DE60024615T2 - Phosphine Stabilisatoren für oxidoreduktase Enzyme - Google Patents

Phosphine Stabilisatoren für oxidoreduktase Enzyme Download PDF

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Description

  • KREUZRFERENZ ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität zu der vorläufigen US-Patentanmeldung Serien-Nummer 60/123 833, die am 11. März 1999 eingereicht wurde.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Stabilisierung der Aktivität eines Oxidoreduktase-Enzyms, insbesondere ein Stabilisierungsverfahren, welches das Mischen eines Phosphins oder Phosphits mit einem Oxidoreduktase-Enzym umfasst.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung gehört zum technischen Gebiet von Oxidoreduktase-Enzymen, insbesondere zu einem Verfahren zur Stabilisierung von diesen.
  • Eine breite Klasse von Enzymen, welche zur selektiven Reduktion und/oder Hydrierung von ungesättigten organischen Verbindungen in der Lage sind, sind die Nikotinamid-abhängigen Oxidoreduktasen, wie sie von Walsh diskutiert wurden (Enzymatic Reaction Mechanisms Freeman & Co., N.Y., 1979; Seiten 311–521).
  • Nikotinamid-abhängige Oxidoreduktasen erfordern die Anwesenheit von Nikotinamid-Cofaktoren. Die Strukturen der natürlich auftretenden Nikotinamid-Cofaktoren (NAD+, NADP+, NADH und NADPH) sind unten gezeigt.
  • Figure 00010001
  • Ein reduzierter Nikotinamid-Cofaktor (NADH oder NADPH) bindet an das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym und transferiert ein "Hydrid" (zwei Elektronen und ein Wasserstoffkern), um ein Substrat zu reduzieren, welches ebenfalls an dem Enzym bindet. Nachdem das Substrat reduziert worden ist, setzt das Enzym die oxidierte Form des Nikotinamid-Cofaktors (NAD+ oder NADP+) frei. Biologische Systeme recyceln üblicherweise die oxidierten Nikotinamid-Cofaktoren, indem ein externes Reduktionsmittel in Kombination mit anderen Enzymen angewandt wird, um die reduzierte Form der Nikotinamid-Cofaktoren zu regenerieren. In diesen Nikotinamid-Cofaktoren ist der Nikotinamidring (der direkt unten schematisch gezeigt ist) die reaktive Gruppe. Um den reduzierten Cofaktor zu regenerieren, muss ein externes Reduktionsmittel das Äquivalent eines "Hydrids" zu der oxidierten (Pyridinium) Form des Cofaktors regioselektiv zur Bildung der reduzierten (1,4-Dihydropyridin) Form des Cofaktors transferieren.
  • Figure 00020001
  • Obgleich Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzyme und Nikotinamid-Cofaktoren in allen lebenden Organismen in niedrigen Konzentrationen vorliegen, neigen sie dazu, unter nicht-biologischen Bedingungen chemisch instabil zu sein, und sie sind in gereinigter Form extrem teuer. Aufgrund ihrer hohen Kosten müssen die meisten industriellen Prozesse, welche eine Kombination von Enzymen und Nikotinamid-Cofaktoren versuchen anzuwenden, ein Verfahren bereitstellen, um die Nikotinamid-Cofaktoren zu regenerieren.
  • Eine Vielzahl von Verfahren zur Cofaktorregeneration sind bekannt, wie sie von Chenault und Whitesides (Appl. Biochem. Biotechnol. 1987, 14, 147–97) und in Enzymes in Organic Synthesis K. Drauz, H. Waldeman, Herausgeber; VCH: Weinheim, 1995; Seiten 596–665, diskutiert sind.
  • Die Aktivität von Oxidoreduktase-Enzymen, wie zum Beispiel Nikotinamid-Cofaktor-abhängigen Enzymen, kann erhöht oder aufrechterhalten werden durch die Anwesenheit von bestimmten Stabilisatoren, wie bestimmten Schwefel enthaltenden Stabilisatoren. Gleichwohl besteht immer noch ein Bedarf nach weiteren Enzym-stabilisierenden Verbindungen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung der Aktivität eines Oxidoreduktase-Enzyms, welches das Mischen eines Phosphins oder Phosphits mit einem Oxidoreduktase-Enzym umfasst.
