DE4435789C1 - Peptide und Fusionsproteine umfassend eine aus dem Leserahmen UL 57 des Cytomegalievirus stammende Aminosäuresequenz und diese enthaltende diagnostische Testkits - Google Patents

Description

Infektionen des Menschen mit dem humanen Cytomegalievirus (HCMV) sind weit verbreitet und verlaufen in der Regel symptomlos während der Kindheit. HCMV-spezifische IgG- Antikörper als Marker für eine abgelaufene/latente Infektion lassen sich je nach getesteter Population bei 50-90% der Erwachsenen feststellen. Congenitale Infektion sowie akute Infektionen bei Immunsupprimierten wie Transplantationspatienten und HIV-Infizierten können zu einer lebensbedrohenden Krankheit führen.

Um eine frühzeitige und effektive antivirale Therapie sicherzustellen, ist es von großem Interesse festzustellen, ob eine akute Infektion vorliegt. Zur Diagnose einer akuten HCMV-Infektion können verschiedene Methoden zur Anwendung kommen. Insbesondere bei Transplantationspatienten, bei denen eine ständige, begleitende Diagnostik möglich ist, haben sich in den letzten Jahren der pp65-spezifische Antigenemietest sowie die PCR aufgrund ihrer überlegenen Sensivität weitgehend durchgesetzt. Im Routinelabor erfolgt die Diagnose einer akuten Infektion, z. B. im Rahmen der viralen Differentialdiagnose bzw. während der Schwangerschaftsvorsorge, in der Regel durch den Nachweis des Erregers in der Zellkultur sowie serologisch durch den Nachweis spezifischer Antikörper, insbesondere im ELISA. Als spezifische Antigene für den Antikörpernachweis werden z. Z. ausschließlich mehr oder weniger gereinigte, schlecht charakterisierte Lysate HCMV-infizierter Zellkulturen verwendet. Dies führt insbesondere beim IgM-Nachweis zu Spezifitäts- bzw. Sensitivitätsproblemen. Es existieren zahlreiche Publikationen, die die diagnostische Relevanz verschiedener rekombinanter Antigene bzw. chemisch synthetisierter Peptide behandeln. Die bisher vorliegenden Ergebnisse sind in M.P. Landini: "Antibody Responses to Human Cytomegalovirus Proteins", Reviews in Medical Virology 2, 63-72 (1992) zusammengefaßt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Peptide und/oder Fusionsproteine bereitzustellen, die für die Diagnostik vorteilhaft sind, sowie Testkits, die diese enthalten und Verfahren zum Nachweis von akuten Infektionen des HCMV.

Für diagnostische Tests sind zwei Aspekte von besonderer Bedeutung. Einerseits müssen die Antigene hochspezifisch sein, d. h. in dem diagnostischen Test muß klar erkennbar sein, daß es sich um den gesuchten Erreger handelt (und nicht um einen anderen Erreger). Andererseits muß der diagnostische Test hochsensitiv sein, d. h. es muß möglichst zuverlässig jede Infektion mit dem gesuchten Erreger nachgewiesen werden können, auch wenn nur verhältnismäßig wenige Antikörper in der zu untersuchenden Probe vorliegen. Falsch positive Ergebnisse sollten möglichst nicht auftreten.

Die einzelnen durch das humane Cytomegalievirus codierten Proteine werden in der Regel durch den Leserahmen, durch den sie codiert sind, gekennzeichnet. Landini (a.a.O.) hat beispielsweise die genomische Lokalisation der verschiedenen bereits bekannten Proteine des HCM-Virus angegeben. Der Leserahmen kann daher der Charakterisierung des Proteins dienen.

Der Leserahmen UL57 des humanen Cytomegalievirus codiert für das sogenannte Major-DNA-binding protein, das ein Molekulargewicht von etwa 130 bis 133 kD aufweist. Anders et al. haben das Protein und den Leserahmen in J. Virology, 62, S. 1364-1372 (1988) charakterisiert. Interessanterweise weist der Leserahmen UL57 eine signifikante Homologie zu den entsprechenden Leserahmen anderer Herpesviren auf, insbesondere zu den Viren HHV-6 und in geringerem Ausmaß zu EBV (Epstein-Barr-Virus). Aufgrund dieser Homologie zu den Leserahmen anderer Viren wäre das durch UL57 codierte Major- DNA-binding protein eigentlich nicht für die Diagnostik prädestiniert, da die Gefahr von Kreuzreaktionen besteht.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde aber überraschend festgestellt, daß ein Bereich aus dem Leserahmen UL57 in besonders vorteilhafter Weise für die Diagnostik verwendet werden kann, da Peptide sowie Fusionsproteine, die diese Aminosäuresequenz aufweisen, in diagnostischen Tests vorteilhafte Ergebnisse ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden drei Fragmente aus dem Leserahmen UL57 bereitgestellt, wobei die beiden Fragmente UL57/1 und UL57/3 mittels Polymerase Kettenreaktion amplifiziert werden konnten und das Fragment UL57/2 wurde mittels chemischer DNA-Synthese bereitgestellt. Diese DNA- Fragmente wurden in einen Expressionsvektor (pGEX-3) umkloniert, der die Expression der viralen Antigene in Form von Fusionsproteinen (mit der Glutathion-S-Transferase (GST)) ermöglicht. Die Fusionsantigene wurden gereinigt und in ELISA-Experimenten mit ausgewählten Seren getestet. Dabei ergab sich überraschenderweise, daß das aus 57 AS bestehende Antigenfragment UL57/3 ein hervorragendes Antigen zum spezifischen und sensitiven Nachweis von IgM-Antikörpern während der akuten HCMV-Infektion ist. Die beiden anderen Fragmente erwiesen sich hingegen als diagnostisch nicht relevant. Da UL57/3 aufgrund seiner geringen Größe nur schwer als Nichtfusionsprotein in E.coli exprimiert werden kann, erfolgte die Expression auch als autologes Fusionsprotein zusammen mit weiteren diagnostisch relevanten HCMV-Antigenfragmenten, die ebenfalls eine spezifische und sensitive IgM-Serodiagnostik gewährleisten. Beim autologen Fusionsprotein 52/3 57/3 erfolgte die Expression C-terminal mit den Aminosäuren 297-433 von p52. Beim autologen Fusionsprotein 52/3 57/3 150/7 wurden am C-terminalen Ende von 57/3 zusätzlich die 54 C-terminalen Aminosäuren von pp150 exprimiert. Außerdem wurde UL57/3 als Peptid chemisch synthetisiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Peptide umfassend eine vom Cytomegalievirus (HCMV) stammende Aminosäuresequenz, die aus dem Leserahmen UL57 des HCM-Virus stammt, wobei dieser Leserahmen für das Major-DNA-binding protein codiert, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine Homologie von wenigstens 60% zu der Aminosäuresequenz

aufweisen.

Bevorzugterweise haben die erfindungsgemäßen Peptide eine Homologie von wenigstens 80% zu der oben dargestellten Aminosäuresequenz. In besonders bevorzugter Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Peptide die oben dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Teilsequenz davon auf. Üblicherweise haben die erfindungsgemäßen Peptide eine Länge von wenigstens 10 Aminosäuren; bevorzugt sind aber Peptide mit einer Länge von wenigstens 25 Aminosäuren und besonders bevorzugt sind Peptide mit einer Länge von wenigstens 49 Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Peptide können durch an sich bekannte chemische Methoden (beispielsweise Festphasensynthese) synthetisiert werden, oder auch durch gentechnische Methoden hergestellt werden.

