DE4312097A1 - Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid

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    • G01N31/228Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators for peroxides

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung niedriger Konzentrationen von H₂O₂ mittels Luminol. Dabei wird Luminol durch ein Hypochlorit zu einem Zwischenprodukt oxidiert, welches über eine Reaktion mit H₂O₂ eine Chemolumineszenz emittiert, deren Intensität proportional von der H₂O₂-Konzentration abhängt. Das Verfahren zeichnet sich durch eine sehr kurze Meßzeit aus und kann daher zur Bestimmung sich zeitlich ändernder H₂O₂-Konzentrationen angewandt werden. Es ist weiterhin für sehr niedrige H₂O₂-Bestimmungen unter physiologischen Bedingungen geeignet.
Derartige Bestimmungen von H₂O₂ spielen in der klinischen Analytik (z. B. Aktivitätsmessung von Phagozyten), in der Medizin (Einfluß von Pharmaka auf Immunzellen), in der Biochemie (z. B. Enzymaktivitätsbestimmungen) sowie in der Bioökologie (z. B. H₂O₂-Gehalt von Flußwasser) eine bedeutende Rolle. Auf den möglichen Anwendungsgebieten des dargelegten Verfahrens sind bisher unterschiedliche Analysemethoden im Einsatz, welche auf der Grundlage der Spektrophotometrie, der Fluoreszenz oder der Chemolumineszenz arbeiten.
Wasserstoffperoxid kann erstens direkt spektrophotometrisch aufgrund seiner Adsorption im UV-Bereich quantifiziert werden (Beers, R. F., Sizer, I. W.; A spectrometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase; J. Biol. Chem. 195, 1952, 133-140). Voraussetzung allerdings ist dafür, daß sich keine die Absorption störenden Substanzen in der Probe befinden und das nur sehr hohe H₂O₂-Konzentrationen (Millimolarbereich) bestimmt werden können. Dieses sehr unempfindliche Verfahren ist deshalb für viele biologische Anwendungen nicht geeignet.
Eine beträchtliche Verbesserung der Empfindlichkeit wird bei Verwendung von Chemolumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden erreicht. Prinzipiell wird bei diesen Verfahren durch Zugabe einer Peroxidase oder eines Metallkomplexes ein Fluoreszenz- oder Lumineszenzindikator durch H₂O₂ oxidiert. Fluoreszenzverfahren basieren darauf, daß durch die H₂O₂-abhängige Oxydation ein Fluoreszenzindikator akkumulieren kann, so daß die gemessene Fluoreszenz der Menge an produziertem H₂O₂ entspricht. Beispielsweise kann H₂O₂ aufgrund seiner Fähigkeit bestimmt werden, p-Hydroxyphenylazetat zu einem stabilen Produkt zu oxidieren, dessen Konzentration mittels Fluoreszenz gemessen wird (Hyslop, P. A., Sklar, L. A.; Anal. Biochem.; 141, 1984, 280-286). Das Scopoletinassay ist eine ähnlich arbeitende Methode.
Bei den Lumineszenzverfahren ist die emittierte Lichtmenge proportional der H₂O₂-Produktion. Eine von Wymann et al. angegebene Möglichkeit besteht in der Luminoloxidation durch H₂O₂ zu chemisch-angeregtem 3-Aminophthalat, welches in direkter Proportion zur H₂O₂-Konzentration Licht emittiert (Wymann, M. P., Tscharner, V. von, Deraulean, D. A., Baggiolini, M.; Chemiluminescence detection of H₂O₂ produced by human neutrophils during the respiratory burst; Anal. Biochem. 165, 1987, 317-378). Lucigenin ist ein weiterer zur Anwendung kommender Lumineszenzindikator.
In Campbell et al. (campbell, A. K.; chemiluminscence : principles and applications in biology and medicine; 1988, Weinheim. Chichester; VCH Ellis Horwood) werden noch andere Verfahren zur H₂O₂-Analyse mit ähnlicher Konzeption vorgestellt.
