schluss kommt, dass die blastische Variante des Mantelzelllymphoms trotz dessen höherer Proliferationsrate dazu neigte, höhere Mengen des p27^Kip1-Proteins zu exprimieren (Quintanilla-Martinez, L. et al., Am. J. Path. 1998, 153: 175–182). Zur Beurteilung der Expression des FOXP1-Proteins in diesen Neoplasmen färbten wir sowohl normale als auch blastische Varianten des Mantelzell-Lymphoms mit dem JC12-Antikörper immunologisch an.
Diese Daten sind in 22 veranschaulicht. Die obere Reihe der Figur veranschaulicht 7 Fälle von Mantelzell-Lymphomen, während die untere Reihe 5 Fälle der blastischen Variante des Mantelzell-Lymphoms veranschaulicht. Wir haben herausgefunden, dass 4/5 der Fälle der blastischen Variante von MCL im Vergleich zu nur 2/7 der Fälle von typischem MCL sehr hohe Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern zeigt. Für die blastische Variante von MCL ist im Gegensatz zu den üblichen Fällen gezeigt worden, dass sie ein häufiges Auftreten von Mutationen und Deletionen bei negativen regulatorischen Genen des Zellzyklus aufweist (p53, p16^INK4a und p21^Waf1), welche zur Entwicklung einer aggressiveren Erkrankung mit höherer Proliferationsaktivität beitragen (Pinyol M. et al., Blood 1997, 89: 272–280; Hernandez, L. et al., Blood 1996, 87: 3351–3359).
Mantelzelllymphome sind durch die t (11; 14) Translokation charakterisiert, welche zu Überexpression von Cyclin D1 führt. Cyclin D1 an sich weist nur eine geringe Transformationsaktivität auf, und für eine Anzahl von anderen Proteinen ist gezeigt worden, dass sie mit diesem Protein in Wechselwirkung stehen und dessen onkogene Aktivität erhöhen (zusammengefasst in Quintanilla-Martinez, L. et al., Am. J. Path. 1998; 153: 175–182). Da das FOXP1-Protein potenzielle Cyclin-Bindungsstellen enthält, kann dieses Protein eine Rolle spielen, die die Transformationsaktivität von Cyclin D1 beeinträchtigt. Die Überexpression des FOXP1-Proteins kann auch zur Unterstützung der Unterscheidung der aggressiveren blastischen Variante des Mantelzell-Lymphoms geeignet sein.
(Quintanilla-Martinez, L. et al., Mantle Cell Lymphomas Lack Expression of p27^kip1, a Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor Am. J. Path. 1998; 153: 175–182 Pinyol M. et al., Deletions and loss of expression of p16^INK4a and P21^Waf1 genes are associated with aggressive variants of Mantle cell lymphomas. Blood 1997, 89: 272–280; Hernandez, L. et al., p53 gene mutations and protein overexpression are associated with aggressive variants of mantle cell lymphomas. Blood 1996, 87: 3351–3359).
Expression von FOXP1 bei Prostatatumoren
Schnitte von Mehrgewebeblöcken, die Fälle von Prostatatumoren zusammen mit etwas normalen und prämalignen Geweben enthalten, wurden von Dr. Elias Campo und Dr. Pedro Fernàndez aus Barcelona, Spanien, bereitgestellt. Das normale Prostatagewebe zeigte entweder vereinzelte zytoplasmatische oder vereinzelte zytoplasmatische Expression sowie Expression des FOXP1-Proteins im Zellkern (nicht im Allgemeinen in derselben Zelle). Von den 27 Tumoren, die mit dem JC12-Antikörper angefärbt sind, exprimierten 9 Fälle kein FOXP1-Protein, während 7 Fälle zytoplasmatische Expression und 10 Fälle nukleäre FOXP1-Proteinexpression zeigten. Die Expression von FOXP1 in diesem Gewebe war sehr komplex und es lag kein allgemeines Gesamtmuster vor. In mehreren Fällen lag jedoch ein deutlicher Unterschied zwischen der Expression des FOXP1-Proteins in normalem Gewebe und in dem Tumor aus demselben Patienten vor. Natürlich haben wir auch Tumoren beobachtet, welche höhere Mengen des FOXP1-Proteins als das normale Gewebe exprimieren, sei es denn, dass es im Zellkern oder im Zytoplasma lokalisiert ist. Diese FOXP1-Überexpression zusammen mit dessen Expressionsverlust in anderen Prostatatumoren deutet darauf hin, dass diese differenzielle Expression des FOXP1-Proteins klinische Auswirkungen in diesen Malignomen haben kann.
Therapeutisches/Diagnostisches Potenzial
1. Verwendung von FOXP1 zum frühen Nachweis von Malignomen und als prognostischer Indikator.
Sowohl der Verlust von LOH auf 3p als auch verminderte p27^Kip1-Proteinexpression sind als frühe Ereignisse bei der Entwicklung solider Tumoren bekannt und stehen mit einer schlechten Prognose im Zusammenhang. Da gezeigt worden ist, dass Verlust der FOXP1-Proteinexpression im Zellkern mit diesen Beobachtungen im Zusammenhang steht, könnte die Analyse der FOXP1-Gensequenz oder anomaler Muster der mRNA- oder Proteinexpression eine große Auswahl an Anwendungen für Durchmusterungsprogramme zum frühen Nachweis von prämalignen Läsionen bei einer Auswahl von Tumorarten, z.B. Zervikal-, Brust-, Prostata-, Magen-, Dickdarm-, Nieren-, Kopf-und-Nacken- und Lungentumor, aufweisen. Die Anfärbung mit dem JC12-Antikörper zusammen mit der Anfärbung von p27^Kip1 könnte zu einer verlässlicheren Prognose sowohl bei hämatologischen als auch bei nicht-hämatologischen Malignomen führen.
2. Genetische Durchmusterung
Da immer mehr Informationen verfügbar sind, ist es möglich, dass vererbte Mutationen im FOXP1-Gen nachgewiesen werden. Die Identifizierung von vererbten Mutationen könnte zum Durchmustern von Familien mit einer Prädisposition gegenüber einer Reihe von Krebsarten führen.
3. Entwicklung effektiver Behandlungspläne.
Da berichtet worden ist, dass Herunterregulation von p27^Kip1 die Sensitivität gegenüber Anti-Krebsmitteln erhöht, (St Croix, B. et al. 1996. Nat. Med. 2: 1204–1210) ist vorgeschlagen worden, dass Patienten mit schwacher p27^Kip1-Expression in deren Tumoren angesichts ihrer schlechten Prognose die besten Kandidaten für adjuvante Chemostrahlentherapie sind (Shamma, A., Y. Doki, T. Tsujinaka, H. Shiozaki, M. Inoue, M. Yano, K. Kawanishi und M. Monden, 2000. Oncol. 58: 152–158). Beurteilung des FOXP1-Status dieser Patienten kann diesen Prozess auch unterstützen.
4. Gentherapie
Da sich die Methode der Gentherapie immer mehr bewährt, könnte die Einführung des FOXP1-Gens in Tumoren zum Behandeln von Patienten verwendet werden, welche keine funktionelle Kopie dieses Gens aufweisen.
5. Tierärztliche Anwendung
Der FOXP1-Antikörper JC12 war in der Lage, das Foxp1-Protein der Maus in Mausmilz und das African Green Monkey-Protein in COS-Zellen nachzuweisen. Diese Kreuzreaktivität zwischen den Arten wirft die Möglichkeit auf, dass Nachweis des FOXP1-Proteins bei der Beurteilung der Prognose/Behandlung von Tumoren aus anderen Tierarten tierärztlich verwendet werden kann.
