DE4312097A1 - Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von WasserstoffperoxidInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung niedriger
Konzentrationen von H₂O₂ mittels Luminol. Dabei wird Luminol
durch ein Hypochlorit zu einem Zwischenprodukt oxidiert, welches
über eine Reaktion mit H₂O₂ eine Chemolumineszenz emittiert,
deren Intensität proportional von der H₂O₂-Konzentration abhängt.
Das Verfahren zeichnet sich durch eine sehr kurze Meßzeit aus und
kann daher zur Bestimmung sich zeitlich ändernder H₂O₂-Konzentrationen
angewandt werden. Es ist weiterhin für sehr
niedrige H₂O₂-Bestimmungen unter physiologischen Bedingungen
geeignet.
Derartige Bestimmungen von H₂O₂ spielen in der klinischen
Analytik (z. B. Aktivitätsmessung von Phagozyten), in der Medizin
(Einfluß von Pharmaka auf Immunzellen), in der Biochemie (z. B.
Enzymaktivitätsbestimmungen) sowie in der Bioökologie (z. B. H₂O₂-Gehalt
von Flußwasser) eine bedeutende Rolle. Auf den möglichen
Anwendungsgebieten des dargelegten Verfahrens sind bisher
unterschiedliche Analysemethoden im Einsatz, welche auf der
Grundlage der Spektrophotometrie, der Fluoreszenz oder der
Chemolumineszenz arbeiten.
Wasserstoffperoxid kann erstens direkt spektrophotometrisch
aufgrund seiner Adsorption im UV-Bereich quantifiziert werden
(Beers, R. F., Sizer, I. W.; A spectrometric method for measuring the
breakdown of hydrogen peroxide by catalase; J. Biol. Chem. 195, 1952,
133-140). Voraussetzung allerdings ist dafür, daß sich keine die
Absorption störenden Substanzen in der Probe befinden und das nur
sehr hohe H₂O₂-Konzentrationen (Millimolarbereich) bestimmt
werden können. Dieses sehr unempfindliche Verfahren ist deshalb
für viele biologische Anwendungen nicht geeignet.
Eine beträchtliche Verbesserung der Empfindlichkeit wird bei
Verwendung von Chemolumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden
erreicht. Prinzipiell wird bei diesen Verfahren durch Zugabe
einer Peroxidase oder eines Metallkomplexes ein Fluoreszenz- oder
Lumineszenzindikator durch H₂O₂ oxidiert. Fluoreszenzverfahren
basieren darauf, daß durch die H₂O₂-abhängige Oxydation ein
Fluoreszenzindikator akkumulieren kann, so daß die gemessene
Fluoreszenz der Menge an produziertem H₂O₂ entspricht.
Beispielsweise kann H₂O₂ aufgrund seiner Fähigkeit bestimmt
werden, p-Hydroxyphenylazetat zu einem stabilen Produkt zu
oxidieren, dessen Konzentration mittels Fluoreszenz gemessen wird
(Hyslop, P. A., Sklar, L. A.; Anal. Biochem.; 141, 1984, 280-286). Das
Scopoletinassay ist eine ähnlich arbeitende Methode.
Bei den Lumineszenzverfahren ist die emittierte Lichtmenge
proportional der H₂O₂-Produktion. Eine von Wymann et al.
angegebene Möglichkeit besteht in der Luminoloxidation durch H₂O₂
zu chemisch-angeregtem 3-Aminophthalat, welches in direkter
Proportion zur H₂O₂-Konzentration Licht emittiert (Wymann, M. P.,
Tscharner, V. von, Deraulean, D. A., Baggiolini, M.;
Chemiluminescence detection of H₂O₂ produced by human neutrophils
during the respiratory burst; Anal. Biochem. 165, 1987, 317-378).
Lucigenin ist ein weiterer zur Anwendung kommender
Lumineszenzindikator.
In Campbell et al. (campbell, A. K.; chemiluminscence : principles
and applications in biology and medicine; 1988,
Weinheim. Chichester; VCH Ellis Horwood) werden noch andere
Verfahren zur H₂O₂-Analyse mit ähnlicher Konzeption vorgestellt.
