DE60012488T2 - Enzymatisch katalysierte signalamplifizierung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion von Zielmolekülen unter Verwendung von Methoden der enzymatisch katalysierten Amplifizierung von mit dem Zielmolekül assoziierten detektierbaren Strukturen.
  • Verschiedene Nukleinsäuren-Amplifizierungstechniken sind bereits bekannt, z.B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Dennoch leiden viele dieser Techniken (einschließlich PCR) unter dem Nachteil, dass sie spezifisch eine Zielmolekül-Sequenz (Amplicon), verstärken, die sich in der zu untersuchenden Probe befindet. Dieses Amplicon, einmal hergestellt, kann in einfacher Weise einen Arbeitsplatz im Labor kontaminieren, indem keine strikten Kontrollen eingehalten werden. Solche Kontaminationen können Zweifel an den nachfolgenden Amplifizierungsreaktionen auslösen und können die Einstellung der Untersuchungen und den Be ginn kostspieliger Dekontaminierungsprozeduren erfordern.
  • Techniken wie die PCR, die die Gegenwart einer Sequenz durch Amplifizierung ihrer Anzahl bis zu detektierbaren Mengen detektiert, sind als Zielmolekül-Amplifizierungssysteme bekannt. Im Gegensatz dazu sind mehrere Techniken bekannt, die ein Signal bis zu einem detektierbaren Level amplifizieren, üblicherweise nachfolgend der Bindung eines Detektormoleküls an das interessierende Molekül, ohne Amplifizierung des besagten Moleküls. Diese werden als Signal-Amplifizierungstechniken bezeichnet.
  • Ein solches System Chiron Corporation (Urdea et al., US 5,681,697 und die hierin zitierten Verweise) ist als verzweigtes DNA-System (bDNA) bekannt. Dieses System basiert auf der Bindung einer großen Anzahl von Detektorsonden, die innerhalb ihrer Sequenz eine Hybridisierungsstelle für eine für das Zielmolekül nicht spezifische Sequenz enthalten, an das Zielmolekül. Diese Sequenz fungiert als Hybridisierungsstelle für eine vorher synthetisierte verzweigte DNA-Struktur mit zahlreichen Hybridisierungsstellen für sekundäre Verzweigungen oder für Detektorsonden. Einer der hauptsächlichen Nachteile dieses Systems ist die große Anzahl von Komponenten, die erforderlich ist, um die finale Struktur herzustellen, an die sich die Detektorsonden binden. Zusätzlich machen die vielen Hybridisierungsschritte, die im Rekonstruktionsprozess eingebunden sind, das System anfällig für das Auftreten eines unspezifischen Hintergrundsignals.
  • Andere Zielmolekül-Detektionssysteme, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, schließen die US 5,451,503 , WO 98/02580, WO 97/42346 und US 5,681,697 ein.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren für die Amplifizierung eines auf einer Nukleinsäure basierenden Signals. Es umfasst die Synthese einer Wiederholstruktur, die mehrere Kopien einer detektierbaren Sequenz enthält und wird durch die gemeinsame Reaktion einer Polymerase (die die Wiederholstruktur verlängert) und eines Separierungsmittel (das Hybridisierungsstellen freilegt, um die Rekonstruktion von Sequenzwiederholungen zu erlauben) hergestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet folgende Vorteile gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden:
    • 1. Es verwendet eine kleine Anzahl günstiger Komponenten und vermeidet so Probleme der hohen Kosten pro Assay, die mit anderen Signal-Amplifizierungssystemen, wie z.B. bei bDNA, verbunden sind.
    • 2. Es verwendet an Stelle des Ansatzes einer Target-Amplifizierung eine Signal-Amplifizierung und kann somit Kontaminierungsprobleme überwinden, die mit vielen bekannten Methoden, wie z.B. PCR, verbunden sind.
    • 3. Es ist ein enzymatisch katalysiertes Verfahren, das die signalerzeugende Struktur anstelle von den passiven auf der Hybridisierung basierenden Ansätzen von nicht-enzymatischen Verfahren, wie z.B. bDNA, aktiv rekonstruiert.
    • 4. Es hat die Fähigkeit, RNA- und DNA-Targets mit gleicher Wirksamkeit im Gegensatz z.B. zur PCR, die einen ersten umgekehrten Transkriptionsschritt erfordert, bevor die RNA-Zielmoleküle amplifiziert werden können, ohne Vorbehandlung zu adressieren.
    • 5. Da das Verfahren in Verbindung mit einem an einer festen Phase immoblisierten Zielmolekül verwendet wird, ermöglicht es die Integration in innovative Festphasen-Vorrichtungen, wie z.B. Biochips.
  • Das Zielmolekül kann zuerst an einer Festphase immoblisiert werden, bevor das Detektionsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet wird. Die Erfindung ist nicht auf dieses oder irgendein anderes spezifisches Assay-Format beschränkt.
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst:
    • i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde enthaltend einen Bindungsrest, der für das besagte Zielmolekül spezifisch ist, und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz, um ein Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen;
    • ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden im vorangehenden Schritt hergestellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschritts der Behandlung der besagten Probe und der Lokalisierungssonde mit:
    • a) einer einsträngigen Amplifizierungs-Matrize enthaltend:
    • i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung:
    • a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz;
    • b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz, die komplementär ist zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes, oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz besitzt und
    • c) einen Amplifizierungsrest, der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und
    • ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest;
    • b) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komple mentären Stranges zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize in der Lage ist;
    • c) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize zu entfernen, wenn sie zu dem besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um eine nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize zu dem besagten komplementären Strang zu erlauben und
    • d) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize komplementär sind, zu ermöglichen;
    • iii) Detektion jeder gebundenen Amplifizierungs-Matrize von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten und iv) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iii) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls.
  • Der Rückbezug in den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung auf „den vorhergehenden Schritt" ist üblicherweise ein Rückbezug auf Schritt (i) des Ver fahrens, obwohl im „vorhergehenden Schritt" ein Amplifizierungsschritt (d.h. ein Schritt zur Herstellung einer Amplifizierungsstruktur) einer anderen Ausführungsform der Erfindung eingeschlossen ist (siehe unten).
  • Die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz kann durch die Verwendung einer doppelsträngigen 5'-Exonuklease, gegen deren Aktivität die Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz geschützt ist, entfernt werden. Die Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (und, wenn erforderlich, andere Sequenzen) kann vor der Exonuklease-Aktivität geschützt werden, indem normale Reste durch 2'-O-Methyl-RNA-Reste während deren Synthese ersetzt werden.
  • In einer zweiten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls bereit (unter Verwendung einer Amplifizierungs-Matrize, deren Verlängerungs- und Hybridisierungsregion sich voneinander unterscheiden, um interferierende Nebenreaktionen zu minimieren), das die folgenden Schritte umfasst:
    • i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde, die einen Bindungsrest enthält, der für das besagte Zielmolekül spezifisch ist, und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz, um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen;
    • ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden Komplex gebunden ist, der im vorherigen Schritt durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschrittes der Behandlung der besagten Probe und der Lokalisierungssonde mit
    • a) einer einsträngigen ersten Amplifizierungs-Matrize enthaltend:
    • i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung:
    • a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz;
    • b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz, die zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes komplementär ist und eine im Wesentlichen unterschiedliche Sequenz zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz hat und
    • c) ein Amplifizierungsrest, der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf eine Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und
    • ii) gegebenenfalls enthaltend wenigstens einen Signalrest, der von der Nukleinsäurensequenz verschieden ist;
    • b) eine einsträngige zweite Amplifizierungs-Matrize enthaltend:
    • i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung :
    • a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz enthaltend die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize;
    • b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz enthaltend die Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize und
    • c) einen Amplifizierungsrest, der in allen bis auf den letzten Amplifizierungsschritt auf eine Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und
    • ii) gegebenenfalls enthaltend wenigstens einen Signalrest, der von einer Nukleinsäurensequenz verschieden ist;
    • c) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize in der Lage ist;
    • d) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen zu entfernen, wenn sie zum besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um die nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen des besagten komplementären Stranges zu erlauben und
    • e) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu den besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenzen der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen komplementär sind, zu ermöglichen;
    • iii) Detektion jeder gebundenen ersten und/oder zweiten Amplifizierungs-Matrize des Amplifizierungsschrittes oder der Amplifizierungsschritte und iv) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iii) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls.
  • Die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen kann durch die Verwendung einer doppelsträngigen 5'-Exonuklease, gegen deren Aktivität die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize und die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten zweiten Amplifizierungs-Matrize geschützt ist, entfernt werden.
  • Lokalisierungssonde
  • Die Lokalisierungssonde enthält zwei verschiedene Bereiche, die das Zielmolekül bindende Gruppe und die Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz. Die Funktion der das Zielmolekül bindenden Gruppe ist es, das Zielmolekül zu lokalisieren und mit diesem Wechselwirkungen zu entwickeln, um es an dieser Stelle zu lokalisieren. Die das Zielmolekül bindende Gruppe kann alles, was zur spezifischen Bindung des Zielmoleküls in der Lage ist, enthalten. Ist das Zielmolekül z.B. eine Nukleinsäurensequenz, kann die Bindungsgruppe eine Nukleinsäurensequenz enthalten, die komplementär zur Target-Nukleinsäurensequenz ist. Alternativ kann sie RNA, eine Mischung aus RNA und DNA oder z.B. PNA umfassen. Alternativ kann die Bindungsgruppe einen Antikörper oder ein ein Antigenbindendes Fragment hiervon, die für das Zielmolekül spezifisch sind, enthalten (Harlow, E. und Lane, D., „Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998). Andere Bindungsmechanismen (z.B. unter Einbeziehung kovalenter Bindungen) und Reagenzien sind dem Fachmann bereits geläufig. Die Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz umfasst eine Nukleinsäurensequenz, die nicht komplementär zum Zielmolekül ist und an dieses nicht binden sollte, wodurch dieses für spätere Bindungsmöglichkeiten zugänglich bleibt. Ist das Zielmolekül eine Nukleinsäurensequenz, kann die Lokalisierungssonde so konstruiert werden, dass deren das Zielmolekül bindenden Gruppe und die Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz Oligonukleotide sind, die über eine 5'-3'-Verknüpfung oder alternativ über eine 5'-5'-Verknüpfung verbunden sind, sodass jeder Bereich ein verlängerbares freies 3'-Ende besitzt. Wo die das Zielmolekül bindende Gruppe ein Antikörper oder ein Antigenbindendes Fragment ist, kann die Signal-Nukleinsäuregruppe unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren kovalent zu dieser gebunden sein (vgl. z.B. Ito, W. und Kurosawa, Y., 1993, Journal of Biological Chemistry, 268(27):20668–20675).