Die so herstellbaren Fusionsproteine weisen eine Aminosäure­ sequenz eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 auf. In bevorzugter Weise stammt ein Teil des Fusionsproteins von der Glutathion-S-Transferase. Die erfindungsgemäßen Fusions­ proteine können aber auch einen Teil von wenigstens einem an­ deren antigenen Protein des humanen Cytomegalievirus aufwei­ sen. In besonders bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei dem anderen antigenen Protein des humanen Cytomegalievi­ rus um das pp150-Tegumentprotein oder das p52-Protein. Kombi­ nationen von Teilsequenzen der oben erwähnten Proteine sind besonders bevorzugt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Testkits zum Nachweis von Antikörpern, insbesondere IgM-Antikörpern gegen das Cytomegalievirus, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein umfassen. Hierbei handelt es sich bevorzugterweise um Testkits zur Durchführung eines ELISA-Tests.

Die Peptide bzw. Fusionsproteine werden zum Nachweis von Antikörpern, insbesondere IgM-Antikörpern gegen das Cytomegalievirus verwendet, wobei man eine zu untersuchende Probe mit einem erfindungsgemäßen Peptid und/oder einem erfindungsgemäßen Fusionsprotein zusammenbringt und den Antikörper-Peptid-Komplex und/oder den Antikörper- Fusionsprotein-Komplex mit einer Nachweiskomponente detektiert.

Bevorzugterweise ist die Nachweiskomponente ein Antihumanantikörper, der gekoppelt ist mit einem Indikatormolekül, insbesondere Meerrettich-Peroxidase.

Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht dem Fachmann auch die Synthese von Oligonucleotiden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine Sequenz von Oligonucleotiden enthalten, die für eine Aminosäuresequenz codieren, die zumindest einem Teil der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht. Bevorzugt sind die Oligonucleotide 12-30 Basen lang. Üblicherweise handelt es sich hierbei um DNA-Oligonucleotide, die für die Polymerase Kettenreaktion verwendet werden können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff Peptid sowohl Oligo- wie auch Polypeptide. Die Peptide können also von wenigen Aminosäuren (10, insbesondere 20) bis zu verhältnismäßig vielen Aminosäuren umfassen. Die Obergrenze der Anzahl der Aminosäuren bei den erfindungsgemäßen Peptiden liegt bei etwa 150 Aminosäuren, in bevorzugter Ausführungsform bei etwa 100 Aminosäuren.

Unter dem Begriff "Homologie" wird der Grad der Übereinstimmung von zwei DNA- bzw. Aminosäuresequenzen verstanden. 60% Homologie bedeutet beispielsweise, daß 60 von 100 Aminosäure-Positionen in den Sequenzen übereinstimmen. Die Homologie von Proteinen wird durch die Sequenzanalyse bestimmt.

Da das humane Cytomegalievirus bereits verhältnismäßig gut erforscht ist, kann die Sequenz sowie der Leserahmen, der das erfindungsgemäße Peptid umfaßt, mit Hilfe der Veröffentlichung von Chee et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 154, Springer Verlag (1990), S. 126-169, ermittelt werden.

Der Ausdruck Fusionsprotein bedeutet, daß ein Konstrukt bereitgestellt wird, das einerseits eine Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Peptids UL57/3 aufweist und andererseits ein Fragment eines anderen Proteins, insbesondere eines anderen antigenen Proteins, des humanen Cytomegalievirus und/oder ein vom Expressionsvektor stammendes Fragment. In besonders bevorzugter Weise stammen diese weiteren Bestandteile der Fusionsproteine von dem Tegumentprotein pp150 und/oder von dem Protein p52 des Cytomegalievirus. In ganz besonders bevorzugter Form handelt es sich hierbei um die Fragmente, die in der deutschen Patentanmeldung P 44 26 453.4 beschrieben wurden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gefunden, daß sich solche Fusionsproteine gut in E. coli exprimieren lassen, die zumindest einen Teil der Glutathion-S-Transferase (GST) aufweisen. Die Vektoren, mit denen derartige Fusionsproteine bereitgestellt werden können, wurden insbesondere von Vornhagen et al., Journal of Clinical Microbiology, 32, S. 981-986 (1994) beschrieben.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Testkits, die zum Nachweis von Antikörpern gegen humanes Cytomegalievirus geeignet sind und die wenigstens ein erfindungsgemäßes Fu­ sionsprotein aufweisen. In der Diagnostik sind mehrere ver­ schiedene Testmethoden, wie Western Blot, Radio-Immuno-Assay und andere bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung be­ sonders bevorzugt sind solche Testkits, die sich zur Durch­ führung des ELISA-Tests (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) eignen. Bei diesen Tests findet eine Kopplung an eine feste Phase statt. Häufig wird das Antigen, im vorliegenden Fall das Fusionsprotein bzw. Peptid, an eine feste Phase, insbe­ sondere an Mikrotiterplatten gebunden und die freien Bindungsstellen werden abgesättigt. In diese Mikrotiterplatten wird dann die zu untersuchende Probe, meist Serum, eingebracht, inkubiert und gewaschen. Die an die feste Phase gebundenen Antikörper sind dann gegen das nachzuweisende Antigen gerichtet. Diese Antikörper werden in der Regel mit Anti-Human-Immunglobulin-Antikörpern nachgewiesen, an die eine Anzeigekomponente gebunden ist. Als besonders geeignet hat sich hierbei die Meerrettich- Peroxidase erwiesen, die eine Farbreaktion katalysiert, anhand der das Testergebnis abgelesen werden kann.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Testkits wird die zu untersuchende Probe mit einem Fusionsprotein zusammengebracht. Der Antikörper-Fusionsprotein-Komplex kann dann mit einer Nachweiskomponente detektiert werden. Durch die erfindungsgemäßen Fusionsproteine bzw. Peptide werden Antigene bereitgestellt, die eine hohe Sensitivität, gleichzeitig aber eine hohe Spezifität aufweisen. Mit den erfindungsgemäßen Peptiden bzw. Fusionsproteinen wird daher nur eine geringe IgM-Reaktivität mit Seren gesunder Blutspender erhalten. Es ist also mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptide bzw. Fusionsproteine möglich, einen Test für IgM-Antikörper durchzuführen, der mit einer hinreichenden Sensitivität nachweist, ob eine akute Infektion vorliegt und, der gleichzeitig das Auftreten von klinisch nicht relevanten oder gar von falsch positiven Ergebnissen erheblich verringert, wenn nicht gar ausschließt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgte die Evaluierung der Antigene mit:

• a) unselektionierten Seren gesunder Blutspender ohne Anzeichen einer akuten HCMV-Infektion. Die Einteilung der Seren in HCMV-positiv/-negativ erfolgte mit einem Paul- Ehrlich-Institut-zugelassenen anti-CMV IgG ELISA (Biotest), siehe Tab. 3
• b) ausgesuchten Seren immunkompetenter (funktionierendes Im­ munsystem) Individuen mit akuter HCMV-Infektion, dokumen­ tiert durch ein positives Ergebnis in der Virusisolierung und/oder durch IgG-Serokonversion (siehe Tab. 1)
• c) ausgesuchten Seren von Transplantationspatienten mit akuter HCMV-Primärinfektion, siehe Tab. 2. Der Nachweis der akuten Infektion erfolgte mit Hilfe des pp65- spezifischen Antigenemietests.

