DE4342846A1 - Tumor-Nekrose-Faktor-alpha inaktivierende Peptide - Google Patents

Tumor-Nekrose-Faktor-alpha inaktivierende Peptide

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DE4342846A1
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Description

Die Erfindung betrifft Peptide oder Peptidderivate, die spezifisch an den humanen Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF α) oder dessen Rezeptoren binden. Weiterhin umfaßt die Erfindung auch die Verwendung dieser Peptide oder Peptidderivate als TNF α-Antagonisten und Diagnostika für TNF α.
Stand der Technik
Der humane Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF α) ist ein Protein aus der Gruppe der Zytokine. Er wird vornehmlich als Antwort auf Gewebeschädigungen, bakterielle Endotoxine, Viren und andere Zytokine von aktivierten Makrophagen produziert. Er ist ein bedeutender Regulator in der Immunabwehr und bei Entzündungsprozessen, indem er den Organismus vor Gewebeabbau und Infektionen schützt. Weiterhin fördert er den Wiederaufbau von geschädigtem Gewebe. TNF α wurde von E. CARSWELL et al. (1975) Proc Natl Acad Sci USA 72 : 3666-3700 im Serum von Mäusen entdeckt. Dort zeigt der Faktor bei bestimmten Tumoren zytostatische und zytotoxische Wirkungen, die eine Funktion als endogener, tumorizidaler Faktor vermuten lassen.
Die Struktur des humanen TNF α und die Expression der TNF α kodierenden DNA ist beschrieben in den Publikationen von PENNICA et al. (1984) Nature 312 : 724-729; von MARMENOUT et al. (1985) Europ J Biochem 152 : 515- 522; von WANN et al. (1985) Science 228 : 149-154; und von SHIRAI et al. (1985) Nature 313 : 803-806.
Neben den schützenden Funktionen ist TNF α in einer Vielzahl von pathologischen Prozessen involviert, bei denen ein erhöhter TNF α-Spiegel zum Teil lebensbedrohliche Zustände hervorruft. So spielt TNF α bei folgenden Krankheitsbildern eine wesentliche Rolle: Septischer Schock, Kachexie, cerebrale Malaria, Graft-versus-host-Reaktion (Transplantat gegen Wirt-Reaktion), Arthritis, Frühgeburt, Osteoporose und multiple Sklerose. (Für einen Überblick ist aufschlußreich: BEUTLER and CERAMI (1989) Ann Rev Immunol 7 : 625-655; und BONAVISTA and GRANGER (eds) (1990) "Tumor Necrosis Factor: Structure, Mechanism of Action, Role in Disease and Therapy", Kerger, Basel).
Da TNF α bei einer Vielzahl von pathogenen Zuständen beteiligt ist, sind TNF α- Antagonisten von großer therapeutischer Bedeutung. TNF α wirkt über zwei Membranrezeptoren mit 55 kD und 75 kD (kD = Kilo-Dalton = Molekularmasse) auf seine Zielzellen ein (HOHMANN et al. (1989) J Biol Chem 264 : 14927- 14934).
Über die Mechanismen der Signalweiterleitung im Zellinneren ist wenig bekannt. Die bisherigen Versuche, die Wirkung von TNF α zu inhibieren, konzentrieren sich auf die Blockierung der Interaktion von TNF α und seinen Rezeptoren. Dies kann entweder über eine Bindung eines Inhibitors an TNF α oder an die Rezeptoren geschehen. Für beide Strategien gibt es Beispiele. Die Inhibierung der toxischen Effekte von TNF α wird durch Bindung von nicht toxischen TNF α-Mutanten und monoklonalen Antikörpern an die TNF α- Rezeptoren erreicht (J.-I. YAMAGISHI et al. (1990) Prot Engin 3 : 713-719 und T. ESPEVIK et al. (1990) J Exp Med 171 : 415-426).
Die TNF α-Mutanten und die monoklonalen Antikörper sind relativ große Moleküle und daher für den therapeutischen Einsatz nur bedingt geeignet, da sie Gewebe nur schwer durchdringen und zudem eine hohe biologische Halbwertszeit besitzen. Antikörper bilden weiterhin über ihren Fc-Teil oft störende Immunkomplexe aus. Ebenfalls treten anti-Idiotyp-Antikörper auf. Kreuzreaktionen mit "Selbst"-Strukturen können zu einer Autoimmunkrankheit führen.
Kleinere Moleküle, wie Antikörperfragmente oder Peptide sind daher therapeutisch weit besser geeignet (R. SUTHERLAND et al. (1987) Cancer Res 47 : 1627-1633 und M. WITLOW and D. FIPULA (1991) Methods 2 : 97-105).