  • Weitere Vorteile der Erfindung werden teilweise in der nachfolgenden Beschreibung dargelegt werden, und teilweise werden sie aus der Beschreibung offensichtlich werden, oder sie können durch die Ausführung der Erfindung gelernt werden. Die Vorteile der Erfindung können realisiert werden und erreicht werden mit Hilfe der Elemente und Kombinationen, welche besonders in den anhängigen Ansprüchen herausgestellt werden. Es sollte sich verstehen, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und nur beispielhaft sind und nicht die Erfindung, wie sie beansprucht ist, beschränken sollen.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung kann leichter durch den Bezug auf die nachfolgende detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und der darin eingeschlossenen Beispiele und der Figuren und ihrer vorausgehenden und nachfolgenden Beschreibung verstanden werden. Es versteht sich ebenfalls, dass die hierin verwendete Terminologie für den Zweck der Beschreibung nur von besonderen Ausführungsformen ist und nicht beschränkend sein soll.
  • Es muss festgestellt werden, dass, wie in der Beschreibung und den anhängigen Ansprüchen verwendet, die Einfachformen "ein", "ein(e)" und "der (die) (das)" Pluralbezeichnungen einschließen, wenn der Kontext diesem nicht deutlich entgegensteht. So schließt zum Beispiel der Bezug auf "eine aromatische Verbindung" Mischungen von aromatischen Verbindungen ein.
  • Häufig werden Bereiche hierin von "etwa" einem bestimmten Wert und/oder zu "etwa" einem anderen bestimmten Wert ausgedrückt. Wenn ein solcher Bereich ausgedrückt wird, schließt eine weitere Ausführungsform von dem einen bestimmten Wert und/oder zu dem anderen bestimmten Wert ein. In gleicher Weise, wenn Werte als ungefähre Abschätzungswerte angegeben sind, und zwar durch die Verwendung des vorhergehenden "etwa", versteht es sich, dass der bestimmte Wert eine weitere Ausführungsform bildet. Es versteht sich ferner, dass die Endpunkte von jedem der Bereiche signifikant sowohl in bezug auf den anderen Endpunkt als auch unabhängig von dem anderen Endpunkt sind.
  • In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen, welche folgen, wird auf eine Vielzahl von Ausdrücken Bezug genommen, welche die folgenden Bedeutungen besitzen sollen:
    Ein Gewichtsprozentwert einer Komponente basiert, wenn es nicht spezifisch gegensätzlich angegeben ist, auf dem Gesamtgewicht der Formulierung oder Zusammensetzung, in welcher die Komponente eingebracht ist.
  • Ein Rest einer chemischen Spezies, wie in der Beschreibung und den zusammenfassenden Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf die Gruppeneinheit, welche das resultierende Produkt der chemischen Spezies in einem bestimmten Reaktionsschema oder anschließenden Formulierung oder chemischen Produkt ist, unabhängig ob nun die Gruppeneinheit tatsächlich aus der chemischen Spezies erhalten wurde. Somit bezieht sich ein Ethylenglykolrest in einem Polyester auf eine oder mehrere -OCH2CH2O- -Wiederholungseinheiten in dem Polyester, unabhängig davon, ob Ethylenglykol zur Herstellung des Polyesters verwendet wurde. In entsprechender Weise bezieht sich ein Sebacinsäurerest in einen Polyester, auf eine oder mehrere -CO(CH2)8CO- Gruppeneinheiten in dem Polyester, unabhängig davon, ob der Rest durch die Umsetzung von Sebacinsäure oder einem Ester davon zur Herstellung des Polyesters erhalten wurde.
  • "Optional" oder "gegebenenfalls" bedeuten, dass das danach beschriebene Ereignis oder der danach beschriebene Umstand auftreten kann oder nicht, und dass die Beschreibung Fälle einschließt, bei denen das Ereignis oder der Umstand auftritt, und Fälle, bei denen er nicht auftritt. Zum Beispiel bedeutet der Ausdruck "gegebenenfalls substituiertes Nieder-Alkyl", dass die Nieder-Alkylgruppe substituiert sein kann oder nicht, und dass die Beschreibung sowohl nicht substituiertes Nieder-Alkyl als auch Nieder-Alkyl, bei dem Substitution vorliegt, einschließt.
  • Mit dem Ausdruck "wirksame Menge" einer Verbindung oder einer Eigenschaft, wie hierin vorgesehen, ist eine solche Menge, welche in der Lage ist zur Durchführung der Funktion der Verbindung oder der Eigenschaft, für welche eine wirksame Menge ausgedrückt wird, gemeint. Wie es unten herausgestellt wird, wird die exakte erforderliche Menge von Verfahren zu Verfahren variieren, und zwar in Abhängigkeit von anerkannten Variablen, wie der angewandten Verbindungen und den beobachteten Prozessierbedingungen. Somit ist es nicht möglich, eine exakte "wirksame Menge" zu spezifizieren. Gleichwohl kann eine geeignete wirksame Menge durch einen mit durchschnittlicher Erfahrung im Fachbereich nur durch die Anwendung routinemäßiger Experimente bestimmt werden.