Referenzen

Aburent, H., Wang, Y., Shibata, Y., Noda, T., Schwarz, D., & D., H. (1994). Am. J. Hum. Genet., 55 Suppl., 269.
Adams, P. D., Sellers, W. R., Sharma, S. K., Wu, A. D., Nalin, C. M., & Kaelin Jr, W. G. (1996). Identification of a cyclin-cdk2 recognition motif present in substrates and p21-like cyclin-dependent kinase inhibitors. Mol. Cell. Biol., 16, 6623–6633.
Alizadeh, A. A., Eisen, M. B., Davis, R. E., Ma, C., Lossos, I. S., Rosenwald, A., Boldrick, J. C., Sabet, H., Tran, T., Yu, X., Powell, J. I., Yang, L., Marti, G. E.,. Moore, T., Hudson Jr, J., Lu, L., Lewis, D. B., Tibshirani, R., Sherlock, G., Chan, W. C., Greiner, T. C., Weisenburger, D. D., Armitage, J. O., Warnke, R., Levy, R., Wilson, W., Grever, M. R., Byrd, J. C., Botstein, D., Brown, P. O., & Staudt, L. M. (2000). Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature, 403, 503–511.
Asante-Owusu, R. N., Banham, A. H., Böhnert, H. U., Mellor, E. J. C. & Casselton, L. A. 1996. Heterodimerizatign between two classes of homeodomain proteins in the mushroom Coprinus cinereus brings together potential DNA-binding and activation domains. Gene 172: 25–31.
Alkema, M. J., Jacobs, H., van Lohuizen, M., & Berns, A. (1997). Peturbatian of B and T cell development and predisposition to lymphomagenesis in Eμ-Bmi1 transgenic mice require the Bmi1 RING finger. Oncogene, 15, 899–910.
Baars, J. W., de Jong, D., Willemse, E. M., Gras, L., Dalesio, O., v. Heerde, P., Huygens, P. C., v.d. Lelie, H., & Kr v.d. Borne, A. E. G. (1999). Diffuse large B-cell non-Hodgkin lymphomas: the clinical relevance of histological subclassification. Br. J. Cancer, 79, 1770–1776.
Bergthorsson, J. T., Johannsdottir, J., Jonasdottir, A., Eiriksdottir, G., Egilsson, V., Ingvarsson, S., Barkardottir, R. B., & Arason, A. (1998). Chromosome imbalance at the 3p14 region in human breast tumors: High frequency in patients with inherited predisposition due to BRCA2. Eur. J. Cancer, 34, 142–147.
Béroud, C., Joly, D., Gallou, C., Staroz, F., Orfanelli, M. T., & Junien, C. (1998). Software and database for the analysis of mutations in the VHL gene. Nucl. Acids Res., 26, 256–258.
Bockmühl, U., Wolf, G., Schmidt, S., Schwendel, A., Jahnke, V., Dietel, M., & Petersen, I. (1998). Genomic alterations associated with malignancy in head and neck cancer. Head & Neck, 20, 145–151.
Brauch, H., Johnson, B., Hovis, J., Yano, T., Gazdar, A., Pettengill, O. S., Graziano, S., Sarenson, G. D., Poiesz, B. J., Minna, J., & al, e. (1987). Molecular analysis of the short arm of chromosome 3 in small-cell and non-small-cell carcinoma of the lung. N. Engl. J. Med., 317, 1109–1113.
Brauch, H., Tory, K., Kotler, F., Gazdar, A. F., Pettengill, O. S., Johnson, B., Graziano, S., Wintin, T., Buys, C. H., Sorenson, G. D., Poiesz, B. J., Minna, J. D., & Zbar, B. (1990). Molecular mapping of deletion sites in the spart arm of chromosome 3 in human lung cancer. Genes Chrm. Cancer, 1, 240–246.
Buchhagen, D. L. (1996). Frequent involvement of chromosome 3p alterations in lung carcinogenesis: allelotypes of 215 established cell lines at six chromosome 3p loci. J. Cell. Biochem. Suppl., 24, 198–209.
Buchhagen, D. L., Worsham, M. J., Dyke, D. L., & Carey, T. E. (1996). Two regions of homozygosity on chromosome 3p in squamous cell carcinoma of the head and neck: comparison with cytogenetic analysis. Head Neck, 18, 529–537.
Bugert, P., Kenck, C., Wilhelm, M., & Kovacs, G. (1995). Refining a proximal breakpoint cluster at chromosome 3p11.2 in non-papillary renal cell carcinomas. Int. J. Cancer, 68, 723–726.
Bugert, P., Wilhelm, M., & Kovacs, G. (1997). FHIT gene and the FRA3B region are not involved in the genetics of renal cell carcinomas. Genes Chrm. Cancer, 20, 9–15.
Cairns, P., Polascik, T. J., Eby, Y., Tokino, K., Califano, J., Merlo, A., Mao, L., Herath, J., Jenkins, R., Westra, W., Rutter, J. L., Buckler, A., Gabrielson, E., Tockman, M., Cho, K. R., Hedrick, L., Bova, G. S., Isaacs, W., Koch, W., Schwab, D., & Sidransky, D. (1995). Frequency of homozygous deletion of p16/CDKN2 in primary human tumours. Nature Genet., 11, 210–212.
Califano, J., van der Riet, P., Westra, W., Nawroz, H., Clayman, G., Piantadosi, S., Corio, R., Lee, D., Greenberg, B., Koch, W., & Sidransky, D. (1996). Genetic progression model for head and neck cancer: implications for field cancerization. Cancer Res., 56, 2488–2492.
Cance WG, Brennan MF, Dudas ME, et al. Altered expression fo the retinoblastoma gene product in human sarcomas. N Engl. J. Med. 323: 1457–1462, 1990.
Casaccia-Bonnefil, P., Tikoo, R., Kiyokawa, H., & al., e. (1997). Oligodendrocyte precursor differentiation is perturbed in the absence of the cyclin-degendent kinase inhibitor p27^Kip1. Genes Dev., 11, 2335–2346.
Catzavelos, C., Bhattacharya, N., Ung, Y. C., Wilson, J. A., Roncari, L., Sandhu, C., Yeger, H., Morava-Protzner, I., Kapusta, L., Franssen, E., Pritchard, K. I., & Slingerland, J. M. (1997). Decreased levels of the cell cycle inhibitor p27^kip1 protein: Prognostic implication in primary breast cancer. Nature Med., 3, 227–230.
Catzavelos, C., Tsao, M. S., DeBoer, G., Bhattacharya, N., Shepherd, F. A., & Slingerland, J. M. (1999). Reduced expression of the cell cycle inhibitor p27^kip1 in non-small cell lung carcinoma: a prognostic factor independent of Ras. Cancer Res., 59, 684–688.
Cebon, J. MacGregor, D, Scott, A. and DeBoer, R. 1997. Australas J. Dermatol. 38; S66–72.
Chen, L. C., Matsumura, K., Deng, G., Kurisu, W., Ljung, B. M., Lerman, M. I., Waldman, F. M., & Smith, H. S. (1994). Deletion of two separate regions on chromosome 3p in breast cancers. Cancer Res., 54, 3021–3024.
Chino, K., Esumi, M., Ishida, H., & Okada, K. (1999). Charactertic loss of heterozygosity in chromosome 3p and low frequency of replication errors in sporadic renal cell carcinoma. J. Urol., 162, 614–618.
Clurman, B. E., & Porter, P. (1998). New insights into the tumor suppression function of P27(kip1). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15158–15160.
