DE4244561A1 - Diagnostikum für cancerogene Erkrankungen, Verfahren zu dessen Isolierung sowie Mittel und Verfahren zur Bestimmung des Diagnostikumgehalts in Flüssigkeiten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Diagnostikum für cancerogene Erkrankungen, ein Verfahren zu dessen Isolierung sowie ein Mittel und ein Verfahren zur Bestimmung des Diagnostikumgehalts in Flüssigkeiten.

Krebs ist eine oft tödlich verlaufende Krankheit, der immer mehr Menschen zum Opfer fallen. Es gibt daher seit langem viele Bemühungen, geeignete Diagnoseverfahren zur möglichst frühen Erkennung von Krebserkrankungen zu entwickeln, da in diesem Fall die Heilungsaussichten am größten sind.

Dykstra, W.G. und Herbst, E.J. (1965), Spermidine in regenerating liver: relation to rapid synthesis of ribonucleic acid, Science 149, 428-429, sowie Russel, D. und Snyder, S.H. (1968), Amine synthesis in rapidly growing tissues: ornithine decarboxylase activity in regenerating rat liver, chick embryo, and various tumors, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 60, 1420-1427, haben bereits vor vielen Jahren festgestellt, daß biogene Polyamine wie Putrescin (1,4- Diamino-butan), Spermidin (N-(3-Aminopropyl)-1,4- diaminobutan und Spermin (N,N′-bis-(3-Aminopropyl)-1,4- diaminobutan) in schnell wachsendem Gewebe, wie Krebsgewebe, im Vergleich zu langsamer wachsendem Gewebe in erhöhtem Maße synthetisiert werden.

Seit von Russell, D.H. (1971), Increased polyamine concentrations in the urine of human cancer patients, Nature (New Biol.) 233, 144-145, erstmals festgestellt worden war, daß im Urin von krebskranken Patienten erhöhte Konzentrationen an biogenen Polyaminen nachweisbar sind, wurde angenommen, daß die Polyaminkonzentration in den Körperflüssigkeiten von Patienten als biochemische Marker für die Diagnose von verschiedenen Krebserkrankungen, wie Gewebe- oder Blutkrebs, verwendet werden können.

Entsprechende Verfahren sind bei Russel D.H. und Russel, S.D. (1975), Relative usefulness of measuring polyamines in serum, plasma, and urine as biochemical markers of cancer, Clin. Chem. 21, 860-863, Bachrach, U. (1976), Polyamines as chemical markers of malignancy, Ital. J. Biochem. 25, 77-93, Fujita, K. Nagatsu. T., Maruta, K., Ito, M., Senba, H., und Miki, K. (1976), Urinary putrescine, spermidine, and spermine in human blood and solid cancers and in an experimental gastric tumor of rats, Cancer Res. 36, 1320-1324, und Maruta, K., Teradaira, R., Watanabe, N., Nagatsu, T., Asano, M., Yamamoto, K. Matsumoto, T., Shinoya, Y., und Fujita, K. (1989), Simple, sensitive assay of polyamines by high­ performance liquid chromatography with electrochemical detection after post-column reaction with immobilized polyamine oxidase, Clin. Chem. 35, 1694-1696, beschrieben.

Weiterhin hatten Nixon, J.C. (1985), Naturally occuring pterins, in "Folates und Pterins" (Blakley, R.L. und Benkovic, S.J. eds), Band 2, Seiten 1-42, John Wiley & Sons, New York und Hausen, A., Fuchs, D., Reibnegger, G., Werner, E.R., und Wachter, H (1989), Neopterin in clinical use, Pteridines 1, 3-10, gefunden, daß der Neopterinspiegel im Urin und Blutserum von Krebspatienten erhöht ist. Neopterin hat die folgende chemische Strukturformel:

Schließlich berichten Rokos, H., Rokos, K., Frisius, H. und Kirstaedter, H.-J. (1980), Altered urinary excretion of pteridines in neoplastic disease, determination of biopterin, neopterin, xanthopterin, and pterin, Clin. Chim. Acta 105, 275-286, Stea, B., Halpern, R.M., Halpern, B.C. and Smith, R.A. (1981), Urinary excretion levels of unconjugated pterins in cancer patients and normal individuals, Clin. Chim. Acta 113, 231-242, sowie Nagatsu, T., Yamaguchi, T., Sawada, M., Fujita, K., Shinpo, K., Ito, M., Hirano, M., Sugimoto, T., Matsuura, S., and Akino, M. (1984), Elevated levels of polyamines and radioimmunoassayable 6-hydrooxymethylpterin­ like compound in urine from cancer patients, Biogenic Amines 1, 51-62, daß Biopterin sowie einige andere Pteridine in den Körperflüssigkeiten von Krebspatienten teilweise in erhöhtem Male gegenüber Gesunden vorliegen. Die Formel für Biopterin ist nachfolgend angegeben.

Bei allen vorgenannten Markern und Verfahren ist jedoch von Nachteil, daß die isolierten Substanzen nicht zwangsläufig auf eine Krebserkrankung hinweisen, da erhöhte Mengen an den genannten Substanzen auch auf die Proliferation gesunder schnellwachsender Gewebe zurückzuführen sein könnten.

Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, einen körpereigenen Marker bzw. Indikator zur sicheren und spezifischen Krebsdiagnose anzugeben. Darüber hinaus soll ein Verfahren zur Isolierung und ein Mittel zur quantitativen Bestimmung des Diagnostikums zur Verfügung gestellt werden.

Diese Aufgabe löst die Erfindung durch das im unabhängigen Patentanspruch 1 angegebene Diagnostikum 2-(3-Aminopropyl)­ amino-4-hydroxy-6-[(1′R,2′S)-1′,2′-dihydroxy-propyl]­ pteridin, im folgenden Oncopterin genannt, das im unabhängigen Patentanspruch 5 angegebene Mittel sowie die in den unabhängigen Patentansprüchen 6, 12, 14 und 19 angegebenen Verfahren. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, Aspekte und Details der Erfindung ergaben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung.

Oncopterin hat die folgende Strukturformel:

Oncopterin ist ein biogenes Amin, dessen Vorkommen vorliegend zum ersten Mal beschrieben wird. Die Verbindung weist eine einzigartige Struktur auf. Sie enthält sowohl einen Polyaminrest als auch das Pteringerüst. Beide Komponenten sind isoliert bereits mit mäßigem Erfolg als Indikatoren für Krebserkrankungen beim Menschen eingesetzt worden. Mit Oncopterin liegt nun zum ersten Mal eine Verbindung vor, die beide Indikatoren vereinigt. Oncopterin reichert sich bei Krebspatienten im Vergleich zu gesunden Personen in allen Körperflüssigkeiten an, im Hinblick auf eine routinemäßige Bestimmung der Konzentration hat es sich aber am günstigsten erwiesen, wenn die Oncopterinkonzentration aus dem Urin von Patienten bestimmt wird.

Die chemische Verwandtschaft mit den natürlich vorkommenden vorgenannten Substanzen Neopterin und Biopterin ist augenfällig. Dennoch ist es vorliegend zum ersten Mal gelungen, Oncopterin als natürlich vorkommende Substanz, insbesondere beim Menschen, nachzuweisen, zu isolieren und die chemische Struktur aufzuklären.

In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 verschiedene HPLC-Chromatogramme (A bis D) einer Urinprobe eines an Leberkrebs erkrankten Patienten,

Fig. 2 das UV-Spektrum von Oncopterin-acetat in Wasser,

Fig. 3 das ¹H NMR-Spektrum bei 270 MH und 50°C in D₂O von Oncopterin-acetat, wobei jedes Signal dem Proton oder den Protonen des entsprechenden Kohlenstoffatoms in der gezeigten Strukturformel zugeordnet ist, und

Fig. 4 das CD-Spektrum von Oncopterin-acetat in Wasser.