  • Die "Enzyme Commission of International Union of Biochemistry and Molecular Biology ("EC")" hat ein allgemein bekanntes numerisches System aus vier Ziffern zur Klassifizierung von Enzymen im Hinblick auf den Reaktionstyp, welchen die Enzyme katalysieren, entworfen. Das EC-Klassifikationssystem wurde von Dixon, Webb, Thorne und Tipton ("Enzymes", Kapitel 5, Seiten 207–230, Academic Press, 1979) beschrieben, und zwar für den Zweck der Beschreibung der Klassifikation von Enzymen und der Beziehung der Klassifikationen zu den Substraten und Produkten der durch die Enzyme katalysierten Reaktionen.
  • Die erste Ziffer einer Enzymklassifikation ("EC") entspricht einer von sechs Klassen von Enzymen. Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden Vertreter der Klasse von Oxidoreduktasen verwendet, welche Enzyme umfasst, die die Übertragung von Elektronen, H-Atomen oder Hydrid-Atomen vermitteln. Oxidoreduktasen haben bezüglich der ersten Ziffer der EC-Klassifikation eine "1".
  • Die zweite Ziffer einer EC-Klassifikation betrifft die Unterklassen der Enzyme, welche durch die erste Ziffer spezifiziert werden. Für eine Oxidoreduktase gehört die zweite Ziffer zu einer Gruppe von zwanzig Unterklassen an funktionellen Gruppen der Substrate und/oder Produkte für die Enzyme, d.h. Klassen der funktionellen Gruppen in den Substraten oder Produkten, welche eine Oxidation oder Reduktion erfahren. Die dritte Ziffer einer EC-Klassifikation betrifft eine andere Reihe von Unter-Unterklassen. In dem Fall der Oxidoreduktasen gibt eine dritte Ziffer von "1" eine Oxidoreduktase an, welche die Anwesenheit von Nikotinamid-Cofaktoren erfordert. Deshalb werden zum Beispiel die Nikotinamid-Cofaktor-abhängigen Enzyme unter dem EC-System alle als Enzyme der "1.x.1.y."-Klasse klassifiziert. Die vierte Ziffer einer EC-Klassifikation spezifiziert eine fortlaufende Nummer für das Enzym, welche sich häufig auf die besondere Identität des natürlichen Substrates des Enzyms bezieht.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung stabilisieren Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzyme, welche weiter durch die Werte von x und y in der EC-Klassifikation des Enzyms definiert werden. Die zweite Ziffer einer EC-Klassifikation eines Enzyms, d.h. der Wert x, entspricht der Klasse der funktionellen Gruppe, welche durch das Enzym oxidiert oder reduziert wird. Bevorzugte Enzyme mit x-Werten von 1, 3, 4, 5 oder 10 entsprechen Keton- oder Aldehydreduktionen (x = 1); Olefinreduktion (x = 3); Iminreduktion (x = 4 oder 5); und der Reduktion von Diphenolen oder Ascorbat (x = 10). Deshalb ist in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym ein Enzym, welches unter dem EC-System als ein Enzym der 1.x.1.y.-Klasse klassifiziert wird, wobei x 1, 3, 4, 5 oder 10 ist. Von mehr als 340 Enzymen ist derzeit bekannt, dass sie innerhalb jener bevorzugten Klassen von Enzymen fallen.