Cote, R. J., Shi, Y., Groshen, S., Feng, A. C., Cordon-Cardo, C., Skinner, D., & Lieskovosky, G. (1998). Association of p27^kip1 levels with recurrence and survival in patients with stage C prostate cancer. J. Natl. Cancer Inst., 90, 916–920.
Dalla-Favera, R., Yye, B. H., Le Coco, F., G., G., Lista, F., Knowles, D. M., Louie, D. C., Offit, K., & Chaganti, R. S. K. (1994). Identification of genetic lesions associated with diffuse large-cell lymphoma. Ann. Oncol., 5 Suppl, S55–S60.
Decker, H. J., Weidt, E. J., & Brieger, J. (1997). The von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. A rare and intriguing disease opening new insight into basic mechanisms of carcinogenesis. Cancer Genet. Cytogenet., 93, 74–83.
Devilee, P., van den Broek, M., Mannens, M., Slater, R., Cornelisse, C. J., Westerveld, A., & Khan, P. M. (1991). Differences in patterns of allelic loss between two common types of adult cancer, breast and colon carcinoma, and Wilms' tumor of childhood. Int. J. Cancer, 47, 817–821.
Devillee, P., van den Broek, M., Kuipers-Dijkshoorn, N., Kolluri, R., Meera Khan, P., Pearson, P. L., & Cornelisse, C. J. (1989). At least four different chromosomal regions are involved in loss of heterozygosity in human breast carcinoma. Genomics, 5, 554–560.
Dietrich, C. U., Pandis, N., Teixeira, M. R., Bardi, G., Gerdes, A. M., Anderson, J. A., & Heim, S. (1995). Chromosome abnormalities in benign hyperproliferative disorders of epithelial and stromal breast tissue. Int. J. Cancer, 60, 49–53.
Durand, B., Gao, F. B., & Raff, M. (1997). Accumulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27^Kip1 and the timing of oligodendrocyte differentiation. EMBO J., 16, 306–317.
Eiriksdottir, G., Barkardottir, R. B., Agnarsson, B. A., Johannesdottir, G., Olafsdottir, K., Egilsson, V., & Ingvarsson, S. (1998). High incidence of loss of heperozygosity at chromosome 17p13 in breast tumors from BRCA2 mutation carriers. Oncogene, 16, 21–26.
Emilion, G., Langdon, J. D., Speight, P., & Partridge, M. (1996). Frequent gene deletions in potentially malignant oral lesions. Br. J. Cancer, 73, 809–813.
Esposito, V., Baldi, A., De-Luca, A., Groger, A. M., Loda, M., Giordano, G. G., Caputi, M., Baldi, F., Pagano, M., & Giordano, A. (1997). Prognostic role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in non-small cell lung cancer. Cancer Res., 57, 3381–3385.
Euhus, D. M., Maitra, A., Wistuba, I. I., Alberts, A., Albores-Saavedra, J., & Gazdar, A. F. (1999). Loss of heterozygosity at 3p in benign lesions preceding invasive breast cancer. J. Surg. Res., 83, 13–18.
Eyfjord, J. E., Thorlacius, S., Steinarsdottir, M., Valgardsdottir, R., Ogmundsdottir, H. M., & Anamthawat-Jonsson, K. (1995). p53 abnormalities and genomic instability in primary human breast carcinoma. Cancer Res., 55, 646–651.
Flørenes, V. A., Maelandsmo, G. M., Kerbel, R. S., Slingerland, J. M., Nesland, J. M., & Holm, R. (1998). Protein expression of the cell-cycle inhibitor p27^Kip1 in malignant melanoma. Am. J. Path., 153, 305–312.
Foster, K., Crossey, P. A., Cairns, P., Hetherington, J. W., Richards, F. M., Jones, M. H., Bentley, E., Affara, N. A., Ferguson-Smith, M. A., & Maher, E. R. (1994). Molecular genetic investigation of sporadic renal cell carcinoma: Analysis of allele loss on chromosomes 3p, 5q, 11p, 17 and 22. Br. J. Cancer, 69, 230–234.
Fouret, P. J., Dabit, D., Mergui, J.-L., & Uzan, S. (1998). Lass of heterozygosity on the short arm of chromosome 3 in cervical intro-epithelial neoplasia without concomitant cervical carcinoma. Pathobiol., 66, 306–310.
Fredersdorf, S., Burns, J., Milne, A. M., Packham, G., Fallis, L., Gillett, C. E., Royds, J. A., Peston, D., Hall, P. A., Hanby, A. M., Barnes, D. M., Shousha, S., O-Hare, M. J., & Lu, X. (1997). High level expression of p27^kip1 and cyclin D1 in some human breast cancer cells: Inverse correltation between the expression of p27^kip1 and degree of malignancy in human breast and colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 6380–6385.
Fullwood, P., Marchini, S., Rader, J. S., Martinez, A., Macartney, D., Broggini, M., Morelli, C., Barbanti-Brodano, G., Maher, E. R., & Latif, F. (1999). Detailed genetic and physical mapping of tumor suppressor loci on chromosome 3p in ovarian cancer. Cancer Research, 59, 4662–4667.
Gazdar, A., Bader, S., Hung, J., Kishimoto, Y., Sekida, Y., Sugio, K., Virmani, A., Fleming, J., Carbone, D., & Minno, J. D. (1994). Molecular genetic changes found in human lung cancer and its precursor lesions. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59, 565–572.
Gazdar, A. F., Kurvari, V., Virmani, A., Gollahon, L., Sakaguchi, M., Westerfield, M., Kodagoda, D., Stasny, V., Cunningham, H. T., Wistuba, I. I., Tomlinson, G., Tonk, V., Ashfaq, R., Leitch, A. M., Minna, J. D., & Shay, J. W. (1998). Characterization of paired tumor and non-tumor cell lines established from patients with breast cancer. Int. J. Cancer, 78, 766–774.
Ginsberg, R. J., Kris, M. G., & Armstrong, J. G. (1993). Non-small cell lung cancer. In V. T. De Vita Jr., S. Hellman, & S. A. Rosenberg (Eds.), Cancer: Principles and Practise of Oncology. (pp. 673–723). Philadelphia: Lippincott, J. B.
Gorunova, L., Hoglund, M., Andren-Sandberg, A., Dawiskiba, S., Jin, Y., Mitelman, F., & Johansson, B. (1998). Cytogenetic analysis of pancreatic carcinomas: intratumor heterogeneity and nonrandom pattern of chromosome aberrations. Genes Chrm. Cancer, 23, 81–99.
Grati, F. R., Sirchia, S. M., Garagiola, I., Sironi, E., Galioto, S., Rossella, F., Serafini, P., Dulcetti, F., Bazzetti, A., Brusati, R., & Simoni, G. (2000). Losses of heterozygosity in oral and oropharyngeal epithelial carcinomas. Cancer Genet. Cytogenet., 118, 57–61.
Hahn, S. A., Schutte, M., Hoque, A. T., Moskaluk, C. A., da Costa, L. T., Rozenblum, E., Weinstein, C. L., Fischer, A., Yeo, C. J., Hruban, R. H., & Kern, S. E. (1996). DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science, 271, 350–353.
Harris, N. L., Jaffe, E. S., Stein, H., Banks, P. M., Chan, J., Cleary, M. L., Delsol, G., Dewolfpeeters, C., Falini, H., Gatter, K. C., Grogan, T. M., Isaacson, P. G., Knowles, D. M., Mason, D. Y., Müller-Hermelink, H. K., Pileri, S. A., Piris, M. A., Ralfkiaer, E., & Warnke, R. A. (1994). A revised european-american classification of lymphoid neoplasm's – a proposal from the international lymphoma study-group. Blood, 84, 1361–1392.