  • Primäre Amplifizierungs-Matrize und die Primär-Struktur:
  • Die Amplifizierungs-Matrize wird synthetisiert, um über ihren Hybridisierungsbereich (ihre Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz) mit einer komplementären Nukleinsäurensequenz zu hybridisieren. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen kann das 3'-Ende dieses hybridisierten Komplements verlängert werden, um ein Komplement zu dem verlängerten Bereich (die verlängerte Nukleinsäurensequenz) der Amplifizierungs-Matrize zu schaffen. Die selektive Entfernung des verlängerten Bereichs der Amplifizierungs-Matrize führt dann zu einem neu synthetisierten einsträngigen Bereich, an den eine zusätzliche Amplifizierungs-Matrize hybridisieren kann. Eine Wiederholung der Schritte der Hybridisierung, Verlängerung und Entfernung führt zu einer verlängerten Struktur, die aus mehreren Wiederholungen der Amplifizierungs-Matrize aufgebaut ist. Um diese Struktur von anderen, die nachfolgend hergestellt werden können, zu unterscheiden, wird diese als Primär-Struktur bezeichnet. Die Amplifizierungs-Matrizen, die bei deren Herstellung einbezogen sind, werden als erste Amplifizierungs-Matrizen bezeichnet.
  • Innerhalb der Primär-Struktur sind die Amplifizierungs-Gruppen der eingebauten ersten Amplifizierungs-Matrizen. Diese Bereiche, die zu dem Zielmolekül oder der Primär-Struktur nicht-komplementär sind, sind für die Hybridisierung mit gewöhnlich markierten Detektionssonden zugänglich.
  • Wenn der Hybridisierungsbereich der ersten Amplifizierungs-Matrize synthetisiert worden ist, um z.B. komplementär zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz der Lokalisierungssonde zu sein, dann würde die Primär-Struktur an die Lokalisierungssonde gebunden, welche selbst an das Zielmolekül gebunden würde. Die Hybridisierung der Detektionssonden an die Primär-Struktur würde daher eine linear amplifizierte Anzahl von signalgenerierenden Stellen liefern, die an die Zielsequenz geknüpft sind.
  • Sekundäre Amplifizierungs-Matrizen und die Sekundär-Struktur:
  • Als eine Alternative für die Bereitstellung von Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenzen für eine nachfolgende Detektion, z.B. durch Detektionssonden, können die ersten Amplifizierungsgruppen der Matrize, die in die erste Struktur eingebaut sind, als Komplemente zu den Hybridisierungsbereichen der sekundären Amplifizierungs-Matrizen dienen.
  • Der Hybridisierungsbereich (d.h. die Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der zweiten Amplifizierungs-Matrize) ist so synthetisiert, dass er komplementär zu der Amplifizierungs-Gruppe der primären Amplifizierungs-Matrize ist. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen kann das 3'-Ende der ersten Matrizen-Amplifizierungsgruppe verlängert werden, um ein Kom plement zu dem verlängerten Bereich der sekundären Amplifizierungs-Matrize zu schaffen. Selektive Entfernung des verlängerten Bereiches der sekundären Matrize führt dann zu einem neu synthetisierten einsträngigen Bereich, an den eine zusätzliche sekundäre Amplifizierungs-Matrize hybridisieren kann. Eine Wiederholung der Schritte der Hybridisierung, der Verlängerung und der Entfernung führt zu mehrfach verlängerten Strukturen (aufgebaut aus mehreren Wiederholungen der sekundären Matrize), die an die Primär-Struktur gebunden sind. Diese Struktur wird als Sekundär-Struktur bezeichnet.
  • Die eingebauten Amplifizierungs-Gruppen der sekundären Matrizen, die zu dem Zielmolekül der Primär-Struktur oder der Sekundär-Struktur nicht komplementär sind, sind für die Hybridisierung durch geeignet markierte Detektionssonden zugänglich. Insgesamt wird ein nicht-linearer Anstieg der Anzahl von mit dem Zielmolekül assoziierten signalerzeugenden Stellen durch die Herstellung der Sekundär-Struktur bereitgestellt.
  • Jede Reaktion, die zu der Rekonstruktion einer Struktur führt, wird als Wiederholung bezeichnet. Die erste Wiederholung erzeugt die Primär-Struktur, die zweite Wiederholung die Sekundär-Struktur usw..
  • Tertiär- und Quartär-Strukturen etc. können in dieser Weise leicht durch Durchführung der geeigneten Anzahl von Wiederholungen hergestellt werden. Die durchgeführte Anzahl von Wiederholungen hängt von der Anwen dung ab und spiegelt die erforderliche Sensitivität wieder.
  • Separierungsmittel
  • Die Herstellung der verlängerten Primär- oder Sekundär-Struktur etc. beruht auf der Entfernung des verlängerten Bereiches der Amplifizierungs-Matrize, sobald das Komplement zu diesem Bereich hergestellt ist. Die „Freilegung" dieses neu synthetisierten Stranges liefert eine Stelle, an der eine andere Amplifizierungs-Matrize hybridisieren kann, wodurch der Rekonstruktionsprozess fortgesetzt wird. Die Separierungsmittel sind für die Entfernung des verlängerten Bereiches verantwortlich. Diese Separierungsmittel können jede einzelne oder eine Kombination von folgendem einschließen: Eine doppelsträngige spezifische 5'-Exonuklease (wie z.B. T7-Gen-6-Exonuklease oder Lambda-Exonuklease), eine Restriktions-Endonuklease, eine RNase (wie z.B. RNase H), erhöhte Temperatur oder chemische Denaturierung.
  • Die selektive Entfernung des verlängerten Bereichs erfordert einige Mittel zur Kontrolle oder Begrenzung der Aktivität der Separierungsmittel, während sichergestellt wird, dass die anderen Bereiche der eingebauten Amplifizierungs-Matrize an der wachsenden Struktur gebunden bleiben. Schutz gegen Exonuklease kann durch die Verwendung von Nukleotid-Analoga oder synthetische Nukleinsäurensequenzen (z.B. Phosphorothioat-Verknüpfungen bzw. 2'-O-Methyl-RNA) erreicht werden. Die Einbeziehung dieser synthetischen Blo ckierungsmittel kann die Aktivität der Exonukleasen auf die Bereiche beschränken, wo sie erforderlich sind.
  • Der Einbau von modifizierten Verknüpfungen kann ebenso die Aktivitäten der Restriktionsenzyme modifizieren, was zu doppelsträngiger Spaltung, einsträngiger Spaltung (Nicking) oder Nicht-Restriktion von Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, die aus der gleichen Basensequenz aufgebaut sind, führt. Deoxynukleotid-Phosphorothioate, methylierte Nukleotide und borierte Deoxynukleotsid-Triphosphate sind alles Beispiele für geeignete Analoga, die die Aktivitäten von ihren Restriktions-Enzymen modifizieren können, wenn sie in die Erkennungsstellen eingebaut sind.
  • Die Verwendung von chimären RNA:DNA-Amplifizierungs-Matrizen erlaubt die selektive Entfernung von bestimmten Teilen der Matrize unter Verwendung von RNase H, das auf den RNA-Bereich von RNA:DNA-Hybriden wirkt.
  • Wenn in der ersten und zweiten Ausführungsform das Separierungsmittel eine doppelsträngige spezifische 5'-Exonuklease ist, wird der Hybridisierungsbereich der Amplifizierungs-Matrizen und das 5'-Ende der Lokalisierungssonde durch Einbeziehung von modifizierten Verknüpfungen oder synthetischen Nukleotid-Analoga geschützt. Wenn das Separierungsmittel RNase H ist, wird der verlängerte Bereich der Amplifizierungs-Matrizen wenigstens teilweise aus RNA aufgebaut, während der Hybridisierungsbereich aus DNA auf gebaut wird. Haben die Separierungsmittel ein Temperaturoptimum von 37 °C, können sie in Verbindung mit einer Polymerase, wie z.B. der Klenow(Exo-)Polymerase, verwendet werden. In solch einem Fall kann das Verfahren isothermisch bei 37 °C durchgeführt werden. Alternativ kann das Verfahren natürlich auch bei mehr als einer Temperatur durchgeführt werden. Wenn das verwendete Separierungsmittel eine Restriktions-Endonuklease ist, besteht die Möglichkeit, das System mit einer Vielzahl von Formaten durchzuführen. Beispiele und Vorteile hierfür sind im Folgenden angegeben:
    • 1. Das Verfahren kann isothermisch durchgeführt werden, um ein schnelles qualitatives Ergebnis bereitzustellen, oder in einem Temperaturzyklus, um ein weniger schnelles, dafür aber quantitatives Ergebnis bereitzustellen.
    • 2. Das Verfahren kann bei Temperaturen höher als 37 °C durchgeführt werden, um eine Temperaturkontrollierte Stringenz zu erreichen (eine wichtige Möglichkeit gegeben durch die Länge und Komplexität der verwendeten Amplifizierungs-Matrizen).
    • 3. Die Aktivitäten der Restriktions-Endonukleasen sind definiert, gut charakterisiert und auf der Sequenz basierend, mehr als bei Exonukleasen wie z.B: T7-Gen-Exonuklease und Lambda-Exonuklease, deren Substratspezifität variieren kann.
    • 4. Die Kombination und gleichzeitige Wirkung der Restriktions-Endonukleasen und Polymerasen bei einem einzigen Satz von Reaktionsbedingungen wurde häufig demonstriert.
    • 5. Die Breite hinsichtlich der Betriebstemperaturen erlaubt einen flexibleren Ansatz beim Synthese-Grundprinzip, insbesondere im Hinblick darauf, unterschiedliche Materialien, wie z.B. PNA und 2'-O-Methyl-RNA, zu verwenden.
  • Wenn das Separierungsmittel eine Restriktionsendonuklease ist, werden eine oder mehrere Restriktionsstellen in die Verlängerungs- und Hybridisierungsbereiche der Amplifizierungs-Matrizen eingebaut. Solche Stellen in dem Hybridisierungsbereich können durch den Einbau von Nukleotid-Analoga an der Stelle der enzymatischen Spaltung geschützt werden. Solche Stellen im verlängerten Bereich sind nicht modifiziert. Die Hybridisierung der Amplifizierungs-Matrize und die Herstellung eines Komplements zu dem verlängerten Bereich führt zur Bildung von doppelsträngigen Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme. Die Verwendung von einem oder mehreren modifizierten dNTP in der Reaktionsmischung führt zu einem geschützten neu synthetisierten Strang. Das Enzym spaltet die Stelle im verlängerten Bereich der Amplifizierungs-Matrize, und bei der verwendeten Betriebstemperatur oder durch Erhöhung der Temperatur werden die resultierenden Fragmente disoziiert. Dies stellt eine einsträngige Stelle bereit, an der eine zusätzliche Amplifizierungs-Matrize hybridisieren kann, um den Rekonstruk tionsprozess fortzusetzen.
  • Die oben beschriebenen verwendeten Restriktionsenzyme müssen zu der Gruppe gehören, die zur Spaltung des ungeschützten Stranges einer hemi-modifzierten Enzymerkennungsstelle in der Lage ist. Es ist ebenso wichtig, dass die Sequenz der Erkennungsstelle nicht palindromisch ist, sodass die Amplifizierungs-Matrizen, welche selbst hybridisieren, keine Substrate für doppelsträngige Spaltung durch das Restriktionsenenzym sind. Ein Beispiel für ein geeignetes Enzym ist BsoB1. Es ist ebenso möglich, Enzyme zu verwenden, deren Aktivität natürlich darauf beschränkt ist, im Gegensatz zur doppelsträngigen Spaltung einen einzelnen Strang zu spalten. Ein Beispiel dieser Art von Enzymen ist N.BstNB1, das die Erkennungssequenz von SEQ ID NO:1 besitzt. Wenn solch ein Enzym verwendet wird, ist es nicht notwendig, dNTP-Analoga der Reaktionsmischung zuzusetzen, um den neu synthetisierten Strang zu schützen.
