DE4444753A1

DE4444753A1 - Verfahren zur Gewinnung eines antibiotisch wirksamen Präparates aus der bovinen Milch und zu deren synthetischen Darstellung

Info

Publication number: DE4444753A1
Application number: DE4444753A
Authority: DE
Inventors: Hans-Dieter Dr Rer Nat Zucht; Wolf-Georg Prof Dr M Forssmann; Manfred Dr Phil Raida; Knut Dr Rer Nat Adermann
Original assignee: Forssmann Wolf-Georg Prof Drmed 30175 Hannover De
Current assignee: Forssmann Wolf-Georg Prof Drmed 30175 Hannover De
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1994-12-15
Publication date: 1996-06-20
Anticipated expiration: 2014-12-16
Also published as: DE4444753C2

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zu Produktion eines antibiotisch wirksamen Peptid-Präparates aus der Kuhmilch. Die Gewinnung dieser Peptide kann entweder durch eine gezielte Verarbeitung von Vorzugsmilch erfolgen, oder sie erfolgt über die chemische Peptid-Synthese.

Bei den Peptiden, die Gegenstand dieses Patentantrages sind, handelt es sich um spezielle Bruchstücke des Casein-alpha-s2-Moleküls. Casein-alpha-s2 wurde von Stewart und Mitarbeitern 1987 in seiner Primärstruktur beschrieben (Stewart et al., Mol Biol Evol, Vol 4, S. 231, 1987). In seiner phosphorylierten Form ist als Funktion für das Casein-alpha-s2 eine Calciumtransportfunktion beschrieben. Eine antibiotische Wirksamkeit wurde für Caseine und Caseinfragmente bislang nicht veröffentlicht. Für den Nachweis einer antimikrobiellen Aktivität ist es notwendig, einen Test durchzuführen, der für sehr basische Peptide geeignet ist. Hier ist der Wachstumshemmtest von Lehrer und Mitarbeitern notwendig (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S. 167 1991)

Caseinfragmente, die die Aminosäurereste beginnend von Position 165 bis 203 enthalten, wirken auf Bakterien wie E. coli wachstumshemmend. Diese wachstumsmodulierenden Eigenschaften von bestimmten Casein-alpha-s2-Fragmenten wurden bei der Entwicklung des hier vorgestellten Verfahrens erstmals eindeutig nachgewiesen.

Diese Moleküle sind in der Vollmilch in großer Menge enthalten und können mit dem hier vorgestellten Verfahren gewonnen werden. Nachfolgend werden die gegen Bakterien wirksamen Moleküle analog zu den aus dem Casein gewinnbaren Casomorphinen als Casobiotika bezeichnet. Im patentgemäßen Präparat, welches aus Kuhmilch gewinnbar ist, sind 17 identifizierte verschiedene Casein-alpha-s2-Fragmente vorhanden, die sich in ihrer biologischen Wirksamkeit ergänzen. Über die chemische Synthese kann Casein-alpha-s2-165- 203 bzw. Casein-alpha-s2-166-203 in reiner und biologischer aktiver Form hergestellt werden. Beide Reinstoffe wirken, wie auch das aus Vollmilch gewonnene Präparat, hemmend auf das Wachstum von Bakterien.

Der erfindungsgemäße Stoff, bestehend aus dem Präparat welches aus Kuhmilch hergestellt wird als auch das synthetische Produkt können die bakterielle Flora des Darms, der Haut und anderer bakteriell besiedelter Körperzonen verändern und bei einer bakteriellen Fehlbesiedlung zu einer Verbesserung der Keimflora führen. Die dargestellten Reinstoffe, sowie das patentgemäße Präparat lassen sich daher zur Bekämpfung von Durchfällen, insbesondere Säuglingsdurchfällen, verwenden. Beide Präparate sind als Zusatzstoffe für Lebensmittel oder als Therapeutika zu verwenden und dienen bei der Herstellung von Lebensmitteln als Hilfsstoffe, insbesondere bei Lebensmitteln, die durch Gärung und andere bakterielle Prozesse hergestellt werden. Bei dem patentgemäßen Präparat handelt es sich um ein natürliches Konservierungsmittel.

Zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Casobiotikapräparates aus der Kuhmilch wird unbehandelte Rohmilch zunächst mit Essigsäure und Calciumsulfat versetzt und gekocht, um alle hochmolekularen Proteine zu denaturieren und auszufällen. Bei dieser Prozedur werden die vorliegenden Caseinphosphopeptide ebenfalls gefällt und abgetrennt. Die verbliebene "Molkefraktion", die nur noch hitzestabile Proteine und Peptide enthält, wird verdünnt und ein Polymer-Kationenaustauscherharz eingerührt, um alle basischen Peptid-Moleküle zu binden. Anschließend ist es notwendig, das Harzmaterial zur Abtrennung unspezifisch gebundener Peptide und Milchfette mit Harnstoff-Lösungen zu waschen. Die Peptide können schließlich eluiert werden. Dieses Eluat wird mit Hilfe der Reversed-Phase-HPLC gereinigt. Die biologisch aktiven Fraktionen werden mit Hilfe eines Wachstumstests, der für die Kontrolle von basischen Peptiden optimiert ist, ermittelt und von den begleitenden Verunreinigungen abfraktioniert. Die so gewonnene auf Bakterien wirksame Fraktion kann durch weitere aufeinander abgestimmte HPLC-Reinigungsschritte weiter gereinigt werden. Die Reinigung kann bis zur Gewinnung der einzelnen biologisch relevanten Peptidfragmente aus dem Casein- alpha-s2-Molekül erfolgen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und den folgenden Abbildungen, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird erläutert. Es zeigen

Abb. 1: Wachstumshemmtest von Casein-alpha-s2-165-203 und -166-203
Radialer Diffusions-Wachstumshemmtest mit Escherichia coli nach Lehrer und Mitarbeitern (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S. 167 1991). Die Nummern entsprechen den in Abb. 2 angegebenen Fraktionen. Der Wachstumshemmtest ist für den Nachweis antibiotischer Peptide optimal, da als Trägermaterial statt des sonst üblichen Agar-Agars eine spezielle Agarose verwendet wurde, die keine fixierten Ladungszentren enthält. Gezeigt sind die erzielbaren Hemmhöfe nach Auftrag von 1-10 µg Peptid.

Abb. 2: RP-HPLC
Auftrennung des vorbehandelten Peptidkonzentrats (Kationenaustauschereluat) mit Hilfe einer präparativen Reversed-Phase-C4-Chromatografie.

Säule: Stahlmantel 10×125 mm
Material: Parcosil RP-C4, 300 Å, 5 µm
Eluent A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
Flußrate: 1 ml/min
Gradient: gestrichelt eingezeichnet, Bezug auf die rechte Y-Achse
Detektion: Absorption bei 280 nm, Durchflußzelle
Anlage: Kontron HPLC System 460
Probe: entspricht 350 ml Molke bzw. 525 ml Rohmilch

Hervorgehoben im oberen HPLC-Elutionsprofil ist die Fraktion, die höchste antibiotische Wirksamkeit gegenüber E. coli aufweist. In dem unteren Balkendiagramm ist die ermittelte biologische Aktivität aufgetragen.

Abb. 3: Wachstumshemmtest
Radialer Diffusions-Wachstumshemmtest mit Escherichia coli nach Lehrer und Mitarbeitern (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S. 167 1991). Die Nummern entsprechen den in Abb. 2 angegebenen Fraktionen. Der Wachstumshemmtest ist für den Nachweis von antibiotischen Peptiden optimal, da als Trägermaterial statt des sonst üblichen Agar-Agars eine spezielle Agarose verwendet wurde, die keine fixierten Ladungszentren enthält.