Abb. 1 zeigt die zur Klonierung der verschiedenen Fragmente verwendeten Primer bzw. Oligonucleotide für die Polymerase Kettenreaktion (PCR).

Abb. 2 zeigt die DNA-Sequenz und die daraus resultierende Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Peptids aus dem Leserahmen UL57, das die Bezeichnung UL57/3 erhalten hat.

Abb. 3 zeigt die DNA und die daraus resultierende Aminosäuresequenz des autologen Fusionsproteins mit der Kurzbezeichnung 52/3 57/3. Der andere Teil des Fusionsproteins stammt von dem antigenen Protein p52 des humanen Cytomegalievirus.

Abb. 4 zeigt die DNA und die daraus resultierende Aminosäuresequenz des autologen Fusionsproteins 52/3 57/3 150/7/2. Dieses Fusionsprotein enthält neben der Sequenz des erfindungsgemäßen Peptids jeweils einen Teil des antigenen Proteins p52 und des Tegumentproteins pp150.

Abb. 5 stellt in Tabelle 1 die IgM-Reaktivität mit verschiedenen Seren immunkompetenter Individuen mit akuter HCMV-Infektion dar. Bei den Patientenseren handelt es sich um solche Patienten, die über ein funktionierendes Immunsystem verfügen und eine akute HCMV-Infektion haben.

Abb. 6 zeigt in Tabelle 2 die IgM-Reaktivität mit Seren von Transplantationspatienten mit akuter HCMV- Primärinfektion. Transplantationspatienten verfügen regelmäßig nicht über ein voll funktionierendes Immunsystem, da in Zusammenhang mit der Transplantation regelmäßig Immunsuppressiva verabreicht werden.

Abb. 7 zeigt in Tabelle 3 die IgM-Reaktivität der rekombinanten Antigene mit den Seren gesunder Blutspender, die unterteilt wurden einmal in CMV-seropositive und andererseits in CMV-seronegative. Die Unterscheidung in Seropositivität bzw. Seronegativität erfolgte durch die Bestimmung der IgG-Antikörper. Vorteilhaft bei den erfindungsgemäßen Peptiden bzw. Fusionsproteinen ist, daß praktisch keine falsch positiven Ergebnisse erhalten wurden.

Abb. 8 zeigt in Tabelle 4 eine kurze Charakterisierung der erfindungsgemäßen Antigene. Die Abkürzung GST bedeutet hierbei, daß der andere Bestandteil des Fusionsproteins von der Glutathion-S-Transferase herstammt. Die Abkürzung P bedeutet, daß es sich um ein chemisch synthetisiertes Peptid handelt.

Die Daten zeigen deutlich, daß von den getesteten UL57- Fragmenten insbesondere UL57/3 diagnostisch relevant ist. Dieses Antigenfragment zeigte mit Seren von Personen mit akuter HCMV-Infektion eine extrem hohe IgM-spezifische Reaktivität. Die Zahl der reaktiven Proben war bei den Immunkompetenten (Tab. 1) wie auch bei den Transplantationspatienten (Tab. 2) gleich bzw. höher als mit den rekombinanten Antigenen 150/7 und 52/3. Diese Antigene hatten sich in einer vorangegangenen Evaluierung als besonders geeignet für den Nachweis akuter HCMV-Infektionen erwiesen. Mit Seren gesunder Blutspender zeigte sich hingegen eine sehr geringe IgM-Reaktivität. Bei der Austestung der autologen Fusionsproteine ergaben sich bei beiden Kollektiven der akut-Infizierten eine gleiche Anzahl an positiven Ergebnissen. Lediglich bei der Höhe der Reaktivität konnten individuelle Unterschiede festgestellt werden. Eine etwas geringere IgM-spezifische Prevalenz war beim chemisch synthetisierten Peptid 57/3-P festzustellen. Zusammenfassend ist festzustellen, daß das mit UL57/3 bezeichnete Antigenfragment hervorragend zur IgM-spezifischen Serodiagnostik akuter HCMV-Infektionen geeignet ist.

Beispiel 1 PCR-Amplifikation und Klonierung des Fragmentes UL57/3

Ausgehend vom Cosmid-Klon PCM1029 (Fleckenstein, B., I. Mueller and J. Collins. 1982, Cloning of the complete human cytomegalovirus in cosmids. Gene 18, 39-46), der die Gesamtsequenz von UL57 enthält, erfolgte eine PCR- Amplifikation des Teilfragmentes UL57/3, das für die Aminosäuren 545-601 des Leserahmens UL57 codiert, mit Hilfe der Primer PCCUL577.seq und PCCUL578.seq (Abb. 1). Beide Primer besitzen zusätzlich zum UL57 komplementären Bereich Überhänge, die bestimmte singuläre Restriktionsschnittstellen enthalten, d. h. PCCUL578.seq: EcoRI, PCCUL577.seq: BamHI. Diese Schnittstellen ermöglichen die gerichtete Klonierung des Amplifikats. Die PCR-Amplifikation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 100 µl, bestehend aus 10 µl Reaktionspuffer (Perkin-Elmer Cetus), 200 µM der 4 Desoxynucleotide, 0,5 µM beider PCR-Primer, 50-100 ng der Ausgangs-DNA sowie 2,5 Units der AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus). Die Amplifikation wurde im Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler in 25 Zyklen bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 min -55°C, 1 min -72°C, 1 min 94°C. Der PCR-Reaktionsansatz wurde in einer Submarine-Agarose Gelkammer in einem 1,2%igen Agarosegel (Ultra Pure Agarose, BRL), das 0,5 µg/ml Ethidiumbromid enthält, unter Verwendung eines TBE- Laufpuffers (0,089M Tris/Borat, 0,002M EDTA) elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wurde das amplifizierte DNA-Fragment mit einer UV-Leuchte bei 364 nm sichtbar gemacht und der Gelbereich, der die entsprechende Bande enthielt, mit einem Skalpell herausgeschnitten. Die Elution der DNA aus dem Gelfragment erfolgte mittels einer Biotrap Kammer (Schleicher & Schüll), entsprechend der Vorschrift des Herstellers. Daran schloß sich eine zusätzliche Aufreinigung der DNA mit einer Elutip D-Säule (Schleicher & Schüll), entsprechend der Gebrauchsanweisung des Herstellers, an.

Das so gereinigte und getrocknete DNA-Fragment wurde in 80 µl aqua dest gelöst. Nach Zugabe von 10 µl NEBuffer 4 (New England Biolabs) erfolgte ein BamHI/EcoRI- Verdau durch Zugabe von jeweils 100 U beider Enzyme. Nach 2 Stunden folgte eine Phenol-Extraktion, mit anschließender Ethanolprezipitation. 100 ng des so vorbereiteten DNA- Fragments wurden mit 200 ng BamHI/EcoRI-behandeltem DNA des Standardvektors pUC8 für 16 h bei 4°C ligiert und anschließend damit E.coli JM109 transformiert. Die Ausplattierung des Transformationsansatzes erfolgte auf mit Ampicillin (50 µg/ml) und X-Gal(30 µg/ml) versetzten Agarplatten. Weiße Kolonien wurden in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin überimpft und für 12-16 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte ein EcoRI/BamHI Restriktionsverdau und eine Elektrophorese im Agarosegel. Ein Klon, bei dem sich ein zusätzliches DNA-Fragment der erwarteten Größe zeigte, erhielt den Namen pUC8/PCCUL57/3 und wurde zur weiteren Klonierung verwendet.

