DE4438023C1 - Verfahren zur Substratversorgung bei der Kultivierung von Mikroorganismen - Google Patents

Description

Das Verfahren findet Anwendung bei der Kultivierung von Mikro­ organismen in einem kontinuierlichen oder diskontinuierlichen aeroben Fermentationsverfahren.

Für ihr Wachstum benötigen Mikroorganismen während des Fermentationsprozesses als Wachstumsgrundlage neben Sauerstoff, Nährsalzen und Stickstoff auch eine Kohlenstoffquelle. Diese stellt bei technischen Prozessen meist organische Kohlenstoff­ verbindungen dar, aus welchen die Mikroorganismen den zum Wachs­ tum erforderlichen Kohlenstoff durch Abbau- und Umbauprozesse gewinnen.

Die Zugabe des Substrates oder der Mischung aus verschiedenen Substraten erfolgt überlicherweise durch einmalige Vorlage oder eine dosierte Einspeisung in flüssiger Form über den Fermenter­ deckel oder -kragen entsprechend dem Bedarf an Kohlenstoff durch die Mikroorganismen. Die Zuführung des Sauerstoffes wird in der Regel durch Einblasen von Luft gewährleistet. Bei solch einer Verfahrensführung kann es, insbesondere bei großvolumigen Fer­ mentoren, zu ungünstigen Verbrauchskoeffizienten kommen. In Teilen des Kulturmediums sind dann die Bedingungen für die Versorgung der Mikroorganismen mit Substraten ungenügend, so daß in diesen Zonen Substratkonzentrationsgradienten vorliegen. Auf solche Gradienten reagieren die Mikroorganismen mit einer ver­ ringerten Wachstumsaktivität und einem erhöhten Substratver­ brauch ohne Leistungssteigerung oder mit der Bildung unerwünsch­ ter Stoffwechselprodukte. Diese Mangelzonen oder Überschußzonen innerhalb des Fermentationssystems entstehen insbesondere an den Eintrittsstellen des Substrates dann, wenn eine ausreichend intensive Durchmischung mit dem Kulturmedium nicht gewährleistet werden kann.

Es sind Verfahren beschrieben, bei welchem eine gasförmige C-Quelle zur Mikroorganismenzucht verwendet wird. (H. J. Rehm: Industrielle Mikrobiologie, Springer-Verlag 1980; S. 183 f).

So wird der Kulturlösung ein Gasgemisch zugesetzt, welches als C-Quelle Methan und gleichzeitig Sauerstoff und Stickstoff enthält. Über das Mischungsverhältnis der Gasbestandteile ist eine optimale Fahrweise des Fermenters einstellbar.

Nach DD 2 32 927 wird zur Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute bei einem Fermentationsprozeß mit nach dem Umwälzprinzip arbeitender Begasung einer sauerstoffhaltigen Phase eine äquivalente Menge eines kohlenstoffhaltigen Substrates zugesetzt. Dabei erfolgt jedoch die Zugabe des Substrates in einem durch einen zusätz­ lichen Energieeintrag unter erhöhtem Systemdruck stehenden Teil des Kulturmediums, in diesem Fall in einem extern geführten Strom des Kulturmediums. Dieses Verfahren kann aber nur dort an­ gewendet werden, wo die Mikroorganismen durch den erhöhten Druck, die Scherkräfte und die örtliche Überdosierung von Sub­ strat im externen Kreislauf nicht geschädigt werden.

Es ist auch ein Fermentationsverfahren beschrieben (DD 1 51 574), bei welchem ein für das Wachstum der Mikroorganismen erforder­ licher Stoff im gasförmigen Zustand der Luft direkt zugesetzt wird. Durch eine angepaßte Strömungsgeschwindigkeit und Tempera­ tur des Gasstromes (O₂-Strom) wird Ammoniak als N₂-Quelle so zu­ gesetzt, daß es gasförmig als Mischung mit dem Sauerstoff in die Fermentationsflüssigkeit eintritt. Nachteilig ist bei all diesen Verfahren, daß die Zugabe des Substrates mit einer Veränderung des Fermentationsregimes oder der apparativen Ausrüstung verbunden ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung von Gradienten des Substrates oder der Nährstoffe im Kulturmedium eines aeroben Fermentationsprozesses bei einer gleichzeitigen Verbesserung der Substrat- und Nährstoffverteilung im Kulturme­ dium einen effizienteren Umsatz der Substrate zu erreichen.