Die Nachteile bestehen bei diesen fluoreszenten und
chemolumineszenten Methoden besonders in der geringen Spezifität.
Beispielsweise konnte in Kontrollexperimenten gezeigt werden, daß
peroxidasevermittelte Luminszenzreaktionen bis zu 50% durch
H₂O₂-unabhängige Prozesse bedingt sind (Misra, H. P.,
Squatrito, P. M.; The role of superoxid anion in peroxidasecatalyzed chemiluminscence
luminol; Arch. Biochem. Biophys. 215(1),
1982, 59-65/ Lock, R., Johansson, A., Orselius, K., Dahlgren, C.;
Analysis of horseradish peroxidase-amplified chemiluminscence
produced by human neutrophils reveals a role for the superoxide
anion in the light emitting reaction; Anal. Biochem. 173(2), 1988,
450-455). Nachteilig ist weiter, daß für eine maximale
Lumineszenzemission und eine schnelle Kinetik stark basische pH-Werte
nötig sind. In der Regel benötigen herkömmliche Verfahren
eine lange Meßzeit, welche im Minutenbereich liegen kann, wenn
noch mit ausreichender Empfindlichkeit gearbeitet werden soll.
Speziell zu den Nachteilen fluoreszenter Verfahren gehört auch
die Tatsache, daß potentielle Artefakte wie Ramanstreuung und
Autofluoreszenz an Zellen auftreten (Wymann, M. P., Tscharner, V.
von, Deraulean, D. A., Baggiolini, M.; Chemiluminescence detection
of H₂O₂ produced by human neutrophils during the respiratory
burst, Anal. Biochem. 165 (1987) 31-378).
Nachteilig ist weiterhin, daß durch die Zugabe der Peroxidase
das Wasserstoffperoxid dabei vollständig entfernt wird.
Dadurch werden Zellsysteme empfindlich gestört und der
natürliche Zeitverlauf der H₂O₂-Konzentration als Summe H₂O₂-bildender
und verbrauchender Prozesse kann nur verzerrt erfaßt
werden.
Andere in das Anwendungsgebiet des Verfahrens fallende
Methoden sind Aktivitätsbestimmungen an Enzymen, welche unter
Verbrauch oder Bildung von H₂O₂ ablaufen, z. B. die Bestimmung
der Katalaseaktivität. Dieses Enzym katalysiert die Zerstörung
von H₂O₂ in molekularen Sauerstoff und in Wassermoleküle. Die
Enzymaktivität kann folglich über die Änderungsrate der H₂O₂-Konzentration
gemessen werden. Dies wird heute vorrangig durch
direkte spektrophotometrische Bestimmung der H₂O₂-Konzentration
realisiert (Aebi, H.; Catalase in vitro; Methods Enzymol. 105,
1984, 121-126). Da diese Methode nicht sehr empfindlich für H₂O₂
ist, muß mit relativ hohen H₂O₂-Konzentrationen gearbeitet
werden. Dies bringt nachteilig mit sich, daß der entstehende
Sauerstoff bei der Katalasereaktion in Gasform freigesetzt
wird und damit die Absorption empfindlich stört. Von Nachteil
ist weiterhin, daß höhere H₂O₂-Konzentrationen die Katalase
selber inaktivieren und somit die Ergebnisse verfälscht
werden.
Die Nachteile herkömmlicher Chemolumineszenzanalysen auf der
Basis von Luminol können durch Betrachtung des
Reaktionsmechanismus verdeutlicht werden. Nach Mer´nyi et al.