Durch seine Spezifität als Indikator für Krebserkrankungen ist das Oncopterin ein hervorragendes Diagnostikum für cancerogene Erkrankungen. Ein besonders hoher Anteil dieser Verbindung findet sich in den Körperflüssigkeiten (Körperliquor) von Patienten, die an einem Gewebekrebs, wie Lungen-, Leber-, Blasen-, Prostata- und/oder Eierstockkrebs, erkrankt sind. Auch bei Blutkrebserkrankungen, wie diversen Leukämiearten, ist der Spiegel an Oncopterin im Körperliquor der Erkrankten gegenüber gesunden Vergleichspersonen erhöht, wenn auch nicht in dem Male wie bei Gewebekrebspatienten.

Das Diagnostikum kann aus jedem Körperliquor, wie Blut, Lymphe oder Urin gewonnen werden. Am einfachsten und ohne Eingriffe in den menschlichen Körper ist eine Bestimmung des Oncopteringehalts im Urin möglich, weshalb es besonders bevorzugt ist, das Oncopterin aus dem Urin zu gewinnen.

In natürlicher Umgebung bzw. auch in isolierter Form liegt das Diagnostikum häufig als Säureamid vor. Es hat sich daher als günstig erwiesen, wenn das Diagnostikum in dieser Form verwendet wird.

Zur Bestimmung einer unbekannten Konzentration an Oncopterin im Körperliquor eines Menschen kann eine Eichkurve verwendet werden, die mit Hilfe bekannter Mengen der Verbindung erstellt worden ist. Diese bekannten Mengen können aus natürlich gewonnenem und/oder synthetisch hergestelltem Oncopterin bestehen. Bei der Erstellung der Eichkurve werden mit optischen Methoden die Werte für steigende Verdünnungen eines Mittels, das Oncopterin enthält, bestimmt. Die unbekannte Konzentration einer oncopterinenthaltenden Flüssigkeit läßt sich dann durch Vergleich mit den Standardkonzentrationen der Eichkurve leicht feststellen.

Die Isolierung von reinem Oncopterin aus menschlichem Urin war nicht einfach, da aufgrund der großen strukturellen Ähnlichkeiten mit Neopterin und Biopterin eine Abtrennung von diesen Substanzen Schwierigkeiten bereitete. Es wurde aber ein Verfahren gefunden, mittels dessen eine Abtrennung des Oncopterin von anderen Pteridinen ermöglicht wurde. Dabei wurde folgendermaßen vorgegangen:

80 l Urin von Patienten mit einem malignen Lymphom wurden in einem Rotationsverdampfer auf 2 l eingeengt.

Die eingeengte Lösung wurde anschließend zur Abtrennung eines Niederschlags abzentrifugiert. 50 ml des Überstandes wurden auf eine mit DEAE (Diethylaminoethyl)-Cellulofine gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von 10 und einer Länge von 50 cm, die von der Seikagaku Corp. bezogen worden war, aufgetragen. Die Säule wurde daraufhin so lange mit Wasser gewaschen, bis das Eluat neutral war. Danach wurde die Säule mit 2,88%igem Ammoniak eluiert und das Eluat auf etwa 100 ml im Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde dann auf eine mit CM (Carboxymethyl)-Cellulofine gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von 10 und einer Länge von 50 cm, bezogen von der Seikagaku Corp., aufgetragen. Die Säule wurde sodann zuerst mit 3 l Wasser gewaschen und anschließend mit 3 l 3%iger Ameisensäure eluiert. Der Rest des vorgenannten Überstandes wurde in entsprechender Weise fraktioniert.