  • Wenn das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung isothermisch durchgeführt wird, ist die Reaktion relativ schnell (verglichen zu nicht-isothermen Verfahren), aber qualitativ hinsichtlich des erzeugten Signal-Outputs. Das Thermocycling (bei dem die gespaltenen Fragmente bei einer höheren Temperatur als der Betriebstemperatur des Restriktionsenzyms disoziiert werden) kann verwendet werden, um ein Signal-Output zu erzeugen, das quantitative Daten liefert.
  • In einer dritten Ausführungsform stellt die vorlie gende Erfindung ein Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls und der Verwendung eines Restriktionsenzyms und Polymerase bereit, das folgende Schritte enthält:
    • i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde enthaltend einen Bindungsrest, der für das besagte Zielmolekül spezifisch ist und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz, um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen, wobei die Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz für eine oder mehrere Begrenzungsstellen für eine Begrenzungs-Endonuklease für die Hybridisierung an einen komplementären Strang besitzt;
    • ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur die an jeden im vorherigen Schritt hergestellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschrittes der Behandlung der besagten Probe und der Lokalisierungssonde mit:
    • a) einer einsträngigen Amplifizierungs-Matrize enthaltend:
    • i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung;
    • a) Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz;
    • b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz, die komplementär zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorhergehenden Amplifizierungsschrittes ist oder, wenn kein vorhergehender Amplifizierungsschritt erfolgt, vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz besitzt und
    • c) einen Amplifizierungsrest, der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist;
    • ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest;
    • b) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize, in der Lage ist;
    • c) die besagte Begrenzungs-Endonuklease;
    • d) die Reagenzien und Bedingungen, die notwendig sind zur:
    • i) Beeinflussung der Wirkung des Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize komplementär sind und
    • ii) Beeinflussung des Dissoziation der Fragmente der Nukleinsäurenstränge, die durch die besagte Aktivität der Begrenzungs-Endonuklease vom ungeschnittenen komplementären Strang abgeschnitten wurden, während die Dissoziation von ungeschnittenen Nukleinsäurensträngen von ungeschnittenen komplementären Strängen nicht beeinflusst wird;
    • iii) Detektion jeder gebundenen Amplifizierungs-Matrize von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten; und
    • iv) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iii) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls.
  • Insbesondere kann der Amplifizierungsschritt (ii) mindestens zweimal durchgeführt werden.
  • Die besagte Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz und die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz können Nukleotidmodifikationen aufweisen, die die Spaltung durch die besagte Restriktionsendonuklease verhindern, und besagte Reagenzien einschließlich wenigstens ein modifiziertes Nukleotid, das, wenn es in dem besagten komplementären Strang durch das besagte Polymerisierungsmittel eingebaut ist, die Spaltung des besagten komplementären Stranges durch die besagte Restriktionsendonuklease verhindert.
  • Die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz kann wenigstens eine Nukleotid-Modifikation aufweisen, die die Spaltung durch die besagte Restriktions-Endonuklease verhindert, wobei die Restriktions-Endonuklease nur eine einsträngige Spaltungsaktivität besitzt.
  • In den ersten drei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in denen die Amplifizierungsgruppe keine Nukleinsäurensequenz ist, d.h. in der letzten Wiederholung des Amplifizierungsschrittes, muss sie nicht in 3'-Position zur Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz angeordnet sein. Stattdessen muss sie ausreichend in 3'-Position zu der verlängerten Nukleinsäurensequenz angeordnet sein, sodass sie nicht von der Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz durch das Separierungsmittel getrennt wird.
  • Die Amplifizierungsgruppe kann z.B. ein Biotin-Molekül (detektierbar durch Verwendung von Standard-Techniken) enthalten, das mit einer Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz konjugiert ist, möglicherweise (aber nicht notwendigerweise) an deren 3'-Ende.
  • Alternativ kann die Amplifizierungsgruppe ein Flurophor enthalten. Beispielsweise kann eine Flurophor/Quencher-Technik (wie z.B. die von Molecular Beacons) angewendet werden (wie z.B. bei der Fluoreszenz-PCR verwendet). Eine Quencher-Gruppe kann am 3'-Bereich der verlängerten Nukleinsäurensequenz konjugiert sein und eine Flurophor-Gruppe am 5'-Bereich der Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz konjugiert sein, sodass, wenn die Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz einen Teil der Amplifizierungs-Matrize bildet, die Fluoreszenz gequencht wird und, wenn das Separierungsmittel die Separierung der Hybridisierungs- und Verlängerungs-Nukleinsäurensequenzen, Fluoreszenz auftritt.
  • In ähnlicher Weise ermöglichen die Signal-Gruppen der vorliegenden Erfindung die Erzeugung eines Signals, während die Amplifizierungs-Gruppen hergestellt werden. Es kann sein, dass es nur erwünscht ist, die Herstellung der Amplifizierungsstruktur zu detektieren, wenn die Amplifizierung vollständig ist. In diesem Falle kann die Detektion ohne Verwendung jeglicher Signal-Gruppen erreicht werden. Alternativ kann es z.B. erwünscht sein, ein Echtzeit-Signal während der Amplifizierung zu generieren. In diesem Falle kann eine Signalgruppe, die an der Hybridisierungs- und Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz wie oben beschrieben lokalisiert ist, wie z.B. eine Flurophor/Quencher-Kombination, verwendet werden. Dies ermöglicht die Erzeugung eines detektierbaren Fluoreszenz-Signals, während das Separierungsmittel die Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz von den Amplifizierungs-Matrizen entfernt.
  • Die Amplifizierungs-Matrizen können aus weniger als drei Bereichen bestehen. Eine vierte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung benutzt Amplifizierungs-Matrizen, die in 5-3'-Richtung einen Verlängerungs-Nukleinsäurenbereich und einen Hybridisierungs-Nukleinsäurenbereich aufweisen. Das 3'-Ende der Amplifizierungs-Matrize ist zur Vermeidung einer Verlängerung modifiziert.
  • Die Schritte der Hybridisierung, der Verlängerung und der Separation können mit den ersten und zweiten Ausführungsformen angewendet werden, um eine Primär-Struktur zu erzeugen. Wenn die Amplifizierungs-Matrizen keine modifizierten Verknüpfungen zum Schutz des Hybridisierungsbereiches enthalten, kann die Verdauung durch die Exonuklease bis zur vollständigen Entfernung der Amplifizierungs-Matrize fortgesetzt werden. Die resultierende Struktur besteht dann aus einer einsträngigen verlängerten Amplifizierungsgruppe einer Lokalisierungssonde, die über die Bindungsgruppe der Lokalisierungssonde an die Zielsequenz gebunden ist. Dies kann unter Verwendung einer komplementär markierten Detektionssonde detektiert werden. Wenn die Herstellung einer Sekundär-Struktur eher als die Detektion erforderlich ist, wird die Struktur stattdessen mit einer zusätzlichen zweiten Sonde kontaktiert, die in der 5'-3'-Richtung einen Hybridisierungs-Nukleinsäurenbereich und eine Amplifizierungs-Gruppe enthält. Alle von dieser Sonde verbleibenden unhybridisierten Teile können vor Zusatz der Sekundär-Amplifizierungs-Matrizen und der Herstellung der Sekundär-Struktur durch waschen entfernt werden.
  • Wie bei der ersten Ausführungsform kann eine einzelne Amplifizierungs-Matrize, deren Verlängerungs- und Hybridisierungsbereichssequenzen im Wesentlichen die gleichen sind, verwendet werden, oder es können wie bei der zweiten Ausführungsform zwei Amplifizierungs-Matrizen, deren Extensions- und Hybridisierungsbereichssequenzen im Wesentlichen unterschiedlich sind, eingesetzt werden.
  • Die Primär-Struktur kann auch unter Verwendung von Amplifizierungs-Matrizen, die aus zwei Regionen (Hybridisierung und Verlängerung) und einem Restriktionsenzym (wie bei der dritten Ausführungsform) her gestellt sein. Die resultierende Struktur besteht aus mehreren Wiederholungen des Hybridisierungsbereichs der Amplifizierungs-Matrix, hybridisiert an die verlängerte Amplifizierungsgruppe der Lokalisierungssonde. Sie enthält keine Amplifizierungsgruppen der Amplifizierungs-Struktur.
  • In einer vierten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls bereit, das folgende Schritte umfasst:
    • i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde enthaltend:
    • a) einen Bindungsrest, der für das besagte Zielmolekül spezifisch ist;
    • b) eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz, um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen und
    • c) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest;
    • ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden im vorangehenden Schritt hergestellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschrittes der Behandlung des besagten Komplexes mit:
    • a) einer einsträngigen Amplifizierungs-Matrize enthaltend:
    • i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung:
    • a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz und
    • b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz, die komplementär ist zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz besitzt und
    • ii) gegebenenfalls mindestens eine sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest;
    • b) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize in der Lage ist;
    • c) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize zu entfernen, wenn sie zu dem besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um eine nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize zu dem besagten komplementären Strang zu ermöglichen;
    • d) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize komplementär sind, und
    • iii) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte der Behandlung des Produktes der vorherigen Wiederholung oder, wenn es keine vorherige Wiederholung gibt, der Produkte von Schritt ii) mit:
    • a) einem Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, den Rest der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize der vorherigen Wiederholung oder Schritt ii) bei der Hybridisierung zu dem besagten komplementären Strang zu entfernen;
    • b) eine zusätzliche Lokalisierungssonde enthaltend:
    • i) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz, die zu dem besagten komplementären Strang der vorherigen Wiederholung oder Schritt (ii) spezifisch ist;
    • ii) einen Amplifizierungsrest, der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und um einen Komplex herzustellen und
    • c) Durchführung von Schritt (ii), wie oben beschrieben, gegebenenfalls unter Verwendung einer Amplifizierungs-Matrize, die sich von der zuvor verwendeten unterscheidet;
    • iv) Detektion von allen gebundenen zusätzlichen Lokalisierungssonden oder der Amplifizierungs-Matrize von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten und
    • v) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iv) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls.