Daneben sind wirksame niedermolekulare TNF α-Antagonisten nicht bekannt.
Aufgabe
Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung und der Einsatz von Peptiden oder deren Derivaten, die nicht zur Gruppe der Antikörper oder Antikörperfragmente und TNF α-Mutanten zählen. Insbesondere sind kleine Moleküle von Interesse, die leicht herstellbar sind und gute Verträglichkeit für den Menschen oder das Tier aufweisen. Eine Wirkung als Antigen soll möglichst vollständig ausgeschlossen sein.
Lösung
Die Aufgabe wird durch Peptide oder Peptidderivate gelöst, die die folgende Formel besitzen:
R₁-Xaa₁ · Xaa₂ · Xaa₃ · Xaa₄ ·Xaa₅ · Xaa₆ · Xaa₇-R₂
dabei steht
Xaa₁ für Ala, Arg, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Tyr, VaI oder für eine Bindung;
Xaa₂ für L-Ala, D-Ala, Arg, Asn, His, Lys oder Pro,
Xaa₃ für Arg oder Lys;
Xaa₄ für Arg, Lys oder Pro;
Xaa₅ für Trp oder Tyr;
Xaa₆ für Phe, Trp oder Tyr;
Xaa₇ für Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr oder für eine Bindung;
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure.
Bevorzugt ist dabei, daß eine der Aminosäuren-Typen Tryptophan oder Phenylalanin höchstens an zwei unterschiedlichen Positionen in der Sequenz der Formel auftritt.
Begriffserläuterungen
Die im Text verwendeten Abkürzungen sind durch die Regeln bestimmt, die von der IUPAC-IUB Kommision für biochemische Nomenklatur festgelegt worden sind (Biochemistry 11 : 1726 (1972) und Biochem. J. 219 : 345 (1984)). Folgende übliche Abkürzungen werden verwendet: Ala = Alanin; Arg = Arginin; His = Histidin; Ile = Isoleucin; Leu = Leucin; Lys = Lysin; Met = Methionin; Phe = Phenylalanin; Pro = Prolin; Ser = Serin; Trp = Tryptophan; Tyr = Tyrosin und Val = Valin.
Die Schutzgruppe des Restes R₁ kann bestehen aus:
Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl-, Aralkyl-, Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt sind Naphthoyl-, Naphthylacetyl-, Naphthylpropionyl-, Benzoylgruppe oder einer Acylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen.
Die Schutzgruppe des Restes R₂ kann bestehen aus:
Eine Alkoxy- oder Aryloxygruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder aus einer Aminogruppe.
Weitere Schutzgruppen - sowohl für R₁ und R₂ - sind in Houben-Weyl (1974) Georg Thieme Verlag, 4. Auflage beschrieben. Die Beschreibung der Schutzgruppen in der zitierten Literaturangabe ist Teil der Offenbarung.
Die Sequenz des erfindungsgemäßen Peptids oder Peptidderivates kann am N- terminalen und/oder C-terminalen Ende an Stelle einer Schutzgruppe mit weiteren Rahmen-Aminosäure-Sequenzen verbunden sein. Diese weiteren Rahmen-Aminosäure-Sequenzen sind für die Bindung des erfindungsgemäßen Peptids oder Peptidderivates nicht wesentlich, sie können jedoch Träger von anderen Funktionen sein, so zum Beispiel Chelate oder auch zytostatische oder zytotoxische Sequenzen umfassen. Derartige Rahmen-Aminosäure- Sequenzen treten in der Natur auf. Es kann sich dabei zum Beispiel um die zwischen den hypervariablen Bereichen angeordneten Sequenzen des variablen Bereichs eines Antikörper handeln. Diese Sequenzen werden als "Frame-Work" (Rahmensequenzen) bezeichnet. Als Rahmen-Aminosäure- Sequenzen sind weiterhin nicht abgespaltene Signalsequenzen eines sezernierten eukaryontischen Proteins bekannt, wobei das Protein in einem Bakterium exprimiert wird. Derartige Signalsequenzen haben bisweilen keinen Einfluß auf die Funktion des nachfolgenden Proteins. Ebenfalls ist es möglich, erfindungsgemäße Peptide oder Peptidderivate hintereinander zu koppeln, wobei Rahmen-Aminosäure-Sequenzen zwischen den Einzelsequenzen angeordnet sind.