Beispiel 2 PCR-Amplifikation und Klonierung des Teilfragmentes UL57/1

Ausgehend vom Klon PCM1029 (s. Beispiel 1) erfolgte die PCR- Amplifikation des Fragmentes UL57/1, das für die Aminosäuren 755-1000 des Leserahmens UL57 codiert, mit Hilfe der Primer PCCUL571.seq und PCCUL572.seq und die spätere Klonierung des amplifizierten Fragments wie oben beschrieben. Der entsprechende Klon wurde als puc8/PCCUL571 bezeichnet.

Beispiel 3 Klonierung des Teilfragmentes UL57/2

Bei diesem Teilfragment war eine PCR-Amplifikation trotz mehrfacher Modifikation der Primer nicht möglich gewesen. Aus diesem Grunde wurde die zu klonierende Ausgangs-DNA chemisch synthetisiert. Dazu wurde die Aminosäuresequenz des Fragments mittels des Computerprogramms der Fa. DNASTAR in DNA übersetzt, wobei lediglich Codons stark exprimierter E.coli- Gene verwendet wurden. Durch geringfügige Modifikation der DNA-Sequenz wurden, ohne die AS-Sequenz zu verändern, singuläre Restriktionsschnittstellen eingeführt, um die Klonierung der chemisch synthetisierten Oligonukleotidpaare zu ermöglichen.

Die Synthese der Oligonukleotide erfolgte auf einem DNA- Synthesizer 381A der Fa. Applied Biosystems, die anschließende Aufreinigung der Oligonukleotide, unter Verwendung der OPC-Cartridges (Applied Biosystems), nach den Anweisungen des Herstellers.

Je 10 ng der Oligonukleotide HC572SY1.Seq und HC572SY2.SEQ wurden mit ca. 200 ng des mittels der Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII geöffneten Vektors pUC8 für 16 h bei 4°C ligiert und anschließend damit E.coli JM109 transformiert. Die Ausplattierung auf X-Gal/Ampicillin-haltigen Agarplatten sowie die Anzucht der Kolonien erfolgte wie oben beschrieben. Nach Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte ein Restriktionsverdau mit PstI; diese Schnittstelle war durch das erste Oligonukleotidpaar neu eingeführt worden. Ein Klon, der eine Liniarisierung zeigte, wurde für die weiteren Experimente verwendet. Die DNA dieses Klons wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI behandelt und mit je 10 ng der Oligonukleotide HC572SY3.SEQ und HC572SY4.SEQ ligiert. Transformation, Ausplattierung und Isolierung erfolgten wie oben beschrieben. Ein Klon, der nach Restriktionsverdau mit BsgI liniarisiert worden war, wurde für den dritten Klonierungsschritt verwendet. Dieser wurde nach Restriktionsverdau mit BsgI und EcoRI mit dem Oligonukleotiden HC572SY5.SEQ und HC572SY6.SEQ wie oben beschrieben durchgeführt. Ein Klon, der mit Hilfe von AvaI liniarisiert worden war, wurde mit pUC8/UL57/2 bezeichnet und für die weiteren Arbeiten verwendet.

Beispiel 4 Klonierung der Fragmente UL57/1-3 in den Expressionsvektor pGEX-3X

Um die Expression der Antigenfragmente UL57/1-3 in Fusion mit dem heterologen Protein Glutathion-S-transferase (GST) zu gewährleisten, erfolgt die Umklonierung in den Expressionsvektor pGEX-3X (Smith, D. B., and K. S. Johnson. 1988. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione-S-transferase. Gene 67, 31-40). Dieser Vektor besitzt eine BamHI- Schnittstelle am 3′ Ende des für GST kodierenden Gens. Der Leserahmen der BamHI-Schnittstelle stimmt mit denen der kodierenden Fragmente der Klone pUC8/UL57/1-3 überein. 100 mg der mittels EcorRI- und BamHI-Restriktionsverdau aus pUC8/UL57/1, pUC8/UL57/2 und pUC8/UL57/3 freigesetzten DNA- Fragmente wurden mit 200 ng des mit den gleichen Restriktionsenzymen geöffneten Vektors pGEX-3X für 16 h bei 4°C ligiert. Danach folgt eine Transformation mit E. coli JM109 und eine Ausplattierung auf Ampicillin-haltigen Platten. Isolierte Kolonien wurden in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin überimpft und 16 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte ein BamHI/EcoRI-Restriktionsverdau. Klone mit Inserts der zu erwartenden Größe wurden mit pGEX-3/UL57/1, pGEX-3/UL57/2 und pGEX-3/UL57/3 bezeichnet und für die Expression der UL57- Fragmente als GST-Fusionsproteine verwendet.

Beispiel 5 Klonierung der autologen Fusionsproteine 52/3 57/3 und 52/3 57/3 150/7/2