Abb. 4: Wachstumshemmtest
Radialer Diffusions-Wachstumshemmtest mit Escherichia coli nach Lehrer und Mitarbeitern (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S. 167 1991) (Vergrößerte Darstellung). Es wird die Ausbildung des Hemmhofs in der Fraktion "7" deutlich. Auch in den benachbarten Fraktionen ist ebenfalls eine geringere biologische Hemmwirkung zu detektieren.

Abb. 5: RP-C18-HPLC
Chromatografische Trennung der Fraktion "7" aus der Abb. 2 mit Hilfe der Reversed-Phase- HPLC auf einer analytischen RP-C18-Säule. Die biologische Aktivität erstreckt sich über einen breiten Bereich von 26 bis 29 Min Elutionszeit (farblich hervorgehoben). Die Verarbeitung der Fraktion 13 (dunkler hervorgehoben) ist in Abb. 6 gezeigt.

Säule: Stahlmantel 10×125 mm
Material: Parcosil RP-C18 100 Å, 5 µm
Eluent A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
Gradient:
0-5 Min: 0% Eluent B-15% Eluent B
5 Min-65 Min: 15% B-80% Eluent B
Flußrate: 1,5 ml/min
Detektion: Absorption bei 280 nm, Durchflußzelle
Anlage: Kontron HPLC System 460
Menge: entsprechend 315 ml Molke oder 472 ml Milch

Abb. 6: RP-C18-HPLC
Chromatografische Trennung der Fraktion "7-13" mittels RP-HPLC auf einer analytischen RP-C4-Säule. Die biologische Aktivität konnte in der Fraktion "7-13-8" (dunkel hervorgehoben) detektiert werden.

Säule: Stahlmantel 4 mm × 125 mm
Material: Parcosil RP-C4 300 Å, 5 µm
Eluent A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
Gradient:
0-5 Min: 0% Eluent B-15% Eluent B
5 Min-65 Min: 15% B-80% Eluent B
Flußrate: 1,0 ml/min
Detektion: Absorption bei 214 nm, Durchflußzelle
Anlage: Kontron HPLC System 460
Menge: entsprechend 315 ml Molke oder 472 ml Milch

Abb. 7: Kapillarzonenelektrophorese
Kapillarzonenelektrophoretische Trennung der Fraktion "7-13-8". Das Elektropherogramm zeigt ein dominierendes Signal. Hierbei handelt es sich um Casein-alpha-s2-165-203.

System: Kapillarzonenelektrophoresesystem P/ACE 2100, Beckmann München
Detektion: Absorption bei 200 nm
Bedingungen:
konstanter Strom von 120 Mikroampere
resultierende Spannung etwa 15-17 k Volt

Als Kapillare wurde eine 57 cm lange unbeschichtete Kapillare TSP 075375 aus "fused silica" der Firma Composite Metal Services (UK) verwendet. Als Injektionsvolumen wurden 60 nl bei einer Injektionsrate von 6 nl/sec verwendet. Als Puffer wurde 100 mM NaH₂PO₄ mit 0,02% Hydroxypropylmethylcellulose pH 2,5 verwendet.

Abb. 8: RP-C18-HPCL (LC-MS Kopplung)
Darstellung eines Chromatogramms nach RP-C18-HPLC gekoppelt mit einem Quadrupolmassenspektrometer als Detektor. Die Massenspektrometrie erfolgt in einem Elektrospray-Massenspektrometer Sciex API III der Firma Perkin Elmer (Ueberlingen). Als Säule wurde eine analytische RP-C-18-Säule von YMC in der Dimension 1 mm × 25 mm verwendet. Das RP-Gelmaterial war ein RP-C18 Träger mit einer Porengröße von 120 Å und einer Partikelgröße von 3 µm. Das Injektionsvolumen betrug 1 µl. Eine Probenmenge entsprechend 5 µg Gesamtprotein wurde aufgetragen. Laufmittel A war 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), Laufmittel B war 0,1% TFA in Aceonitril/Wasser (4 : 1). Als Flußrate wurde 20 µl/min gewählt. Der Gradient entsprach einer Zunahme des Eluenten B von 1% je min. Zeitgleich wurde eine UV-Detektion in einer Durchflußzelle bei einer Wellenlänge von 210 nm und einer Empfindlichkeit von 0,01 AE aufgezeichnet.