Um im Einzelfall zu entscheiden, ob ein bestimmtes erfindungsgemäßes Peptid oder Peptidderivat mit wenigstens einer Rahmen-Aminosäure-Sequenz und/oder wenigstens einer Schutzgruppe zum Gegenstand der Erfindung zählt, ist ein Vergleich zwischen
  • (i) diesem Peptide oder Peptidderivat mit Rahmen-Aminosäure- Sequenz und/oder mit Schutzgruppe und
  • (ii) demselben Peptid ohne Rahmen-Aminosäure-Sequenz und ohne Schutzgruppe
anzustellen. Dabei sollten beide Moleküle im wesentlichen dieselben Funktionen bei der Bindung (vgl. Beispiel 2.1.) und der Inhibierung (vgl. Beispiel 2.2.) aufweisen.
Die aufgeführten Aminosäuren sind L-Aminosäuren mit Ausnahme der ausdrücklich kenntlich gemachten D-Aminosäure D-Alanin.
Der Ausdruck: "Bevorzugt ist dabei, daß eine der Aminosäuren-Typen Tryptophan oder Phenylalanin höchstens an zwei unterschiedlichen Positionen in der Sequenz der Formel auftritt." besagt, daß sich in dem erfindungsgemäßen Peptid oder Peptidderivat über die Sequenz Xaa₁ bis Xaa₇ der Aminosäure-Typ Tryprophan, Phenylalanin oder Thyrosin höchstens an zwei Position der Sequenz 1 bis 7 befindet.
Vorteile
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate haben gegenüber herkömmlichen TNF α-Bindungsmolekülen und TNF α-Antagonisten einige Vorteile. Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate sind kleine Moleküle, die geringe bis keine Antigenaktivität besitzen. Es entfällt die Bildung von Fc-Komplexen, wie sie sonst bei Antikörpern zu beobachten ist. Ebenfalls wird das Complement-System nicht aktiviert. Da die große Immunkomplexe nicht entstehen können, bleiben die Zielmoleküle und die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate löslich, sofern das Zielmolekül zuvor in gelöster Form vorgelegen hat.
Die Peptide oder Peptidderivate sind leicht an andere Moleküle, wie Diagnostika oder zytotoxische Moleküle koppelbar. So sind Chelatbildner mit zentralem Metallatom (zum Beispiel Gadolinium) als Diagnostika und cis- Diamindichlorplatin als zytotoxische Substanzen bekannt. Weitere Verwendungen ergeben sich auch aus den Publikationen: EP-Publikation 0 502 595; DE-Offenlegungsschriften DE-OS 40 25 788 und DE-OS 41 07 570; weiterhin R. SUTHERLAND (1987) Cancer Res 47 : 1627-1633; und M. WHITLOW and D. FlLPULA (1991), Methods 2 : 97-105; und Römpps Chemie-Lexikon/Otto- Albrecht Neumüller, Band 2, Seiten 855 bis 856, 8. Auflage, 1981, Stuttgart, (ISBN 3-440-04512-9). Aufgrund der Molekülgröße der Peptide oder Peptidderivate ist eine gezielte Reaktion mit einer der funktionellen Gruppen des erfindungsgemäßen Peptids oder Peptidderivates möglich.
Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate leicht herstellbar. Derart kurze Peptide oder Peptidderivate können mittels einer Technik hergestellt werden, die den Fachleuten im Bereich der Peptidsynthese bekannt ist. Eine Zusammenfassung vieler dieser Techniken können bei J.M. STEWART and J.D. YOUNG, San Francisco, 1969; und J. MEIERHOFER, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2 p 46, Academic Press (New York), 1973 für die Festphasen-Methode und E. SCHRODER and K.LUBKE, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York) 1965 für die Flüssigphasen- Methode nachgelesen werden. Die Schritte der Synthese sind in den EP-OS 0 097 031 beschrieben. Die allgemeinen Verfahrensschritte aus den europäischen Publikationen lassen sich analog auf die Synthese der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate übertragen. Weitere Literatur zu der Festphasensynthese sind: Solid Phase Synthesis, E. ATHERTON and R.C. SHEPPARD (1989) IRL Press, ISBN 1-85221-133-4 and Amino Acid and Peptide Synthesis, J. JONES, Oxdford Science Publication (1992) ISBN 0-19-855668-3.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate lassen sich gemäß dem Beispiel 1.4. herstellen.
Weitere Vorteile gegenüber Antikörpern oder deren Fragmenten bestehen in der besseren Lagerfähigkeit. Die Moleküle sind stabiler und benötigen keine weiteren Proteine, um stabilisiert zu werden.