• a) Ausgehend vom Klon pUC8/PCC52/3 - das klonierte Fragment kodiert für AS 297-433 von p52 - erfolgte eine PCR- Amplifikation mit Hilfe der Primer PCC525.seq und PCC526.seq und die spätere Klonierung des amplifizierten Fragments wie oben beschrieben. Aufgrund der Überhänge der beiden hier verwendeten Primer besitzt das amplifizierte Fragment am 5′- Ende eine BamHI und am 3′-Ende jeweils eine BgIII- und EcoRI- Schnittstelle. Der entsprechende Klon wurde als pUC8/PCCS2/3F bezeichnet.
• b) Mit DNA des Klons pUC8/UL57/3 erfolgte ein Restriktionsverdau mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI. 200 ng des so geöffneten Vektors wurden mit je 10 ng der beiden Oligonukleotide UL57F3.SEQ und UL57F4.SEQ ligiert und anschließend damit E.coli JM109 wie oben beschrieben transformiert. Isolierte Kolonien wurden wie oben beschrieben in LB-Medium angeimpft und inkubiert. Nach Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte ein Restriktionsverdau mit BgIII, mit anschließender Agarosegel-Elektrophorese. Ein Klon, der eine Liniarisierung als Nachweis der Integration der beiden Oligonukleotide zeigte, wurde mit pUC8/UL57/3F bezeichnet und für die weiteren Klonierungsarbeiten verwendet.
• c) Mit DNA des Klons pUC8/UL57/3F erfolgte ein Restriktionsverdau mit BamHI und EcoRI. Das dabei freigesetzte Fragment von ca. 200 bp wurde mit Hilfe einer Agarose-Elektrophorese isoliert, und wie oben beschrieben aus dem herausgeschnittenen Gelstück eluiert. Ca. 50 ng dieses DNA-Fragmentes wurden dann mit 200 ng des mit BgIII und EcoRI geöffneten und ebenfalls mittels Elektrophorese gereinigten Vektors puC8PCC52/3F ligiert. Daran schloß sich eine Transformation mit E.coli JM109 und eine Ausplattierung auf Ampicillin-enthaltenden Agarplatten an. Isolierte Kolonien wurden in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin überimpft und 12-16 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte ein BamHI/EcoRI-Restriktionsverdau, mit anschließender Elektrophorese im Agarosegel. Ein Klon mit einem Insert der erwarteten Größe wurde als pUC8/52/3 UL57/3 bezeichnet und für die weiteren Experimente verwendet. Bei dieser Vorgehensweise wird ausgenutzt, daß die Erkennungssequenzen von BamHI und BgIII die gleichen Überhänge besitzen, wodurch eine Ligation ermöglicht wird. Beide Schnittstellen gehen jedoch nach erfolgter Ligation verloren. Der Übergang von 52/3F zu UL57/3 ist so gewählt, daß eine Translation im gleichen Leserahmen möglich ist.
• d) Mit DNA des Klons pUC8/PCC150/7/2 - dieser Klon enthält ein für die Aminosäuren 994-1048 des HCMV-Antigens pp150 codierendes Teilfragment - erfolgt ein Restriktionsverdau mit BamHI und EcoRI. Das so freigesetzte Fragment von ca. 170 bp wird wie oben beschrieben elektrophoretisch gereinigt. 50 ng des gereinigten Fragments werden mit 200 ng des mit BgIII und EcoRI behandelten Vektors pUC8/52/3 57/3 bei 4°C für 16 h ligiert und damit E.coli JM109 transformiert. Die Ausplattierung erfolgte auf ampicillinhaltigen Agarplatten. Isolierte Kolonien wurden in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin überimpft und 12-16 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte ein BamHI/EcoRI Restriktionsverdau, mit anschließender Elektrophorese im Agarosegel. Ein Klon mit einem Insert der erwarteten Größe wurde mit pUC8/52/3 57/3 150/7/2 bezeichnet und für die weiteren Arbeiten verwendet.
• e) Um die Expression des autologen Fusionsproteins zu gewährleisten, erfolgte die Umklonierung der entsprechenden DNA-Fragmente in den Vektor pET5c, der den starken T7- Promotor des Gens 10 des Bakteriophagen T7 besitzt. Dahinter besitzt dieser Vektor eine Ribosomenbindungstelle und ein Startcodon in entsprechendem Abstand. Hinter dem Startcodon liegt ein Leserahmen von 11 Aminosäuren des Gens 10 des Bakteriophagen T7 und eine BamHI- und eine EcoRI-Schnittstelle. Das Leseraster der BamHI-Schnittstelle stimmt mit der der oben beschriebenen autologen Fusionsproteine überein. 100 ng der mittels EcoRI- und BamHI- Restriktionsverdau aus pUC8/52/3 UL57/3 und pUC8/52/3 57/3 150/7/2 freigesetzten DNA-Fragmente wurden mit 200 ng des mit den gleichen Restriktionsenzymen geöffneten Vektors für 16 h bei 4°C ligiert. Danach folgte eine Transformation mit E.coli JM109 und eine Ausplattierung auf Ampicillin-haltigen Platten. Isolierte Kolonien wurden in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin überimpft und 16 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte ein BamHI/EcoRI-Restriktionsverdau. Klone mit Inserts der zu erwartenden Größe wurde als pET5a/52/3 UL57/3 bzw. pET5c/52/3 57/3 150/7/2 bezeichnet. Um die Expression des rekombinanten Proteins zu gewährleisten, wurde DNA der Expressionsklone in den chloramphenicolresistenten Expressionsstamm BL21(DE3)pLysS transformiert. Jeweils einer der resultierenden Klone wurde für die weiteren Arbeiten verwendet.

Beispiel 6 Chemische Synthese des Peptids UL57/3P und seine Reinigung

Die Synthese des Peptids UL57/3P erfolgte entsprechend der in Abb. 2 festgehaltenen Aminosäuresequenz mit einem Millipore 9050 continuous flow peptide synthesizer (Millipore Corp., Milford, MA, USA), unter Verwendung der 9- Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Chemie. Die Synthese erfolgte mit 1000 mg des Trägermaterials (PEG-PS resin) und 0.8 mmol des jeweiligen, aktivierten Aminosäureesters. Abspaltung vom Trägermaterial und Schutzgruppenentfernung erfolgte in einer 12stündigen Inkubation, in einem Gemisch aus 88% Trifluoressigsäure, 5% Phenol (flüssig), 2% Triisopropylsilan und 5% aqua dest. Freies Peptid wurde mehrfach mit eiskaltem Äther präzipitiert und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Reinigung erfolgte mittels präperativer Reversed-Phase HPLC an einer C4-Säule (25 × 100 mm, 15 µm, 300A, Delta-Pak, Waters, Millipore Corp.) unter Verwendung eines Gradienten von 0-60% Acetonitril in 0,1% TFA. Die gesammelten Fraktionen wurden lyophilisiert und mittels Reversed-Phase HPLC und SDS-PAG-Elektrophorese analysiert. Fraktionen, die reines Peptid enthielten, wurden für die Evaluierung im ELISA verwendet.

Beispiel 7 Anzucht, Expression und Aufreinigung von UL57/1-GST, UL57/2- GST und UL57/3-GST

Mit einer isolierten Kolonie auf einer Agarplatte der Klone pGEX-3/UL57/1-3 (LB/AMP Medium) wurden 150 ml LB/AMP-Medium angeimpft. Die Kultivierung erfolgte in einem 1 l EMK, bei 37°, im Rundschüttler bei 160 Upm für 16 h.

Die Anzucht der 3 l Kultur erfolgte in 6 Parallelansätzen zu je 0.5 l in 2 l EMK mit Schikanen. Das Medium (LB/,AMP) war auf 37° vortemperiert. Die Kolben wurden inokuliert mit je 20 ml der Vorkultur (1 : 26) und inkubiert bei 37°C und 160 Upm im Rundschüttler. Das Wachstum wurde kontinuierlich verfolgt durch Messung der Absorption A bei 600 nm. Bei einer A (600 nm) von 0.7 wurde induziert durch Zugabe von IPTG (Endkonz. 1 mM).

Die Ernte erfolgte 4 h nach Induktion durch Zentrifugation (6 × 1 l-Becher, 4000 g, 0-4°C, 30 min). Die gut abgetropften Bakterienpellets wurden in 200 ml eiskaltem PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (2 × 250 ml-Becher, 5000 g, 0-4°, 10 min). Die gut abgetropften Pellets wurden eingefroren und gelagert bei -20 bis -30°C.

Nach Auftauen der Bakterienpellets wurden diese in 80 ml Basis-Puffer (Tris-HCl/20mM/pH7.5) resuspendiert und anschließend homogenisiert (Teflon/Glas-Potter- Homogenisator). Unter Rühren bei Raumtemperatur wurden folgende Additive zugegeben: NP-40 (0.1%), PMSF (0.1 mM), Pefabloc (0.1 mM), EDTA (50 mM) und Lysozym (100 mg). Das Gesamtvolumen betrug 100 ml. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur stark gerührt und nach 60 min auf Eis gestellt. Alle weiteren Schritte erfolgten auf Eis bzw. gekühlt. Nach der Inkubation wurde Glycerin (10%) und 2- Mercaptoethanol (14 mM) zugegeben und vermischt. Das Volumen wurde mit Basis-Puffer auf 140 ml eingestellt. Der Lyseansatz wurde anschließend sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"), gefolgt von maschinellem Pottern (Teflon/Glas-Potter-Homogenisator, 1000 UpM, 6 Stöße). Bei den Klonen pGEX-3/UL57/1 und pGEX/UL57/2 wurde solubilisiertes Material durch Zentrifugation abgetrennt (1 × 250 ml- Becher, 10 000 g, 10 min, 0-4°C) und verworfen.