  • Es ist ebenso möglich, den Amplifizierungs-Prozess unter Verwendung von Amplifizierungs-Matrizen, die in 5'-3'-Richtung einen Hybridisierungs- und Verlängerungsbereich enthalten und deren Sequenzen sich voneinander unterscheiden, durchzuführen. In einer fünften Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls unter Verwendung von Amphifizierungs-Matrizen bereit, deren Hybridisierungs- und Verlängerungs-Sequenzen sich unterscheiden, das folgende Schritte umfasst:
    • i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde enthaltend einen Bindungsrest, der für das besagte Zielmolekül spezifisch ist, und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz, um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen;
    • ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden im vorangehenden Schritt hergestellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschrittes der Behandlung des besagten Komplexes mit
    • a) einer einsträngigen ersten Amplifizierungs-Matrize enthaltend:
    • i) in einer 5'- bis 3'- Richtung:
    • a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz und
    • b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz die komplementär ist zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz besitzt und
    • ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest;
    • b) eine einsträngige zweite Amplifizierungs-Matrize enthaltend:
    • i) angeordnet in einer 5- bis 3'- Richtung:
    • a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz enthaltend die Hybridisierungs-Nukleinsäure der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize und
    • b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz enthaltend die Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize und
    • ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest;
    • c) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize in der Lage ist;
    • d) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize zu entfernen, wenn sie zu dem besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um eine nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize zu dem besagten komplementären Strang zu erlauben;
    • e) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorhergehenden Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorhergehender Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize komplementär sind, zu erlauben;
    • iii) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte der Behandlung der Produkte der vorherigen Wiederholung oder, wenn es keine vorherige Wiederholung gibt, der Produkte von Schritt (ii) mit:
    • a) einem Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, den Rest der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize der vorhergehenden Wiederholung oder Schritt (ii) zu entfernen, wenn zu besagten komplementären Strang hybridisiert wird, und
    • b) eine zusätzliche Lokalisierungssonde enthaltend:
    • i) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensonde, die für den besagten komplementären Strang der vorherigen Wiederholung oder Schritt (ii) spezifisch ist, und
    • ii) ein Amplifizierungsrest, der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist; um einen Komplex herzustellen und
    • c) Durchführung von Schritt (ii), wie oben beschrieben, gegebenenfalls unter Verwendung einer Amplifizierungs-Matrize, die sich von der zuvor verwendeten unterscheidet;
    • iv) Detektion von allen gebundenen zusätzlichen Lokalisierungssonden oder der Amplifizierungs-Matrize von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten und
    • v) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iv) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls.
  • Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenzen der Amplifizierungs-Matrizen der vierten und fünften Ausführungsform können derart modifiziert werden, dass sie nicht in 3'-Richtung durch das Polymerisierungsmittel verlängert werden können.
  • Die Entfernung der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize kann durch Verwendung einer doppelsträngigen spezifischen 5'-Exonuklease erreicht werden.
  • Mit den Verfahren der vierten und fünften Ausführungsform kann die Entfernung der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize durch die Verwendung von erhöhten Temperaturen erreicht werden. In solch einem Fall kann die besagte Lokalisierungssonde kovalent an das besagte Zielmolekül vor der Entfernung der besag ten ersten Amplifizierungs-Matrize gebunden werden. Insbesondere kann eine kovalente Anbindung vor der Hybridisierung der Amplifizierungs-Matrizen erreicht werden.
  • Vor dem Detektionsschritt der ersten, zweiten und dritten Ausführungsformen kann ein Verfahren mit den Schritten (i) bis (iii) der vierten oder fünften Ausführungsform der Erfindung (wenigstens soweit eine Amplifizierungs-Struktur hergestellt wird) und umgekehrt mit den Schritten (i) und (ii) der ersten, zweiten und dritten Ausführungsformen durchgeführt werden. Ist der Amplifizierungsrest in einem finalen Amplifizierungsschritt eine Nukleinsäurensequenz, so kann Schritt (i) der nachfolgenden Methode ausgelassen werden.
  • Somit kann in solch einem Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls gemäß einem der ersten, zweiten und dritten Ausführungsformen, wenn der besagte Amplifizierungsrest der besagten Amplifizierungs-Matrize von dem besagten finalen Amplifizierungsschritt eine Nukleinsäurensequenz enthält, Schritt (ii) eines Verfahrens gemäß einem der vierten oder fünften Ausführungsform zusätzlich durchgeführt werden.
  • In ähnlicher Weise kann in einem Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls gemäß einem der vierten oder fünften Ausführungsformen vor dem besagten Detektionsschritt zusätzlich Schritt (ii) eines Verfahrens gemäß einem der ersten, zweiten oder dritten Ausführungsformen enthalten sein.
  • Bei den ersten, zweiten und dritten Ausführungsformen (und Verfahren deren finaler Amplifizierungsschritt oder Wiederholung solche Ausführungsformen einbezieht) kann der Schritt der Detektion von jeder gebundenen Amplifizierungs-Matrize folgende Schritte umfassen:
    • i) Behandlung der besagten Probe, Lokalisierungssonde und Amplifizierungs-Matrize oder Amplifizierungs-Matrizen mit einer Detektionssonde, die spezifisch an den besagten Amplifizierungsrest der besagten Amplifizierungs-Matrizen bindet, und
    • ii) Detektion von jeder gebundenen Detektionssonde.
  • Bei den vierten und fünften Ausführungsformen (und Verfahren deren finaler Amplifizierungsschritt oder Wiederholung solche Ausführungsformen einbezieht) kann der Schritt der Detektion von allen gebundenen zusätzlichen Lokalisierungssonden die folgenden Schritte umfassen:
    • i) Behandlung der besagten Probe, Lokalisierungssonde und Amplifizierungs-Matrix mit einer Detektionssonde, die spezifisch an die besagte zusätzliche Lokalisierungssonde bindet , und
    • ii) Detektion von allen gebundenen Detektionsson den.
  • Die Detektionssonde kann eine Markierung besitzen, die durch eines der Verfahren ausgewählt aus der Gruppe Luminometrie, Fluorometrie, Spektrophotmetrie, und Radiometrie detektiert wird. Die Detektionssonde kann z.B. mit einer der Gruppen FAM (Carboxyfluorescein), HEX (Hexachlorofluorescein), TET (Tetrachlorofluorescein), ROX (Carboxy-X-Rhodamin), TAMRA (Carboxytetramethylrhodamin), JOE (Carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-diemethoxyfluorescein) oder mit Biotin markiert sein.
  • Alternativ oder zusätzlich kann der Detektionsschritt jegliche optinalen Signalreste, die in dem Verfahren verwendet werden, detektieren. Wie zuvor erörtert, können solche Reste Fluorophor/Quencher-Kombinationen (die bei der Detektion alleine den Fluorophor-Rest enthalten) oder z.B. Biotin-Moleküle enthalten. Die Anwesenheit von Signalresten erlaubt die Echtzeit-Detektion der Amplifizierung, wenn die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden, insbesondere wenn die Signalreste Fluorophore enthalten.
  • In den verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der Amplifizierungsschritt zweimal oder mehrmals durchgeführt werden, wobei jeder Amplifizierungsschritt unter Verwendung einer Amplifizierungs-Matrize mit von der im vorherigen Amplifizierungsschritt verwendeten Amplifizierungs-Matrize verschiedenen Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz, Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz und Amplifizierungs rest durchgeführt wird.
  • In den verschiedenen Ausführungsformen der vorliegende Erfindung kann das zu detektierende Zielmolekül eine Nukleinsäurensequenz sein, wobei der Bindungsrest der besagten Lokalisierungssonde eine Nukleinsäurensequenz enthält, die komplementär zu der Nukleinsäurensequenz des besagten Zielmoleküls ist.
  • Die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von mehr als einer Lokalisierungssonde durchgeführt werden, wobei jede Lokalisierungssonde die gleiche Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz besitzt.
  • Die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können z.B. zwei Wiederholungen enthalten.
  • Nicht umgesetzte Reagenzien, die in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können am Ende von Schritt (i) jeder Wiederholung oder des Detektionsschrittes durch Waschen entfernt werden. Die nicht umgesetzten Reagenzien sind ausgewählt aus der Gruppe der Lokalisierungssonde, Amplifizierungs-Matrize, erste Amplifizierungs-Matrize, zweite Amplifizierungs-Matrize und Detektionssonde.
  • Die Detektion der Primär- und Sekundär-Strukturen, die unter Verwendung der Ausführungsformen 1 bis 5 der Erfindung hergestellt wurden, kann durch mehrere verschiedene Verfahren erreicht werden.
  • Beispielsweise können geeignet markierte Detektionssonden mit den Amplifizierungsresten der Amplifizierungs-Matrizen, die im letzten Schritt der ersten, zweiten und dritten Ausführungsformen verwendet werden, hybridisieren. In den vierten und fünften Ausführungsformen können die Detektionssonden die Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenzen der Lokalisierungssonden hybridisieren. Dies erfordert die Verwendung eines Separierungsmittels, um verbleibende Hybridisierungsbereiche der Amplifizierungs-Matrize zu entfernen, ebenso erfordert dies eine im Anschluss verwendete Detektionssonde, die an den verlängerten Amplifizierungsrest der in der vorherigen Wiederholung verwendeten Lokalisierungssonde bindet. Wird die Trennung durch Denaturierung erreicht, dann erfordert dies zusätzlich die Verwendung einer kovalenten Quervernetzung, wie zuvor erörtert (z.B. unter Verwendung eines Quervernetzungsmittels wie DZQ (Diazirinidylbenzochinon).
  • Alternativ oder zusätzlich können an die Amplifizierungs-Matrizen eine interne oder 3'-terminal angeordnete Markierung (d.h. Signalrest) gebunden sein, die in die Strukturen bei deren Herstellung eingebaut werden.
  • Wie zuvor beschrieben, können die Amplifizierungs-Matrizen so synthetisiert werden, dass eine Fluorophor-Markierung in der Sequenz des Hybridisierungsbereiches von einer Quencher-Markierung in dem verlängerten Bereich während der Rekonstruktion der Primär-/Sekundär-Struktur getrennt wird. In dieser Weise ist eine Echtzeit-Generierung des Signals möglich.
  • Die Erfindung wird weiter ersichtlich anhand der folgenden Beschreibung mit Bezug zu den verschiedenen Figuren der begleitenden Zeichnungen, die alleine anhand von Beispielen, Formen der Detektion von Zielmolekülen und Signal-Amplifizierung zeigen.
  • 1 zeigt Formen von Lokalisierungssonden, die an die Target-Nukleinsäurensequenzen hybridisiert sind;
  • 2 zeigt eine Amplifizierungs-Matrize, die in der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
  • 3 zeigt ein Detektionsverfahren für ein Zielmolekül gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
  • 4 zeigt eine inkorrekte Bindung einer Amplifizierungs-Matrize;
  • 5 zeigt Amplifizierungs-Matrizen, die in der zweiten Ausführungsform der vorliegende Erfindung verwendet werden;
  • 6 zeigt ein Detektionsverfahren für ein Zielmolekül gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
  • 7 zeigt eine Amplifizierungs-Matrize, die in dem Verfahren der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
  • 8 zeigt das Verfahren der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
  • 9 zeigt das Verfahren der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
  • 10 zeigt Ergebnisse von Beispiel 6. Die y-Achse zeigt die Steigung (A490/min.) von 0 (unten) bis 0,140 (oben). Die x-Achse zeigt (links nach rechts) Positiv 1, Positiv 2, Negativ Klenow und Negativ T7 und
  • 11 zeigt die Strang-Verlängerung durch SAEX1 und SAEX22. Die y-Achse zeigt die Steigung (A490/min.) von 0 (unten) bis 0,200 (oben). Die x-Achse zeigt (weit rechts) die Kontrolle ohne Enzym und (alle anderen Balken) Positive.