Die Nachteile bestehen bei diesen fluoreszenten und chemolumineszenten Methoden besonders in der geringen Spezifität. Beispielsweise konnte in Kontrollexperimenten gezeigt werden, daß peroxidasevermittelte Luminszenzreaktionen bis zu 50% durch H₂O₂-unabhängige Prozesse bedingt sind (Misra, H. P., Squatrito, P. M.; The role of superoxid anion in peroxidasecatalyzed chemiluminscence luminol; Arch. Biochem. Biophys. 215(1), 1982, 59-65/ Lock, R., Johansson, A., Orselius, K., Dahlgren, C.; Analysis of horseradish peroxidase-amplified chemiluminscence produced by human neutrophils reveals a role for the superoxide anion in the light emitting reaction; Anal. Biochem. 173(2), 1988, 450-455). Nachteilig ist weiter, daß für eine maximale Lumineszenzemission und eine schnelle Kinetik stark basische pH-Werte nötig sind. In der Regel benötigen herkömmliche Verfahren eine lange Meßzeit, welche im Minutenbereich liegen kann, wenn noch mit ausreichender Empfindlichkeit gearbeitet werden soll. Speziell zu den Nachteilen fluoreszenter Verfahren gehört auch die Tatsache, daß potentielle Artefakte wie Ramanstreuung und Autofluoreszenz an Zellen auftreten (Wymann, M. P., Tscharner, V. von, Deraulean, D. A., Baggiolini, M.; Chemiluminescence detection of H₂O₂ produced by human neutrophils during the respiratory burst, Anal. Biochem. 165 (1987) 31-378). Nachteilig ist weiterhin, daß durch die Zugabe der Peroxidase das Wasserstoffperoxid dabei vollständig entfernt wird. Dadurch werden Zellsysteme empfindlich gestört und der natürliche Zeitverlauf der H₂O₂-Konzentration als Summe H₂O₂-bildender und verbrauchender Prozesse kann nur verzerrt erfaßt werden.
Andere in das Anwendungsgebiet des Verfahrens fallende Methoden sind Aktivitätsbestimmungen an Enzymen, welche unter Verbrauch oder Bildung von H₂O₂ ablaufen, z. B. die Bestimmung der Katalaseaktivität. Dieses Enzym katalysiert die Zerstörung von H₂O₂ in molekularen Sauerstoff und in Wassermoleküle. Die Enzymaktivität kann folglich über die Änderungsrate der H₂O₂-Konzentration gemessen werden. Dies wird heute vorrangig durch direkte spektrophotometrische Bestimmung der H₂O₂-Konzentration realisiert (Aebi, H.; Catalase in vitro; Methods Enzymol. 105, 1984, 121-126). Da diese Methode nicht sehr empfindlich für H₂O₂ ist, muß mit relativ hohen H₂O₂-Konzentrationen gearbeitet werden. Dies bringt nachteilig mit sich, daß der entstehende Sauerstoff bei der Katalasereaktion in Gasform freigesetzt wird und damit die Absorption empfindlich stört. Von Nachteil ist weiterhin, daß höhere H₂O₂-Konzentrationen die Katalase selber inaktivieren und somit die Ergebnisse verfälscht werden.
Die Nachteile herkömmlicher Chemolumineszenzanalysen auf der Basis von Luminol können durch Betrachtung des Reaktionsmechanismus verdeutlicht werden. Nach Mer´nyi et al. (Mer´nyi, g., Lind, J., Eriksen, T. E.; Luminol chemiluminscence: Chemistry, Excitation, Emitter; J. Biolumin. Chemilumin. 5, 1990, 53-56) läuft der allgemeine Oxydationsweg von Luminol in mehreren Teilschritten ab. In einem ersten Abschnitt erfolgt die Oxydation zu einem Diazachinon. Dieses zerfällt schnell hydrolytisch und kann andernfalls auch sehr spezifisch mit H₂O₂ in ein Hydroperoxid umgewandelt werden. Letztere Reaktion führt schließlich zur Emission von Chemolumineszenz. Die Nachteile obengenannter Chemolumineszenzmethoden ergeben sich daraus, daß bei Verwendung von Katalysatoren vor allen Dingen der erste Abschnitt sehr unspezifisch und die Gesamtreaktion relativ langsam abläuft.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, auf der Basis einer Chemolumineszenzreaktion mit Luminol ein Analyseverfahren zur Quantifizierung von H₂O₂ zu entwickeln, welches durch eine kurze Meßzeit, hohe Empfindlichkeit und Spezifität charakterisiert ist.