(Mer´nyi, g., Lind, J., Eriksen, T. E.; Luminol chemiluminscence:
Chemistry, Excitation, Emitter; J. Biolumin. Chemilumin. 5, 1990,
53-56) läuft der allgemeine Oxydationsweg von Luminol in
mehreren Teilschritten ab. In einem ersten Abschnitt erfolgt
die Oxydation zu einem Diazachinon. Dieses zerfällt schnell
hydrolytisch und kann andernfalls auch sehr spezifisch mit H₂O₂
in ein Hydroperoxid umgewandelt werden. Letztere Reaktion
führt schließlich zur Emission von Chemolumineszenz. Die
Nachteile obengenannter Chemolumineszenzmethoden ergeben sich
daraus, daß bei Verwendung von Katalysatoren vor allen Dingen
der erste Abschnitt sehr unspezifisch und die Gesamtreaktion
relativ langsam abläuft.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, auf der
Basis einer Chemolumineszenzreaktion mit Luminol ein
Analyseverfahren zur Quantifizierung von H₂O₂ zu entwickeln,
welches durch eine kurze Meßzeit, hohe Empfindlichkeit und
Spezifität charakterisiert ist.
Dies wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein
Hypochlorit in ein Probengefäß injiziert wird, welches neben
Luminol die zu analysierende Probenlösung enthält. Luminol
wird dabei zu einem Diazachinon oxydiert, welches in einer
H₂O₂-spezifischen Reaktion eine Lichtemission auslöst, die dem
H₂O₂-Gehalt in der Probe entspricht. Die Erfindung wird im
folgenden anhand von graphischen und schematischen
Darstellungen näher erläutert.
In Abb. 1 ist der prinzipielle Reaktionsmechanismus
schematisiert dargestellt. Danach wird der erste
Oxydationsschritt von Luminol zum Diazachinon durch ein
Hypochlorit sehr schnell bewirkt, wodurch der Einfluß anderer
Oxydantien auf diesen Reaktionsweg vernachlässigbar wird. Das
auf diese Weise akkumulierende Diazachinon kann unter
Konkurrenz mit seinem alternativen hydrolytischen Zerfall bei
Anwesenheit von H₂O₂ weiter in ein Hydroperoxid umgewandelt
werden, welches unter Lichtemission zum Aminophthalat
zerfällt. Kontrollexperimente an komplizierten Zellsystemen
zeigen, daß im Gegensatz zu oben erwähnten Verfahren die
Luminszenz dieses Systems ausschließlich durch H₂O₂ bedingt
wird.
Abb. 2 zeigt die Lichtkinetik einer derartigen
Chemolumineszenzreaktion für verschiedene H₂O₂-Konzentrationen.
Man sieht, daß unter den gewählten Bedingungen die
Lichtemission bereits nach wenigen Sekunden beendet ist. Nach
2 s sind über 99% der Gesamtlichtmenge abgestrahlt, so daß
eine entsprechend kurze Meßdauer für die vollständige
Erfassung des Lichtsignals ausreicht. Abb. 2 verdeutlicht
außerdem, daß Änderungen der H₂O₂-Konzentration die Dauer der
Lichtemission nicht verlängern. Durch die sehr kurze
Reaktionszeit mit Luminol wird eine mögliche Parallelreaktion
des Hypochlorits mit H₂O₂ verhindert, wodurch der Verbrauch des
nachzuweisenden H₂O₂ minimal ist. Durch die kurze Meßdauer wird
außerdem die gemessene Lichtintensität nicht durch
unspezifische Lumineszenzsignale beeinflußt. Wie für alle
Luminolreaktionen zeigt die Chemolumineszenz eine pH-Abhängigkeit.
Prinzipiell kann das Verfahren auch im schwach
basischen Bereich eingesetzt werden, womit H₂O₂-Bestimmungen im
physiologischen Milieu möglich sind. Werden Luminol und
Hypochlorit zusammen mit einer Pufferlösung definierten pH-Wertes
standardisiert eingesetzt, so ist die resultierende
Chemolumineszenz in einem großen Bereich der H₂O₂-Konzentration
linear, so daß sich bei Kenntnis von Hypochloridkonzentration,
Luminolkonzentration und pH-Wert die H₂O₂-Konzentration
unmittelbar aus der Chemolumineszenzintensität ergibt.