Hazaczek, P., Podolski, J., Toloczko, A., Kurzawski, G., Sikorski, A., Rabbitts, P., Huebner, K., & Lubinski, J. (1996). Losses at 3p common deletion sites in subtypes of kidney tumours: histopatholagical correlations. Virchows Arch., 429, 37–42.
Hengst, L., Dulic, V., Slingerland, J., & al., e. (1994). A cell cycle regulated inhibitor of cyclin dependent kinases,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5291–5294.
Hengst, L., & Reed, S. I. (1996). Translational control of p27^KIP1 accumulation during the cell cycle. Science, 271, 1861–1864.
Hernandez, S., Hernandez, L., Bea, S., Cazorla, M., Fernandez, P. L., Nadal, A., Muntane, J., Mallofre, C., Montserrat, E., Cardesa, A., & Campo, E. (1998). cdc25 cell cycle-activating phosphatases and c-myc expression in human non-Hodgkin's lymphomas: Cancer Res., 58, 1762–1767.
Hibi, K., Takahashi, T., Yamakawa, K., Ueda, R., Sekido, Y., Ariyoshi, Y., Suyama, M., Takagi, H., Nakamura, Y., & Takahashi, T. (1992). Three distinct regions involved in 3p deletion in human lung cancer. Oncogene, 7, 445–449.
Hughson, M. D., Meloni, A., Dougherty, S., Silva, F. G., & Sandberg, A. (1996). Analysis of 3p allelic los in papillary and nonpapillary renal cell carcinoma. Correlation with tumor karyotypes. Cancer Genet. Cytogenet., 87, 133–139.
Hunter, T., & Pines, J. (1994). Cyclins and cancerII: cyclin D and cdk inhibitors come of age. Cell, 79, 573–582.
Ito, R., Yasui, W., Ogawa, Y., Toyosawa, S., Tahara, E., & Ijuhin, N. (1999). Reduced expression of cyclin dependent kinase inhibitor p27(Kip1) in oral malignan tumors. Pathobiol., 67, 169–173.
Jiang, G. L., Liu, L. M., Buyse, I. M., Simon, D., & Huang, S. (1999). Decreased RIZ1 expression but not RIZ2 in hepatoma and suppression of hepatoma tumorigenicity by RIZ1. Int. J. Cancer, 83, 541–546.
Johansson, B., Billström, R., Kristoffersson, U., Åkerman, M., Garwicz, S., Ahlgren, T., Malm, C., & Mitelman, F. (1997). Deletion of chromosome arm 3p in hematologic malignancies. Leukemia, 11, 1207–1213.
Jones, M. H., & Nakamura, Y. (1992). Deletion mapping of chromosome 3p in female genital tract malignancies using microsatellite polymorphism. Oncogene, 7, 1631–1634.
Jordan, R. C., Bradley, G., & Slingerland, J. (1998). Reduced levels of the cell-cycle inhibitor p27^kip1 in epitheial dysplasia and carcinoma of the oral cavity. Am. J. Pathol., 152, 585–590.
Kaestner, K. H., Knüchel, W., & Martínez, D. E. (2000). Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors. Genes & Development, 14, 142–146.
Katayose, Y., Kim, M., Rakkar, A. N., Li, Z., Cowan, K. H., & Seth, P. (1997). Promoting apoptosis: A novel activity associated with the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Cancer Res., 57, 5441–5445.
Kato, J.-Y., Matsuoka, M., Polyak, K., Massague, J., & Sherr, C. J. (1994). Cyclic AMP-induced G1 phase arrest mediated by an inhibitor (p27^Kip1) of cyclin-dependent kinase 4 activation. Cell, 79, 487–496.
Kawamata, N., Morosettie, R., Miller, C. W., Park, D., Spirin, K. S., Nakamaki, T., Takeuchi, S., Hatta, Y., Simpson, J., & Wilczynski, S. (1995). Molecular analysis of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27/Kip1 in human malignancies. Cancer Res., 55, 2266–2269.
Kiyokawa, H., Kineman, R. D., Manova-Todorova, K. O., Soares, V. C., Hoffman, E. S., Ono, M., Khanam, D., Hayday, A. C., Frohman, L. A., & Koff, A. (1996). Enhancer growth of mice lacking the cyclin-dependent kinase inhibitor function of p27 (Kip1). Cell, 85, 721–732.
Knudson, A. G. (1971). Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 820–823.
Koff, A., Ohtsuki, M., Polyak, K., Roberts, J. M., & Massague, J. (1993). Negative regulation of G1 in mammalian cells: inhibition of cyclin E-dependent kinase by TGF-b. Science, 260, 536–539.
Kok, K., Naylor, S. L., & Buys, C. H. (1997). Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes. Adv. Cancer Res., 71, 27–92.
Kolluri, S. K., Weiss, C., Koff, A., & Gottlicher, M. (1999). p27(Kip1) induction and inhibition of proliferation by the intracellular Ah receptor in developing thymus and hepatoma cells [In Process Citation]. Genes Dev., 13, 1742–1753.
Kops, G. J. and Burgering, B. M. (1999). Forkhead Transcription Factors: new insights into protein kinase B (c-akt) signalling. J. Mol. Med. 77 656–665.
Kovacs, G. (1993). Molecular cytogenetics of renal cell tumors. Adv. Cancer Res., 62, 89–124.
Kovacs, G. (1993). Molecular differential pathology of renal cell tumours. Histpath., 22, 1–8.
Koyama, H., Raines, E. W., Bornfeldt, K. E., Roberts, J. M., & Ross, R. (1996). Fibrillar collagen inhibits arterial smooth muscle proliferation through regulation of cdk2 inhibitors. Cell, 87, 1069–1078.
Le Beau, M. M., Drabkin, H., Glover, T. W., Gemmill, R., Rassool, F. V., McKeithan, T. W., & Smith, D. I. (1998). An FHIT tumor suppressor gene? Genes Chrm. Cancer, 21, 281–289.
Kwak, L., Wilson, M., Weiss, L. M., Horning, S. J., Warnke, R. A., & Dorfman, R. F. (1991). Clinical significance of morphological subdivision in diffuse large B cell lymphoma. Cancer, 68, 1988–1993.
Lennert, K., Mohri, N., Stein, H., & Kaiserling, F. (1975). The histopathology of malignant lymphoma. Br. J. Haematol., 31 (Suppl), 193–203.
Li, J., Yen, C., Liaw, D., Podsypanina, K., Bose, S., Wang, S. I., Pue, J., Miliaresis, C., Rodgers, L., McCombie, R., Bigner, S. H., Giovanella, B. C., Ittman, M., Tycko, B., Hibshoosh, H., Wigler, M. H., & Parsons, R. (1997). Pten, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human, brain, breast and prostate cancer. Science, 275, 1943–1947.
Li, X., Lee, N. K., Waber, P. G., Schweitzer, C., Cheng, Q. C., & Nisen, P. D. (1994). Allelic loss at chromosomes 3p, 8p, 13q and 17p associated with poor prognosis in head and neck cancer. J. Natl. Cancer Inst., 86, 15241–1529.
Loda, M., Cukor, B., Tam, S. W., Lavin, P., Fiorentino, M., Draetta, G. F., Jessup, J. M., & Pagano, M. (1997). Increased proteasome-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas. Nature Med., 3, 231–234.