Dies wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Hypochlorit in ein Probengefäß injiziert wird, welches neben Luminol die zu analysierende Probenlösung enthält. Luminol wird dabei zu einem Diazachinon oxydiert, welches in einer H₂O₂-spezifischen Reaktion eine Lichtemission auslöst, die dem H₂O₂-Gehalt in der Probe entspricht. Die Erfindung wird im folgenden anhand von graphischen und schematischen Darstellungen näher erläutert.
In Abb. 1 ist der prinzipielle Reaktionsmechanismus schematisiert dargestellt. Danach wird der erste Oxydationsschritt von Luminol zum Diazachinon durch ein Hypochlorit sehr schnell bewirkt, wodurch der Einfluß anderer Oxydantien auf diesen Reaktionsweg vernachlässigbar wird. Das auf diese Weise akkumulierende Diazachinon kann unter Konkurrenz mit seinem alternativen hydrolytischen Zerfall bei Anwesenheit von H₂O₂ weiter in ein Hydroperoxid umgewandelt werden, welches unter Lichtemission zum Aminophthalat zerfällt. Kontrollexperimente an komplizierten Zellsystemen zeigen, daß im Gegensatz zu oben erwähnten Verfahren die Luminszenz dieses Systems ausschließlich durch H₂O₂ bedingt wird.
Abb. 2 zeigt die Lichtkinetik einer derartigen Chemolumineszenzreaktion für verschiedene H₂O₂-Konzentrationen. Man sieht, daß unter den gewählten Bedingungen die Lichtemission bereits nach wenigen Sekunden beendet ist. Nach 2 s sind über 99% der Gesamtlichtmenge abgestrahlt, so daß eine entsprechend kurze Meßdauer für die vollständige Erfassung des Lichtsignals ausreicht. Abb. 2 verdeutlicht außerdem, daß Änderungen der H₂O₂-Konzentration die Dauer der Lichtemission nicht verlängern. Durch die sehr kurze Reaktionszeit mit Luminol wird eine mögliche Parallelreaktion des Hypochlorits mit H₂O₂ verhindert, wodurch der Verbrauch des nachzuweisenden H₂O₂ minimal ist. Durch die kurze Meßdauer wird außerdem die gemessene Lichtintensität nicht durch unspezifische Lumineszenzsignale beeinflußt. Wie für alle Luminolreaktionen zeigt die Chemolumineszenz eine pH-Abhängigkeit. Prinzipiell kann das Verfahren auch im schwach basischen Bereich eingesetzt werden, womit H₂O₂-Bestimmungen im physiologischen Milieu möglich sind. Werden Luminol und Hypochlorit zusammen mit einer Pufferlösung definierten pH-Wertes standardisiert eingesetzt, so ist die resultierende Chemolumineszenz in einem großen Bereich der H₂O₂-Konzentration linear, so daß sich bei Kenntnis von Hypochloridkonzentration, Luminolkonzentration und pH-Wert die H₂O₂-Konzentration unmittelbar aus der Chemolumineszenzintensität ergibt.