Dies wird in Abb. 3 für drei unterschiedliche
Hypochloritkonzentrationen, eine Luminolkonzentration von 5*10-5 mol/l
und einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4
demonstriert. Die Chemolumineszenzintensitäten sind in
relativen Lichteinheiten angegeben, wobei jedem
Intensitätswert eine Meßdauer von 2 s zugrunde liegt. Die
untere Nachweisgrenze liegt bei 2*10-9 mol/l H₂O₂. In
Abhängigkeit vom Probenvolumen ist demzufolge H₂O₂ noch in
einer Menge von 10-12 mol nachweisbar. Gemäß Abb. 3 können auch
höhere H₂O₂-Konzentrationen im nichtlinearen Bereich bestimmt
werden, wenn zuvor eine Eichkurve erstellt wurde.
Bedingt durch die sehr kurze Meßdauer und die hohe
Empfindlichkeit eignet sich das Verfahren zur Bestimmung sich
zeitlich ändernder, sehr niedriger H₂O₂-Konzentrationen, indem
es entweder zeitlich versetzt an mehreren analogen Proben oder
aber auch mehrmals an derselben Probe eingesetzt werden kann.
Die Möglichkeit einer mehrmaligen Injektion von Hypochlorit
zur selben Probe ergibt sich daraus, daß Hypochlorite sehr
schnell und vollständig mit Luminol reagieren, H₂O₂ dabei nur
minimal verbraucht wird und durch den relativen Überschuß von
Luminol sich dessen Konzentration kaum nachweisbar ändert.
Durch handelsübliche programmierbare Chemoluminometer mit
Injektionstechnik ist die wiederholte, zeitlich versetzte
Anwendung des Verfahrens in einfacher Weise realisierbar.
Sind zusätzlich noch andere organische Substanzen wie
Proteine in der Probenlösung enthalten, so daß in Konkurrenz
zur Luminolreaktion eine Reaktion des Hypochlorit mit diesen
organischen Substanzen möglich wird, ändert sich nicht die
lineare Beziehung zwischen H₂O₂-Konzentration und
Lumineszenzintensität. Bei stark verdünnten Proteinlösungen
ist diese Reaktion vernachlässigbar gering und die
Chemolumineszenzintensitäten sind noch unmittelbar mit der
H₂O₂-Konzentration korreliert. Bei höheren
Proteinkonzentrationen muß aber mittels einer
Referenzbestimmung an einer Probe ohne Proteingehalt eine
Eichung vorgenommen werden.
Zusammenfassend ist das Verfahren durch folgende Eigenschaften
und Vorteile charakterisiert:
- a) Die Chemolumineszenz ist über drei Größenordnungen proportinal der H₂O₂-Konzentration.
- b) Am Gesamtsignal haben wasserstoffperoxidunabhängige Lichtprozesse keinen Anteil, woraus eine hohe Spezifität resultiert.
- c) Die untere Nachweisgrenze liegt bei 2*10-9 mol/l H₂O₂.
- d) Die Meßdauer mit 2 s sehr kurz.
- e) Die Wechselwirkungen des Systems mit dem nachzuweisenden H₂O₂ sind gering.
- f) Unter optimalen Bedingungen kann das Verfahren mit hoher Präzision durchgeführt werden (Standardabweichung <3%).
Im folgenden sollen einige konkrete Einsatzmöglichkeiten des
Verfahrens mit ihren Vorteilen beschrieben werden.
Das Enzym Katalase ist nicht durch sein Substrat H₂O₂ sättigbar
und weist demzufolge eine ausschließlich exponentielle Kinetik
des H₂O₂-Abbaus auf. Die Aktivität wird deshalb durch die
Geschwindigkeitskonstante (k) der Exponentialfunktion
ausgedrückt. Diese Aktivität ergibt, wenn auf das
Molekulargewicht bezogen, die spezifische Aktivität. Im
Prinzip sind für die Aktivitätsbestimmung zwei Messungen von
H₂O₂-Konzentrationen zu unterschiedlichen Zeitpunkten
ausreichend, wobei ausschließlich die Relation der beiden
Meßwerte von Bedeutung ist.
In mehrere Probenröhrchen werden 800 µl einer
Luminollösung (5*10-5 mol/l Luminol; 10-50 mmol/l
Phosphatpuffer) gegeben. Im Anschluß erfolgt die Zugabe der zu
bestimmenden Probe (50 µl) unbekannter Katalasekonzentration.