Lott, S. T., Lovell, M., Naylor, S. L., & Killary, A. M. (1998). Physical and functional mapping of a tumor suppressor locus for renal cell carcinoma within chromosome 3p12. Cancer Res., 58, 3533–3537.
Lovell, M., Lott, S. T., Wong, P., El-Naggar, A., Tucker, S., & Killary, A. M. (1999). The genetic locus NRC-1 within chromosome 3p12 mediates tumor suppression in renal cell carcinoma independently of histological type, tumor microenvironment, and VHL mutation. Cancer Res., 59, 2182–2189.
Lubinski, J., Hadaczek, P., Podolski, J., Toloczko, A., Sikorski, A., McCue, P., Druck, T., & Huebner, K. (1994). Common regions of deletion in chromosome regions 3p12 and 3p14.2 in primary clear cell renal carcinomas. Cancer Res., 54, 3710–3713.
Maestro, R., Gasparotto, D., Vukosavljevic, T., Barzan, L., Sulfaro, S., & Boiocchi, M. (1993). Three discrete regions of deletion at 3p in head and neck cancers. Cancer Res, 53, 5775–5779.
Medema, R. H., Kops, G. J. P. L., Bos, J. L., & Burgering, B. M. T. (2000). AFX-like Forkhead transcription factors mediate cell-cycle regulation by Ras and PKB through p27^kip1. Nature, 404, 782–787.
Mehle, C., Lindblom, A., Ljunberg, B., Stenling, R., & Roos, G. (1998). Loss of heterozygosity at chromosome 3p correletes with telomerase activity in renal cell carcinoma. Int. J. Oncol., 13, 289–295.
Millard, S. S., Yan, J. S., Nguyen, H., Pagano, M., Kiyokawa, H., & Koff, A. (1997). Enhanced ribosomal association of p27(Kip1) mRNA is a mechanism contributing to accumulation during growth arrest. J. Biol. Chem., 272, 7093–7098.
Mineta, H., Miura, K., Suzuki, I., Takebayashi, S., Misawa, K., Ueda, Y., & Ichimura, K. (1999). p27 expression correlates with prognosis in patients with hypopharyngeal carcinoma. Anticancer Res., 19, 4407–4412.
Mitelman, F., Mertens, F., & Johansson, B. (1997). A breakpoint map of recurrent chromosomal rearrangements in human neoplasia. Nat. Genet., 15, 417–474.
Moller, M. B., Skjodt, K., Mortensen, L. S., & Pedersen, N. T. (1999). Clinical significance of cyclin-dependent kinase inhibitor p27^kip1 expression and proliferation in non-Hodgkin's lymphoma:independent prognostic value of p27^kip1. Br. J. Haematol., 105, 730–736.
Mori, M., Mimori, K., Shiraishi, T., Tanaka, S., Ueo, H., Sugimachi, K., & Akiyoshi, T. (1997). p27 expression and gastric carcinoma. Nature Med., 3, 593.
Morosetti, R., Kawamata, N., Gombart, A. F., Miller, C. W., Hatta, Y., Hirama, T., Said, J. W., Tomonaga, M., & Koeffler, H. P. (1995). Alterations of the p27^kip1 gene in non-Hodgkin's lymphomas and adult T-cell leukemia/lymphoma. Blood, 86, 1924–1930.
Nguyen, H., Gitig, D. M., & Koff, A. (1999). Cell-free degradation of p27(kip1), a G1 cyclin-dependent kinase inhibitor, is dependent on CDK2 activity and the proteasome. Mol. Cell. Biol., 19, 1190–1201.
Nigg, E. (1991). The substrates of the cdc2 kinase. Semin. Cell. Biol., 2, 261–270.
Nourse, J., Firpo, E., Flanagan, W. M., Coats, S., Polyak, K., Lee, M.-H., Massague, J., Crabtree, G. R., & Roberts, J. M. (1994). Interleukin-2-mediated elimination of the p27^KIP1 cyclin-dependent kinase inhibitor prevented by rapamycin. Nature, 372, 570–573.
The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification Project. (1997). A clinical evaluation of the international lymphoma study group classification of non-Hodgkin's lymphoma. Blood, 89, 3909–3918.
Orend, G., Hunter, T., & Ruoslanhti, E. (1998). Cytoplasmic displacement of cyclin E-cdk2 inhibitors p21Cip1 and p27^kip1 in anchorage-independent cells. Oncogene, 16, 2575–2583.
Pagano, M., Tam, S. W., Theodoras, A. M., Romero, P. B., Sal, G. D., Chau, V., Yew, P. R., Draetta, G. F., & Rolfe, M. (1995). Role of the ubiquitin-proteasome in regulating abundance of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Science, 269, 682–685.
Pandis, N., Jim, Y., Limon, J., Bardi, G., Idvall, I., Mandahl, N., Mitelman, F., & Heim, S. (1993). Interstitial deletion of the short arm of chromosome 3 as a primary chromosome abnormality in carcinomas of the breast. Genes Chrm. Cancer, 6, 151–155.
Parry, D., Bates, S., Mann, D. J., & Peters, G. (1995). Lack of cyclinD-cdk complexes in Rb-negative cells correlates with high levels of p16INK4/MTS1 tumour suppressor gene product. EMBO J., 14, 503–511.
Partridge, M., Emilion, G., Pateromichelakis, S., A'Hern, R., Lee, G., Phillips, E., & Langdon, J. (1999). The prognostic significance of allelic imbalance at key chromosomal loci in oral cancer. Br. J. Cancer, 79, 1821–1827.
Pietenpol, J. A., Bohlander, S. K., Sato, Y., Papadopoulos, N., Liu, B., Friedman, C., Trask, B. J., Roberts, J. M., Kinzler, K. W., Rowly, J. D., & Vogelstein, B. (1995). Assignment of the human p27^kip1 gene to 12p13 and its analysis in leukemias. Cancer Res., 55, 1206–1210.
Polyak, C., Lee, M.-H., Erdjument-Bromage, H., Koff, A., Roberts, J. M., Tempst, P., & Massague, J. (1994). Cloning of p27^kip1, a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals. Cell, 78, 59–66.
Polyak, K., Kato, J. Y., Solomon, M. J., Sherr, C. J., Massague, J., Roberts, J. M., & Koff, A. (1994). p27^Kip1, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-b and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev., 8, 9–22.
Porter, P. L., Malone, K. E., Heagerty, P. J., Alexander, G. M., Gatti, L. A., Firpo, E. J., Daling, J. R., & Roberts, J. M. (1997). Expression of cell cycle regulators p27 Kip1 and cyclin E, alone and in combination, correlate with survival in young breast cancer patients. Nat. Med., 3, 222–225.
Presti Jr., J. C., Reuter, V. E., Cordon-Cardo, C., Mazumdar, M., Fair, W. R., & Jhanwar, S. C. (1993). Allelic deletions in renal tumors: histopathological correlations. Cancer Res., 53, 5780–5783.
Quintanilla-Martinez, L., Thieblemont, C., Fend, F., Kumar, S., Pinyol, M., Campo, E., Jaffe, E., & Raffeld, M. (1998). Mantle cell lymphomas lack expression of p27^kip1 a cyclin-dependent kinase inhibitor. Am. J. Pathol., 153, 175–182.
Rabbitts, P., Bergh, J., Douglas, J., Collins, F., & Waters, J. (1990). A submicroscopic homozygous deletion at the D3S3 locus in a cell line isolated from a small cell lung carcinoma. Genes Chrm. Cancer, 2, 231–238.
