DE4323487C2 - Verfahren zur temperaturabhängigen Fixierung von Biokatalysatoren und Gewebezellen auf festen, biokompatiblen Trägermaterialien - Google Patents
Verfahren zur temperaturabhängigen Fixierung von Biokatalysatoren und Gewebezellen auf festen, biokompatiblen TrägermaterialienInfo
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Description
Die Fixierung von Enzymen (d. h. biokatalytisch wirksamen Proteinen) auf
geeigneten Trägermaterialien zur Katalysierung von Bioreaktionen unter den
kontrollierten Bedingungen (u. a. pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, Viskosität)
eines nach dem Oberflächenprinzip arbeitenden Bioreaktors ist ein zentrales Problem der
Biotechnologie (s. z. B. Präve, P. et al., "Fundamentals of Biotechnology", Kap. 12.4 und
Kap. 6, VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, (1987)). Die Immobilisierung der Enzyme
ist deshalb so wichtig, um einerseits ihre optimale katalytische Aktivität über lange
Zeiträume sicherzustellen und andererseits ihre Vermischung mit dem Reaktionsmedium
zu verhindern. Letzteres würde sonst zum Verlust des Enzyms und zu einem höheren
technischen Aufwand bei der Produktaufarbeitung (Reinigung) führen.
Als Trägermaterialien zur Fixierung in Bioreaktoren wird eine Vielzahl von
Feststoffen verwendet, u. a. Glas, Keramik, Silica Gel, Kunststoffe,
Collagenverbindungen, Stärkeverbindungen, Polymere. Die Form dieser Träger im
Bioreaktor variiert ebenfalls stark, neben Platten, Fasern und Hohlfasern sind Hohlkugeln,
Folien und Membranen gebräuchlich. Die Fixierung der Enzyme auf diesen Trägern
erfolgt entweder durch Adsorption, chemische Bindungen (kovalent, ionogen,
immunologisch) oder Einschluß.
Ein wichtiges Problem bei der Immobilisierung der Enzyme ist die Gefahr der
teilweisen oder vollständigen Denaturierung derselben durch den Kontakt mit der
Trägeroberfläche und der damit verbundene Verlust von katalytischer Aktivität. Dies ist
besonders gravierend, wenn anorganische Trägermaterialien in direkten Kontakt mit dem
Enzym kommen. Aber auch organische Träger wie natürliche Polymere (z. B. Dextran)
können in manchen Enzymen Konformationsumwandlungen mit daraus resultierender
Reduktion der enzymatischen Aktivität induzieren. Um dieses Problem bei anorganischen
Trägern in den Griff zu bekommen, wird in jüngster Zeit vermehrt mit sogenannten
biokompatiblen Oberflächen gearbeitet. Diese werden durch Beschichtung des Trägers mit
organischen Filmen aus einem Material, welches bei Kontakt mit dem Enzym keine
Konformationsumwandlungen in demselben induziert (biokompatibel), erzeugt. Der Stand
der Technik wird hier durch auf dem Träger immobilisierte Lipid-Monoschichten
repräsentiert, die durch ihre membranähnlichen Oberflächeneigenschaften eine hohe
Biokompatibilität gewährleisten und unter bestimmten Bedingungen die Fixierung von
Enzymen auf der Monoschicht-Oberfläche gestatten.
Ein weiterer Nachteil der bisherigen Verfahren zur Enzymfixierung ist die zumeist
technisch aufwendige Art der Fixierung. Diese muß i.a. außerhalb des Bioreaktors
durchgeführt werden und ist oft irreversibler Natur, d. h. das Enzym kann entweder gar
nicht oder nur unter Verlust seiner enzymatischen Aktivität von der Oberfläche wieder
entkoppelt werden. Diese Option der gezielten Kopplung bzw. Entkopplung des Enzyms
an/von der Trägeroberfläche ist jedoch aus prozeßtechnischer Hinsicht sehr vorteilhaft.
Das neue Verfahren soll einerseits eine optimale Biokompatibilität der
Trägeroberflächen garantieren und weiterhin die Option bieten, die Kopplung bzw.
Entkopplung des Enzyms mit der biokompatiblen Oberfläche durch Veränderung der
Temperatur im Bioreaktor gezielt zu steuern.
Anorganische Festkörper wie z. B. Silizium oder Siliziumdioxid können mit einer ca.