Die ameisensäurehaltigen Eluate wurden vereinigt und im Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser gelöst und in zwei 25 ml Portionen auf eine Florisil (Magnesiumsilikt)-Säule (Innendurchmesser 2, Länge 40 cm, bezogen von Wako Pure Chemical Industries) aufgetragen. Die beiden vereinigten Eluate der beiden Portionen wurden zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 24 ml Wasser aufgenommen und in 8 ml-Portionen einer Chromatographie bei mittlerem Druck auf einer ODS CQ-3-Säule (Innendurchmesser 5, Länge 45 cm, bezogen von der Fuji Gel Corp.) unterzogen, wobei 2%ige Essigsäure als Eluiermittel eingesetzt wurde. 4,9 mg Oncopterin, vorliegend als Acetat, wurden sodann aus dem vorgenannten Eluat mittels präparativer HPLC (High Performance Liquid Chromatography, Hochleistungs­ flüssigkeitschromatographie) über eine Inertsil PREP-ODS- Säule (Innendurchmesser 20, Länge 250 mm; GL Sciences, Inc.) und anschließendem Eindampfen des Eluats gewonnen.

Eine analytische HPLC wurde alternativ dazu mittels des Geräts JASCO 880-PU durchgeführt, das mit einem JASCO FP-210 Fluoreszenzdetektor (Anregung bei 355 nm, Emission bei 450 nm) und einem SIC Chromatocorder 12 ausgerüstet war. Die Auftrennung erfolgte über eine Develosil ODS-K-5- Umkehrphasensäule (Innendurchmesser 4,6, Länge 250 mm); Nomura Chemicals), die mit einer Lösung aus 30 mM Ammoniumphosphat, pH-Wert 3,5, enthaltend 2% Methanol eluiert wurde, oder über eine Nucleosil 10 SA strong cation exchange-Säule (Innendurchmesser 4,6, Länge 250 mm; Chemco Scientific Co. Ltd.), die mit einer Lösung aus 100 mM Ammoniumphosphat, pH-Wert 3,5, enthaltend 10% Methanol, eluiert wurde. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug für beide Säulen jeweils 1 ml/min. Die Retentionsvolumina von Oncopterin und Biopterin aus Urinproben betrugen 30,79 ml und 26,96 ml für die Develosil-Säule und 10,61 ml und 3,45 ml für die Nucleosil-Säule, vergl. auch Fig. 1; die Proben A und B wurden auf einer Develosil-Säule und die Proben C und D wurden auf einer Nucleosil-Säule gewonnen. Bei den Proben B und D wurden 100 pmol Standardoncopterin zu der 5 µl Urinprobe zugegeben. Die Konzentrationen von Oncopterin und Biopterin in diesen Proben betrugen 254 µmol/mol Kreatinin bzw. 50 µmol/mol Kreatinin.

Routinegemäß wurden in die Oncopterinkonzentrationen folgendermaßen bestimmt. Der erste Morgenurin von Patienten, die an verschiedenen Arten von Krebs litten, sowie von gesunden Kontrollpersonen wurde sofort nach dem Einsammeln tiefgefroren und bei -80°C im Dunkeln bis zur Messung aufbewahrt. Da festgestellt worden war, daß sich die Oncopterinkonzentration im Urin nach Säurehydrolyse erhöht, wurden die einzelnen Proben vor der Bestimmung einer Säurebehandlung unterzogen. Dazu wurde ein Gemisch aus Urin (120 µl) und 6 M Salzsäure (60 µl) in einem mit einem Gummipfropfen verschlossenen Reagenzglas für 2 Stunden bei 100°C erhitzt. Die Lösung wurde anschließend lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 120 µl einer 30 mM Ammoniumphosphatpufferlösung, pH-Wert 3,5, aufgenommen und bei 3000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang abzentrifugiert. Ein 5 µl-Aliquot des Überstandes, der 5 µl Urin entsprach, wurde in der vorbeschriebenen HPLC-Analyse eingesetzt. Ohne den Hydrolyseschritt war im Urin von gesunden Personen überhaupt kein Oncopterin nachweisbar. Die Konzentrationen an dieser Verbindung im Urin von Krebskranken waren geringer als im hydrolierten Urin. Die Nachweisgrenze für Oncopterin liegt beim vorstehend beschriebenem Verfahren bei 0,2 pmol/5 µl Urin. Somit liegt ein hochsensitives Mikroverfahren für die routinemäßige Bestimmung von Oncopterin im Körperliquor vor.