  • Definitionen
  • Der Begriff „Antikörper" in dessen vielfältigen grammatikalischen Formen wird hier so verwendet, dass er sich auf Immunoglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Bereiche von Immunoglobulin-Molekülen bezieht, d.h. Molekülen, die eine einen Antikörper kombinierende Stelle oder ein Paratop enthalten. Solche Moleküle werden ebenso als „Antigen-bindende Fragmente" von Immunoglobulin-Molekülen bezeichnet.
  • Beispielhafte Antikörper-Moleküle sind intakte Immunoglobulin-Moleküle, im Wesentlichen intakte Immunoglobulin-Moleküle und solche Bereiche eines Immunoglobulin-Moleküls, das das Paratop enthaltend einschließlich solche Bereiche, die aus dem Stand der Technik als Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) bekannt sind.
  • Antikörper und deren Verwendung sind aus dem Stand der Technik bekannt, z.B. durch die Lehre von Harlow, E. und Lane, D., „Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998.
  • Der hier verwendete Begriff „Nukleinsäure" schließt Protein-Nukleinsäuren (PNA), d.h. Nukleinsäuren, in denen die Basen durch ein Polypeptid-Rückgrat verknüpft sind, genauso wie natürlich vorkommende Nukleinsäuren, z.B. DNA und RNA, oder Analoge hiervon, mit einem Zuckerphosphat-Rückgrat ein.
  • Beispiel 1
  • Wie aus 1a ersichtlich, enthält die Lokalisierungssonde 10 einen Bindungs-Nukleinsäurenrest 11, der über eine 5'-5'-Verknüpfung mit dem Amplifizierungsrest 12 verbunden ist. Der Bindungs-Nukleinsäurerest 11 hybridisiert die Target-Nukleinsäurensequenz 21 des Zielmoleküls 20. 1b zeigt, dass die Lokalisierungssonde 30, die den Bindungsrest 31 enthält, der gegenüber Exonuklease-Aktivität durch die Verwendung von 2'-O-Methyl-RNA-Reste bei dessen Herstellung resistent bleibt, enthält, durch eine 5'-3'-Verknüpfung mit Amplifizierungsrest 32 verbunden ist. Der Bindungs-Nukleinsäurenrest 31 hybridisiert mit der Target-Nukleinsäurensequenz 21 des Zielmoleküls 20.
  • 2 zeigt eine erste Amplifizierungs-Matrize 40, die, angeordnet in 5'-3'-Richtung, einen Verlängerungsbereich 41, einen Exonuklease-resistenten Hybridisierungsbereich 42 und einen Amplifizierungsrest 43 enthält.
  • Nach dem Verfahren der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (3) hybridisiert der Hybridisierungsbereich 42 der Amplifizierungs-Matrize 40 mit dem Amplifizierungsrest 32 der Lokalisierungssonde 30 (3a). Die Aktivität von DNA-Polymerase führt dann zur Verlängerung des Amplifizierungsrestes 32, wobei der verlängerte Bereich 40 als Matrizenstrang verwendet wird (3b) Eine doppelsträngige spezifische 5'-Exonuklease (nicht gezeigt) verdaut dann das 5'-Ende des hybridisierten, verlängerten Bereiches 41. Die Exonuklease-Aktivität wird unterbrochen, wenn das Enzym auf den Exonuklease-resistenten Hybridisierungsbereich 42 stößt (3c). Die zusätzliche Amplifizierungs-Matrize 40 ist dann zur Hybridisierung der verlängerten Nukleinsäure-Signalsequenz 32 (3d) in der Lage, und das Verfahren der Verlängerung und Verdauung durch Exonuklease setzt sich unter Erhalt der Anordnung von 3e fort.
  • Nachdem die Reaktionsmischung zur Entfernung unhybridisierter Amplifizierungs-Matrize 40 gewaschen wurde, wird das Verfahren unter Verwendung der zweiten Amplifizierungs-Matrize 50, die einen verlängerten Bereich 51, einen Hybridisierungsbereich 52 und einen Amplifizierungsrest 53 enthält, wiederholt (3f). Der Hybridisierungsbereich 52 ist zum Amplifizierungsrest 43 komplementär. Die Schritte der Verlängerung des Amplifizierungsrestes 43, der Verdauung des verlängerten Bereiches 51 und der Hybridisierung der zusätzlichen Amplifizierungs-Matrize 50 wird dann wie oben fortgesetzt, um die Sekundär-Struktur herzustellen. Hierdurch wird eine große Anzahl von Amplifizierungsresten 53, die für die Hybridisierung zugänglich sind, eingebaut (3g bis 3j).
  • Die Detektionssonde 60 enthält eine Nukleinsäurensequenz zur Signaldetektion 61, die komplementär zum Amplifizierungsrest 53 ist und mit einem Biotin-Markierungsmolekül 62 verbunden ist. Nach der Hybridisierung der Detektionssonde 60 und dem Waschen zur Entfernung von unhybridisierten Sonden werden die Biotin-Markierungsmoleküle 62 unter Verwendung von Standard-Techniken detektiert. Das Ergebnis des Detektionsschrittes wird dann mit der Anwesenheit der Zielsequenz 21 korreliert.
  • Wie aus 4 ersichtlich, gibt es bestimmte unerwünschte Wechselwirkungen, die z.B. zwischen dem Amplifizierungsrest 32, der Lokalisierungssonde 30 und dem verlängerten Bereich 41 der Amplifizierungs-Matrize 40 möglich sind. 4a zeigt den verlän gerten Bereich 41, der mit dem Amplifizierungsrest 32 hybridisiert ist. Dies unterliegt einer Exonuklease-Aktivität (4b) und nachfolgend ist der Hybridisierungsbereich 42 der Amplifizierungs-Matrize 40 zur Hybridisierung mit dem Amplifizierungsrest 32 in der Lage. Dennoch ist es nicht möglich, die Signal-Nukleinsäurensequenz 32 zu verlängern und es ist keine weitere Rekonstruktion möglich, da die Amplifizierungs-Matrize 40 keinen verlängerten Bereich 41 mehr besitzt.
  • Beispiel 2
  • 5 zeigt Paare von Amplifizierungs-Matrizen, die bei dem Verfahren nach der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die erste Amplifizierungs-Matrize 70 enthält, angeordnet in 5'-3'-Richtung, einen verlängerten Bereich 71, einen Hybridisierungsbereich 72 und einen Amplifizierungsrest 73. Die zweite primäre Amplifizierungs-Matrize 80 enthält, angeordnet in 5'-3'-Richtung einen verlängerten Bereich 81 (der die gleiche Sequenz wie die Hybridisierungsregion 72 besitzt), einen Hybridisierungsbereich 82 (der die gleiche Sequenz wie der verlängerte Bereich 71 besitzt) und einen Amplifizierungsrest 73. Der verlängerte Bereich 71 und der Hybridisierungsbereich 72 haben im Wesentlichen unterschiedliche Sequenzen, sodass sie nicht die gleiche Nukleinsäurensequenz hybridisieren. Die erste sekundäre Amplifizierungs-Matrize 90 enthält, angeordnet in 5'-3'-Richtung einen verlängerten Bereich 91, einen Hybridisierungsbereich 92 (der zum Amplifizie rungsrest 73 zum Amplifizierungsrest 73 von der vorherigen Wiederholung komplementär ist) und einen Amplifizierungsrest 93. Die zweite sekundäre Amplifizierungs-Matrize 100 enthält, angeordnet in 5'-3'-Richtung einen verlängerten Bereich 101 (der die gleiche Sequenz wie der Hybridisierungsbereich 92 besitzt), einen Hybridisierungsbereich 102 (der dieselbe Sequenz wie der verlängerte Bereich 91 besitzt) und einen Amplifizierungsrest 103. Der verlängerte Bereich 91 und der Hybridisierungsbereich 92 haben im Wesentlichen unterschiedliche Sequenzen, sodass sie nicht die gleichen Nukleinsäurensequenzen hybridisieren. Die Nukleinsäurensequenzen 72, 82, 92 und 102 enthalten durch 2'-O-Methyl-RNA substituierte Nukleinsäurensequenzen, die gewährleisten, dass sie gegen 5'-Exonuklease-Aktivität resistent sind.
  • In der Praxis (6) wird die Target-Nukleinsäurensequenz 21 des Zielmoleküls 20 durch die Bindungs-Nukleinsäurensequenz 111 der Lokalisierungssonde 110 hybridisiert. Der Bindungs-Nukleinsäurerest 111 enthält substituierte Nukleinsäuren, die gewährleisten, dass er gegen 5'-Exonuklease-Aktivität resistent ist (6a). Anschließend hybridisiert der Hybridisierungsbereich 72 der ersten Amplifizierungs-Matrize 70 mit dem Amplifizierungsrest 112 der Lokalisierungssonde 110 (6b). Da der verlängerte Bereich 71 vom Hybridisierungsbereich 72 verschieden ist, ist er nicht in der Lage, mit dem Amplifizierungsrest 112 zu hybridisieren.
  • Anschließend verlängert die DNA-Polymerase-Aktivität das freie 3'-OH-Ende des Amplifizierungsrestes 112 unter Verwendung des verlängerten Bereiches 71 als Matrize. Die 5'-Exonuklease-Aktivität verdaut anschließend den verlängerten Bereich 71 (6c).
  • An diesem Punkt ist es für den verlängerten Bereich 71 der Amplifizierungs-Matrize 70 möglich, mit dem verlängerten Amplifizierungsrest 112 zu hybridisieren (6d, oben). Da der verlängerte Bereich 71 jedoch nicht vor 5'-Exonuklease-Aktivität geschützt ist, wird er verdaut, wodurch der verlängerte Amplifizierungsrest 112 ungeschützt zurückbleibt (6e). Die Reste der teilweise verdauten Amplifizierungs-Matrize 70 (enthaltend den Hybridisierungsbereich 72 und den Amplifizierungsrest 73) sind nicht dazu in der Lage, mit dem verlängerten Amplifizierungsrest 112 zu hybridisieren.
  • Alternativ (6d, unten) ist der Hybridisierungsbereich 82 der Amplifizierungs-Matrize 80 dazu in der Lage, mit dem verlängerten Amplifizierungsrest 112 zu hybridisieren. Anschließend wird der Amplifizierungsrest 112 weiter durch DNA-Polymerase-Aktivität unter Verwendung des verlängerten Bereiches 81 als Matrize verlängert. Der verlängerte Bereich 81 wird anschließend verdaut (6e2) und die Rekonstruktion der Primär-Struktur setzt sich mit der Hybridisierung des Hybridisierungsbereiches 72 der Amplifizierungs-Matrix 70 mit dem verlängerten Amplifizierungsrest 112 fort.