Die Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 dargestellte Verfahren gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteran­ sprüchen 2-4 angegeben.

Für ein Fermentationsverfahren mit einer Sauerstoffzuführung in Form eines sauerstoffhaltigen Gases ist es weiterhin erforder­ lich, die Kohlenstoff- und Nährstoffquelle für den Wachstums- oder Akkumulationsprozeß der Mikroorganismen in das Kulturmedium einzubringen. Der in flüssiger Form vorliegende Kohlenstoffträ­ ger kann eine Flüssigkeit niederer Zähigkeit oder auch höherer Zähigkeit darstellen. Die Nährstoffe sind allgemein in gelöster Form vorliegend, wobei als Lösungsmittel im Normalfall Wasser verwendet wird.

Liegt das dem Fermentationsprozeß zuzusetzende Substrat mit einer höheren Viskosität vor, so können diese nach bekannten Methoden (z. B. durch Verdünnen) in Flüssigkeiten niederer Vis­ kosität überführt werden, um so im Zustand für eine Aerosolbil­ dung vorzuliegen.

Solche Substrate als Kohlenstoffquelle können Alkane mit Ketten­ längen zwischen C₁₀ und C₂₀ oder insbesondere Alkohole, wie bei­ spielsweise Methanol oder Ethanol sein. Letztgenannte Substrate können allein oder als Cosubstrate verwendet werden.

Als Substrate für den erfindungsgemäßen Einsatz eignen sich aber auch beispielsweise Melasse, Stärkehydrolysate oder Molke. Ins­ besondere die viskose Lösung von Melasse bedarf einer entspre­ chenden Aufbereitung, um eine Weiterverarbeitung als Aerosol zu ermöglichen. Solche Substrate und Nährstofflösungen werden durch bekannte Vorrichtungen und/oder Verfahren in ein Aerosol über­ führt, wobei das dabei entstehende Tropfenspektrum der Flüssig­ keitspartikel im erforderlichen Maße dem Substratverbrauch bzw. dem Nährstoffverbrauch des Fermentationsprozesses anzupassen ist.

Den Substraten und Nährstoffen für den Wachstums- oder Akkumula­ tionsprozeß der Mikroorganismen sind auch solche chemischen Ver­ bindungen gleichzusetzen, welche für die Einstellung des pH-Wer­ tes erforderlich sind. Da die Proteinkonfiguration und -aktivi­ tät vom eingestellten pH-Wert abhängen, sind auch die zellulären Transportvorgänge und biochemischen Reaktionen innerhalb der Zellen und damit gleichfalls die Wachstumsgeschwindigkeit pH- ab­ hängig. Üblicherweise wird für Bakterien ein Maximum der Wachs­ tumsgeschwindigkeit bei einem pH-Wert von 6,5 und 7,5 erreicht.

Solche chemischen Verbindungen können insbesondere sein: Natron­ lauge, Ammoniak, Schwefelsäure und Phosphorsäure.

Die zum Zellaufbau erforderlichen Nährstoffe und Spurenelemente wie Calcium, Stickstoff oder Phosphor werden in technischen Fermentationen bekannterweise als Kaliumphosphate, Ammoniumsul­ fate oder Calciumchloride zugesetzt.

Erfindungsgemäß wird das in feinst zerteilter Form vorliegende flüssige Substrat oder die flüssigen Nährstoffe der dem Fermen­ tationsprozeß zuzuführenden sauerstoffhaltigen Phase zugemischt. Eine solche Mischung ist in seiner Wirkung dann besonders effek­ tiv, wenn zum Zeitpunkt des Eintretens der sauerstoffhaltigen Phase in das Fermentationsmedium diese Stoffe in feinst zerteil­ ter Form zu dieser beigemischt werden. Ist die sauerstoffhaltige Phase Luft, dann erfolgt in bekannter Weise eine Zerstäubung des in flüssiger Form vorliegenden Substrates in die Luft und der gemeinsame Eintrag in den Fermentationsprozeß. Dabei wird die Effizienz des Gesamtverfahrens in bezug auf den Ertragskoeffizi­ enten durch die Intensität der Mischung Substrat-sauerstoffhal­ tige Phase bestimmt. Das Verfahren kann aber auch so durchge­ führt werden, daß unter Nutzung der kinetischen Energie der sauerstoffhaltigen Phase, z. B. der Luft, das Substrat oder die Nährstoffe in feine Flüssigkeitströpfchen zerteilt werden und diese als Mischung mit der Luft (Substratnebel) in die Fermenterlösung fein verteilt eingebracht werden.