Aufgetrennt wurde die biologisch aktive Fraktion "7" aus dem Chromatogramm in Abb. 2. Es identifizierte Peptidmassen eingetragen (schwarze Punkte). Dominierende Massen erhielten eine fettere Markierung. Mit Kreuzen sind Peptidmassen gekennzeichnet, die aus dem Casein- alpha-s2 abgeleitet werden können. Diese Moleküle sind für biologische Aktivität der Fraktion 7 verantwortlich.

Abb. 9 Elektrospraymassenspektrum der Peptidfraktion "7-13-8":
Es sind die Massen 4869,6 Da Casein-alpha-s2-165-203 und in sehr viel geringerem Maße die Masse 4741 Dalton für Casein-alpha-s2-166-203 detektierbar. Die berechneten Massen stimmen sehr gut mit den theoretisch vorhergesagten Massen überein. Die Abweichung ist kleiner als 0,5 Dalton.

Beispiele Beispiel 1 Isolierung und Reinigung eines antibiotischen Präpararates aus boviner Milch 1. Vorbehandlung

Für die Gewinnung der antibiotischen Peptidfraktion wurde folgendes Verfahren durchgeführt.

Zunächst wurde 1,5 Liter unbehandelte Rohmilch (Vorzugsmilch) mit Essigsäure angesäuert. Die Endkonzentration betrug 10% (v/v). Die angesäuerte Milch wurde erhitzt und 5 min bei T Grad Celsius inkubiert. Diese Lösung wurde auf 50 Grad Celsius abgekühlt und dazu CaCl₂ _* 2H₂O in einer Konzentration von 1/gl gegeben.

Schließlich wurde für 15 min bei 3500 × g und 4 Grad Celsius zentrifugiert, um die so erzeugte Molke von der Fettfraktion (oben aufschwimmend) und von den denaturierten Proteinen (unten abgesetzt) zu trennen. Es resultiert ein Volumen von ca. 1 Liter.

Diese Lösung wurde mit A. dest auf ein Volumen von 5 Litern aufgefüllt, um die Säurekonzentration auf 2% (v/v) zu senken. Zur Konzentrierung der in dieser Lösung befindlichen basischen Peptide wurden zu der verdünnten Lösung 25 ml eines polymeren Kationenaustauscherharzes gegeben (Biotek, Lot. 3321/91, 20 µm Partikelgröße). Die Suspension wurde zur Inhibition von Serinproteasen mit 50 µM PMSF versetzt und für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

Das Gelmaterial wurde filtriert und zum Waschen des Gelmaterials mit drei Portionen A. dest (je 250 ml) resuspendiert und erneut filtriert. Um unspezifisch gebundene Proteine und Fette vom Gelmaterial zu entfernen, wurde das Harz mit 250 ml einer 5 M Harnstofflösung in einem 5 mM Phosphatpuffer (pH 3,0) für 30 min gerührt und schließlich wie zuvor beschrieben abgesaugt. Das Harz wurde erneut in 250 ml A. dest resuspendiert und abgenutscht. Alle bislang angefallenen Waschlösungen wurden verworfen.

Zur Elution der gebundenen Peptide wurden zu dem Harz einer 1 mol/l NaCl 5 mM Phoshatpuffer (pH 3,0) zugesetzt und für ca. 5 min bei RT gerührt. Das Harzmaterial wurde durch Zentrifugation für 5 Min. bei 1000 × g abgetrennt, die so gewonnene Lösung mit Hilfe einer Einmal-Sterilfilterkartusche (0,2 µm Porengröße) sterilfiltriert und bei -20 Grad Celsius gefroren gelagert.