Roz, L., Wu, C. L., Porter, S., Scully, C., Speight, P., Read, A., Sloan, P., & Thakker, N. (1996). Allelic imbalance on chromosome 3p in oral dysplastic lesions: an early event in oral carcinogenesis. Cancer Res., 56, 1288–1231.
Ruas, M., & Peters, G. (1998). The p16INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives. Biochim. Biophys. Acta, 1378, F115–177.
Sáez, A., Sánchez, E., Sánchez-Beato, M., Cruz, M. A., Chacón, I., Muñoz, E., Camacho, F. I., Martínez-Montero, J. C., Mollejo, M., García, J. F., & Piris, M. A. (1999). p27^KIP1 is abnormally expressed in Diffuse Large B-cell Lymphomas and is associated with an adverse clinical outcome. Br. J. Cancer, 80 (9), 1427–1434.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Stein, H., & Dallenbach, F. (1992). Diffuse large cell lymphomas of B and T cell type. In D. M. Knowles (Eds.), Neoplastic Hematopathology. (pp. 675–714). Baltimore: Williams & Wilkins.
Sanchez, Y., El-Naggar, A., Pathak, S., & Killary, A. M. (1994). A tumor suppressor locus within 3p14–p12 mediates rapid cell death of renal cell carcinomas in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3383–3387.
Sanchez-Beato, M., Camacho, F. I., Martinez-Montero, J. C., Saez, A. I., Villuendas, R., Sanchez-Verde, L., Garcia, J. F., & Piris, M. A. (1999). Anomalous high p27^kip1 expression in a subset of aggressive B-cell lymphomas is associated with cyclin D3 overexpression. p27/KIP1-cyclin D3 colocalization in tumor cells. Blood, 94, 765–772.
Sánchez-Beato, M., Sáez, A. I., Martínez-Montero, J. C., Mateo, M. S., Sánchez-Verde, L., Villuendas, R., Troncone, G., & Piris, M. A. (1997). Cyclin-dependent kinase inhibitor p27^KIP1 in lymphoid tissue: p27^KIP1 expression is inversely proportional to the proliferative index. Am. J. Pathol., 151, 151–160.
Sandhu, C., Garbe, J., Daksis, J., & al, e. (1997). TGF-b stabilizes p15INK4B protein, increases p15INK4B/cdk4 complexes and inhibits cyclin D1/cdk4 association in human mammary epithelial cells. Mol. Cell Biol., 17, 2458–2467.
Sato, T., Saito, H., Morita, R., Koi, S., Lee, J. H., & Nakamura, Y. (1991). Allelotype of human ovarian cancer. Cancer Res., 51, 5118–5122.
Sekido, Y., Ahmadian, M., Wistuba, I. I., Latif, F., Bader, S., Wei, M.-H., Duh, F.-M., Gazdar, A. F., Lerman, M. I., & Minna, J. D. (1998). Cloning of a breast cancer homozygous deletion junction narrows the region of search for a 3p21.3 tumor suppressor gene. Oncogene, 16, 3151–3157.
Sezinger, B. R., Klinger, H. P., Junien, C., Nakamura, Y., Le Beau, M., Cavence, W., Emanuel, B., Ponder, B., Naylor, S., Mitelman, F., Louis, D., Menon, A., Newsham, I., Decker, J., Kaelbling, M., Henry, I., & von Deimling, A. (1991). Report of the committee on chromosome and gene loss in human neoplasia. Cytogenet. Cell. Genet., 58, 1080–1096.
Sgambata, A., Zhang, Y., Arber, N., Hibshoosh, H., Doki, Y., Ciaparrone, M., Santella, R. M., Cittadini, A., & Weinstein, I. B. (1997). Deregulated expression of p27^kip1 in human breast cancers. Clin. Cancer Res., 3, 1879–1887.
Shamma, A., Doki, Y., Tsujinaka, T., Shiozaki, H., Inoue, M., Yano, M., Kawanishi, K., & Monden, M. (2000). Loss of p27^kip1 expression predicts poor prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Oncol., 58, 152–158.
Sherr, C. J., & Roberts, J. M. (1995). Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases. Genes Dev., 9, 1149–1163.
Sherr, J. S. (1996). Cancer cell cycles. Science, 274, 1672–1677.
Singh, S. P., Lipman, J., Goldman, H., Ellis, F. H., Aiseman, L., Cangi, M. G., Signoretti, S., Chiaur, D. S., Pagano, M., & Loda, M. (1998). Loss or altered subcellular localization of p27 in Barrett's associated adenocarcinoma. Cancer Res., 58, 1730–1735.
Slingerland, J. M., Hengst, L., Pan, C.-H., & al, e. (1994). A novel inhibitor of cyclin-cdk activity detected in Transforming Growth Factor b-arrested epithelial cells. Mol. Cell Biol., 14, 3683–3694.
Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., & Cantley, L. C. (1994). Use of an orientated peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr. Biol., 4, 973–982.
Soucek, T., Yeung, R. S., & Hengstschlager, M. (1998). Inactivation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 upon loss of the tuberous sclerosis comphex gene-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15653–15658.
Srinivasan, J., Koszelak, M.,. Mendelow, M., Kwon, Y.-G., & Lawrence, D. S. (1995). The design of peptide based substrates for the cdc2 protein kinase. Biochem. J., 309, 927–931.
St Croix, B., Florenes, V. A., Rak, J. W., Flanagan, M., Bhattacharya, N., Slingerland, J. M., & Kerbel, R. S. (1996). Impact of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27^kip1 on resistance of tumor cells to anticancer agents. Nat. Med., 2, 1204–1210.
Steck, P. A., Perhouse, M. A., Jasser, S. A., Yung, W. K. A., Lin, H., Ligon, A. H., Langford, L. A., Baumgard, M. L., Hattier, T., Davis, T., Frye, C., Hu, R., Swedlund, B., Teng, D. H. F., & Tavtigian, S. V. (1997). Identification of a candidate tumour suppressor gene, Mmacl, at chromosome 10q23.3 that is mutated in some advanced cancers. Nature Genet., 15, 356–362.
Stein, H., & Dallenbach, F. (1992). Diffuse large cell lymphomas of B and T cell type. In D. M. Knowles (Eds.), Neoplastic Hematopathology. (pp 675–714). Baltimore: Williams & Wilkins.
Sundaresan, V., Heppell-Parton, A., Coleman, N., Miozzo, M., Sozzi, G., Ball, R., Cary, N., Hasleton, P., Fowler, W., & Rabbitts, P. (1995). Somatic genetic changes in lung cancer. and precancerous lesions. Ann. Oncol., 6 (Suppl. 1), S27–S32.
Tan, P., Cady, B., Wanner, M., Worland, P., Cukor, B., Magi-Galluzzi, C., Lavin, P., Draetta, G., Pagano, M., & Loda, M. (1997). The cell cycle inhibitor p27 is an independent prognostic marker in small (T1a,b) invasive breast carcinomas. Cancer Res., 57, 1259–1263.
Tenjo, T., Toyoda, M., Okuda, J., Watanabe, I., Yamamoto, T., Tanaka, K., Ohtani, M., Nohara, T., & Kawasaki, H. (2000). Prognostic significance pf p27(kip1) protein expression and spontaneous apoptosis in patients with colorectal adenocarcinomas. Oncol., 58, 45–51.
Texeira, L. T., Kiyokawa, H., Peng, X. D., Christov, K. T., Frohman, L. A., & Kineman, R. D. (2000). p27^kip1-deficient mice exhibit accelerated growth hormone-releasing hormone (GHRH)-induced somatotrope proliferation and adenoma formation. Oncogene, 19, 1875–1884.