  • Nach dem Waschen zur Entfernung unhybridisierter Amplifizierungs-Matrizen 70 und 80 wird die Rekonstruktion der Sekundär-Struktur unter Verwendung der Amplifizierungs-Matrizen 90 und 100 durchgeführt. Die Sekundär-Struktur wird dann detektiert und die Ergebnisse der Detektion mit der Anwesenheit der Zielmoleküle korreliert.
  • Beispiel 3
  • 7 zeigt eine Amplifizierungs-Matrize, die in einer Ausführungsform der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Die Amplifizierungs-Matrize 120 enthält einen verlängerten Bereich 121, einen Hybridisierungsbereich 122 mit der gleichen Nukleinsäurensequenz des verlängerten Bereiches 121 (wenigstens bis zu dem Umfang, dass sie beide dazu in der Lage sind, die gleiche Nukleinsäurensequenz zu hybridisieren) und einen Amplifizierungsrest 123. Der verlängerte Bereich 121 und der Hybridisierungsbereich 122 haben beide in diesem Beispiel zwei Restriktionsstellen 130, wobei die Restriktionsstellen des verlängerten Bereiches 121 durch Restriktions-Endonuklease-Aktivität gespalten werden können, wenn sie mit einer komplementären Sequenz hybridisiert werden. Dennoch besitzen die Restriktionsstellen des Hybridisierungsbereiches 122 durch 2'-O-Methyl-RNA modifizierte Nukleotide, sodass sie nicht der Restriktions-Endonuklease-Aktivität unterliegen.
  • Die Signal-Amplifizierung unter Verwendung des Verfahrens nach der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird wie in 8 gezeigt, er reicht. Die Bindungsnukleinsäurensequenz 141 der Lokalisierungssonde 140 hybridisiert mit der Zielnukleinsäurensequenz 21 des Zielmoleküls 20. Der Amplifizierungsrest der Lokalisierungssonde 142 ist komplementär zum Hybridisierungsbereich 122 der Amplifizierungs-Matrix 120, aber besitzt Substitution durch 2'-O-Methyl-RNA-Nukleotide, sodass er nicht der Restriktions-Endonuklease-Aktivität unterliegt. Anschließend hybridisiert der Hybridisierungsbereich 122 der Amplifizierungs-Matrix 120 mit dem Amplifizierungsrest 142 (8a), der dann durch DNA-Polymerase-Aktivität unter Verwendung des verlängerten Bereiches 121 als Matrix verlängert wird (8b). Wenigstens eine der dNTPs der festen Phase, die bei der Polymerase verwendet werden, wird mit Substitutin durch 2'-O-Methyl-RNA modifiziert, sodass deren Einbau den neu synthetisierten Strang, der gegen die Restriktions-Endonuklease-Aktivität resistent ist, liefert.
  • Die Restriktions-Endonuklease-Aktivität spaltet dann den verlängerten Bereich 121. In einem isothermen Assayformat werden die resultierenden Fragmente so synthetisiert, dass sie bei der verwendeten Betriebstemperatur disoziieren. In einem thermocyclischen Format wird die Temperatur erhöht, um die Dissoziation der Fragmente ohne begleitende Dissoziation der ungespaltenen Sequenzen zu erlauben. Die zusätzliche Amplifizierungs-Matrize 120 ist anschließend dazu in der Lage, den verlängerten Amplifizierungsrest 142 zu hybridisieren und die Reaktion kann zur Rekonstruktion der primären Struktur fortgeführt werden. Die De tektion oder die Rekonstruktion der Sekundär-Struktur wird nachfolgend durch Wiederholung der gleichen grundsätzlichen Verfahren, wie zuvor beschrieben, durchgeführt.
  • Beispiel 4
  • In der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (9) wird die Nukleinsäurensequenz 21 des Zielmoleküls 20 durch den Bindungsrest 151 (der Nukleotidmodifikationen aufweist, um ihn, wenn erforderlich, resistent gegen doppelsträngige 5'-Exonuklease-Aktivität zu machen) der Lokalisierungssonde 150 hybridisiert (9a). Der Amplifizierungsrest 152 ist mit der Bindungs-Nukleinsäurensequenz 151 durch den Verlängerungsblocker 153 (eine 3'-Propanol-Addition) verknüpft, sodass er eine ungeschützte 3'-OH-Gruppe aufweist. Wenn der Amplifizierungsrest 152 als Matrizenstrang für die Synthese eines komplementären Stranges fungiert, verhindert der Verlängerungsblocker den Fortschritt von jeglicher DNA-Polymerase über das Ende des Amplifizierungsrestes hinaus, wobei die Entfernung des Bindungsrestes 151 von der Target-Nukleinsäurensequenz 21 verhindert wird. Sobald die ungebundene Lokalisierungssonde entfernt ist, kann der Bindungsrest 151 optional mit der Zielsequenz 21 vor der Rekonstruktion der Primär-Struktur quervernetzt werden.
  • Bei der Verwendung hybridisiert der Hybridisierungsbereich 161 der Amplifizierungs-Matrize 160 mit dem Amplifizierungsrest 152 (9b). Der Hybridisie rungsbereich 161 hat eine ungeschützte 3'-OH-Gruppe wie der Amplifizierungsrest 152. Der verlängerte Bereich 162 fungiert dann als Matrizenstrang für die Verlängerung des Amplifizierungsrestes 152, der wiederum als Matrizenstrang für die Verlängerung des Hybridisierungsbereiches 161 bis zum Verlängerungsblocker 153 fungiert (9c). Die doppelsträngige 5'-Exonuklease-Aktivität kann anschließend die verlängerte Amplifizierungs-Matrize 160, wie in diesem Beispiel gezeigt, verdauen, wobei ein frei verlängerter Amplifizierungsrest 152 zurückbleibt (9d). Alternativ können die Amplifizierungs-Matrizen vollständig durch die Verwendung von erhöhten Temperaturen entfernt werden. Zusätzlich können die Amplifizierungs-Matrizen so synthetisiert werden, dass sie modifizierte und unmodifizierte Restriktionsstellen enthalten, die eine Endonuklease-Spaltung erlauben, um den verlängerten Bereich alleine der Amplifizierungs-Matrix zu entfernen.
  • Die zusätzliche Amplifizierungs-Matrize 160 ist dann dazu in der Lage, mit dem verlängerten Amplifizierungsrest 152 zu hybridisieren (9e) und der verlängerte Bereich 162 ist wieder dazu in der Lage, als Matrizenstrang für die Synthese eines komplementären Stranges zu dienen, wobei der Amplifizierungsrest 152 weiter verlängert wird. Ebenso ist der Amplifizierungsrest 152 dazu in der Lage, als Matrizenstrang für die Verlängerung des Hybridisierungsbereiches 161 zu dienen (9f). Die Entfernung eines Teils oder der gesamten verlängerten Amplifizierungs-Matrize 160 wird anschließend durch 5'- Exonuklease-Aktivität (wie in diesem Beispiel) oder durch erhöhte Temperaturen oder durch eine Restriktions-Endonuklease erreicht (9g, 9h).
  • Ist der Amplifizierungsrest 152 erst einmal ausreichend verlängert worden, kann er durch Hybridisierung der Detektionssonden, die komplementär zu den Wiederholungen innerhalb des verlängerten Stranges sind, detektiert werden. Alternativ werden die sekundären Amplifizierungs-Matrizen, die in der 5'-3'-Richtung des Hybridisierungsbereiches 161 enthalten sind, die Verlängerungsblocker 153 und der Amplifizierungsrest 173 mit dem verlängerten Amplifizierungsrest 152 hybridisiert (9i, 9j). In den Hybridisierungsbereich können, sofern erforderlich, modifizierte Nukleotide (wie in diesem Beispiel) eingebaut werden, um diesen resistent gegen doppelsträngige 5'-Exonuklease-Aktivität zu machen.
  • Der Amplifizierungsrest 173 wird anschließend als Target für eine zusätzliche Runde einer wie zuvor durchgeführten Signal-Amplifizierung unter Verwendung der Amplifizierungs-Matrize 180, die in der 5'-3'-Richtung des Hybridisierungsbereiches 181 und des verlängerten Bereiches 182 enthalten ist, verwendet (9j bis 9p). Ein letzter Detektionsschritt wird anschließend durchgeführt (9q), der den verlängerten Bereich 181 der Amplifizierungs-Matrize 180 detektiert.
  • Beispiel 5
  • Die verschiedenen Ausführungsformen (siehe oben) der Erfindung sind in soweit modifiziert als die Verlängerungs-Nukleinsäurensequenzen 41, 52, 71, 81, 121, 162 und 182 in Form eines loop-Motivs bereitgestellt werden. Als Ergebnis sind die Nukleotide innerhalb des loop-Motivs für die Hybridisierung mit komplementären Nukleotiden, z.B. in Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenzen, nicht zugänglich.
  • Somit verhindern die loop-Motive eine unerwünschte Hybridisierung der Verlängerungs-Nukleinsäurensequenzen, wodurch die Sequenzen nur freigelegt werden, wenn das loop-Motiv linearisiert wird, d.h. durch die Aktivität eines Polymerisierungsmittels, wie z.B. DNA-Polymerase, wenn diese einen komplementären Strang zu der Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz synthetisiert.
  • Beispiel 6
  • Konzertierte Aktion von T7-Gen-6-Exonuklease und Klenow(Exo-)Polymerase.
  • CMV-002 (SEQ ID NO:2), eine 24-Mer Sequenz, die für einen konservierten Bereich in GlyB-Gen von CMV spezifisch ist, wurde kovalent mit einem Festphasenträger verknüpft und als Ziel für die Amplifizierungs-Matrix SA-EX1 (SEQ ID NO:3) verwendet. Ein Detektions-Oligonukleotid SA-B1 (SEQ ID NO:4) wurde synthe tisiert, um an der durch SA-EX1 generierten Stelle in Kombination mit der konzertierten Aktion der Klenow(Exo-)Polymerase und T7-Gen-6-Exonuklease zu hybridisieren.
  • Die Nukleotide 1 und 2 von SEQ ID NO:3 enthalten Phosphortioat-Verknüpfungen. Die Nukleotide 20 bis 26 von SEQ ID NO:3 sind 2'-O-Methyl-RNA. Nukleotid 1 von SEQ ID NO:4 enthält eine angebundene Biotin-Markierung. Alle Oligos wurden von Oswel (Southampton, UK) bereitgestellt.
  • 76 pmol von SA-EX1 wurde zu 2 mg von CMV-002-Träger in jeweils vier 0,2 ml-Eppendorf-Spitzen in ein Gesamtvolumen von 40 ml von 1 × Klenow(Exo-)Puffer zugesetzt. Man ließ die Hybridisierung bei Raumtemperatur für 10 min unter leichtem Rühren durch Inversion in 1-Minuten-Intervallen fortschreiten.
  • Zu den Spitzen A und B wurden 10 ml von 1 × Klenow-Puffer enthaltend 10 Einheiten von Klenow(Exo-)Polymerase 100 Einheiten von T7-Gen-6-Exonuklease und 2 ml eines 20 mM dNTP-Gemisches zugesetzt. Zu der Spitze C wurden 10 ml der gleichen Mischung ohne Zusatz von Polymerase zugesetzt. Zur Spitze D wurden 10 ml der Mischung ohne Zusatz von T7-Exonuklease zugesetzt. Die Proben wurden leicht gerührt und bei 37 °C für 15 min inkubiert.