Beim Klon pGEX-3/UL57/3 wurde nichtsolubilisiertes Material durch Zentrifugation abgetrennt (4 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 30 min, 0-4°C) und verworfen.

Das nach der Lyse nicht solubilisierte Material (Pellet) des Klons pGEX-3/UL57/1 wurde in 50 ml Waschpuffer 1 (Tris-HCl/ 100 mM/pH9/10% Glycerin/0.5% NP-40/14 mM 2- Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas-Potter- Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (2 × 50 ml-Becher, 33 000 g, 20 min, 0-4°C) und verworfen.

Das nicht solubilisierte Material (Pellets) wurde in 30 ml Waschpuffer 2 (Glycin-HCl/100 mM/pH3/14 mM 2- Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas-Potter- Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 20 min, 0-4°C) und verworfen.

Das nicht solubilisierte Material (Pellet) wurde in 30 ml Waschpuffer 3 (Tris-HCl/20 mM/pH9/4 M Harnstoff/14 mM 2-Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas- Potter-Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 30 min, 0-4°C) und verworfen.

Das nach dem 3. Wasch-Schritt unlösliche Material (Pellet) wurde in 30 ml Solubilisierungspuffer (Tris-HCl/20 mM/ pH 9/8 M Harnstoff/14 mM 2-Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas-Potter-Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Weiterhin unlösliches Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 30 min, 8-10°C) und verworfen.

Das solubilisierte Protein wurde über SQ-Sepharose (HiLoad) chromatographiert. Dabei wurde eine Säule der Dimension 1.6 × 10 cm (20 ml) verwendet. A (280 nm) und Leitfähigkeit wurden kontinuierlich registriert. Der Fluß betrug 5 ml/min, Säulenpuffer = Solubilisierungspuffer. Nach Probenauftrag, gefolgt von 50 ml Säulenpuffer, wurde ein zunächst flacher, linearer NaCl-Gradient (dC/dV = 2.5 mM/ml, bis 500 mM) in Säulenpuffer, gefolgt von einem steilen, linearen NaCl- Gradient (dC/dV= 10mM/ml, bis 1000 mM) angelegt. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen zerlegt und eingefroren. Die Antigen-enthaltenden Fraktionen fanden sich im Bereich des flachen Gradienten. Der Nachweis erfolgte durch SDS-PA-Disc- Elektrophorese, mit anschließender Coomassie-Färbung.

Die Fraktionen, die nachweislich reines Antigen enthielten (Coomassie-Gel), wurden aufgetaut, vereint und mit gleichem Volumen an Renaturierungspuffer (Tris-HCl/100 mM/pH9/ 10% Glycerin/14 mM 2-Mercaptoethanol) verdünnt (Erniedrigung der Harnstoffkonzentration auf 4 M). Alle weiteren Schritte erfolgten in einer (Ultrafiltrationsrührzelle (Membran = Omega 50) unter Eiskühlung und Stickstoff-Atmosphäre. Die Proteinlösung wurde zunächst auf ca. 30 ml konzentriert und mit Renaturierungspuffer langsam auf das doppelte verdünnt.

Weitere Konzentrierungen erfolgten jeweils auf die Hälfte des Ausgangsvolumens, gefolgt von Verdünnungen im Verhältnis 1 : 1 mit Renaturierungspuffer. Dabei wurde die Harnstoffkonzentration in Stufen abgesenkt: 4 M-2 M-1 M- 0.5 M-0.25 M.

Die Endkonzentration an Harnstoff betrug maximal 0.25 M. Das Retentat wurde der Kammer entnommen und aliquotiert eingefroren und gelagert bei -60 bis -80°C.

Das nach der Lyse nicht solubilisierte Material (Pellet) des Klons pGEX-3/UL57/2 wurde in 50 ml Waschpuffer 1 (Tris-HCl/ 100 mM/pH9/10% Glycerin/0.5% NP-40/14 mM 2- Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas-Potter- Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (2 × 50 ml-Becher, 33 000 g, 20 min, 0-4°C) und verworfen.

Das nicht solubilisierte Material (Pellets) wurde in 30 ml Waschpuffer 2 (Glycin-HCl/100 mM/pH3/14 mM 2- Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas-Potter- Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 20 min, 0-4°C) und verworfen.

Das nicht solubilisierte Material (Pellet) wurde in 30 ml Waschpuffer 3 (Tris-HCl/20 mM/pH9/4 M Harnstoff/14 mM 2-Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas-Potter- Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 30 min, 0-4°C) und verworfen.

Das nach dem 3. Wasch-Schritt unlösliche Material (Pellet) wurde in 30 ml Solubilisierungspuffer (Tris-HCl/20 mM/ pH9/8 M Harnstoff/14 mM 2-Mercaptoethanol) vorhomogenisiert (Teflon/Glas-Potter-Homogenisator) und sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Weiterhin unlösliches Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 30 min, 8-10°C) und verworfen.

Das solubilisierte Fusionsprotein wurde mit gleichem Volumen an Renaturierungspuffer verdünnt (Erniedrigung der Harnstoffkonzentration auf 4 M). Alle weiteren Schritte erfolgten in einer Ultrafiltrationsrührzelle (Membran = Omega 50) unter Eiskühlung und Stickstoff-Atmosphäre. Die Proteinlösung wurde jeweils auf die Hälfte des Ausgangsvolumens konzentriert und wieder mit Renaturierungspuffer langsam verdünnt. Dabei wurde die Harnstoffkonzentration in Stufen abgesenkt: 4 M-2 M-1 M- 0.5 M-0.25 M. Die Endkonzentration an Harnstoff betrug maximal 0.25 M. Das Retentat wurde der Kammer entnommen und aliqotiert eingefroren und gelagert bei -60 bis -80°C.

Das lösliche Protein des Klons pGEX-3/UL57/3 wurde über GSH- Sepharose-4B (Pharmacia) chromatographiert. Dabei wurde eine Säule der Dimension 2.6 × 10 cm (50 ml) verwendet. A (280 nm) wurde kontinuierlich registriert.

Der Fluß betrug 2 ml/min. Säulenpuffer = Tris-HCl/20 mM/ pH7.5/1.4 mM Mercaptoethanol. Nach erfolgtem Probenauftrag wurde solange mit Säulenpuffer nachgespült, bis der Schreiber die Basislinie wieder erreicht hatte. Das GST-Protein wurde mit 5 mM Glutathion (GSHred.) in Säulenpuffer eluiert. Das GSH wurde unmittelbar vor der Verwendung gelöst. Das GSH- Eluat (vom Schreiber registrierter Absorptionspeak) wurde gesammelt und aliquotiert eingefroren und gelagert bei -60 bis -80°C.

Beispiel 8 Anzucht, Expression und Aufreinigung des autologen Fusionsproteins 52/3 57/3

Ausgehend von einer Plattenkolonie (LB/CA, AMP) des Klons pET5c 52/3 57/3 wurde eine 15 ml Kultur (LB/CA, AMP) bei 37°C im Rundschüttler bis zu einer A (600 nm) = 1.8-2.0 angezogen. Die Kultur wurde dann vermischt mit Glycerin (87%), bis zu einer Endkonzentration von 15% (v/v). Die Kultur wurde in 0.1 ml-Portionen eingefroren und gelagert bei -60 bis -80°C.

Ein gefrorenes Aliquot der Vorkultur wurde rasch aufgetaut und in 150 ml LB/CA, AMP-Medium einpipettiert. Die Kultivierung erfolgte in einem 1 l EMK, bei 28°C, im Rundschüttler bei 100 Upm, für 16 h.