5 nm dicken, bimolekularen Schicht aus amphiphilen Molekülen (im folgenden Bilayer
genannt) beschichtet werden (Tamm, L. "Supported Phospholipid Bilayers", Biophysical.
Journal (Biophys. Soc. USA) 47, 105-113, (1985)). Das Resultat ist ein sogenannter Solid
Supported Bilayer (SSB), wie er schematisch in Abb. 1 gezeigt ist. Die Dicke des
SSB ist ca. 50 nm und die Dicke der Wasserschicht zwischen Festkörperoberfläche und
Bilayer ist 1,5 bis 2,0 nm (Johnson et al., "Structure of an adsorbed DMPC bilayer
measured with specular reflection of neutrons", Biophysical Journal 59, 289-294, (1991)).
Zur Beschichtung werden Phospholipidmoleküle, die Hauptkomponenten jeder tierischen
Zellmembran, verwendet. Durch diese Beschichtung wird die anorganische Oberfläche
vollständig biokompatibel, d. h. mit dieser Oberfläche in Kontakt kommende Proteine
denaturieren nicht. Die physikalischen Eigenschaften derartiger Bilayer-Beschichtungen
und ihre Herstellung im Labormaßstab wurden in den letzten Jahren eingehend untersucht
(s. Naumann, C. et al., "Phase transition behavior of single phosphatidylcholine bilayers
on a solid support studied by DSC, NMR and FT-IR", Biophysical Journal 63, 1314-1319
(1992) sowie Bayerl, T. M and M. Bloom, "Physical properties of single phospholipid
bilayers adsorbed to micro glass beads", Biophysical Journal 58, 357-362, (1990)). Ein
wichtiges Ergebnis dieser Arbeiten ist die Erkenntnis, daß die Bilayer-Beschichtungen für
Zeiträume von Wochen bis Monaten stabil sein können und die gesamte Oberfläche des
Trägermaterials bedecken. Weiterhin wurde gezeigt, daß die strukturellen und
dynamischen Eigenschaften dieser Bilayer denen natürlicher Lipidmembranen sehr
ähnlich sind.
Verwendet man zur Beschichtung statt dem zwitterionischen und damit nach außen
elektrisch neutralen Lezithin (das in tierischen Zellen am häufigsten vorkommende
Phospholipid) eine binäre Mischung aus Lezithin und einem Lipid mit negativer Ladung
(z. B. Phosphoserin oder Phosphoglycerol) erhält man eine negativ geladene Oberfläche.
Die Verteilung der Oberflächenladung hängt nun vom Mischungsverhalten der beiden
Phospholipidkomponenten ab (Lee, A.G., Biochim. Biophys. Acta 472 (1977) 237-344).
Bei regulären Mischungsverhalten ist die Bildung von Lipiddomänen (Cluster) mit hoher
negativer Oberflächenladung im kristallinen Phasenzustand möglich (infolge teilweiser
Entmischung, Sackmann, E., "Biophysics" , Hoppe, W., Lohmann, W., Markl, H., Ziegler,
H. (eds.), pp 425-457, Springer Verlag Berlin, 1983). Diese Domänen sind durch ihre
hohe Oberflächenladung in der Lage, Proteine mit entgegengesetzter (positiver) Ladung
durch Coulomb Wechselwirkung fest zu binden (Johnson et al., "Coupling of spectrin and
polylysine to phospholipid monolayers studied by specular reflection of neutrons",
Biophysical Journal 60, 1017-1025, (1991)). Eine schematische Darstellung einer solchen
Bindung wird in Abb. 2 gegeben. Hingegen werden negativ geladene Proteine
abgestoßen und somit eine selektive Bindung von Proteinen nach ihrem Ladungszustand
ermöglicht. Wird nun der kristalline Phasenzustand nach der Bindung des Proteins durch
Temperaturerhöhung in den flüssig-kristallinen Zustand überführt (Phasenübergang erster
Ordnung bei der Phasenübergangstemperatur Tm), zersetzen sich die Domänen infolge
einsetzender lateraler Diffusion der einzelnen Phosholipidmoleküle und die
Oberflächenladung wird über die gesamte beschichtete Oberfläche verteilt. Der daraus
resultierende drastische Abfall der lokalen (auf eine Domäne bezogenen)
Oberflächenladungsdichte bewirkt eine Entkopplung des bis dahin gebundenen Proteins.