  • Die Proben wurden in DARAS(RTM)-Säulen (Tepnel Medical Limited, UK; www.tepnel.com) mit Frittenboden überführt. 100 ml des 1 × Proben-Puffers (50 mM Nat riumcitrat, 80 mM Natriumchlorid, 8 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Tris.HCl pH 8,3) wurden durch jede Säule dreifach dispensiert.
  • 50 ml von 1 × Proben-Puffer enthaltend 79 pmol von SA-B1 wurden zu jeder Säule zugesetzt und die Säuleninhalte wurden 10 min lang bei Raumtemperatur durch periodische Inversion gemischt. Die Säulen wurden durch Spülen mit 100 ml des System-Puffers (10 mM Tris.HCl, pH 8,3) jeweils dreifach gewaschen.
  • Die Anwesenheit von hybridisiertem SA-B1-Oligonukleotid wurde unter Verwendung des EDSA1-Detektionsprotokolls auf dem DARAS(RTM)-System bestätigt. Die Ergebnisse sind in 10 als Steigung des detektierten Signals dargestellt (Änderung der Absorption bei 490 nm/min).
  • Beispiel 7
  • Strangverlängerung durch sequentielle Hybridisierung CMV-002 (SEQ ID NO:2) wurde kovalent mit einem Festphasenträger verknüpft und als Ziel für das EDSA-Amplifizierungs-Oligonukleotid SA-EX1(SEQ ID NO:3) verwendet. Ein zweites Amplifizierungs-Oligonukleotid, SA-EX22 (SEQ ID NO:5) wurde hergestellt, um mit der durch SA-EX1 durch konzertierte Aktion der Klenow (Exo-)Polymerase und T7-Exonuklease generierten Stelle zu hybridisieren. Ein Detektions-Oligonukleotid SA-B2 (SEQ ID NO:6) wurde hergestellt, um mit der SA-EX22 durch konzertierte Aktion von der Klenow(Exo-) Polymerase und T7-Exonuklease generierten Stelle zu hybridisieren.
  • Die Nukleotide 1 und 2 von (SEQ ID NO:5) enthalten Phosphorothioat-Verknüpfungen. Die Nukleotide 22 bis 27 von SEQ ID NO:5 sind 2'-O-Methyl-RNA. Nukleotid 1 von SEQ ID NO:6 besitzt eine angebundene Biotin-Markierung. Alle Oligos wurden von Oswel (Southapmton, UK) bereitgestellt. Alle Enzyme und Puffer wurden durch Amersham Life Sciences Inc. (UK) bereitgestellt.
  • 10 pmol von SA-EX1 wurde zu 2 mg von CMV-002-Träger in jedem von sechs 0,2 ml Eppendorf-Spitzen in einem Gesamtvolumen von 30 ml von 1 × Klenow(Exo-)Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT 50 mg/ml BSA) zugesetzt. Man ließ Die Hybridisierung bei Raumtemperatur 10 min lang unter leichtem Rühren durch Inversion in 1-Minuten-Invervallen fortschreiten. Die Festphase wurde durch Ansaugen entfernt und 50 ml von 1 × Klenow-Puffer wurden zugesetzt. Nachdem sich die Kügelchen abgesetzt hatten, wurde die obere Phase durch Ansaugen entfernt. Dies wurde zwei weitere Male wiederholt.
  • Zu den Spitzen A bis E wurden 30 ml von 1 × Klenow-Puffer, enthaltend 15 Einheiten von Klenow(Exo-)Polymerase, 100 Einheiten von T7-Gen-6-Exonuklease, 2 ml eines 20 mM dNTP-Gemisches und 100 pmol von SA-EX22 zugesetzt. Zur Spitze F wurden 30 ml der gleichen Mischung ohne Zusatz der Polymerase und der T7-Exonuklease zugesetzt. Die Proben wurden leicht gerührt und bei 37 °C 30 min lang inkubiert.
  • Die Proben wurden in DARAS(RTM)-Säulen mit Frittenboden überführt. 100 ml des 1 × Proben-Puffers (50 mM Natriumcitrat, 80 mM Natriumchlorid, 8 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Tris.HCl pH 8,3) wurden durch jede Säule dreifach dispensiert.
  • 50 ml des 1 × Proben-Puffers enthaltend 1 pmol von SA-B2 wurden jeder Säule zugesetzt und die Säuleninhalte wurden durch 10-minütige periodische Inversion bei Raumtemperatur gemischt. Die Säulen wurden durch Spülen mit 100 ml des System-Puffers (10 mM Tris.HCl, pH 8,3) jeweils dreifach gewaschen.
  • Die Anwesenheit von markiertem SA-B2-Oligonukleotid wurde unter Verwendung des EDSA1-Detektionsprotokolls auf dem DARAS(RTM)-System bestätigt. Die Ergebnisse sind in 11 als Steigung des detektierten Signals dargestellt (Änderung der Absorption bei 490 nm/min).
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001

Claims (29)

  1. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls (20) umfassend die Schritte: i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde (10,30) enthaltend einen Bindungsrest (11,31), der für das besagte Zielmolekül (20) spezifisch ist, und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (12,32), um ein Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen; ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden im vorangehenden Schritt hergestellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschritts der Behandlung der besagten Probe und der Lokalisierungssonde (10,30) mit: a) einer einsträngigen Amplifizierungs-Matrize (40,50) enthaltend: i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung: a) eine Verlängerungsnukleinsäurensequenz (41, 51); b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (42), die komplementär ist zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (12,32,52) des vorherigen Amplifizierungsschrittes, oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlängerungsnukleinsäurensequenz (41,51) besitzt und c) einen Amplifizierungsrest (43,53), der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest; b) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (12,32,53) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (41,51) der besagten Amplifizierungs-Matrize (40,50) in der Lage ist; c) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (41,51) der besagten Amplifizierungs-Matrize (40,50) zu entfernen, wenn sie zu dem besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um eine nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (42,52) der besagten Amplifizierungs-Matrize (40,50) zu dem besagten komplementären Strang zu erlauben und d) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungs mittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (12,32,53) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (41,51) der besagten Amplifizierungs-Matrize (40,50) komplementär sind, zu ermöglichen; iii) Detektion jeder gebundenen Amplifizierungs-Matrize (40,50) von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten und iv) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iii) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls (20).
  2. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach Anspruch 1, wobei das Entfernen der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (41,51) durch die Verwendung einer doppelsträngigen 5'-Exonuklease, gegen deren Aktivität die Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (42,52) geschützt ist, erreicht wird.
  3. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls (20) umfassend die Schritte: i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde (110), die einen Bindungsrest (11) enthält, der für das besagte Zielmolekül (20) spezifisch ist, und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (112), um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen; ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden Komplex gebunden ist, der im vorherigen Schritt durch ein- oder mehrmalige Durchführungen des Amplifizierungsschrittes der Behandlung der besagten Probe und der Lokalisierungssonde (110) mit a) einer einsträngigen ersten Amplifizierungs-Matrize (70,90) enthaltend: i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung: a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (71, 91); b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (72,92), die zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (93,103,112) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes komplementär ist und eine im Wesentlichen unterschiedliche Sequenz zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (71, 91) hat und c) ein Amplifizierungsrest (73,93), der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf eine Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und ii) gegebenenfalls enthaltend wenigstens einen Signalrest, der von der Nukleinsäurensequenz verschieden ist; b) eine einsträngige zweite Amplifizierungs-Matrize (80,100) enthaltend: i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (81,101) enthaltend die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (72,92) der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize (70,90); b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (82,102) enthaltend die Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (71,91) der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize (70,90) und c) einen Amplifizierungsrest (83,103), der in allen bis auf den letzten Amplifizierungsschritt auf eine Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und ii) gegebenenfalls enthaltend wenigstens einen Signalrest, der von einer Nukleinsäurensequenz verschieden ist; c) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (93,103,112) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (71,81,91,101) der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize (70,80,90,100) in der Lage ist; d) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs- Nukleinsäurensequenz (71,81,91,101) der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen (70,80,90,100) zu entfernen, wenn sie zum besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um die nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (72,82,92,102) der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen (70,80,90,100) des besagten komplementären Stranges zu erlauben und e) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (93,103,112) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu den besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenzen(71,81,91,101) der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen (70,80,90,100) komplementär sind, zu ermöglichen; iii) Detektion jeder gebundenen ersten und/oder zweiten Amplifizierungs-Matrize (70,80,90,100) des Amplifizierungsschrittes oder der Amplifizierungsschritte und iv) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iii) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls (20).
  4. Verfahren zur Bestimmung eines Zielmoleküls (20) gemäß Anspruch 3, wobei das Entfernen der besag ten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (71,81,91,101) der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrizen (70,80,90,100) durch die Verwendung einer doppelsträngigen 5'-Exonuklease, gegen deren Aktivität die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (72,92) der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize (70,90) und die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (82,102) der besagten zweiten Amplifizierungs-Matrize (80,100) geschützt ist, erreicht wird.
  5. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls (20), umfassend die Schritte: i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde (140) enthaltend einen Bindungsrest (141), der für das besagte Zielmolekül (20) spezifisch ist und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (142), um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen, wobei die Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (142) für eine oder mehrere Begrenzungsstellen für eine Begrenzungs- Endonuklease für die Hybridisierung an einen komplementären Strang besitzt; ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur die an jeden im vorherigen Schritt hergestellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschrittes der Behandlung der besagten Probe und der Lokalisierungssonde (140) mit: a) einer einsträngigen Amplifizierungs-Matrize (120) enthaltend: i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung; a) Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (121); b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (122), die komplementär zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (123,142) des vorhergehenden Amplifizierungsschrittes ist oder, wenn kein vorhergehender Amplifizierungsschritt erfolgt, vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (121) besitzt und c) einen Amplifizierungsrest (123), der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist; ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest; b) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (123,142) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (121) der besagten Amplifizierungs-Matrize (120), in der Lage ist; c) die besagte Begrenzungs-Endonuklease; d) die Reagenzien und Bedingungen, die notwendig sind zur: i) Beeinflussung der Wirkung des Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (123,142) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (121) der besagten Amplifizierungs-Matrize (120) komplementär sind und ii) Beeinflussung des Dissoziation der Fragmente der Nukleinsäurenstränge, die durch die besagte Aktivität der Begrenzungs-Endonuklease vom ungeschnittenen komplementären Strang abgeschnitten wurden, während die Dissoziation von ungeschnittenen Nukleinsäurensträngen von ungeschnittenen komplementären Strängen nicht beeinflusst wird; iii) Detektion jeder Amplifizierungs-Matrize (120) von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten; und iv) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iii) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls (20).