Dies wird in Abb. 3 für drei unterschiedliche Hypochloritkonzentrationen, eine Luminolkonzentration von 5*10-5 mol/l und einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 demonstriert. Die Chemolumineszenzintensitäten sind in relativen Lichteinheiten angegeben, wobei jedem Intensitätswert eine Meßdauer von 2 s zugrunde liegt. Die untere Nachweisgrenze liegt bei 2*10-9 mol/l H₂O₂. In Abhängigkeit vom Probenvolumen ist demzufolge H₂O₂ noch in einer Menge von 10-12 mol nachweisbar. Gemäß Abb. 3 können auch höhere H₂O₂-Konzentrationen im nichtlinearen Bereich bestimmt werden, wenn zuvor eine Eichkurve erstellt wurde.
Bedingt durch die sehr kurze Meßdauer und die hohe Empfindlichkeit eignet sich das Verfahren zur Bestimmung sich zeitlich ändernder, sehr niedriger H₂O₂-Konzentrationen, indem es entweder zeitlich versetzt an mehreren analogen Proben oder aber auch mehrmals an derselben Probe eingesetzt werden kann. Die Möglichkeit einer mehrmaligen Injektion von Hypochlorit zur selben Probe ergibt sich daraus, daß Hypochlorite sehr schnell und vollständig mit Luminol reagieren, H₂O₂ dabei nur minimal verbraucht wird und durch den relativen Überschuß von Luminol sich dessen Konzentration kaum nachweisbar ändert. Durch handelsübliche programmierbare Chemoluminometer mit Injektionstechnik ist die wiederholte, zeitlich versetzte Anwendung des Verfahrens in einfacher Weise realisierbar.
Sind zusätzlich noch andere organische Substanzen wie Proteine in der Probenlösung enthalten, so daß in Konkurrenz zur Luminolreaktion eine Reaktion des Hypochlorit mit diesen organischen Substanzen möglich wird, ändert sich nicht die lineare Beziehung zwischen H₂O₂-Konzentration und Lumineszenzintensität. Bei stark verdünnten Proteinlösungen ist diese Reaktion vernachlässigbar gering und die Chemolumineszenzintensitäten sind noch unmittelbar mit der H₂O₂-Konzentration korreliert. Bei höheren Proteinkonzentrationen muß aber mittels einer Referenzbestimmung an einer Probe ohne Proteingehalt eine Eichung vorgenommen werden. Zusammenfassend ist das Verfahren durch folgende Eigenschaften und Vorteile charakterisiert:
  • a) Die Chemolumineszenz ist über drei Größenordnungen proportinal der H₂O₂-Konzentration.
  • b) Am Gesamtsignal haben wasserstoffperoxidunabhängige Lichtprozesse keinen Anteil, woraus eine hohe Spezifität resultiert.
  • c) Die untere Nachweisgrenze liegt bei 2*10-9 mol/l H₂O₂.
  • d) Die Meßdauer mit 2 s sehr kurz.
  • e) Die Wechselwirkungen des Systems mit dem nachzuweisenden H₂O₂ sind gering.
  • f) Unter optimalen Bedingungen kann das Verfahren mit hoher Präzision durchgeführt werden (Standardabweichung <3%).
Im folgenden sollen einige konkrete Einsatzmöglichkeiten des Verfahrens mit ihren Vorteilen beschrieben werden.
Beispiel 1 Bestimmung der Katalaseaktivität
Das Enzym Katalase ist nicht durch sein Substrat H₂O₂ sättigbar und weist demzufolge eine ausschließlich exponentielle Kinetik des H₂O₂-Abbaus auf. Die Aktivität wird deshalb durch die Geschwindigkeitskonstante (k) der Exponentialfunktion ausgedrückt. Diese Aktivität ergibt, wenn auf das Molekulargewicht bezogen, die spezifische Aktivität. Im Prinzip sind für die Aktivitätsbestimmung zwei Messungen von H₂O₂-Konzentrationen zu unterschiedlichen Zeitpunkten ausreichend, wobei ausschließlich die Relation der beiden Meßwerte von Bedeutung ist.