Timmer, T., Terpstra, P., vandenBerg, A., Veldhuis, P. M. J. F., TerElst, A., Voutsinas, G., Hulsbeek, M. M. F., Draaijers, T. G., Looman, M. W. G., Kok, K., Naylor, S. L., & Buys, C. H. C. M. (1999). A comparison of genomic structures and expression patterns of two closely related flanking genes in a critial lung cancer region at 3p21.3. Eur. J. Human Genet., 7, 478–486.
Todd, S., Franklin, W. A., Varella-Garcia, M., Kennedy, T., Hilliker Jr., C. E., Hahner, L., Anderson, M., Wiest, J. S., Drabkin, H. A., & Gemmill, R. M. (1997). Homozygous deletions of human chromosome 3p in lung tumors. Cancer Res., 57, 1344–1352.
Tseng, S.-L., Yu, J.-C., Yue, C.-T., Chang, S.-F., Chang, T.-M., Wu, C.-W., & Shen, C.-Y. (1997). Allelic loss of BRCA1, and BRCA2, and adjacent loci in relation to TP53 abnormality in breast cancer. Genes Chrm. Cancer, 20, 377–382.
Tsihlias, J., Kapusta, L., & Slingerland, J. (1999). The prognostic significance of altered cyclin-dependent kinase inhibitors in human cancer. Ann. Rev. Med., 50, 401–423.
Tsihlias, J., Kapusta, L. R., DeBoer, G., Morava-Protzner, I., Zbieranowski, I., Bhattacharya, N., Catzavelos, G. C., Klotz, L. H., & Slingerland, J. M. (1998). Loss of cyclin dependent kinase inhibitor p27^Kip1 is a novel prognostic factor in localized human prostate adenocarcinoma. Cancer Res., 58, 542–548.
Uzawa, N., Yoshida, M. A., Hosoe, S., Oshimura, M., Amagasa, T., & Ikeuchi, T. (1998). Functional evidence for involvement of multiple putative tumor suppressor genes on the short arm of chromosome 3 in human oral squamous cell carcinogenesis. Cancer Genet. Cytogenet., 107, 125–131.
van der Lugt, N. M. T., Domen, J., Linders, K., van Roon, M., Robanus-Maandag, E., te Riele, H., van der Valk, M., Deschamps, J., Sofroniew, M., van Lohuizen, M., & al, e. (1994). Posterior transformation, neurological abnormalities, and severe hematopoietic defects in mice with a targeted deletion of the proto-oncogene. Genes Dev., 8, 757–769.
Vidal, A., & Koff, A. (2000). Cell-cycle inhibitor: three families united by a common cause. Gene, 247, 1–15.
Virmani, A. K., Fong, K. M., Kodagoda, D., McIntire, D., Hung, J., Tonk, V., Minna, J. D., & Gazdar, A. F. (1998). Allelotyping demonstrates common and distinct patterns of chromosomal loss in human lung cancer types. Genes Chrm. Cancer, 21, 308–319.
Vlach, J., Hennecke, S., Alevizopoulos, K., Conti, D., & Amati, B. (1996). Growth arrest by the cyclin-dependent kinase inhibitor p27^Kip1 is abrogated by c-myc. EMBO J., 15, 6595–6604.
Vlach, J., Hennecke, S., & Amati, B. (1997). Phosphorylation-dependent degradation of the cyclin- dependent kinase inhibitor p27^Kip1. EMBO J., 16, 5334–5344.
Vrhorac, R., Delmer, A., Tang, R., Marie, J. R., Zittoun, R., & Ajchenbaum-Cymbalista, F. (1998). Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27^kip1 in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 91, 4694–4700.
Wang, X., Gorospe, M., Huang, Y., & Holbrook, N. J. (1997). p27^kip1 overexpression causes apoptotic death of mammalian cells. Oncogene, 15, 2991–2997.
Willers, C. P., Siebert, R., Bardenheuer, W., Lux, A., Michaelis, S., Seeber, S., Luboldt, H.-J., Opalka, B., & Schütte, J. (1996). Genetic instability of 3p12–p21-specific microsatellite sequences in renal cell carcinoma. Br. J. Urol., 77, 524–529.
Wistuba, I. I., Behrens, C., Virmani, A. K., Mele, G., Milchgrub, S., Girard, L., Fondon, J. W. 3., Garner, H. R., McKay, B., Latif, F., Lerman, M. I., Lam, S., Gazdar, A. F., & Minna, J. D. (2000). High resolution chromosome 3p allelotyping of human lung cancer and preneoplastic/preinvasive bronchial epithelium reveals multiple, discontinuous sites of 3p allele loss and three regions of frequent breakpoints. Cancer Res., 60, 1949–1960.
Yamasaki, L. (1998). Growth regulation by the E2F and DP transcription factor families. Results Probl. Cell Differ., 22, 199–227.
Yang, R. M., Naitoh, J., Murphy, M., Wang, H. J., Phillipson, J., Dekernion, J. B., Loda, M., & Reiter, R. E. (1998). Low p27 expression predicts poor prognosis in patients with prostate cancer. J. Urol., 159, 941–945.
Yatabe, Y., Masuda, A., Koshikawa, T., Nakamura, S., Kuroishi, T., Osada, H., Takahashi, T., Mitsudomi, T., & Takahashi, T. (1998). P27^KIP1 in human lung cancers: differential changes in small-cell and non-small-cell carcinomas. Cancer Res., 58, 1042–1047.
Yokata, J., Tsukada, Y., Nakajima, T., Gotoh, M., Shimosato, Y., Mori, N., Tsunokawa, Y., Sugimura, T., & Terada, M. (1989). Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 3 in carcinoma of the uterine cervix. Cancer Res., 49, 3598–3601.
Yokozawa, T., Towatari, M., Iida, H., Takeyama, K., Tanimoto, M., Kiyoi, H., Motoji, T., Asou, N., Saito, K., Takeuchi, M., Kobayashi, Y., Miyawaki, S., Kodera, Y., Ohno, R., Saito, H., & Naoe, T. (2000). Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27^kip1 in acute myeloid leukemia. Leuk., 14, 28–33.
Zhang, J., Sanchez, R. J., Wang, S., Guarnaccia, C., Tossi, A., Zahariev, S., & Pongor, S. (1994). Substrate specificity of cdc2 kinase from human HeLa cells as determined with synthetic peptides and molecular modelling. Biophys., 315, 415–424.
Zhu, L., Harlow, E., & Dynlacht, B. D. (1995). p107 uses a p21CIP1-related domain to bind cyclin/cdk2 and regulate interactions with E2F. Genes Dev., 9, 1740–1752.
Zhu, X., Ohtsubo, M., Bohmer, R. M., Roberts, J. M., & Assoian, R. K. (1996). Adhesion-dependent cell cycle progression linked to the expression of cyclin D1, activation of cyclinE-cdk2, and phosphorylation of the retinoblastoma protein. J. Cell. Biol., 133, 391–403.

Tabelle 1. Reaktivität des monoklonalen JC12-Antikörpers gegenüber normalen humanen Geweben.
Tabelle 2. Expression von QRF-2-Protein in Zelllinien.
Tabelle 3. Expression von QRF-2-Protein in humanen neoplastischen Zellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Transkriptionsfaktorprotein, umfassend (i) ein flügelförmiges Helixmotiv, welches die potenzielle Fähigkeit aufweist, Nukleinsäure zu binden, und (ii) ein Cys₂-His₂-Zinkfingermotiv, welches ebenso eine potenzielle Nukleinsäurebindefähigkeit aufweist.