Weiterhin besitzen die Peptide oder Peptidderivate eine bessere Gewebegängigkeit als Antikörper oder deren Fragmente. Dadurch eignen sie sich besonders als Therapeutikum.
Weitere Ausführungsformen bezüglich der Aminosäure- Sequenzen
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Peptide oder Peptidderivate , die die folgende Formel umfassen:
R₁-Xaa₁ · Xaa₂ · Xaa₃ · Xaa₄ · Xaa₅ · Xaa₆· Xaa₇-R₂
dabei steht
Xaa₁ für Ala, Leu, Ile, Phe, Arg oder für eine Bindung;
Xaa₂ für Lys, L-Ala, D-Ala, Pro oder His
Xaa₃ für Arg;
Xaa₄ für Pro oder Arg;
Xaa₅ für Trp oder Tyr;
Xaa₆ für Trp, Phe oder Tyr;
Xaa₇ für Tyr, Trp, Met, Ile, Leu, Phe, Cys oder für eine Bindung;
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure.
Bevorzugt ist dabei, daß eine der Aminosäuren-Typen Tryptophan oder Phenylalanin höchstens an zwei unterschiedlichen Positionen in der Sequenz der Formel auftritt.
Bevorzugter sind erfindungsgemäße Peptide oder Peptidderivate, die die folgende Formel umfassen:
R₁-Xaa₁ · Xaa₂ · Xaa₃ · Xaa₄ · Xaa₅ · Xaa₆ · Xaa₇-R2,
dabei steht
Xaa₁ für Ala, Leu, Ile, Phe oder Arg;
Xaa₂ für Lys oder D-Ala;
Xaa₃ für Arg;
Xaa₄ für Pro;
Xaa₅ für Trp;
Xaa₆ für Trp;
Xaa₇ für Tyr;
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure.
Mehr bevorzugt sind erfindungsgemäße Peptidderivate mit der Formel
dabei steht
Aus der Gruppe der zuvor genannten Peptidderivate ist die im SEQ ID NO 1 genannte Verbindung die bevorzugteste, nämlich:
CH₃-CO-Ala₁ · Lys₂ · Arg₃ · Pro₄ · Trp₅ · Trp₆ · Tyr₇-NH₂.
Weitere Ausführungsformen bezüglich der Reste
Neben der Abwandlung der Aminosäure-Sequenz der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate ist auch eine Variation der Reste R₁ und R₂ möglich. Die Reste brauchen jedoch die Bindungsfähigkeit und die Inhibierung der Wirkung von TNF α nicht zu beeinflussen. Dennoch lassen sich durch Schutzgruppen Parameter wie Stabilität, Halbwertszeit, Bioverfügbarkeit und Durchdringung von Matrix oder Membranen deutlich beeinflussen.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Peptide oder Peptidderivate, bei denen die Reste stehen:
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe.
Mehr bevorzugt sind erfindungsgemäße Peptide oder Peptidderivate, bei denen die Reste stehen:
R₁ für -H oder eine Acylgruppe und
R₂ für -OH oder Amino-Gruppe.
Am meisten bevorzugt sind erfindungsgemäße Peptide oder Peptidderivate, bei denen die Reste stehen für:
R₁ für CH₃-CO- und
R₂ für eine Amino-Gruppe.
Herstellungsverfahren der erfindungsgemäßen Peptide
Die Erfindung umfaßt weiterhin die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate, wobei eine N-α geschützte ω-Amino-α-aminosäure mit einem Dialdehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels umgesetzt und anschließend die Schutzgruppen der Seitenketten und gegebenenfalls die Schutzgruppen des N-Terminus und/oder des C-Terminus abgespalten werden.
Ebenfalls umfaßt die Erfindung ein Verfahren, bei dem die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate hergestellt werden, indem die Aminosäuren in einer homogenen Phase oder nach der Festphasen-Methode kondensiert werden, wobei das Carboxyl-Ende einer zu koppelnden Aminosäure, deren Aminogruppen und gegebenenfalls funktionellen Gruppen der Seitenkette eine Schutzgruppe tragen, mit dem freien Amino-Ende der zu koppelnden Aminosäure oder des zu koppelnden Peptidfragments in Gegenwart eines Kondensationsreagenzes reagiert, und
im Falle einer nicht-endständigen Aminosäure anschließend die α- Amino-Schutzgruppe der gekoppelten Aminosäure abgespalten wird und weitere Aminosäuren an die zu synthetisierende Peptid-Kette nach den zuvor beschriebenen beiden Schritten gekoppelt werden oder
im Falle einer endständigen Aminosäure gegebenenfalls anschließend die α-Amino-Schutzgruppe der gekoppelten Aminosäure abgespalten wird und
nach Kopplung der letzten Aminosäure im Falle der Festphasen-Methode das Peptid oder Peptidderivat von der Festphase abgespalten wird.