In mehrere Probenröhrchen werden 800 µl einer Luminollösung (5*10-5 mol/l Luminol; 10-50 mmol/l Phosphatpuffer) gegeben. Im Anschluß erfolgt die Zugabe der zu bestimmenden Probe (50 µl) unbekannter Katalasekonzentration. Nun wird mittels eines Injektors H₂O₂ (100 µl einer Stammlösung von 10-5 mol/l H₂O₂) als Substrat injiziert und nach einer exakt gemessenen Zeit erfolgt über einen zweiten Injektor die Hypochloritinjektion (50 µl einer Stammlösung von 2*10-5 mol/l NaOCl), wobei die Lumineszenzemission über eine Zeit von 2 s gemessen wird. Dies muß für mindestens zwei unterschiedliche Zeiten (t₁ und t₂) realisiert werden. Dabei ist es auch möglich, die zweite Bestimmung an derselben Probe durchzuführen. Da die absoluten H₂O₂-Konzentrationen ohne Bedeutung sind, können die Lumineszenzintensitäten (I₁ und I₂) direkt ins Verhältnis gesetzt werden:
Weiterhin wird vom Meßprogramm überprüft, ob die Meßwerte außerhalb des zulässigen linearen Bereichs liegen. Die Experimente wurden mit einem programmierten Chemoluminometer mit Injektionstechnik und Probenwechselautomatik (Autolumat LB 953; Berhold/BRD) durchgeführt. Abb. 4 zeigt für eine Katalasekonzentration von 7,4*10-10 mol/l (33 000 U/mg) den mit dargelegtem Verfahren bestimmten zeitlichen Verlauf der H₂O₂-Konzentration. Die Darstellung erfolgt semilogarithmisch zur Veranschaulichung der Enzymkinetik.
Das Verfahren ist durch folgende Vorteile, insbesondere gegenüber spektrophotometrischen Verfahren, gekennzeichnet:
  • a) Es kann mit niedrigen H₂O₂-Konzentrationen gearbeitet werden, wodurch erstens eine Enzyminaktivierung ausgeschlossen wird und
    zweitens keine die Lichtabsorption störenden Sauerstoffblasen entstehen.
  • b) Es können auch höhere Katalasekonzentrationen gemessen werden, da keine störenden Sauerstoffblasen trotz der hohen Enzymaktivität entstehen (großer Meßbereich).
  • c) Da in eine Probe mehrere Hypochloritinjektionen erfolgen können, ohne das Enzym zu inaktivieren und durch artifizielle H₂O₂-Entstehung die Meßwerte zu verfälschen, kann sehr materialsparend gearbeitet werden.
Beispiel 2 Bestimmung von H₂O₂ an stimulierten Phagozyten als Funktion der Zeit/ Einfluß von Substanzen auf die H₂O₂-Produktion phagozytierender Zellen
20 Ansätze einer Luminollösung (5*10-5 mol/l Luminol; 800 µl 10 mM Hanks II) werden mit 50 µl einer Zellsuspension von Phagozyten (Endkonzentration von 20 000 neutrophilen Granulozyten/ml) gleicher Menge bestückt. Über einen Injektor erfolgt die Zugabe eines Zellstimulators (z. B. 100 µl einer Stammlösung 10-5 mol/l FMLP). Im Anschluß erfolgt für jeden Ansatz eine einmalige Hypochloritinjektion à 50 µl einer NaOCl-Stammlösung von 2*10-4-2*10-5 mol/l jeweils zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Stimulation. Die Chemolumineszenz wird über eine Dauer von 2 s gemessen.
Abb. 5 zeigt den Verlauf einer derartigen Aktivitätskurve für drei unterschiedliche Zellzahlen, so daß der Aktivitätsverlauf über einen Zeitraum von 20 min mit 20 Meßwerten dokumentiert wird. Die Luminszenzmessungen wurden mit einem Autolumat LB 953 (Berthold/BRD) durchgeführt. Abb. 5 demonstriert, daß schon bei äußerst niedrigen Zellonzentrationen eine Zellaktivität nachweisbar ist. Aus diesen Gründen genügen bereits Zellkonzentrationen von 1000 Zellen/ml für den Nachweis der respiratory-burst-Aktivität. Der Aktivitätsnachweis kann auch an verdünntem Vollblut durchgeführt werden, wodurch die umständliche Zellpräparation entfällt und mit kleinsten Blutmengen gearbeitet werden kann (µl-Bereich).