Protein nach Anspruch 1, weiterhin umfassend mindestens eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne.
Protein nach Anspruch 2, wobei das Protein die Aminosäuresequenz gemäß 2 oder eine Aminosäuresequenz umfasst, welche eine Identität von mindestens 70% mit der Aminosäuresequenz gemäß 2 aufweist.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Aminosäuresequenz gemäß 3C oder eine Aminosäuresequenz umfasst, welche eine Identität von mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz gemäß 3C aufweist.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Aminosäuresequenz gemäß 4B oder eine Aminosäuresequenz umfasst, welche eine Identität von mindestens 90% mit der Aminosäuresequenz gemäß 4B aufweist.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Aminosäuresequenz gemäß 4D oder eine Aminosäuresequenz umfasst, welche eine Identität von mindestens 95% mit der Aminosäuresequenz gemäß 4D aufweist.
Protein nach Anspruch 3, welches kein äußeres N-terminates Methionin aufweist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die für das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenz umfasst, die von Position 264 oder Position 267 bis Position 2294 der Nukleinsäuresequenz gemäß 2 gezeigt ist oder welches die Nukleotidsequenz umfasst, die von Position 16 bis 2352 der Nukleinsäuresequenz gemäß 2 gezeigt ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenz gemäß 3A oder 3B umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenz gemäß 4A umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenz gemäß 4C umfasst.
Expressionsvektor, welcher die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 11 umfasst.
Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor von Anspruch 13 transformiert oder transfiziert ist.
Antikörper, welcher in der Lage ist, das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Epitop davon zu binden, welches ein monoklonaler Antikörper JC12 ist, der von dem Hybridom, der bei der Europäischen Zellkultursammlung unter der Accession Nr. 99041425 hinterlegt ist, erhältlich ist.
Antikörper nach Anspruch 15 zur Verwendung zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes, der durch die Expression oder Funktion eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 vermittelt wird oder damit in Zusammenhang steht.
Hybridom, das bei der Europäischen Zellkultursammlung unter der Accession Nr. 99041425 hinterlegt ist.
In vitro-Verfahren zum Nachweis der Expression eines Proteins, welches ein flügelförmiges Helixmotiv und ein Cys₂-His₂-Zinkfingermotiv umfasst, in einem Säugersubjekt, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe von Gewebe, Zellen oder Zelllysaten, die aus dem Säugersubjekt entnommen werden, mit dem Antikörper gemäß Anspruch 18 umfasst, und Nachweisen von spezifischer Bindung des Antikörpers an dessen Zielprotein in dem Gewebe.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der von dem Hybridom erhältlich ist, das bei der Europäischen Zellkultursammlung unter der Accession Nr. 99041425 hinterlegt ist.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 12 oder ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, unter Bedingungen von hoher Stringenz daran zu hybridisieren, oder ein Fragment davon zur Verwendung zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 8 bis 12 oder eines Nukleinsäuremoleküls, das in der Lage ist, daran unter Bedingungen von hoher Stringenz zu hybridisieren, oder eines Fragmentes davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Derivates oder Fragmentes davon zur Verwendung zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Derivat oder Fragment davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 12 oder eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, an die Nukleinsäuremoleküle unter Bedingungen von hoher Stringenz zu hybridisieren oder einen Antikörper nach Anspruch 16, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff dafür.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
In vitro-Verfahren zur Beurteilung der Prognose von prämalignen Läsionen bei einem Patienten, wobei das Verfahren das Nachweisen einer Veränderung des Expressionsmusters oder der Funktion eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in dem Patienten umfasst, wobei eine Veränderung des Expressionsmusters oder der Funktion des Proteins auf die Wahrscheinlichkeit hindeutet, dass sich die prämalignen Läsionen des Patienten zu einem malignen Tumor entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Veränderung des Expressionsmusters oder der Funktion des Proteins aufgrund von Veränderungen der Expressionsmengen oder der subzellulären Lokalisation des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in dem Patienten auftritt.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die prämalignen Läsionen bei nicht-hämatologischen Malignomen auftreten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei die Tumorart eine beliebige Tumorart von Gebärmutterhals-, Brust-, Nieren-, Kopf- und Nacken-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata-, Magen-, Dickdarm- oder Lungentumor ist.
in vitro-Verfahren zur Beurteilung der Prognose eines Zustandes oder von Krebs bei einem Patienten, wobei das Verfahren das Nachweisen von variierenden Expressionsmustern oder variierender Funktion eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
in vitro-Verfahren zur Beurteilung der Prognose eines Zustandes oder von Krebs bei einem Patienten, wobei das Verfahren das Nachweisen von abnormen mRNA-Transkripten oder abnormen Mengen an mRNA-Expression, Nukleotidsequenzen oder einer abnormen Anzahl von Genkopien, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codieren, umfasst.
In vitro-Verfahren zum Durchmustern nach einer Veranlagung für Krebs in einem Subjekt, wobei das Verfahren das Durchmustern nach einer vererbten genetischen Mutation in einer Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
In vitro-Verfahren zur Identifizierung eines Krebspatienten mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Antikrebsmitteln, wobei das Verfahren die Bestimmung von Proteinmengen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in den Tumoren der Patienten umfasst, wobei das Variieren von Expressionsmustern des Proteins in dem Tumor des Patienten auf eine erhöhte Ansprechbarkeit für Antikrebsmittel hindeutet.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Steuerung von T-Zell-vermittelten Immunantworten in einem Subjekt, wobei hohe Mengen des Proteins eine Abnahme von Antigen-spezifischen T-Zell-vermittelten Immunantworten bei dem Subjekt auslösen oder vermitteln.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung von Transplantat-Wirt-Reaktionen bei einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei das transplantierte Gewebe ein transplantiertes Organ ist.
In vitro-Verfahren zum Nachweisen oder Diagnostizieren von Krebs bei einem Subjekt, welches mit verminderten Proteinexpressionsmengen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Untersuchen von erhöhten Methylierungsmengen einer regulatorischen Region einer Nukleinsäuresequenz des Subjektes, welche für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert, in einer Zelle des Subjektes umfasst.
Verwendung eines Methylierungs-Inhibitors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, der mit verminderten Expressionsmengen eines FOXP1-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Zusammenhang steht.
In vitro-Verfahren zum Nachweisen oder Diagnostizieren von Krebs in einem Subjekt, welcher mit erhöhten Expressionsmengen eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 im Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Untersuchen von verminderten Methylierungsmengen einer regulatorischen Region eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert, in einer Zelle des Subjektes umfasst.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 16 oder eines Blockierungspeptids oder eines Nukleinsäuremoleküls, das in der Lage ist, an ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 12 unter Bedingungen von hoher Stringenz zu hybridisieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes bei einem Patienten, der mit Überexpression eines FOXP1-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Zusammenhang steht.
In vitro-Verfahren zur Identifizierung von minimalen Resten einer Erkrankung bei einem Krebspatienten, wobei das Verfahren das Nachweisen des Vorliegens von neoplastischen Zellen bei einem Subjekt durch Identifizieren einer Veränderung des Expressionsmusters oder der Funktion eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
In vitro-Verfahren zur Identifizierung von minimalen Resten einer Erkrankung bei einem Krebspatienten, wobei das Verfahren das Nachweisen des Vorliegens von neoplastischen Zellen bei einem Subjekt durch Identifizieren von abnormen Mengen an mRNA-Expression oder Nukleotidsequenzen oder Anzahl von Genkopien, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codieren, umfasst.