Nun wird mittels eines Injektors H₂O₂ (100 µl einer Stammlösung
von 10-5 mol/l H₂O₂) als Substrat injiziert und nach einer exakt
gemessenen Zeit erfolgt über einen zweiten Injektor die
Hypochloritinjektion (50 µl einer Stammlösung von 2*10-5 mol/l
NaOCl), wobei die Lumineszenzemission über eine Zeit von 2 s
gemessen wird. Dies muß für mindestens zwei unterschiedliche
Zeiten (t₁ und t₂) realisiert werden. Dabei ist es auch
möglich, die zweite Bestimmung an derselben Probe
durchzuführen. Da die absoluten H₂O₂-Konzentrationen ohne
Bedeutung sind, können die Lumineszenzintensitäten (I₁ und I₂)
direkt ins Verhältnis gesetzt werden:
Weiterhin wird vom Meßprogramm überprüft, ob die Meßwerte
außerhalb des zulässigen linearen Bereichs liegen. Die
Experimente wurden mit einem programmierten Chemoluminometer
mit Injektionstechnik und Probenwechselautomatik (Autolumat LB
953; Berhold/BRD) durchgeführt. Abb. 4 zeigt für eine
Katalasekonzentration von 7,4*10-10 mol/l (33 000 U/mg) den mit
dargelegtem Verfahren bestimmten zeitlichen Verlauf der H₂O₂-Konzentration.
Die Darstellung erfolgt semilogarithmisch zur
Veranschaulichung der Enzymkinetik.
Das Verfahren ist durch folgende Vorteile, insbesondere
gegenüber spektrophotometrischen Verfahren, gekennzeichnet:
- a) Es kann mit niedrigen H₂O₂-Konzentrationen gearbeitet
werden, wodurch erstens eine Enzyminaktivierung ausgeschlossen
wird und
zweitens keine die Lichtabsorption störenden Sauerstoffblasen entstehen. - b) Es können auch höhere Katalasekonzentrationen gemessen werden, da keine störenden Sauerstoffblasen trotz der hohen Enzymaktivität entstehen (großer Meßbereich).
- c) Da in eine Probe mehrere Hypochloritinjektionen erfolgen können, ohne das Enzym zu inaktivieren und durch artifizielle H₂O₂-Entstehung die Meßwerte zu verfälschen, kann sehr materialsparend gearbeitet werden.
20 Ansätze einer Luminollösung (5*10-5 mol/l Luminol; 800 µl 10 mM
Hanks II) werden mit 50 µl einer Zellsuspension von
Phagozyten (Endkonzentration von 20 000 neutrophilen
Granulozyten/ml) gleicher Menge bestückt. Über einen Injektor
erfolgt die Zugabe eines Zellstimulators (z. B. 100 µl einer
Stammlösung 10-5 mol/l FMLP). Im Anschluß erfolgt für jeden
Ansatz eine einmalige Hypochloritinjektion à 50 µl einer
NaOCl-Stammlösung von 2*10-4-2*10-5 mol/l jeweils zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Stimulation. Die
Chemolumineszenz wird über eine Dauer von 2 s gemessen.
Abb. 5 zeigt den Verlauf einer derartigen Aktivitätskurve
für drei unterschiedliche Zellzahlen, so daß der
Aktivitätsverlauf über einen Zeitraum von 20 min mit 20
Meßwerten dokumentiert wird. Die Luminszenzmessungen wurden
mit einem Autolumat LB 953 (Berthold/BRD) durchgeführt. Abb. 5
demonstriert, daß schon bei äußerst niedrigen
Zellonzentrationen eine Zellaktivität nachweisbar ist. Aus
diesen Gründen genügen bereits Zellkonzentrationen von 1000
Zellen/ml für den Nachweis der respiratory-burst-Aktivität.
Der Aktivitätsnachweis kann auch an verdünntem Vollblut
durchgeführt werden, wodurch die umständliche Zellpräparation
entfällt und mit kleinsten Blutmengen gearbeitet werden kann
(µl-Bereich).