Verwendung als Diagnostikum
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate können aufgrund ihrer Bindungsfähigkeit als Diagnostikum verwendet werden. Analoge Verwendungen von Bindungsmolekülen sind in den Publikationen EP- Publikation 0 502 595; DE-Offenlegungsschriften 40 25 788 und 41 07 570 beschrieben.
Verwendung als Therapeutikum mit gekoppeltem pharmazeutischem Reagenz
Ebenso besitzen die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate pharmakologische Effekte, wenn sie mit einem pharmakologisch wirksamen weiteren Molekülteil verbunden sind (R. SUTHERLAND (1987) Cancer Res 47: 1627-1633; und M. WHITLOW and D. FlLPULA (1991), Methods 2 : 97-105; und Römpps Chemie-Lexicon/Otto-Albrecht Neumüller, Band 2, Seiten 855 bis 856, 8. Auflage, 1981, Stuttgart, (ISBN 3-440-04512-9)).
Verwendung als Arzneimittel
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate besitzen pharmakologische Eigenschaften und sind deshalb als pharmazeutische Wirkstoffe verwendbar. Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Arzneimittel, das eines der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate oder ein Gemisch davon enthält. Weiterhin gehört zur Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate oder ein Gemisch erfindungsgemäßer Peptide oder Peptidderivate enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen. Ebenfalls umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der pharmazeutisch aktiven, erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate oder deren Gemisch und ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und Trägerstoffe enthält.
Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Peptidderivate gemäß der Sequenzprotokolle Nr. 1 bis 6 eine Inhibierung der TNF α-Aktivität.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate zeigen eine Inhibierung (IC₅₀-Wert) der Zytotoxizität, die von TNF α induziert wird, bei Konzentrationen von 20 bis 80 µmol/l. Höhere Konzentrationen sind anwendbar, ohne das Testsystem zu stören. Somit sind die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate in Konzentrationen von 10 bis 1000 µmol/l einsetzbar.
Die Versuchsergebnisse dieses in vitro Tests zeigen, daß die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate als Arzneimittel oder zur medizinischen Behandlung verwendet werden können. Diese Versuchsergebnisse lassen sich von dem in vitro Testsystem auf ein in vivo System problemlos übertragen, da es sich bei dem Zytotoxizitätstest um eine etablierte Versuchsanordnung handelt, die zum Nachweis der TNF α-Aktivität dient (SECKINGER et al. (1990) J Biol Chem 264 : 11966-11973).
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate können deshalb zur Behandlung und Prävention von septischem Schock, Kachexie, cerebraler Malaria, Graft-versus-host-Reaktion (Transplantat gegen Wirt-Reaktion), Arthritis, Frühgeburt, Osteoporose, Autoimmunkrankheiten und multipler Sklerose dienen. Die Peptide oder Peptidderivate der Erfindung können als ein TNF α-Inhibitor bei Säugern, insbesondere bei Menschen, zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankungen eingesetzt werden.
Die Erfindung liefert weiterhin
  • (i) die Verwendung eines der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate oder deren Gemisch zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von septischem Schock, Kachexie, cerebraler Malaria, Graft-versus-host- Reaktion (Transplantat gegen Wirt-Reaktion), Arthritis, Frühgeburt, Osteoporose, Autoimmunkrankheiten und multipler Sklerose;
  • (ii) ein Verfahren zur Behandlung von septischem Schock, Kachexie, cerebraler Malaria, Graft-versus-host-Reaktion (Transplantat gegen Wirt-Reaktion), Arthritis, Frühgeburt, Osteoporose, Autoimmunkrankheiten und multipler Sklerose, welches Verfahren eine Verabreichung einer Peptid(derivat)menge gemäß der Erfindung umfaßt, wobei die Menge die Krankheit unterdrückt, und wobei die Peptid(derivat)menge einem Patienten gegeben wird, der ein solches Medikament benötigt;
  • (iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von septischem Schock, Kachexie, cerebraler Malaria, Graft-versus-host-Reaktion (Transplantat gegen Wirt-Reaktion), Arthritis, Frühgeburt, Osteoporose, Autoimmunkrankheiten und multipler Sklerose, welche Behandlung eines der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate oder deren Gemisch und wenigstens einen pharmazeutischen Hilfs- und/oder Trägerstoff umfaßt.