Damit ist die Möglichkeit gegeben, durch Veränderung eines Parameters (der Temperatur)
eine selektive Kopplung und Entkopplung von Proteinen bezüglich einer biokompatiblen
Oberfläche (d. h. ohne signifikante Denaturierung der Proteine) zu erreichen.
Domänenbildung bzw. Domänenzerfall sind reversible Vorgänge, damit kann der
(Ent)kopplungsprozeß beliebig oft durch Temperaturveränderung wiederholt werden.
Auch eine Beschichtung des Festkörpers mit positiver Oberflächenladung des
Bilayers kann realisiert werden. Hierzu verwendet man binäre Mischungen aus Lezithin
mit einem amphiphilen, lipidähnlichen Molekül mit positiver Ladung (z. B. di-dodecyl
dimethyl-ammoniumbromid). Damit sind mit dem Verfahren, je nach Zusammensetzung
des zur Beschichtung verwendeten Bilayers, sowohl positiv wie auch negativ geladene
Proteine selektiv an eine biokompatible Oberfläche koppelbar und (bei entsprechender
Temperaturerhöhung auf Werte oberhalb von Tm) wieder gezielt entkoppelbar.
Die Phasenübergangstemperatur Tm (d. h. die "Schalttemperatur" für die zwei
Zustände des Bilayers) ist von der Wahl der Phospholipidkomponenten abhängig und
kann zwischen -20°C bis +90°C variiert werden. Für Proteinanwendungen ist
insbesondere der Temperaturbereich 0°-40°C interessant, der durch eine Vielzahl von
binären Phospholipidmischungen (z. B. durch eine Mischung von 1,2-dielaidoyl-sn-
glycero-3-phosphocholine mit 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphoglycerol) problemlos
realisiert werden kann.
Als Substrat für die Bilayer-Beschichtung werden Kugeln aus Silikat (SiO₂) oder
aus Glas verwendet, die in Durchmessern von 1-40 µm kommerziell verfügbar sind. Eine
Vergrößerung der aktiven, beschichteten Oberfläche kann durch Verwendung von porösen
Silikakugeln (sogenannte Silikagele) erreicht werden.
Die Beschichtung der Trägermaterials erfolgt direkt im Bioreaktor. Hierzu wird das
Trägermaterial zunächst in einem gepufferten Medium (pH≈7) im Bioreaktor dispergiert.
Die zur Beschichtung verwendete Lipidmischung, z. B. durch eine Mischung von 1,2-
dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine mit 20 mol-% 1,2-dimyristoyl-sn-glycero
phosphoglycerol (Tm = 10-12°C) wird durch Ultraschallbehandlung der Lipiddispersion
im gepufferten Medium (pH ≈ 7) zu sehr kleinen, unilamellaren Vesikeln verarbeitet.
Diese werden dann bei Temperaturen oberhalb von Tm in den Wirbelschicht-Reaktor
gegeben und mit dem dispergierten Trägermaterial verrührt. Dabei fusionieren die kleinen
Vesikel spontan auf der Oberfläche des Trägermaterials (bei Zusammenstößen mit
diesem) und bilden den gewünschten Lipidfilm (Bilayer). Überschüssige Vesikel können
z. B. durch Sedimentation des beschichteten Trägermaterials aus dem Überstand
abgetrennt werden. Danach wird die Temperatur des Bioreaktors auf Werte unterhalb von
Tm reduziert. Das Trägermaterial ist nun bereit für die Kopplung des gewünschten
katalytischen Enzyms (mit positiver Ladung). Letzteres kann nun in den Reaktor
eingespült werden und wird unmittelbar von dem Trägermaterial durch Coulomb-
Wechselwirkung gebunden und damit immobilisiert. Da diese Immobilisierung auf einer
biokompatiblen Oberfläche (die der Oberfläche einer natürlichen Membran weitgehend
ähnelt) erfolgt, ist keine signifikante Denaturierung (und damit Verlust an katalytischer
Aktivität) zu erwarten. Die Bindung an die Oberfläche des Trägermaterials ist i.a. fest
genug, um ein Ablösen des Enzyms bei Verwirbelung (Rühren) im Reaktor zu verhindern.
Eine spätere Trennung des immobilisierten Enzyms von dem Reaktionsgemisch ist
einfach durch Sedimentation oder Zentrifugation zu erreichen. Soll hingegen das Enzym
von dem Träger entkoppelt werden (z. B. zur Aufarbeitung oder wegen eines
Enzymwechsels im Reaktor), ist dies durch Temperaturerhöhung auf Werte oberhalb von
Tm und anschließender Sedimentation des Trägers realisierbar.