Mit dem dargelegten Verfahren kann der Einfluß von
Substanzen wie Pharmaka auf die H₂O₂-Bildung von Phagozyten
untersucht werden. Abb. 6/Kurve 2 veranschaulicht
beispielsweise den Einfluß von zugegebener Katalase (7,4*10-9 mol/l)
auf die H₂O₂-Konzentration (Kurve 1 ist
Vergleichsmessung ohne Katalasezusatz). In Abb. 7/Kurve 2 wird
der Einfluß von Natriumazid (10-4 mol/l NaH₃), einem Inhibitor
von H₂O₂-zerstörenden Enzymen, demonstriert. Durch dessen
Wirkung kommt es zur Akkumulation von H₂O₂ (Kurve 1 stellt die
Referenzwerte ohne Azidzusatz dar).
Insgesamt ist das Verfahren durch folgende Vorteile,
insbesondere gegenüber anderen Chemolumineszenzverfahren,
gekennzeichnet:
- a) Das Verfahren ermöglicht einen sehr empfindlichen Nachweis der Zellaktivität.
- b) Im Gegensatz zu Peroxidasemethoden ist dargelegtes Verfahren sehr spezifisch für H₂O₂.
- c) Durch dargelegte Anwendung kann der reale H₂O₂-Konzentrationsverlauf von stimulierten Zellen beobachtet werden, da durch das Verfahren selber kein H₂O₂-Entzug und ein Eingriff in das Regulationssystem erfolgt, wie es bei Peroxidaseverfahren der Fall ist.
- d) Der Arbeitsbereich dargelegter Methode liegt im Bereich der von Zellen produzierten H₂O₂-Mengen.
- e) Nach Vorversuchen an zellfreien Proben kann die Wirkung eines Pharmakons direkt auf die H₂O₂-Produktion phagozytierender Zelle bestimmt werden.
Es wird eine Lösung A hergestellt, welche 5*10-4 mol/l Luminol
und 5*10-12 M Katalase (33 000 U/mg) in 50 mM Phosphatpuffer
enthält. Durch den Katalasezusatz werden H₂O₂-Verunreinigungen
beseitigt. Die Katalase muß aus diesem Grund mindestens eine
Stunde einwirken. Der Puffer muß einen stabilen pH-Wert über
7,0 garantieren. Eine zweite Lösung enthält eine 2*10-5 M
NaOCl-Lösung und ebenfalls 5*10-12 mol/l Katalase (33 000 U/mg).
Anschließend wird das Probegefäß mit 100 µl der Lösung A sowie
850 µl der zu untersuchenden Probelösung bestückt. Unmittelbar
danach erfolgt die Injektion der Lösung B in das Probengefäß
mit gleichzeitiger Messung der Lumineszenzintensität. Durch
die derartige Verdünnung der Katalase ist diese nicht mehr in
der Lage, die H₂O₂-Konzentration der Lösung zu beeinflussen.
Die H₂O₂-Konzentration korreliert streng mit der
Lichtintensität und kann unmittelbar aus Abb. 3 oder
entsprechend den Bedingungen einer anderen Eichkurve ermittelt
werden. Der Wasserstoffperoxidgehalt der Originalprobe wird
unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors errechnet.
Bedingt durch die kurze Meßdauer läßt sich die H₂O₂-Konzentration
wie in den Beispielen 1 und 3 auch bei
zeitlichen Instabilitäten bestimmen. Bei stärkeren organischen
Verunreinigungen muß wie oben beschrieben eine Korrektur
erfolgen, da Hypochlorit in Konkurrenz zur Luminoloxidation
auch mit freien funktionellen Gruppen reagieren kann.
- a) Durch die kurze Meßdauer bedingt können auch instabile H₂O₂-Konzentrationen bestimmt werden.
- b) Der optimale Arbeitsbereich des Verfahrens liegt im Bereich der natürlichen H₂O₂-Konzentration obengenannter wäßriger Lösungen.