Mit dem dargelegten Verfahren kann der Einfluß von Substanzen wie Pharmaka auf die H₂O₂-Bildung von Phagozyten untersucht werden. Abb. 6/Kurve 2 veranschaulicht beispielsweise den Einfluß von zugegebener Katalase (7,4*10-9 mol/l) auf die H₂O₂-Konzentration (Kurve 1 ist Vergleichsmessung ohne Katalasezusatz). In Abb. 7/Kurve 2 wird der Einfluß von Natriumazid (10-4 mol/l NaH₃), einem Inhibitor von H₂O₂-zerstörenden Enzymen, demonstriert. Durch dessen Wirkung kommt es zur Akkumulation von H₂O₂ (Kurve 1 stellt die Referenzwerte ohne Azidzusatz dar).
Insgesamt ist das Verfahren durch folgende Vorteile, insbesondere gegenüber anderen Chemolumineszenzverfahren, gekennzeichnet:
  • a) Das Verfahren ermöglicht einen sehr empfindlichen Nachweis der Zellaktivität.
  • b) Im Gegensatz zu Peroxidasemethoden ist dargelegtes Verfahren sehr spezifisch für H₂O₂.
  • c) Durch dargelegte Anwendung kann der reale H₂O₂-Konzentrationsverlauf von stimulierten Zellen beobachtet werden, da durch das Verfahren selber kein H₂O₂-Entzug und ein Eingriff in das Regulationssystem erfolgt, wie es bei Peroxidaseverfahren der Fall ist.
  • d) Der Arbeitsbereich dargelegter Methode liegt im Bereich der von Zellen produzierten H₂O₂-Mengen.
  • e) Nach Vorversuchen an zellfreien Proben kann die Wirkung eines Pharmakons direkt auf die H₂O₂-Produktion phagozytierender Zelle bestimmt werden.
Beispiel 3 H₂O₂-Bestimmung wäßriger Lösungen (Trinkwasser, Flußwasser, Körperflüssigkeit etc.)
Es wird eine Lösung A hergestellt, welche 5*10-4 mol/l Luminol und 5*10-12 M Katalase (33 000 U/mg) in 50 mM Phosphatpuffer enthält. Durch den Katalasezusatz werden H₂O₂-Verunreinigungen beseitigt. Die Katalase muß aus diesem Grund mindestens eine Stunde einwirken. Der Puffer muß einen stabilen pH-Wert über 7,0 garantieren. Eine zweite Lösung enthält eine 2*10-5 M NaOCl-Lösung und ebenfalls 5*10-12 mol/l Katalase (33 000 U/mg). Anschließend wird das Probegefäß mit 100 µl der Lösung A sowie 850 µl der zu untersuchenden Probelösung bestückt. Unmittelbar danach erfolgt die Injektion der Lösung B in das Probengefäß mit gleichzeitiger Messung der Lumineszenzintensität. Durch die derartige Verdünnung der Katalase ist diese nicht mehr in der Lage, die H₂O₂-Konzentration der Lösung zu beeinflussen.
Die H₂O₂-Konzentration korreliert streng mit der Lichtintensität und kann unmittelbar aus Abb. 3 oder entsprechend den Bedingungen einer anderen Eichkurve ermittelt werden. Der Wasserstoffperoxidgehalt der Originalprobe wird unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors errechnet. Bedingt durch die kurze Meßdauer läßt sich die H₂O₂-Konzentration wie in den Beispielen 1 und 3 auch bei zeitlichen Instabilitäten bestimmen. Bei stärkeren organischen Verunreinigungen muß wie oben beschrieben eine Korrektur erfolgen, da Hypochlorit in Konkurrenz zur Luminoloxidation auch mit freien funktionellen Gruppen reagieren kann.