Für die therapeutische Wirkung sind unterschiedliche Dosen geeignet. Sie hängen beispielsweise von den verwendeten Peptiden oder Peptidderivaten, vom Wirt, von der Art der Verabreichung und von der Art und der Schwere der zu behandelnden Zustände ab.
Im allgemeinen sind jedoch bei Tieren zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 100 µg bis 100 000 µg pro kg Körpergewicht umfassen. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise dem Menschen, liegt eine empfohlene tägliche Dosis im Bereich von 100 bis 100 000 µg pro kg Körpergewicht. Bevorzugt ist eine Dosis von 300 bis 30 000 µg pro kg Körpergewicht, mehr bevorzugt eine Dosis von 1000 bis 10 000 µg pro kg Körpergewicht, am meisten bevorzugt eine Dosis von 2000 bis 5000 µg pro kg Körpergewicht. Zum Beispiel wird diese Dosis zweckmäßigerweise in Teildosen bis zu viermal täglich verabreicht. Zufriedenstellende Resultate sind zu erwarten, wenn die Peptide oder Peptidderivate der Erfindung subkutan oder intra-venös verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die eines der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate oder deren Gemisch und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Zusatz umfassen. Solche Zusammensetzungen können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Dabei ist auf Remington′s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.
Beispiele 1. Chemikalien, Proteine und Zell-Linien 1.1. Chemikalien für die Peptidsynthese
Die Fmoc-geschützen Aminosäuren sind von Novabiochem (Schweiz) und Bachem (Bubendorf; Schweiz) beziehbar. Ihre Herstellung ist Stand der Technik. Bei der Synthese von Peptiden an Polystyrolharz werden die Aminosäuren in situ mit PyBOP (Benzotriatol-1-yl-oxy­ tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat) und NMM (N-Methyl-Morpholin) aktiviert.
1.2. Tumor-Necrosis-Factor-α (Tumor-Nekrose-Faktor-α) (TNF α)
Die Herstellung des TNF α ist in K. ASHMAN et al. (1989) Prot Engin 5 : 387- 391 beschrieben. Das humane ¹²⁵I-markierte TNF α ist von der Firma Amersham (Braunschweig) mit einer spezifischen Aktivität von 800 Ci/mmol beziehbar.
Die extrazellulären Domänen der löslichen humanen 55 kD und 75 kD TNF α- Rezeptoren sp55 und sp75 werden ebenfalls in der Publikation von ASHMAN beschrieben. Die Markierung mit ¹²⁵I ist in der Publikation L. HUSAON and F.C. HAY (1980) Practical Immunology, second ed. Oxford, page 96. beschrieben.
1.3. Zell-Linien
Die murine Fibroblasten-Tumor Zell-Linie L929 wird ausführlich in der Publikation: Seckinger et al. (1990) J Biol Chem 264 : 11966-11973 beschrieben.
1.4. Herstellung der Peptide oder Peptidderivate
Die Synthese von löslichen Peptidgemischen und Peptiden oder Peptidderivaten ist an einem Multiplen Peptidsynthesizer (MPS) AMS 422 von ABIMED (Langenfeld) ausführbar (H. GAUSEPOHL et al. (1992) Peptide Research 5/6 : 315-320).
Die Peptidsynthese, bei der das Peptid oder Peptidderivat über eine Ankergruppe fixiert ist und erst am Ende der Synthese abgespalten wird, erfolgt an Polystyrolharz (Ansatzgröße 50 µmol). Als Lösungsmittel wird DMF verwendet. Es werden stets Doppelkopplungen durchgeführt. Der Synthesezyklus des Automaten besteht aus der Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppe mit 20%-igem Piperidin (zweimal 15 Minuten) und einer anschließenden sechsmaligen Waschprozedur mit DMF, bevor die Aminosäuren gekoppelt werden (zweimal 15 Minuten). Vor der nächsten Fmoc-Abspaltung wird wiederum sechsmal mit DMF gewaschen.
Bei der Reaktion aktiviert der Automat 200 µmol Aminosäure in 400 µl DMF durch Zugabe von 200 µmol PyBOP in 220 µl DMF und 400 µmol NMM in 100 µl DMF.
Der N-Terminus der Peptide oder Peptidderivate wird durch Zugabe von DMF/Acetanhydrid/DIPA im Volumenverhältnis 7 : 2 : 1 acetyliert (30 Minuten rühren).