2. Erster HPLC-Reinigungsschritt

Für den ersten HPLC-Reinigungsschritt wurde eine Reversed-Phase-Chromatografie mit Hilfe eines analytischen C18-Säulenmaterials durchgeführt. Hierzu wurden 35 ml Kationenaustauschereluat entsprechend einer Ausgangsmenge von 350 ml Molke (bzw. 525 ml Milch) mit Hilfe einer RP-C18 Säule der Dimension 1 cm × 12,5 cm aufgetrennt. Als Säulenmaterial fand Parcosil RP-C18 Material (100 Å, 5 µm) Verwendung. Laufmittel A war 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), Laufmittel B war 0,1% TFA Aceonitril. Als Flußrate wurde 1 ml/min gewählt, gesammelt wurden Fraktionen mit einer Größe von 2 ml.

Zur Bestimmung der Bioaktivität wurde ein Äquivalent von 50 µl des Eluates in einer Vakuumzentrifuge (Speed-Vac-Concentrator, Univapo) lyophilisiert, nachdem die Proben bei -80 Grad Celsius tiefgefroren worden waren. Dieses Probenäquivalent wurde 5 µl A. dest aufgenommen und im Wachstumshemmtest eingesetzt. Im Biotest wurde demnach ein Äquivalent von 8,8 ml Molke (bzw. 13 ml Milch) in jede Probenvertiefung pipettiert. Gemessen wurde eine maximale Hemmaktivität von 56 Einheiten in der Fraktion "7" (siehe Abb. 2). Die abgesammelten Probeneluate wurden bei -20 Grad Celsius über Nacht gelagert.

Die Fraktion mit der antibiotischen Aktivität kann als antibiotisches Präparat zu verschiedenen Verwendungszwecken (siehe Patentansprüche) eingesetzt werden. Nach einer analytischen RP- Chromatografie, gekoppelt mit einem Quadrupolmassenspektrometer als Detektor, konnten einige Moleküle aus dem Casein-alpha-s2 über ihre Masse identifiziert werden. Diese Massen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Zahlen im Fettdruck geben Massen wieder die identifiziert werden konnten. Kursive Ziffern geben Massen wieder, die für zwei unterschiedliche jeweilige Caseinmoleküle beginnend mit der Position 165 oder 166 gleichermaßen zugeordnet werden können. Die vorliegenden identifizierten Caseinfragmente wirken antibiotisch und ergänzen sich in ihrer Aktivität.

3. Zweiter HPLC-Reinigungsschritt

Die Fraktion mit der stärksten biologischen Hemmwirkung auf E. coli war Fraktion 7. Diese Fraktion (Volumen 1,8 entsprechend 315 ml Molke, bzw. 472 ml Milch) wurde, um die Acetonitrilkonzentration zu senken, 1 : 1 mit A. dest versetzt und mit Hilfe der im ersten Reinigungsschritt verwendeten RP-C18-Säule rechromatografiert.

Material: Parcosil RP-C18 100 Å, 5 µm
Eluent A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
Gradient:
0-5 Min: 0% Eluent B - 15% Eluent B
5 Min-65 Min: 15% B - 80% Eluent B
Flußrate: 1,5 ml/min
Detektion: Absorption bei 280 nm, Durchflußzelle

Das Eluat wurde in 0,75 ml bzw. 1,5 ml Fraktionen abgesammelt. Für den Biotest wurden 50 µl Eluat lyophilisiert und in 10 µl A. dest aufgenommen , welches komplett eingesetzt wurde. Demnach wurde in dieser zweiten Stufe in jeder Probenvertiefung des Wachstumshemmtestes eine Eluatmenge entsprechend 10,5 ml Molke (bzw. 15,75 ml Milch) eingesetzt. Folgende Bioaktivität konnte bestimmt werden:

Fraktion 1-12: keine Hemmung nachweisbar
Fraktion 13: 17,5 Einheiten (1,75 mm)
Fraktion 14: 25 Einheiten (2,5 mm)
Fraktion 15: 20 Einheitenb (2,0 mm)
Fraktion 16-19: keine Hemmung nachweisbar

4. Dritter HPLC-Reinigungsschritt

Die Fraktion 13 (Volumen 1,45 ml entsprechen 305 ml Molke, bzw. 456 ml Milch) wurde, um die Acetonitrilkonzentration zu senken, 1 : 1 mit A. dest versetzt und mit Milfe einer RP-C4- Säule chromatografiert.