  • Für Enzyme innerhalb der Klasse von 1.1.1.y-Enzymen setzt die untenstehende Tabelle 1 den Wert von y mit dem Namen des Enzyms und ihren natürlichen Substraten in Zusammenhang. Tabelle 1 – Enzyme der 1.1.1.y.-Klasse
    y Name vom Enzym
    1 Alkoholdehydrogenase
    2 Alkoholdehydrogenase
    4 Butandioldehydrogenase
    5 Diacetylreduktase
    6 Glyceroldehydrogenase
    7 Glycerol-3-phosphatdehydrogenase
    14 L-Iditol-2-dehydrogenase
    18 Myo-inositol-2-dehydrogenase
    21 Aldosereduktase
    22 UDP-Glucose-6-dehydrogenase
    26 Glyoxalatdehydrogenase
    27 L-Lactatdehydrogenase
    30 3-Hydroxybutyratdehydrogenase
    37 Malatdehydrogenase
    40 Malatdehydrogenase
    41 Isocitratdehydrogenase
    42 Isocitratdehydrogenase
    44 Phosphogluconatdehydrogenase
    47 Glucose-1-dehydrogenase
    48 Galactose-1-dehydrogenase
    49 Glucose-6-phosphat-1-dehydrogenase
    50 3a-Hydroxysteroiddehydrogenase
    51 3 (oder 17)-b-Hydroxysteroiddehydrogenase
    53 3a (oder 20b)-Hydroxysteroiddehydrogenase
    55 Lactaldehydreduktase
    67 Mannitol-2-dehydrogenase
    72 Glyceroldehydrogenase
    83 D-Malatdehydrogenase
    95 Glyceroldehydrogenase
    119 Glucose-1-dehydrogenase
    122 D-Threo-aldose-1-dehydrogenase
    159 12a-Hydroxysteroiddehydrogenase
    176 12a-Hydroxysteroiddehydrogenase
  • Für Enzyme innerhalb der Klasse von 1.3.1.y-Enzymen sind Enzyme der Klasse 1.3.1.14, d.h. Orotat-Reduktasen, bevorzugt. (NADH)
  • Für Enzyme innerhalb der Klasse von 1.4.1.y-Enzymen setzt die untenstehende Tabelle 2 den Wert von y mit dem Namen des Enzyms und/oder seinem natürlichen Substrat in Zusammenhang. Tabelle 2: Enzyme der 1.4.1.y-Klasse
    y Name vom Enzym
    1 Alanindehydrogenase
    2 Glutamatdehydrogenase
    3 Glutamatdehydrogenase
    4 Glutamatdehydrogenase
    5 L-Aminosäuredehydrogenase
    7 Serindehydrogenase
    8 Valindehydrogenase
    9 Leucindehydrogenase
    10 Glycindehydrogenase
    11 L-Erythro-3,5-diaminohexanoatdehydrogenase
    12 2,4-Diaminopentanoatdehydrogenase
    13 Glutamatsynthase
    14 Glutamatsynthase
    15 Lysindehydrogenase
    16 Diaminopimelatdehydrogenase
    17 N-Methylalanindehydrogenase
    18 Lysin-6-dehydrogenase
    19 Tryptophandehydrogenase
    20 Phenylalanindehydrogenase
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym ein Enzym, welches unter dem EC-System als ein Enzym einer 1.1.1.1-, einer 1.1.1.2.-, einer 1.1.1.4-, einer 1.1.1.5-, einer 1.1.1.6-, einer 1.1.1.7-, einer 1.1.1.14-, einer 1.1.1.18-, einer 1.1.1.21-, einer 1.1.1.22-, einer 1.1.1.26-, einer 1.1.1.27-, einer 1.1.1.30-, einer 1.1.1.37-, einer 1.1.1.40-, einer 1.1.1.41-, einer 1.1.1.42-, einer 1.1.1.44-, einer 1.1.1.47-, einer 1.1.1.48-, einer 1.1.1.49-, einer 1.1.1.50-, einer 1.1.1.51-, einer 1.1.1.53-, einer 1.1.1.55-, einer 1.1.1.67-, einer 1.1.1.72-, einer 1.1.1.83-, einer 1.1.1.95-, einer 1.1.1.119-, einer 1.1.1.122-, einer 1.1.1.159-, einer 1.1.1.176-, einer 1.3.1.14-, einer 1.4.1.1-, einer 1.4.1.2-, einer 1.4.1.3-, einer 1.4.1.4-, einer 1.4.1.5-, einer 1.4.1.7-, einer 1.4.1.8-, einer 1.4.1.9-, einer 1.4.1.10-, einer 1.4.1.11-, einer 1.4.1.12-, einer 1.4.1.13-, einer 1.4.1.14-, einer 1.4.1.15-, einer 1.4.1.16-, einer 1.4.1.17-, einer 1.4.1.18-, einer 1.4.1.19- oder einer 1.4.1.20-Enzymklasse klassifiziert ist.
  • In stärker bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym ein Enzym, welches unter dem EC-System als ein Enzym einer 1.1.1.1-, 1.1.1.2-, 1.1.1.5-, 1.1.1.6-, 1.1.1.7-, 1.1.1.14-, 1.1.1.18-, 1.1.1.21-, 1.1.1.26-, 1.1.1.27-, 1.1.1.37-, 1.1.1.40-, 1.1.1.41-, 1.1.1.42-, 1.1.1.47-, 1.1.1.48-, 1.1.1.49-, 1.1.1.72-, 1.1.1.83-, 1.1.1.95-, 1.1.1.119-, 14-, 1.4.1.1.-, 1.4.1.3-, 1.4.1.4-, 1.4.1.9- oder einer 1.4.1.20-Enzymklasse klassifiziert ist.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym, welches unter dem EC-System als ein Enzym einer 1.1.1.1- oder 1.1.1.2-Enzymklasse klassifiziert ist.