Die Anzucht der 6 l Kultur erfolgte in 12 Parallelansätzen zu je 0.5 l in 2 l EMK mit Schikanen. Das Medium (LB/CA, AMP) war auf 37°C vortemperiert. Die Kolben wurden inokuliert mit je 10 ml der Vorkultur (1 : 51) und inkubiert bei 37°C und 160 Upm im Rundschüttler. Das Wachstum wurde kontinuierlich verfolgt, durch Messung von A (600 nm). Bei einer A (600 nm) von 0.6 wurde induziert, durch Zugabe von IPTG (Endkonz. 1 mM).

Die Ernte erfolgte 3 h nach Induktion durch Zentrifugation (6 × 1 l-Becher, 4000 g, 0-4°C, 30 min). Die gut abgetropften Bakterienpellets wurden in 200 ml eiskaltem PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (2 × 250 ml-Becher, 5000 g, 0-4°C, 10 min). Die gut abgetropften Pellets wurden eingefroren und gelagert bei -20 bis -30°C.

Die eingefrorenen Bakterienpellets wurden aufgetaut und resuspendiert in 160 ml Basis-Puffer (Tris-HCl/20 mM/ pH7.5) und anschließend mit einem (Teflon/Glas-Potter- Homogenisator) homogenisiert. Unter Rühren bei Raumtemperatur wurden folgende Additive zugegeben: NP-40 (0.05%), PMSF (0.2 mM), Pefabloc (0.2 mM), EDTA (50 mM) und Lysozym (50 mg). Das Gesamtvolumen betrug 200 ml. Der Ansatz wurde nach Lysozymzugabe sofort auf Eis gestellt. Alle weiteren Schritte erfolgten auf Eis bzw. gekühlt. Nach der Inkubation wurde Glycerin (10%) und 2-Mercaptoethanol (14 mM) zugegeben und vermischt. Das Volumen wurde mit Basis-Puffer auf 280 ml eingestellt. Der Lyseansatz wurde anschließend sonifiziert (20 kHz, pulsierend, 5 min, Titanrüssel 3/4"). Nicht solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation entfernt (2 × 250 ml-Becher, 27 000 g, 30 min, 0-4°C). Die Pellets wurden verworfen.

Dem Überstand wurde unter Rühren im Eisbad festes, fein gemörsertes Ammoniumsulfat langsam zugegeben (innerhalb 15 min) bis zu einer Konzentration von 30% Sättigung. Es wurde noch 15 min weiter gerührt. Anschließend wurde zentrifugiert (2 × 250 ml-Becher, 27 000 g, 30 min, 0-4°C). Die Pellets wurden verworfen. Der Überstand wurde erneut mit Ammoniumsulfat versetzt, bis zu einer Konzentration von 43% Sättigung und wie vorher zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Pellets wurden resuspendiert in 25 ml Tris-HCl/20 mM/pH8.5, der zusätzlich 2-Mercaptoethanol (14 mM), Pefabloc (0.1 mM) und Glycerin (10%) enthielt, eingefroren und über Nacht gelagert bei -20° bis -30°C.

Die mit Ammoniumsulfat (30-43%) fraktionierte Protein-Lösung wurde aufgetaut, und präzipitiertes Protein wurde entfernt durch Zentrifugation (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 30 min, 0-4°C). Der Überstand wurde über eine Sephadex G-25 (coarse) Säule (Volumen mindestens 200 ml) chromatographiert, wobei A (280 nm) und die Leitfähigkeit im Durchfluß gemessen wurden. Säulenpuffer = Tris-HCl/20 mM/pH8.5 mit 2-Mercaptoethanol (1.4 mM), Pefabloc (0.02 mM) und Glycerin (10%). Das Protein im Ausschlußvolumen wurde vollständig gesammelt und direkt weiter chromatographiert.

Das Sephadex G-25 Eluat wurde über SP-Sepharose (Fast Flow) chromatographiert. Dabei wurde eine Säule der Dimension 2.6 × 12 cm (60 ml) verwendet. A (280 nm) und Leitfähigkeit wurden kontinuierlich registriert. Der Fluß betrug 5 ml/min. Säulenpuffer = Tris-HCl/20 mM/pH8.5 mit 2-Mercaptoethanol (1.4 mM), Pefabloc (0.02 mM) und Glycerin (10%). Nach Probenauftrag, gefolgt von 100 ml Säulenpuffer, wurde ein linearer NaCl-Gradient (dC/dV = 1.2 mM/ml, bis 500 mM) in Säulenpuffer angelegt. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen zerlegt und eingefroren. Die Antigen-enthaltenden Fraktionen fanden sich im Bereich zwischen 200-300 mM NaCl. Der Nachweis erfolgte durch SDS-PA-Disc-Elektrophorese mit anschließender Coomassie-Färbung.

Die Fraktionen, die nachweislich intaktes Antigen (28.8/27.5 kD Banden) enthielten (Coomassie-Gel), wurden aufgetaut, vereint, mit Glycerin versetzt (20%) und mittels Ultrafiltration (Rührzelle, Eisbad, Membran = Omega 30) konzentriert bis zu einem Endvolumen von ca. 5 ml. Das Retentat wurde der Kammer entnommen und anschließend chromatographiert.

Der konzentrierte SP-Sepharose-Pool wurde über Superdex 75 (prep grade) chromatographiert. Dabei wurde eine HiLoad-Säule der Dimension 2.6 × 60 cm (300 ml) verwendet. A (280 nm) und Leitfähigkeit wurden kontinuierlich registriert. Der Fluß betrug 2 ml/min. Säulenpuffer = Basispuffer mit NaCl (0.5 M), Glycerin (20%), 2-Mercaptoethanol (1.4 mM), EDTA (1 mM), PMSF (0.1 mM) und Pefabloc (0.02 mM). Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen zerlegt und eingefroren. Die Antigen- enthaltenden Fraktionen fanden sich im 2. Absorptionspeak. Der Nachweis erfolgte durch SDS-PA-Disc-Elektrophorese mit anschließender Coomassie-Färbung.

Die Fraktionen, die nachweislich intaktes und reines Antigen enthielten (Coomassie-Gel), wurden aufgetaut, vereint und mittels Ultrafiltration (Rührzelle, Eisbad, Membran Omega 30) konzentriert bis zu einer Endkonzentration von mindestens 2 mg/ml. Das Retentat wurde der Kammer entnommen und aliqotiert eingefroren und gelagert bei -60 bis -80°C.

Beispiel 9 Anzucht, Expression und Aufreinigung des autologen Fusionsproteins 52/3 57/3 150/772

Anzucht und Lyse erfolgte, wie beim autologen Fusionsprotein 52/3 57/3 beschrieben.

Dem nach der Lyse anfallenden Überstand wurde unter Rühren im Eisbad festes, fein gemörsertes Ammoniumsulfat langsam zugegeben (innerhalb 15 min) bis zu einer Konzentration von 30% Sättigung. Es wurde noch 15 min weiter gerührt. Anschließend wurde zentrifugiert (2 × 250 ml-Becher, 27 000 g, 30 min, 0-4°). Die Pellets wurden verworfen. Der Überstand wurde erneut mit Ammoniumsulfat versetzt bis zu einer Konzentration von 38% Sättigung und wie vorher zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Pellets wurden resuspendiert in 25 ml Tris-HCl/20mM/pH9-Puffer, der zusätzlich 2-Mercaptoethanol (14 mM), Pefabloc (0.1 mM) und Glycerin (10%) enthielt, eingefroren und über Nacht gelagert bei -20° bis -30°C.