Vorteile
  • a) Durch die kurze Meßdauer bedingt können auch instabile H₂O₂-Konzentrationen bestimmt werden.
  • b) Der optimale Arbeitsbereich des Verfahrens liegt im Bereich der natürlichen H₂O₂-Konzentration obengenannter wäßriger Lösungen.
  • c) Durch seine hohe Spezifität ist das Verfahren auch bei komplexen Nachweisproben anwendbar.
Legenden
Abb. 1 Prinzip der Wasserstoffperoxidanalyse mit dem System Luminol/Hypochlorit.
Abb. 2 Lumineszenzkinetik der Reaktion von NaOCl mit Luminol. Bedingungen: 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l NaOCl; 50 mM Phosphatpuffer mit pH von 7,4.
Abb. 3 Beispiel einer Eichkurve zur Wasserstoffperoxidanalyse mit dem System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 5*10-5 mol/l Luminol; pH von 7,4.
Abb. 4 Wasserstoffperoxidabbau durch Katalase als Funktion der Zeit, bestimmt mit dem System NaOCl/Luminol. Bedingungen: 3*10-10 mol/l Katalase; 5*10-5 mol/l Luminol; 2,5*10-6 mol/l NaOCl; pH von 7,4.
Abb. 5 Wasserstoffperoxidkonzentration einer Granulozytenpopulation als Funktion der Zeit, bestimmt mit dem System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l NaOCl; 10-6 mol/l FMLP; pH von 7,4; 1 - 12 000 Zellen/ml; 2 - 3000 Zellen/ml.
Abb. 6 Einfluß von Katalase auf die Wasserstoffperoxidproduktion einer Granulozytenpopulation, bestimmt mit dem System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 12 000 Zellen/ml; 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l NaOCl; 10-6 mol/l FMLP; pH von 7,4; 1 - ohne Katalase; 2 - mit 7,4*10-9 mol/l Katalase.
Abb. 7 Einfluß von Natriumazid auf die Wasserstoffperoxidproduktion einer Granulozytenpopulation, bestimmt mit dem System Luminol/NaOCl. Bedingungen: 12 000 Zellen/ml; 5*10-5 mol/l Luminol; 10-6 mol/l NaOCl; 10-6 mol/l FMLP; pH von 7,4; 1 - ohne Azid; 2 - mit 10-4 mol/l Natriumazid.

Claims (9)

1. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von H₂O₂ in wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) Luminol als Lumineszenzindikator mit der zu untersuchenden Probenlösung gemischt,
  • b) durch Zugabe einer Hypochloritlösung die Reaktion mit Luminol gestartet und
  • c) die dabei entstehende Chemolumineszenz gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich der pH der Probenlösung im basischen Bereich befindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der luminolhaltigen Probenlösung durch einen Puffer stabilisiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Hypochlorit bezogen auf das Probenvolumen in einer Konzentration von 5*10-7 bis 1*10-4 mol/l zur Anwendung kommt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Luminolkonzentration weniger als 10-4 mol/l beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hypochloritlösung über einen Injektor der Probenlösung zugegeben wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe der Hypochloritlösung zur H₂O₂-Bestimmung zeitlich versetzt mehrmals an derselben Probe vorgenommen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Hypochlorit eine NaOCl-Lösung zur Anwendung kommt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe einer Katalase zur Hypochloritlösung und zur Luminollösung erfolgt, so daß die Endkonzentration der Katalase (33 000 U/mg) nach der Hypochloritinjektion weniger als 1*10-11 mol/l Katalase beträgt.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19503710A1 (de) * 1995-02-04 1996-12-05 Franke Bernd Neuartiger Diabetes-Früherkennungstest zum Nachweis von Glucose im Harn

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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