  • Nichtsdestotrotz versteht es sich, dass die 2. und/oder 4. Ziffer der EC-Klassifikation eines bestimmten Oxidoreduktase-Enzyms inhärent bevorzugte Klassen von Oxidations- und/oder Reduktionsreaktionen, welche durch das Enzym katalysiert werden können, und/oder die entsprechenden Klassen und/oder Spezien von Substraten und Produkten, welche involviert sein können, identifiziert. Eine Auflistung der Namen, EC-Klassifikationen und der entsprechenden chemischen Reaktionen der Oxidoreduktase-Enzyme, welche für die vorliegende Erfindung relevant sind, können in "Enzyme Nomenclature 1992 – Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes", Seiten 1–154, Academic Press, 1992, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, zum Zwecke der Beschreibung der Klassifikation von Enzymen und der Beziehung der Klassifikationen zu den Substraten und Produkten der durch die Enzyme katalysierten Reaktionen gefunden werden. Von besonderer Relevanz sind die Seiten 24–55 (Enzyme der 1.1.1.y-Klasse), der Seiten 65–67 (Enzyme der 1.2.1.y-Klasse), der Seiten 76–83 (Enzyme der 1.3.1.y-Klasse), der Seiten 87–89 (Enzyme der 1.4.1.y-Klasse), der Seiten 93–96 (Enzyme der 1.5.1.y-Klasse) und 113 (Enzyme 1.10.1.y-Klasse).
  • Wenn zum Beispiel das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine Alkoholdehydrogenase [1.1.1.1] oder [1.1.1.2] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt ein Alkohol.
  • In einer ähnlichen Weise werden bevorzugte Klassen oder Spezien von reduzierten organischen Produkten hierin für eine Anzahl von bestimmten EC-Enzym-Klassifikationen identifiziert. Wenn zum Beispiel das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine Aldosereduktase [1.1.1.21] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt ein Alditol. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine Glyoxolatreduktase [1.1.1.26] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt ein Glykolat oder Glycerat.
  • Bezug nehmend auf die Identifizierung von bevorzugten Spezien von reduzierten organischen Produkten für bestimmte Enzyme: Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine Diacetylreduktase [1.1.1.5] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt 3-Hydroxy-2-butanon (Acetoin). Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine Glyceroldehydrogenase [1.1.1.6] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt Glycerol. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine Propandiolphosphatdehydrogenase [1.1.1.7] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt Propan-1,2-diol-1-phosphat. Wenn das Niktonamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine L-Lactatdehydrogenase [1.1.1.27] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt ein (S)-Lactat. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym eine Malatdehydrogenase [1.1.1.37] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt (S)-Malat. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Malatdehydrogenase [1.1.1.40] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt (S)-Malat. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Isocitratdehydrogenase [1.1.1.41] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt Isocitrat. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Isocitratdehydrogenase [1.1.1.42] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt Isocitrat.
  • Wenn außerdem das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Glucose-1-dehydrogenase [1.1.1.47] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt β-D-Glucose. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Galactose-1-dehydrogenase [1.1.1.48] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt D-Glactose. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Glucose-6-phosphat-1-dehydrogenase [1.1.1.49] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt D-Glucose-6-phosphat. Wenn das Nikotinamid-Cofactor-abhängige Enzym Glyceroldehydrogenase (NADP) [1.1.1.72] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt Glycerol. Wenn das Nikotinamid-Cofactor-abhängige Enzym D-Malat-dehydrogenase [1.1.1.83] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt (R)-Malat. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Phosphoglyceratdehydrogenase [1.1.1.95] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt 3-Phosphoglycerat. Wenn das Nikotinamid-Cofactor-abhängige Enzym Glucose-1-dehydrogenase (NADP) [1.1.1.119] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt D-Glucose, D-Mannose, 2-Deoxy-D-glucose und 2-Amino-2-deoxy-D-mannose.
  • Wenn darüber hinaus das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Alanindehydrogenase [1.4.1.1] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt L-Alanin. Wenn das Nikotinamid-Cofactor-abhängige Enzym Glutamatdehydrogenase [1.4.1.3] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt L-Glutamat. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Glutamatdehydrogenase [1.4.1.4] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt L-Glutamat. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Leucindehydrogenase [1.4.1.9] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt L-Leucin. Wenn das Nikotinamid-Cofaktor-abhängige Enzym Phenylalanindehydrogenase [1.4.1.20] ist, ist ein bevorzugtes reduziertes organisches Produkt L-Phenylalanin.