Zur Abspaltung des Peptids oder Peptidderivates vom Harz und zur Abspaltung der Seitenschutzgruppen wird 2 bis 3 ml 90% TFA, 5% Triisobytylsiolan, 5% Wasser und 5% Phenol eingesetzt. Nach fünfstündiger Inkubation werden die Peptide oder Peptidderivate mit ca. 35 ml eiskaltem Ether ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, das Pellet (Sediment) mit 15 bis 20 ml eiskaltem Ether resuspendiert und gewaschen. Das Zentrifugieren und Waschen wird fünfmal wiederholt, bevor die Peptide oder Peptidderivate in einem möglichst geringen Volumen 5%-iger Essigsäure gelöst werden. Anschließend werden die Peptide oder Peptidderivate gefriergetrocknet. Die Peptide oder Peptidderivate liegen nach der Abspaltung C-terminal als Amid vor.
DIPA Diisopropylethylamin
DMF Dimethylformamid
Fmoc o-Fluorenylmethoxycarbonyl
PyBOP Benzotriatol-1-yl-oxy-tripyrrolidinophosphoniumhexafluor­ phosphat
NMM N-Methyl-Morpholin
TFA Trifluoressigsäure
2. Funktioneller Nachweis der Bindung und der Inhibierung 2.1. Kompetitiver Bindungstest TNF α/TNF-Rezeptoren
Die im zytotoxische Test ermittelten Peptide oder Peptidderivate werden in einem Kompetitionstest darauf getestet, ob ihre TNF α-neutralisierende Wirkung auf einer Wechselwirkung mit den TNF-Rezeptoren zurückzuführen ist. Dazu werden 10 ng/Reaktionsgefäß (well) des löslichen, rekombinanten Teils des 55 kD- beziehungsweise 75 kD-Rezeptors (in 50 µl 0,1 mol/l NaHCO₃, pH 9,6) an eine Mikrotiterplatte (Dynateck) gebunden (4°C über Nacht). Nach einmaligem Waschen (3 Minuten mit 200 µl PBS/0,1% Tween 80) werden die noch freien Bindungsstellen durch dreistündige Blockierung bei Raumtemperatur mit Inkubationspuffer (200 µl 6% Gelifundol®S der Firma Biotest (Dreieich; Kat-Nr. 1056061), 0,1 Tween 80 in PBS) abgesättigt. Nach einmaligem Waschen werden 0,5 ng ¹²⁵I-TNF α und der jeweilige Kompetitor (Peptid oder Peptidderivat) (nach 10-minütiger Vorinkubation) in 50 µl Inkubationspuffer zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsgefäße werden dreimal gewaschen und die gebundene Aktivität im γ-Counter gemessen (Zählrate 73,1%). Zur Auswertung werden die beim Kontrollpuffer (ohne Kompetitor) gemessenen cpm-Werte (cpm = Zählimpulse pro Minute) gleich 100% gesetzt.
PBS = Phosphate Buffered Saline
Tween = Polyoxyethylen Sorbitan Monooleat.
2.2. Inhibierungstest der Zytotoxizität von TNF α
Um zu zeigen, daß die TNF α-Bindung auch funktionell wirksam ist, wird gemessen, ob der zytotoxische Effekt von TNF α auf TNF α-sensitive L929- Zellen durch die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate gehemmt wird (Seckinger et al. (1990) J Biol Chem 264 : 11966-11973). Folgende IC₅₀- Werte werden erzielt:
Sequenzprotokoll

Claims (15)

1. Peptide oder Peptidderivate mit der Formel R₁-Xaa₁ · Xaa₂ · Xaa₃ · Xaa₄ · Xaa₅ · Xaa₆ ·Xaa₇-R2,dabei steht
Xaa₁ für Ala, Arg, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Tyr, Val oder für eine Bindung;
Xaa₂ für L-Ala, D-Ala, Arg, Asn, His, Lys oder Pro,
Xaa₃ für Arg oder Lys;
Xaa₄ für Arg, Lys oder Pro;
Xaa₅ für Trp oder Tyr;
Xaa₆ für Phe, Trp oder Tyr;
Xaa₇ für Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr oder für eine Bindung;
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure.
2. Peptide oder Peptidderivate nach Anspruch 1 mit der Formel R₁-Xaa₁ · Xaa₂ · Xaa₃ · Xaa₄ · Xaa₅ · Xaa₆ · Xaa₇-R2,dabei steht
Xaa₁ für Ala, Leu, Ile, Phe, Arg oder für eine Bindung;
Xaa₂ für Lys, L-Ala, D-Ala, Pro oder His;
Xaa₃ für Arg;
Xaa₄ für Pro oder Arg;
Xaa₅ für Trp oder Tyr;
Xaa₆ für Trp, Phe oder Tyr;
Xaa₇ für Tyr, Trp, Met, Ile, Leu, Phe, Cys oder für eine Bindung;
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure.