Die Geschwindigkeit der Substratversorgung (wie auch der Versor­ gung mit Sauerstoff und Nährstoffen) der frei in der Fermenter­ lösung vorhandenen Mikroorganismen ist auf die Übergangsge­ schwindigkeit durch den Flüssigkeitsfilm an der Grenzfläche Gas­ blase/Fermenterlösung zurückzuführen. Wird die Übergangsfläche vom Gas zur Flüssigkeit vergrößert, z. B. durch das Einleiten sehr kleiner, fein verteilter Gasblasen in die Fermenterlösung, vergrößert sich auch die übergehende Substratmenge. Mit dem gleichzeitigen örtlichen Vorhandensein von Sauerstoff und Sub­ strat in der Fermenterlösung werden Gradienten der Sauerstoff- und der Substratkonzentration vermieden und den Mikroorganismen werden, bezogen auf einen Ort im Fermenter, die zum Wachstum oder Speicherstoffbildung aufeinander abgestimmten Substrat- und Sauerstoffmengen angeboten.

Vorteil dieses Verfahrens ist die Erhöhung des Ertragskoeffi­ zienten des Fermentationsprozesses durch die unmittelbare Regelbarkeit der Substratmenge in bezug auf den Sauerstoffver­ brauch sowie auch die Erhöhung der Stoffaustauschkoeffizienten.

Die Erfindung wird an folgendem Beispiel näher erläutert:
In einem 15-l-Fermenter (7 l Fermentationsvolumen) wird eine Fed-batch-Fermentation mit dem Mikroorganismus Methylobacterium rhodesianum durchgeführt. Der mit der Standardnährlösung ver­ setzte Fermenterinhalt wird bei 32°C und einem pH-Wert = 6,9 mit 600 U/min gerührt. Während der Fermentation erfolgt der Eintrag von 2 l Luft pro min über einen Gasverteiler am Boden des Fermenters.

Die Fermentation wird über 72 h geführt und als Substrat Metha­ nol in flüssiger Form in einer durchschnittlichen Menge von 2,5 g/h pro Liter Fermentationsvolumen zugesetzt.

Bei der herkömmlichen Fermentation mit Zusatz des Methanols am Kopf des Fermenters konnte zum Ende der Fermentation eine Bio­ massetrockensubstanz von durchschnittlich 28,7 g/l erreicht werden.

Mit Zugabe des Methanols, erfindungsgemäß durch Zerstäuben dieses (Tropfengröße < 100 µm) und Einmischen in den Gasvertei­ ler am Boden des Fermenters, wurde bei sonst gleichen Fermenta­ tionsbedingungen eine Biomassetrockensubstanz von durchschnitt­ lich 36,4 g/l erreicht.

Claims (4)

1. Verfahren zur Substratversorgung bei der Kultivierung von Mikroorganismen in einem aeroben Fermentationsprozeß unter Zuführung einer gasförmigen sauerstoffhaltigen Phase und einer oder mehrerer Substrate oder Nährstoffe in flüssiger Form in das Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Substrate oder Nährstoffe in ein Aerosol überführt, dieses der sauerstoffhaltigen Phase beigemischt und die Mischung aus Sauerstoffhaltiger Phase und Substrat oder Nährstoffen in das Kulturmedium eingebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der sauerstoffhaltigen Phase das Substrat oder die Nährstoffe unmittelbar vor Eintritt in das Kulturmedium beigemischt werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat oder die Nährstoffe mittels der sauerstoffhaltigen Phase in ein Aerosol überführt werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die sauerstoffhaltige Phase Luft oder Sauerstoff ist.