Die mit Ammoniumsulfat (30-38%) fraktionierte Protein-Lösung wurde aufgetaut und präzipitiertes Protein wurde entfernt durch Zentrifugation (1 × 50 ml-Becher, 40 000 g, 30 min, 0-4°C). Der Überstand wurde über eine Sephadex G-25 (coarse) Säule (Volumen mindestens 200 ml) chromatographiert, wobei A(280 nm) und die Leitfähigkeit im Durchfluß gemessen wurden. Säulenpuffer = Tris-HCl/20mM/pH9 mit 2-Mercaptoethanol (1.4 mM), Pefabloc (0.02 mM) und Glycerin (10%). Das Protein im Ausschlußvolumen wurde vollständig gesammelt und direkt weiter chromatographiert.

Das Sephadex G-25 Eluat wurde über SP-Sepharose (Fast Flow) chromatographiert. Dabei wurde eine Säule der Dimension 2.6 × 12 cm (60 ml) verwendet. A (280 nm) und Leitfähigkeit wurden kontinuierlich registriert. Der Fluß betrug 5 ml/min. Säulenpuffer = Tris-HCl/20mM/pH9 mit 2-Mercaptoethanol (1.4 mM), Pefabloc (0.02 mM) und Glycerin (10%). Nach Probenauftrag, gefolgt von 109 ml Säulenpuffer, wurde ein linearer NaCl-Gradient (dC/dV= 1.7 mM/ml, bis 500 mM) in Säulenpuffer angelegt. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen zerlegt und eingefroren. Die Antigen-enthaltenden Fraktionen fanden sich im Bereich zwischen 150-300 mM NaCl. Der Nachweis erfolgte durch SDS-PA-Disc-Elektrophorese mit anschließender Coomassie-Färbung.

Die Fraktionen, die nachweislich intaktes Antigen (33 kD Bande) enthielten (Coomassie-Gel), wurden aufgetaut, vereint, mit Glycerin versetzt (20%) und mittels Ultrafiltration (Rührzelle, Eisbad, Membran = Omega 30) konzentriert bis zu einem Endvolumen von ca. 5 ml. Das Retentat wurde der Kammer entnommen und anschließend chromatographiert.

Der konzentrierte SP-Sepharose-Pool wurde über Superdex 75 (prep grade) chromatographiert. Dabei wurde eine HiLoad-Säule der Dimension 2.6 × 60 cm (300 ml) verwendet. A (280 nm) und Leitfähigkeit wurden kontinuierlich registriert. Der Fluß betrug 2 ml/min. Säulenpuffer = Basispuffer mit NaCl (0.5 M), Glycerin (20%), 2-Mercaptoethanol (1.4 mM), EDTA (1 mM), PMSF (0.1 mM) und Pefabloc (0.02 mM). Das Eluat wurde in 5 ml- Fraktionen zerlegt und eingefroren. Die Antigen-enthaltenden Fraktionen fanden sich im 1. Absorptionspeak (= größter peak). Der Nachweis erfolgte durch SDS-PA-Disc-Elektrophorese mit anschließender Coomassie-Färbung.

Die Fraktionen, die nachweislich intaktes und reines Antigen enthielten (Coomassie-Gel), wurden aufgetaut, vereint und mittels Ultrafiltration (Rührzelle, Eisbad, Membran = Omega 30) konzentriert bis zu einer Endkonzentration von mindestens 2 mg/ml. Das Retentat wurde der Kammer entnommen und aliqotiert eingefroren und gelagert bei -60 bis -80°C.

Beispiel 10 Evaluierung der rekombinanten Antigene im ELISA

Je 100 ng der gereinigten rekombinanten Antigene UL57/1, UL57/3 und 52/3 UL57/3 bzw. 200 ng der Antigene UL57/2 und 52/3 57/3 150/7/2 wurden in je 100 µl 0,01 M Carbonatpuffer pH 9,5 gelöst, in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Polycorb, Nunc) gegeben und 16 h in einer geerdeten feuchten Kammer inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl einer Kalbsserum- enthaltenden Nachbeschichtungslösung wurde die Inkubation für 2 weitere Stunden fortgesetzt. Danach wurden die Platten entleert und sorgfältig ausgeschlagen. Anschließend wurden die Platten für die eigentliche Testdurchführung verwendet, oder nach Trocknung im Vakuumschrank und anschließendem Einschweißen in Folienschlauch bis zum späteren Gebrauch bei -20°C gelagert. Die Beschichtung des chemisch synthetisierten Peptids erfolgte mit 2 pg/100 µl wie oben beschrieben unter Verwendung von Maxisorb-ELISA-Platten (Nunc). Zur eigentlichen Testdurchführung wurden die Testnäpfchen der ELISA-Platten mit 100 µl 1 : 21 verdünntem Serum gefüllt, mit einer Plastikfolie abgeklebt und 1 h bei 40°C schwimmend in Wasserbad inkubiert. Nach dreimaligem Waschen im Biotest ELISA Washer II erfolgte die Inkubation mit 100 µl eines gegen humanes IgM-gerichteten, Peroxidase-markierten, monoklonalen Antikörpers aus der Maus (Janssen) für 30 min bei 40°C. Nach abermaligem Waschen wurden die gebundenen Antikörper durch eine Farbreaktion mit 1,2-Phenyldiamin als Chromogen sichtbar gemacht. Die optische Dichte der einzelnen Probe wurde bei 495 nm (Referenz: 620 nm) am Anthos HTII ELISA-Reader ermittelt. Alle OD-Werte größer als 0,3 wurden als positives Ergebnis gewertet.

Die Ergebnisse der so erhaltenen Evaluierungen sind in den Tabellen 1-3 dargestellt.

Claims (12)

1. Peptid umfassend eine vom Cytomegalievirus (HCMV) stammende Aminosäuresequenz, die aus dem Leserahmen UL57 des HCM-Virus stammt, wobei dieser Leserahmen für das Major-DNA- binding protein codiert, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Homologie von wenigstens 60% zu der Aminosäuresequenz hat.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Homologie von wenigstens 80% zu der in Anspruch 1 dargestellten Aminosäuresequenz hat.

3. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid der Aminosäuresequenz nach Anspruch 1 oder einer Teilsequenz davon entspricht.

4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Länge von wenigstens 10 Aminosäuren hat.

5. Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es durch chemische Methoden synthetisiert wurde.

6. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fusionsprotein vorliegt.

7. Peptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des Fusionsproteins von der Glutathion-S-Transferase herstammt.

8. Peptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des Fusionsproteins von wenigstens einem anderen Protein, insbesondere einem anderen antigenen Protein, des humanen Cytomegalievirus herstammt.

9. Peptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem anderen antigenen Protein des humanen Cytomegalievirus um das pp150-Tegumentprotein handelt.

10. Peptid nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das weitere antigene Protein des humanen Cytomegalievirus das p52-Protein ist.

11. Testkit zum Nachweis von Antikörpern, insbesondere IgM- Antikörpern gegen das Cytomegalievirus, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 6 bis 10 umfaßt.

12. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Testkit zur Durchführung eines ELISA-Tests handelt.