  • Wie oben vorausgehend beschrieben, verwenden viele Verfahren zur Reduzierung von ungesättigten organischen Verbindungen mit H2 Oxidoreduktase-Enzyme, deren Aktivität durch die Anwesenheit von bestimmten Stabilisatoren erhöht oder aufrechterhalten wird. Es ist im Fachbereich bekannt, bestimmte schwefelhaltige Stabilisatoren zu verwenden, und es ist insbesondere im Fachbereich bekannt, Stabilisatoren mit Sulfhydrilgruppen zu verwenden, welche durch Verbindungen wie Dithiothreitol (DTT), Mercaptoethanol und dergleichen beispielhaft angegeben werden.
  • In unerwarteter Weise wurde herausgefunden, dass bestimmte phosphorhaltige Verbindungen ebenfalls Oxidoreduktase-Enzyme stabilisieren können. Die Enzymstabilisation tritt unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit des H2 oder von ungesättigten organischen Verbindungen, die in den oben beschriebenen Verfahren angewendet werden, auf. Insbesondere wurde in unerwarteter Weise herausgefunden, dass Phosphine oder Phosphite Oxidoreduktase-Enzyme in einer Vielzahl von Verfahren stabilisieren können.
  • Deshalb sieht die Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung der Aktivität eines Oxidoreduktase-Enzyms vor, umfassend das Mischen eines Phosphins oder Phosphits mit einem Oxidoreduktase-Enzym. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung tritt das Mischen des Phosphins oder Phosphits mit dem Oxidoreduktase-Enzym in einem flüssigen Medium auf. Das flüssige Medium kann Wasser, ein organisches Lösungsmittel oder eine Mischung davon umfassen. Vorzugsweise umfasst das flüssige Medium eine im Wesentlichen wässrige Pufferlösung.
  • Vorzugsweise ist das Mischen des Phosphins oder Phosphits mit dem Oxidoreduktase-Enzym dabei wirksam, den Verlust an Aktivität des Oxidoreduktase-Enzym zu verlangsamen, und zwar im Vergleich zu der Rate des Verlustes an Aktivität des Oxidoreduktase-Enzyms in Abwesenheit des Phosphins oder Phosphits. Obgleich man nicht an eine Theorie gebunden sein möchte, nimmt man an, dass die Phosphin- oder Phosphitverbindungen als reduzierende Mittel für bestimmte Oxidations-empfindliche Komponenten der Enzyme, einschließlich Cystein-Aminosäurereste, die in den Enzymen enthalten sind, dienen.
  • Vorzugsweise umfasst das Phosphin oder das Phosphit Phosphorderivate PRn(O-R)3–n, wobei n eine ganze Zahl von null bis drei ist. Vorzugsweise umfassen die R-Gruppen 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatome. Die R-Gruppen (ob sie nun an Phosphor oder Sauerstoff gebunden sind, werden unabhängig gewählt und können gleich oder unterschiedlich sein. Vorzugsweise sind die R-Gruppen Kohlenwasserstoff- oder substituierte Kohlenwasserstoffgruppen, welche Alkyl, Cycloalkyl, aromatische und heteroaromatische Gruppen einschließen.
  • Vorzugsweise werden eine oder mehrere der R-Gruppen mit einer oder mehreren polaren Gruppen substituiert. Bevorzugte polare Gruppen schließen Salze von anionischen Gruppen wie Sulfonat- und Carboxylatgruppen; Salze von kationischen Gruppen wie Alkylammoniumgruppen oder polare, jedoch elektrisch neutrale Gruppen wie Hydroxyl-, Amino-, Alkohol- oder Polyalkylengruppen ein. Polyethylenglykolgruppen sind bevorzugte Polyalkylenglykolgruppen. Die polaren Gruppen, so nimmt man an, sind vorteilhaft bei der Verbesserung der Wirksamkeit der Phosphin- oder Phosphitstabilisatoren, da die polaren Gruppen dazu neigen, die Wasserlöslichkeit der Phosphine oder Phosphite zu erhöhen, so dass sie wirksamer mit den Oxidoreduktase-Enzymen, welche ebenfalls wasserlöslich sind, in Wechselwirkung treten können.
  • Bevorzugte Verbindungen sind Tris(m-sulfonatophenyl)phosphin-Trinatriumsalz (TPPTS), oder 1,3,5-Triaza-7-phosphaadamantan (PTA).
  • Experimentelle Durchführung
  • Die folgenden Beispiele werden dargestellt, um jene Durchschnittsfachleute im Fachbereich mit einer vollständigen Offenbarung und Beschreibung zu versehen, wie die Verbindungen und damit in Verbindung stehende Verfahren und Methoden konstruiert, angewandt und evaluiert werden, und sie sollen lediglich rein beispielhaft für die Erfindung sein und nicht den Umfang dessen beschränken, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Genauigkeit in bezug auf die Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur etc.) sicherzustellen, jedoch sollte man mit Fehlern und Abweichungen rechnen. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich Teile auf Gewichtsteile, ist die Temperatur in °C (Celsius) angegeben oder ist Umgebungstemperatur, und der Druck ist bei oder in der Nähe von atmosphärischem Druck.