Material: Parcosil RP-C4, 300 Å, 5 µm
Eluent A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
Gradient:
0-0,09 Min: 0% Eluent B
0,09-10 Min: 0% Eluent B-25% Eluent B
10 Min-80 Min: 25% B - 70% Eluent B
Flußrate: 1,0 ml/min
Detektion: Absorption bei 214 nm, Durchflußzelle

Das Eluat wurde in 1,0 ml Fraktionen abgesammelt. Für den Biotest wurden 50 µl Eluat lyophilisiert und in 10 µl A. dest aufgenommen, welches komplett eingesetzt wurde. Demnach wurde in dritter Stufe in jeder Probenvertiefung des Wachstumshemmtests eine Eluatmenge entsprechend 15 ml Molke (bzw. 22,8 ml Milch) eingesetzt. Folgende antibiotische Aktivität konnte bestimmt werden:

Fraktion 4-7: keine Hemmung nachweisbar
Fraktion 8: 10 Einheiten (1,0 mm)
Fraktion 9-17: keine Hemmung nachweisbar

Die Fraktion 7-13-8 enthält das Peptid Casein-alpha-s2-165-203 (Reinheitsgrad ca. 95%).

Sequenzanalytische Bestimmung der Primärstruktur des Casein-alpha-s2-165-203

Aus der bioaktiven Fraktion 7-13-8 wurde eine Menge entsprechend etwa 250 ng Peptid eingesetzt. Nach der Isolierung aus der Kuhmilch, wie oben beschrieben, wurde mit Hilfe des Gasphasensequenators Typ 473 A (Applied Biosystems) sequenziert. Der Edman-Abbau (Edman und Begg, Eur J Biochem, 1, 1967, S. 80) erfolgte mit dem Programm PTHRUN. Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde im On-line-Verfahren über ein integriertes HPLC-System nach dem von Applied Biosystems vorgeschriebenen Protokoll durchgeführt. Für diese Fraktion konnte eine Sequenz von 37 Aminosäuren bestimmt werden. Über die Homologie der bereits bekannten Sequenz des Pro-Caseins und der ermittelten Masse des isolierten antibiotisch aktiven Fragments konnte bestätigt werden, daß es sich um Casein-alpha- s2-165-203 handelte.

Beispiel 2 Durchführung des Wachstumshemmtests zur Bestimmung der antibiotischen Aktivität

Der hier durchgeführte Wachstumshemmtest wurde 1991 von Lehrer und Mitarbeitern entwickelt (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S. 167 1991) und in abgewandelter Form eingesetzt. Der Test ist auf die Detektion antibiotischer basischer Peptide zugeschnitten. Er wird folgendermaßen durchgeführt:

Das Testmedium besteht aus zwei Agaroseschichten, dem unteren nährstoffarmen "Basis- Layer" und dem oberen nährstoffreichen "Top-Layer". Die Bakterien liegen im Basis-Layer suspendiert vor.

Die untere Agaroseschicht "Basis-Layer" setzt sich folgendermaßen zusammen:

0,8% Agarose ohne EEO von Serva
10 mM Natrium-Phosphatpuffer pH 7,4 oder alternativ als Puffer
10 mM Tris-HCl pH 7,5
0,3 mg/ml Tryptic-Soy-Broth Pulver von Sigma
0,02% (v/v) Tween 20

Die Lösung wird durch Kochen oder Autoklavieren sterilisiert und im Wärmebad auf eine Temperatur von 50 Grad Celsius abgekühlt.