Die ermittelten Konzentrationen an Oncopterin im Urin einer Kontrollgruppe von gesunden Personen und Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen sind in Tabelle 1 angegeben. Dabei fällt auf, daß Patienten, die an Krebserkrankungen von relativ festen Geweben, wie Leber, Prostata und Blase, litten, die höchsten Oncopterinkonzentrationen im Urin aufwiesen. Patienten mit Blutkrebsarten wie Myelomen, Lymphomen und akuter myelotischer Leukämie zeigten niedrigere Werte von Oncopterin im Urin, die jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe immer noch erheblich erhöht waren. Ein Grund für die relativ große Streuung der Werte innerhalb einer Gruppe könnte auf die unterschiedlichen klinischen Bedingungen der Krebspatienten zurückzuführen sein.

Obwohl der natürliche Syntheseweg des Oncopterins nicht bekannt ist, wurde vermutet, daß Biopterin ein möglicher Vorläufer des Oncopterins im Stoffwechsel sein könnte. Daher wurde, wie ebenfalls in Tabelle 1 angegeben, das Verhältnis der Konzentrationen der beiden Substanzen untersucht. Dabei wurde jedoch festgestellt, daß die Konzentrationen an Biopterin im Urin nur in den Fällen von Lymphonen und akuten myelotischen Leukämien gegenüber einer gesunden Kontrollgruppe erheblich erhöht waren. Ansonsten konnte keine signifikante Beziehung zwischen den beiden Verbindungen im Urin von krebskranken Patienten festgestellt werden.

Darüber hinaus ist berichtet worden, daß Neopterin bei der zellulären Immunantwort eine Rolle spielt und daher als Indikator für die Aktivierungszustand des Immunsystems dienen kann, siehe in diesem Zusammenhang den eingangs erwähnten Artikel von Hausen et al. sowie Huber, C., Batchelor, J.R., Fuchs, D., Hausen, A., Lang, A., Niederwieser, D., Reibnegger, G., Swetly, P., Troppmair, J., Wachter, H. (1984) in J. Exp. Med. 160, 310-316.

Auch wurde berichtet, daß die Neopterinkonzentration in Krebspatienten erhöht ist, vergl. die eingangs erwähnten Artikel von Nixan und Hausen et al. sowie Ogiwara, S., Kiuchi, K., Nagatsu, T., Teradaira, R., Nagatsu, L., Fujita, K., & Sugimoto, T. (1992) in Clin. Chem., im Druck.

Es wurde jedoch keine signifikante Beziehung zwischen der Urinkonzentration an Oncopterin und Neopterin gefunden.

Wie in der eingangs genannten Literatur erwähnt ist, sind die Konzentrationen an Polyaminen (Spermidin, Spermin) und Neopterin im Urin von verschiedenen Krebspatienten um den 2- bis 10- bzw. 2- bis 8fachen Wert erhöht. Mit der neu gefundenen Verbindung Oncopterin ist bei Patienten, die an einer Krebserkrankung eines "harten" Gewebes leiden, eine Erhöhung der Oncopterin-Konzentration im Urin um etwa das 70- bis 100fache gegenüber gesunden Personen gegeben. Damit stellt Oncopterin einen zuverlässigeren Indikator für Krebserkrankungen daß als die bisher verwendeten Marker.