3. Peptide oder Peptidderivate nach Anspruch 1 oder 2 mit der Formel R₁-Xaa₁ · Xaa₂ · Xaa₃ · Xaa₄ · Xaa₅ · Xaa₆ · Xaa₇-R₂dabei steht
Xaa₁ für Ala, Leu, Ile, Phe oder Arg;
Xaa₂ für Lys oder D-Ala;
Xaa₃ für Arg;
Xaa₄ für Pro;
Xaa₅ für Trp;
Xaa₆ für Trp;
Xaa₇ für Tyr;
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe oder wenigstens eine weitere Aminosäure.
4. Peptidderivate nach einem der vorherigen Ansprüche mit der Formel: dabei steht
5. Peptidderivat nach Anspruch 4 mit der Formel CH₃-CO-Ala₁ 3 · Lys₂ · Arg₃ · Pro₄ · Trp₅ · Trp₆ · Tyr₇-NH₂.
6. Peptide oder Peptidderivate nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 3, wobei
R₁ für -H oder eine Amino-Schutzgruppe und
R₂ für -OH oder eine Carboxyl-Schutzgruppe steht.
7. Peptide oder Peptidderivate nach Anspruch 6, wobei die Reste stehen:
R₁ für -H oder eine Acylgruppe und
R₂ für -OH oder Amino-Gruppe.
8. Peptidderivate nach Anspruch 7, wobei die Reste stehen:
R₁ für CH₃-CO- und
R₂ für eine Amino-Gruppe.
9. Verfahren zur Herstellung von Peptiden oder Peptidderivaten nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine N-α geschützte ω-Amino-α- aminosäure mit einem Dialdehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels umgesetzt und anschließend die Schutzgruppen der Seitenketten und gegebenenfalls die Schutzgruppe des N-Terminus und/oder des C-Terminus abgespalten werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Aminosäuren in einer homogenen Phase oder nach der Festphasen-Methode kondensiert werden, wobei das Carboxyl-Ende einer zu koppelnden Aminosäure, deren Aminogruppen und gegebenenfalls funktionellen Gruppen der Seitenkette eine Schutzgruppe tragen, mit dem freien Amino-Ende der zu koppelnden Aminosäure oder des zu koppelnden Peptidfragments in Gegenwart eines Kondensationsreagenzes reagiert, und
im Falle einer nicht-endständigen Aminosäure anschließend die α- Amino-Schutzgruppe der gekoppelten Aminosäure abgespalten wird und weitere Aminosäuren an die zu synthetisierende Peptid-Kette nach den zuvor beschriebenen beiden Schritten gekoppelt werden oder
im Falle einer endständigen Aminosäure gegebenenfalls anschließend die α-Amino-Schutzgruppe der gekoppelten Aminosäure abgespalten wird und
nach Kopplung der letzten Aminosäure im Falle der Festphasen-Methode das Peptid oder Peptidderivat von der Festphase abgespalten wird.
11. Peptide oder Peptidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder hergestellt nach einem der Ansprüche 9 und 10 als Diagnostikum.
12. Peptide oder Peptidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder hergestellt nach einem der Ansprüche 9 und 10 als Medikament, wobei die Peptide oder Peptidderivate mit einem pharmakologisch wirksamen weiteren Molekülteil verbunden sind.
13. Peptide oder Peptidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder hergestellt nach einem der Ansprüche 9 und 10 als Arzneimittel.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der Peptide oder Peptidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder hergestellt nach einem der Ansprüche 9 und 10 oder ein Gemisch davon enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen.
15. Verwendung eines der Peptide oder Peptidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder hergestellt nach einem der Ansprüche 9 und 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von septischem Schock, Kachexie, cerebraler Malaria, Graft-versus-host-Reaktion, Arthritis, Frühgeburt, Osteoporose, Autoimmunkrankheiten und multipler Sklerose.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1997010840A1 (en) * 1995-09-18 1997-03-27 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Anti-inflammatory antisense drug
WO2000021981A3 (de) * 1998-10-09 2000-07-20 Bioserv Ag TNFα BINDENDE PEPTIDE UND IHRE ANWENDUNG FÜR DIE DETEKTION, INAKTIVIERUNG UND/ODER ENTFERNUNG VON TNFα AUS BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN
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