Eine frisch beimpfte Bakterienkultur (5 ml LB-Flüssigmedium (10 g/l Caseinhydrolysat, 5/g/l Hefeextrakt, 5 g/l NCl)) wird für 3 Stunden bei 37 Grad Celsius und 180 Upm im Kulturschüttler (New Brunswick) inkubiert, bis die Lösung eine Trübung von ca. 0,5 Extinktionseinheiten bei 600 nm gemessen aufweist. Die Bakteriensuspension wird für 1 min bei 10 000 × g abzentrifugiert und in 500 µl Pufferlösung des "Basis-Layers" resuspendiert und mit dem aufgeschmolzenen Basislayer versetzt.

Aus dieser Bakteriensuspension wird in Petrischalen eine 3 mm hohe Schicht gegossen. Die Platten werden schließlich bei 4 Grad Celsius abgekühlt, wo sie etwa 48 Stunden haltbar sind.

Vor Gebrauch werden mit Hilfe eines Metallröhrchens 3 mm große Löcher in die erstarrte Agaroseschicht gestanzt. Der gestanzte Agarosekern wir dmit Hilfe einer Kanüle entfernt und in die so erzeugte Kavität die zu testende Probe pipettiert.

Die Inkubation der Bakterien mit der Probensubstanz erfolgt für 3 Stunden bei 37 Grad Celsius im Brutschrank. Die Platten werden schließlich mit dem nährstoffreichen Top-Layer überschichtet und für weitere 16 Stunden im Brutschrank bei 37 Grad Celsius bebrütet. Der Top-Layer ist folgendermaßen herzustellen:

0,8% Agarose ohne EEO s.o.
6% (w/v) Tryptic-Soy-Broth

Die Lösung wird sterilisiert und vor dem Aufgießen auf den Basis-Layer auf exakt 50 Grad Celsius abgekühlt (Wasserbad).

Nach der erfolgten Inkubation im Brutschrank werden die erzielten Hemmhofradien ausgemessen. Hiervon wird der Radius der Probenaktivität (1,5 mm) abgezogen. Ein Hemmhofradius von 0,1 mm entspricht definitionsgemäß einer Aktivität von 1 Einheit. Hierbei ist die Tatsache zu berücksichtigen, daß erfahrungsgemäß bei radialen Diffusionsmethoden ein linear zunehmender Hemmhofradius proportional zu einer exponentiell steigenden Menge an Wirkstoff ist.

Beispiel 3 Chemische Synthese der bovinen antibiotisch aktiven Peptide Casein-alpha-s2-165-203 und Casein-alpha-s2- 166-203

Strategie der Synthese des Casein-alpha-s2-165-203:
Für die Synthese der Peptide mit der Sequenz:

wurde die Durchflußmethode (Atherton und Sheppard, in "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL-Press, Oxford 1989) angewendet. Die genannte Peptidsequenz wurde mit Hilfe einer automatischen Peptid-Syntheseapparatur (Milligen 9050) unter Verwendung von Fmoc- Aminosäuren synthetisiert. Die Fmoc-Aminosäuren waren L-konfiguriert und in vierfachem Überschuß eingesetzt.

Folgende Aminosäurederivate wurden für die Synthese verwendet:
Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-His (Trt), Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe, Fmoc-Ile, Fmoc-Pro, Fmoc-Val.

Die Synthese wurde mit trägergebundener C-terminaler Aminosäure (0,091 mmol Alanin/g Harz) an Fmoc-L-Ala-PEG-PS (Mollipore) durchgeführt. Alle Kopplungen von Aminosäurederivaten wurden in Anwesenheit von O-(1H-Benzotriazol-1-yl)- N,N,N′,N′-tetramethyluronium-tetrafluorborat (TBTU), 1-Hydroxybenzotriazol, Diisopropylethylamin durchgeführt. Folgender Synthesezyklus wurde verwendet:

- Fmoc-Abspaltung mit 20% Piperidin ind DMF für 10 min
- Waschen mit DMF für 12 min
- Acylierung für 30 min
- Waschen mit DMF für 8 min

Die Synthese wurde durch kontinuierliche UV-Detektion verfolgt. Die Synthese wurde mit der Abspaltung des N-terminalen Fmoc-Restes abgeschlossen. Das harzgebundene Peptid wurde dreimal mit je 50 ml Isopropanol, Eisessig, Isopropanol und Diethylether gewaschen und getrocknet.