  • Materialien und Methoden
  • Tris(m)-sulfonatophenyl)phosphin-Trinatriumsalz (TPPTS) wurde von Strem Chemical gekauft, und Natriumdiphenylphosphinobenzol-3-sulfonat (TPPMS) von TCI America. Alkoholdehydrogenase-Enzyme von Thermanaerobium brockii (TBADH, EC 1.1.1.2), β-Nikotinamidadenindinucleotid (NAD+), β-Nikotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP+), und ihre jeweiligen reduzierten Formen wurden von Sigma Chemical gekauft und in einem Kühlschrank gelagert (–10°C). Die Herstellung von TBADH ist in dem US-Patent Nr. 4 352 885 beschrieben. RuCl3-Hydrat (38,4% Ru) wurde von Colonial Metals, Inc. erhalten. 1,3,5-Triaza-7-phosphaadamantan (PTA) wurde mittels der Prozedur von Daigle et al. (Inorg. Synth. 1998, 32, 40–45) hergestellt. [Cl2Ru(TPPTS)2]2 wurde gemäß der Prozedur von Hernandez und Kalck (J. Mol. Catal. A: Chem., 1993, 116, 117–130) hergestellt. Cl2Ru(PTA)4 wurde gemäß der Prozedur von Darensbourg et al. (Inorg. Chem., 1994, 33, 200–08) hergestellt. Phosphatpuffer wurde unter Verwendung von KHPO4 hergestellt. Prozeduren zur 2-Heptanon-Reduktion unter Verwendung von Isopropanol zur Regeneration von NADP wurden von Keinan et al. (J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 162) angepasst. 1H- und 13C-NMR-Spektren wurden auf einem Varian Gemini-300-Spektrometer aufgezeichnet. Referenzproben von NAD+, NADH, NADP+ und NADPH wurden in D2O gelöst, und ihre chemischen Verschiebungen (δ) wurden in bezug zu Natrium-3-(trimethylsilyl)propionat (TMSP) angegeben. Zuweisungen der chemischen Verschiebungen wurden gemäß Ragg et al. (J. Biochim. Biophys. Acta 1991, 1076, 49) und Oppenheimer (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 1971, 68, 3200) vorgenommen. GLC wurde auf einem HP 6890-Gaschromatographen mit einer 30'-DB-FFAP-Kapillarsäule und Flammenionisationsdetektion durchgeführt. Proben von (R)-(–)-2-Heptanol (95%) und (S)-(+)-2-Heptanol (99%, 97% ee) wurden von Aldrich Chemical erhalten. Proben wurden durch die Umwandlung ihrer Trifluoracetatester durch eine standardisierte Behandlung mit Trifluoressigsäureanhydrid analysiert. Der enantiomere Überschuss an (S)-2-Heptanol, der durch die enzymatische Reduktion produziert wurde, wurde mittels chiraler GC und Vergleich zu (R)- und (S)-2-Heptanol-Standards unter Verwendung einer Cyclodex-B-Säule (30 m × 0,25, 0,25μ-Film) bei 40°C bestimmt. Unter die sen Bedingungen betrugen die Retentionszeiten der Trifluoracetate von (R)-2-Heptanol und (S)-2-Heptanol 28,15 Minuten und 28,77 Minuten.
  • Beispiel 1
  • Das Beispiel 1 zeigt, dass das TPPTS als ein Stabilisator für TBADH verwendet werden kann.
  • Phosphatpuffer (10 ml, 0,1 M, pH = 7,0) wurde in ein 100 ml großes Schlenk-Röhrchen unter Argon gegeben. 2-Heptanon (4,92 g, 43,1 mMol), Isopropanol (1,57 g, 26,1 mMol), Heptadecan (41,0 μl), TPPTS (23 mg, 40,0 μMol), NADP+ (0,4 mg, 0,5 μMol) und TBADH (2,7 mg, 19,8 Einheiten) wurden dann unter einem Argonstrom hinzugegeben. Nach der dreimaligen Evakuierung und Wiederauffüllung mit Argon wurde die Apparatur auf 38°C mittels eines Ölbades erhitzt. Die GC-Analyse alle fünf Stunden zeigte eine kontinuierliche Herstellung von 2-Heptanol für die anfänglichen 20 Stunden mit einer Rate, die ~ 210 Umwandlungen (Turnover) von NADP+ pro Stunde anzeigte (insgesamt 2,17 mMol 2-Heptanol in 21 Stunden). Nach zusätzlichen 24 Stunden hatte sich die Ausbeute an 2-Heptanol nicht verändert. Die Endausbeute an 2-Heptanol entsprach 4 343 Umwandlungen an NADP+.