Hierzu ist ein geschichtetes Trägermaterial aus Glas oder Silika im Reaktor
erforderlich. Die Geometrie kann entweder planar (Platten) oder gekrümmt (z. B.
Hohlfiber) sein. Die Beschichtung mit dem Bilayer erfolgt analog zu dem in 3.1
gegebenen Beispiel. Anschließend kann das zu fixierende Enzym oder Gewebematerial
eingespült werden. Temperaturabsenkung auf Werte unterhalb von Tm bewirkt dann die
Kopplung an die biokompatible Oberfläche des Trägermaterials. Mit dieser Art der
Fixierung können u. a. auch wachstumsgekoppelte Bioreaktionen im Bioreaktor (trotz
Zellimmobilisierung) durchgeführt werden, da neu entstehendes Zellmaterial spontan an
der Oberfläche gebunden wird (bzw. gebunden bleibt).
Die Produktaufarbeitung ist besonders einfach, da die Zellen durch
Temperaturerhöhung (T<Tm) vom Träger entkoppelt und aus dem Bioreaktor gespült
werden können.
Das neue Verfahren gestattet auch die Anwendung von Enzymen in Bioreaktionen,
die bisher aufgrund ihrer Lösungseigenschaften (z. B. Hydrophobizität) als nicht geeignet
für Bioreaktoranwendungen galten.
Derartige Enzyme benötigen häufig die teilweise Einbettung in den hydrophoben
Bereich einer Membran zur Erreichung ihrer enzymatischen Aktivität (ein Beispiel unter
vielen ist das Cytochrom P-450 aus tierischen Leberzellen). Hierzu werden die Enzyme
zunächst außerhalb des Bioreaktors in kleine, unilamellare Vesikel funktionell
rekonstituiert (z. B. durch Detergenz-Dialysetechnik oder mittels Extrusion des Lipid-
Protein-Gemisches durch Polycarbonatmembranen). Die rekonstituierten Vesikel werden
anschließend in Reaktoren wie unter 4.1 oder 4.2 beschrieben bei Temperaturen oberhalb
von Tm eingespült und fusionieren auf dem Trägermaterial. Bei Verwendung von
kugelförmigen Trägern ist die gesamte Präparation auch außerhalb des Reaktors möglich.
Anschließend wird dann das Reaktionsgemisch in den Reaktor geladen. Die
Immobilisierung der Enzyme innerhalb der zur Beschichtung verwendeten Membran
ermöglicht einerseits deren enzymatische Aktivität während der Bioreaktion und
verhindert andererseits den Übergang des katalytischen Enzyms in das Reaktionsgemisch.
Claims (6)
1. Verfahren zur Fixierung von Enzymen oder ganzen Zellen auf Festkörpern, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Lipid-Doppelschicht (Bilayer) auf der Festkörperoberfläche
adsorbiert oder gebunden wird und damit eine biokompatible Oberfläche erzeugt wird,
wobei eine Kopplung oder Entkopplung des Enzyms von der bilayerbeschichteten
Festkörperoberfläche durch Veränderung der Temperatur erzielt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Beschichtung
verwendete binäre Lipidmischung eine Lipidspezies mit elektrisch positiver oder
negativer Überschußladung enthält.
3. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Mischungsverhalten der zur Beschichtung verwendeten
Lipidmischung zur Erzeugung von Oberflächenladungsmustern auf den beschichteten
Festkörpern ausgenutzt wird.
4. Anwendung nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche des zur
Beschichtung des Trägermaterials verwendeten Lipid Bilayer als Matrix zur
Einbettung bzw. funktionellen Rekonstitution von membranständigen (d. h. in den
hydrophoben Bereich des Bilayer hineinreichenden) Enzymen, Proteinen oder
Peptiden.
5. Anwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1-3 zur Fixierung von Enzymen,
Proteinen, Peptiden, ganzen Zellen oder Geweben an Trägermaterialien in
Bioreaktoren bzw. Fermentern.
6. Anwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1-3 zur Separation
von Enzymen, Proteinen, Peptiden, ganzen Zellen oder Geweben aus Gemischen.
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1993
- 1993-07-14 DE DE19934323487 patent/DE4323487C2/de not_active Expired - Fee Related
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