Die Peptide wurden vom Trägerharz durch Zugabe einer Mischung von TFA-Ethandithiol- Wasser 94 : 3 : 3 (v/v/v) abgespalten und mit Ether gefällt.

Die Reinigung des Peptids erfolgt mittels Reserved-Phase-HPLC mit einer C18-Säule (Vydac, 10 µmm 300 Å, 20 × 250 mm, Detektion bei 230 nm). Als Laufmittel wurden verwendet: Eluent A: 0,06% Trifluoressigsäure (TFA), Eluent B: 0,06% TFA in Acetonitril/Wasser (4 : 1). Die Flußrate war 10 ml/min, der Gradient war folgendermaßen: von 20% B bis 80% B innerhalb von 70 min. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Die Ausbeute an reinem Produkt betrug 23,3 mg Casein-alpha-s2-165-203 und 13,4 mg Casein-alpha-s2-166-203.

Die Reinheit und Identität der Peptide wurde mit Hilfe der Massenspektrometrie (Quadrupol- Elektrospraymassenspektrometrie, Sciex API III, Perkin Elmer) und Sequenzierung in einem Gasphasensequenator (Model 470, Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt, sowie Kapillarzonenelektrophorese (Bedingungen s. Abb. 7) überprüft. Die biologische Aktivität wurde durch den Wachstumshemmtest kontrolliert.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines antibiotisch wirksamen Präparates aus der Kuhmilch (Beispiel 1, bis zum ersten Reinigungsschritt) und seine Verwendung als antibiotisches Pharmakon zur Beeinflussung einer bakteriellen Flora und Verwendung in der Lebensmitteltechnologie als Hilfsstoff bei Gärprozessen und als Konservierungsstoff.

2. Verfahren zur Gewinnung von Casein-alpha-s2-165-203 in reiner Form aus der Kuhmilch (Beispiel 1, alle weiteren Reinigungsschritte) und seine Verwendung als antibiotisches Pharmakon zur Beeinflussung einer bakteriellen Flora und Verwendung in der Lebensmitteltechnologie als Hilfsstoff bei Gärprozessen und als Konservierungsstoff.

3. Verfahren zur Gewinnung von Casein-alpha-s2-165-203 in reiner Form in der üblichen Form zur Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese durch die üblichen Verfahren und seine Verwendung als antibiotisches Pharmakon zur Beeinflussung einer bakteriellen Flora und Verwendung in der Lebensmitteltechnologie als Hilfsstoff bei Gärprozessen und als Konservierungsstoff.

4. Verwendung des Präparates gemäß Anspruch 1-3 zur Therapie von Durchfallserkrankungen, insbesondere zur Therapie des Säuglingsdurchfalls.

5. Verwendung des Präparates gemäß Anspruch 1-3 zur Therapie von Veränderungen der Darmflora und ihre Beeinflussung.

6. Verwendung des Präparates gemäß Anspruch 1-3 zur Behandlung von mikrobiell ausgelösten Hauterkrankungen.

7. Verwendung des Präparates gemäß Anspruch 1-3 zur Behandlung von Abberationen der humanen Vaginalflora.

8. Verwendung des Präparates gemäß Anspruch 1-3 als Konservierungsstoff von Lebensmitteln oder anderen verderblichen Waren.

9. Verwendung des Präparates gemäß Anspruch 1-3 als Hilfsstoff bei industriellen Gärprozessen, z. B. bei der Bierherstellung, bei der Joghurtproduktion, bei der Sauerkrautherstellung usw., um die vorliegende Bakterienflora zu modifizieren.

10. Verwendung des Präparates gemäß Anspruch 1-3 als Konservierungsmittel von Lebens- und Futtermitteln.