- c) Durch seine hohe Spezifität ist das Verfahren auch bei komplexen Nachweisproben anwendbar.
Abb. 1 Prinzip der Wasserstoffperoxidanalyse mit dem System
Luminol/Hypochlorit.
Abb. 2 Lumineszenzkinetik der Reaktion von NaOCl mit Luminol.
Bedingungen: 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l NaOCl; 50 mM
Phosphatpuffer mit pH von 7,4.
Abb. 3 Beispiel einer Eichkurve zur Wasserstoffperoxidanalyse
mit dem System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 5*10-5 mol/l Luminol;
pH von 7,4.
Abb. 4 Wasserstoffperoxidabbau durch Katalase als Funktion der
Zeit, bestimmt mit dem System NaOCl/Luminol. Bedingungen: 3*10-10 mol/l
Katalase; 5*10-5 mol/l Luminol; 2,5*10-6 mol/l NaOCl; pH
von 7,4.
Abb. 5 Wasserstoffperoxidkonzentration einer
Granulozytenpopulation als Funktion der Zeit, bestimmt mit dem
System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l
NaOCl; 10-6 mol/l FMLP; pH von 7,4; 1 - 12 000 Zellen/ml;
2 - 3000 Zellen/ml.
Abb. 6 Einfluß von Katalase auf die
Wasserstoffperoxidproduktion einer Granulozytenpopulation,
bestimmt mit dem System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 12 000
Zellen/ml; 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l NaOCl; 10-6 mol/l FMLP;
pH von 7,4; 1 - ohne Katalase; 2 - mit 7,4*10-9 mol/l Katalase.
Abb. 7 Einfluß von Natriumazid auf die
Wasserstoffperoxidproduktion einer Granulozytenpopulation,
bestimmt mit dem System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 12 000
Zellen/ml; 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l NaOCl; 10-6 mol/l FMLP;
pH von 7,4; 1 - ohne Azid; 2 - mit 10-4 mol/l Natriumazid.
Claims (9)
1. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von H₂O₂ in wäßrigen
Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) Luminol als Lumineszenzindikator mit der zu untersuchenden Probenlösung gemischt,
- b) durch Zugabe einer Hypochloritlösung die Reaktion mit Luminol gestartet und
- c) die dabei entstehende Chemolumineszenz gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
sich der pH der Probenlösung im basischen Bereich befindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der pH der luminolhaltigen Probenlösung durch einen Puffer
stabilisiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß Hypochlorit bezogen auf das Probenvolumen in einer
Konzentration von 5*10-7 bis 1*10-4 mol/l zur Anwendung kommt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Luminolkonzentration weniger als 10-4 mol/l beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Hypochloritlösung über einen Injektor der Probenlösung
zugegeben wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zugabe der Hypochloritlösung zur H₂O₂-Bestimmung
zeitlich versetzt mehrmals an derselben Probe vorgenommen
wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß als Hypochlorit eine NaOCl-Lösung zur Anwendung kommt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zugabe einer Katalase zur Hypochloritlösung und zur
Luminollösung erfolgt, so daß die Endkonzentration der
Katalase (33 000 U/mg) nach der Hypochloritinjektion weniger
als 1*10-11 mol/l Katalase beträgt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19934312097 DE4312097A1 (de) | 1993-04-08 | 1993-04-08 | Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19934312097 DE4312097A1 (de) | 1993-04-08 | 1993-04-08 | Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4312097A1 true DE4312097A1 (de) | 1994-10-13 |
Family
ID=6485401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19934312097 Withdrawn DE4312097A1 (de) | 1993-04-08 | 1993-04-08 | Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4312097A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19503710A1 (de) * | 1995-02-04 | 1996-12-05 | Franke Bernd | Neuartiger Diabetes-Früherkennungstest zum Nachweis von Glucose im Harn |
-
1993
- 1993-04-08 DE DE19934312097 patent/DE4312097A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19503710A1 (de) * | 1995-02-04 | 1996-12-05 | Franke Bernd | Neuartiger Diabetes-Früherkennungstest zum Nachweis von Glucose im Harn |
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|---|---|---|---|
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