  • Vergleichsbeispiel 1a
  • Das Vergleichsbeispiel 1a zeigt die TBADH-Produktivität ohne einen Stabilisator.
  • Identische Mengen an allen Reagenzien bei einer 2-Heptanon-Reduktion mit Isopropanol (Beispiel 10), außer für das wasserlösliche Phosphin (TPPTS), wurden auf 38°C mit einem Ölbad 23 Stunden lang erhitzt. Die Ausbeute an 2-Heptanol betrug 0,13 mMol, entsprechend insgesamt 271 Umwandlungen an NADP+.
  • Vergleichsbeispiel 1b
  • Das Vergleichsbeispiel 1b zeigt die TBADH-Produktivität mit Dithiothreitol (DTT) als ein Stabilisator.
  • Unter Anwendung der im Vergleichsbeispiel 1a beschriebenen Prozedur und identischen Mengen an allen Reagenzien, außer dem Zweifachen der Menge an 2-Heptanon (9,84, 86,2 mMol) und dem Substituieren von DTT als ein Stabilisator (6 mg, 40 μMol) anstelle von TPPTS, wurde die Reduktion von 2-Heptanon mit Isopropanol bei 38°C 19 Stunden lang durchgeführt, wodurch man 2,51 mMol 2-Heptanol erhielt, was insgesamt 5 021 Umwandlungen an NADP+ entsprach.
  • Vergleichsbeispiel 1c
  • Das Vergleichsbeispiel 1c zeigt die TBADH-Produktivität mit Mercaptoethanol als ein Stabilisator.
  • Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur und identischen Mengen an allen Reagenzien, jedoch unter Substitution von Mercaptoethanol als ein Stabilisator (2,8 μl, 40 μMol) anstelle von DTT, wurde die Reduktion von 2-Heptanon mit Isopropanol bei 38°C 22 Stunden lang durchgeführt, wodurch man 2,56 mMol 2-Heptanol erhielt, was insgesamt 5 121 Umwandlungen an NADP+ entsprach.
  • Beispiel 2
  • Das Beispiel 2 zeigt, dass Triphenylphosphin (TPP) als ein Stabilisator für TBADH verwendet werden kann.
  • Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur und identischen Mengen an allen Reagenzien, jedoch unter Substitution von Triphenylphosphin als ein Stabilisator (10 mg, 40 μMol) anstelle von TPPTS, wurde die Reduktion von 2-Heptanon mit Isopropanol bei 37°C 19 h lang durchgeführt, wodurch man 2,15 mMol 2-Heptanol erhielt, was insgesamt 4 301 Umwandlungen an NADP+ entsprach.
  • Beispiel 3
  • Das Beispiel 3 zeigt, dass "monosulfoniertes Triphenylphosphin" (TPPMS) als ein Stabilisator für TBADH verwendet werden kann.
  • Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur und identischen Mengen an allen Reagenzien, wobei jedoch Triphenylphosphin als ein Stabilisator (15 mg, 40 μMol) anstelle von TPPTS substituiert wird, wurde die Reduktion von 2-Heptanon mit Isopropanol bei 38°C 16 Stunden lang durchgeführt, wodurch man 1,93 mMol 2-Heptanol erhielt, was insgesamt 3 859 Umwandlungen an NADP+ entsprach.
  • Es ist jenen im Fachbereich Erfahrenen ersichtlich, dass verschiedene Modifikationen und Variationen bei der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können. Es ist beabsichtigt, dass die Beschreibung und Beispiele nur als beispielhaft angesehen werden, wobei der wahre Umfang der Erfindung durch die folgenden Ansprüche angegeben wird.

Claims (5)

  1. Verfahren zur Stabilisierung der Aktivität eines Oxidoreduktase-Enzyms, umfassend Mischen eines Phosphins oder Phosphits mit einem Oxidoreduktase-Enzym.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Phosphin oder das Phosphit die phosphorhaltigen Derivate PRn(O-R)3–n umfassen, wobei n eine ganze Zahl von null bis drei ist, die R-Gruppen können gleich oder verschieden sein, und die R-Gruppen umfassen Kohlenwasserstoff-, substituierte Kohlenwasserstoff-, aromatische oder heteroaromatische Gruppen.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die eine oder mehrere R-Gruppen mit einer oder mehreren polaren Gruppen substituiert sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die polare Gruppe Sulfonat-, Carboxylat-, Amino-, Alkylammonium-, Hydroxyl- oder Polyalkylenglycol-Gruppen umfaßt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mischen in einem flüssigen Medium geschieht.
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