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die besagte Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (123) und die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (122), die Nukleotid-Modifikation aufweisen, die die Spaltung durch die besagte Begrenzungs-Endonuklease verhindert, und besagte Reagenzien wenigstens ein modifiziertes Nukleotid, das, wenn es in den besagten komplementären Strang durch das Polymerisierungsmittel eingebaut wird, die Spaltung des besagten komplementären Stranges durch die besagte Begrenzungs-Endonuklease verhindert, einschließen.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die besagte Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz wenigstens eine Nukleotid-Modifikation aufweist, die die Spaltung durch besagte Begrenzungs-Endonuklease verhindert, wobei die Begrenzungs-Endonuklease nur einsträngige Einkerb-Aktivität besitzt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Verfahren isotherm durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Verfahren bei mehr als einer Temperatur durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Amplifizierungsschritt oder Schritt (ii) zwei- oder mehrmals durchgeführt wird.
  11. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls (20) umfassend die Schritte: i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde (150) enthaltend: a) einen Bindungsrest (151), der für das besagte Zielmolekül (20) spezifisch ist; b) eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (152), um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen und c) gegebenenfalls mindestens einen sich von ei ner Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest; ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden im vorangehenden Schritt hergestellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschrittes der Behandlung des besagten Komplexes mit: a) einer einsträngigen Amplifizierungs-Matrize (160,180) enthaltend: i) angeordnet in einer 5'- bis 3'- Richtung: a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (162,182) und b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (161,181), die komplementär ist zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (152,173) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlänge rungs-Nukleinsäurensequenz (162,182) besitzt und ii) gegebenenfalls mindestens eine sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest; b) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (152,173) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (162,182) der besagten Amplifizierungs-Matrize (160,180) in der Lage ist; c) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (162,182) der besagten Amplifizierungs-Matrize (160,180) zu entfernen, wenn sie zu dem besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um eine nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (161,181) der besagten Amplifizierungs-Matrize (160,180) zu dem besagten komplementären Strang zu ermöglichen; d) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizie rungs-Nukleinsäurensequenz (152,173) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (162,182) der besagten Amplifizierungs-Matrize (160,180) komplementär sind, und iii) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte der Behandlung des Produktes der vorherigen Wiederholung oder, wenn es keine vorherige Wiederholung gibt, der Produkte von Schritt ii) mit: a) einem Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, den Rest der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (161,181) der besagten Amplifizierungs-Matrize (160,180) der vorherigen Wiederholung oder Schritt ii) bei der Hybridisierung zu dem besagten komplementären Strang zu entfernen; b) eine zusätzliche Lokalisierungssonde enthaltend: i) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (162,182), die zu dem besagten komplementären Strang der vorherigen Wiederholung oder Schritt (ii) spezifisch ist; ii) einen Amplifizierungsrest (173), der in al len bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist und um einen Komplex herzustellen und c) Durchführung von Schritt (ii), wie oben beschrieben, gegebenenfalls unter Verwendung einer Amplifizierungs-Matrize (160,180), die sich von der zuvor verwendeten unterscheidet; iv) Detektion von allen gebundenen zusätzlichen Lokalisierungssonden oder der Amplifizierungs-Matrize (160,180) von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten und v) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iv) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls (20).
  12. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls (20) umfassend die Schritte: i) In Kontakt bringen einer Probe mit einer Lokalisierungssonde (150) enthaltend einen Bindungsrest (151), der für das besagte Zielmolekül (20) spezifisch ist, und eine Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (152), um einen Komplex aus Zielmolekül und Lokalisierungssonde herzustellen; ii) Herstellung einer Amplifizierungsstruktur, die an jeden im vorangehenden Schritt herge stellten Komplex gebunden ist durch ein- oder mehrmalige Durchführung des Amplifizierungsschrittes der Behandlung des besagten Komplexes mit. a) einer einsträngigen ersten Amplifizierungs-Matrize (160,180) enthaltend: i) in einer 5'- bis 3'- Richtung: a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz (162,182) und b) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz (161,181) die komplementär ist zu der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz (152,173) des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt vom vorangehenden Schritt und die im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie die besagte Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz besitzt und ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest; b) eine einsträngige zweite Amplifizierungs-Matrize enthaltend: i) angeordnet in einer 5- bis 3'- Richtung: a) eine Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz ent haltend die Hybridisierungs-Nukleinsäure der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize und b) eine Hybridisierungs-Nuklein-säurensequenz enthaltend die Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten Amplifizierungs-Matrize und ii) gegebenenfalls mindestens einen sich von einer Nukleinsäurensequenz unterscheidenden Signalrest; c) ein Polymerisierungsmittel, das zur Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorherigen Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorheriger Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch Synthese eines komplementären Stranges zu der besagten Verlängerungs- Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize in der Lage ist; d) ein Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, genügend der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize zu entfernen, wenn sie zu dem besagten komplementären Strang hybridisiert wird, um eine nachfolgende Hybridisierung der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize zu dem besagten komplementären Strang zu erlauben; e) die für die Beeinflussung der Wirkung des besagten Polymerisierungsmittels und Separierungsmittels notwendigen Reagenzien und Bedingungen, um die Verlängerung des 3'-Endes der Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz des vorhergehenden Amplifizierungsschrittes oder, wenn kein vorhergehender Amplifizierungsschritt erfolgt, des vorangehenden Schrittes durch die Synthese einer Vielzahl von Sequenzen, die zu der besagten Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz der besagten Amplifizierungs-Matrize komplementär sind, zu erlauben; iii) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte der Behandlung der Produkte der vorherigen Wiederholung oder, wenn es keine vorherige Wiederholung gibt, der Produkte von Schritt (ii) mit: a) einem Separierungsmittel, das dazu in der Lage ist, den Rest der besagten Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz der besagten ersten und zweiten Amplifizierungs-Matrize der vorhergehenden Wiederholung oder Schritt (ii) zu entfernen, wenn zu besagten komplementären Strang hybridisiert wird, und b) eine zusätzliche Lokalisierungssonde enthaltend: i) eine Hybridisierungs-Nukleinsäurensonde, die für den besagten komplementären Strang der vorherigen Wiederholung oder Schritt (ii) spezifisch ist, und ii) ein Amplifizierungsrest, der in allen bis auf die letzte Wiederholung auf die Nukleinsäurensequenz beschränkt ist; um einen Komplex herzustellen und c) Durchführung von Schritt (ii), wie oben beschrieben, gegebenenfalls unter Verwendung einer Amplifizierungs-Matrize, die sich von der zuvor verwendeten unterscheidet; iv) Detektion von allen gebundenen zusätzlichen Lokalisierungssonden oder der Amplifizierungs-Matrize von dem Amplifizierungsschritt oder den Amplifizierungsschritten und v) Korrelation der Ergebnisse des Detektionsschrittes (iv) mit der Anwesenheit des besagten Zielmoleküls.
  13. Ein Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei die Entfernung der besagten Amplifizierungs-Matrize durch die Verwendung einer doppelsträngigen 5'-Exonuklease erreicht wird.
  14. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei die Ent fernung der besagten Amplifizierungs-Matrize durch eine erhöhte Temperatur erreicht wird.
  15. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach Anspruch 14, wobei die besagte Lokalisierungssonde kovalent an das besagte Zielmolekül vor der Entfernung der besagten Amplifizierungs-Matrize gebunden wird.
  16. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei vor dem besagten Detektionsschritt zusätzlich ein Verfahren gemäß den Schritten (ii) und (iii) nach einem der Ansprüche 11 oder 12 durchgeführt wird.
  17. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Amplifizierungsrest der besagten Amplifizierungs-Matrize vom besagten letzten Amplifizierungsschritt eine Nukleinsäurensequenz enthält und vor dem besagten Detektionsschritt zusätzlich die Schritte (ii)–(iii) nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12 durchgeführt werden.
  18. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei vor dem besagten Detektionsschritt zusätzlich Schritt (ii) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 5 durchgeführt wird.
  19. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei der besagte Amplifizierungsrest der besagten Lokalisierungssonde oder zusätzlicher Lokalisierungssonden vom besagten letzten Amplifizierungsschritt eine Nukleinsäurensequenz enthält und vor dem besagten Detektionsschritt zusätzlich Schritt (ii) eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 5 durchgeführt wird.
  20. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 1 – 9, 18 oder 19, wobei der Schritt der Detektion jeder Amplifizierungs-Matrize die Schritte umfasst: i) Behandlung der besagten Probe, Lokalisierungssonde und Amplifizierungs-Matrize oder Amplifizierungs-Matrizen mit einer Detektionssonde, die spezifisch an den besagten Amplifizierungsrest der letzten der besagten Amplifizierungs-Matrizen bindet, und ii) Detektion jeder gebundenen Detektionssonde.
  21. Verfahren zur Detektion eines Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt der Detektion jeder gebundenen Amplifizierungs-Matrize die Schritte umfasst: i) Behandlung der besagten Probe, Lokalisierungssonde und Amplifizierungs-Matrize mit einer Detektionssonde, die spezifisch an den besagten Amplifizierungsrest der letzten der besagten Amplifizierungs-Matrizen bindet und ii) Detektion jeder gebundenen Detektionssonde.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 21, wobei die Detektionssonde einen Marker besitzt, das durch ein Verfahren aus der Gruppe der Luminometrie, Fluorometrie, Spektrophotometrie und Radiometrie detektiert wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Detektionssonde mit einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe FAM (Carboxifluoresfluorescein), HEX (Hexachlorofluorescein), TET (Tetrachlorofluorescein), ROX (Carboxy-X-Rhodamin), TAMRA (Carboxytetramethylrhodamin), JOE (Carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-Dimethoxy-fluorescein) oder Biotin markiert ist.
  24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Amplifizierungsschritt zwei- oder mehrfach durchgeführt wird, wobei jeder Amplifizierungsschritt unter Verwendung einer Amplifizierungs-Matrize mit einer zu der im vorherigen Amplifizierungsschritt verwendeten Amplifizierungs-Matrize durchgeführt wird unterschiedlichen Verlängerungs-Nukleinsäurensequenz, Hybridisierungs-Nukleinsäurensequenz und Amplifikationsrest.
  25. Verfahren nach einem der vohergehenden Ansprüche, wobei das zu detektierenden Zielmolekül ei ne Nukleinsäurensequenz ist und der Bindungsrest der besagten Lokalisierungssonde eine zur besagten Nukleinsäurensequenz des Zielmoleküls komplementäre Nukleinsäurensequenz enthält.
  26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren unter Verwendung von mehr als einer Lokalisierungssonde durchgeführt wird und jede Lokalisierungssonde die gleiche Amplifizierungs-Nukleinsäurensequenz aufweist.
  27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zwei Wiederholungen umfasst.
  28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei am Ende von Schritt i), am Ende jeder Wiederholung oder am Ende des Detektionsschrittes nicht umgesetzte Reagenzien durch Waschen entfernt werden.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die nicht umgesetzten Reagenzien ausgewählt sind aus der Gruppe der Lokalisierungssonde, der Amplifizierungs-Matrize und der Detektionssonde.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5681697A (en) * 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
GB9609213D0 (en) * 1996-05-02 1996-07-03 Tepnel Medical Ltd Amplification of nucleic acids
DE69719057T2 (de) 1996-07-12 2003-12-04 Tm Technologies Inc., Woburn Verfahren zur signalverstärkung

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