Zur Strukturaufklärung der gewonnenen Substanz (Oncopterin) wurde NMR (Nuclear Magnatic Resonance, Kernmagnetische Resonanz)-Spektroskopie eingesetzt. Das ¹H NMR-Spektrum wurde in D₂O bei 50°C auf einem JEOL JNM-EX 270 Spektrometer aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen entsprechen dem Proton bei 4,50 ppm im Lösungsmittel. Das UV-Spektrum der Substanz wurde in Wasser mittels eines Hitachi 220 A Spektrophotometers bestimmt. Das CD (Circular Dichroism, Circulardichroismus)-Spektrum schließlich wurde mittels eines JASCO J-500-Spektropolarimeters in Wasser aufgenommen.

Wie eingangs bereits angedeutet, gestaltet sich die Abtrennung des Oncopterin von beispielsweise ebenfalls natürlich vorkommendem Pteridinen wie Neopterin und Biopterin aufgrund der chemischen Ähnlichkeit der Substanzen sehr schwierig. So wird auch durch den Reingigungsschritt über die DEAE-Säule noch keinerlei Trennung bewirkt. Auf diese Weise lassen sich lediglich weitere Substanzen, die in der Ausgangsflüssigkeit vorliegen, von den Pteridinen abtrennen. Eine Trennung der Pteridine erfolgte erst über die CM-Säule, da die nicht so basischen Substanzen Neopterin und Biopterin mittels Wasser eluiert werden konnten, während die stärkere Base Oncopterin mittels Wasser nicht von der Säule zu lösen war. Dies gelang erst mit 3%iger Ameisensäure.

Das in Fig. 2 gezeigte UV-Spektrum der gewonnenen Substanz zeigte Maxima bei 218, 243, 279 und 349 nm (log ∈ 4,25, 4,18, 4,35 und 3,91). Dieses Spektrum zeigt eine große Übereinstimmung mit den Spektren von Neopterin und Biopterin, was zeigt, daß alle drei Verbindungen die gleiche chromophore Gruppe, d. h. das 2-Amino-4-hydroxypteridin, aufweisen. Aufgrund ihrer Spezifität des Auftretens bei krebskranken Personen wurde die zunächst strukturell noch nicht vollständig aufgeklärte Substanz Oncopterin genannt.

Im in der Fig. 3 gezeigten ¹H NMR-Spektrum des Oncopterins wurde das Singulett bei 8,71 ppm (Signal a; 1 H) dem am Pteridinring befindlichen Proton und das andere Singulett bei 1,97 ppm (Signal h; 3 H) der Acetylgruppe des Acetatanions zugeordnet. Die drei Signale bei 4,77 ppm (Signal b; 1 H, d, J = 4,6 Hz), 4,13-4,22 ppm (Signal c; 1 H, m) und 1,19 ppm (Signal d; 3 H, d, J = 6,3 Hz) wurden der 1,2- Dihydroxypropylgruppe zugeordnet. Die weiteren drei Signale bei 3,10 ppm (Signale; 2 H, t, J = 6,9 Hz), 1,95-2,05 ppm (Signal f; 2 H, m) und 3,56 ppm (Signal g; 2 H, t, J = 6,6 Hz) deuteten auf die Gegenwart einer Trimethylengruppe hin.

Aus diesen Spektren und Daten sowie den stark basischen Eigenschaften der Substanz wurde dann geschlossen, daß es sich bei Oncopterin um ein Stereoisomer des N²-(3- aminopropyl)biopterin, d. h. um 2-(3-Aminopropyl)-amino-4- hydroxy-6-[(1′R,2′S)-1′,2′-dihydroxypropyl]-pteridin, handelt. Diese Annahme wurde durch den direkten Vergleich der synthetischen Verbindung (siehe hierzu Sawada, M., Yamaguchi, T., Sugimoto, T., Matsuura, S., und Nagatsu, T. (1984), Polarization fluoroimmunoassay of biopterin and neopterin in human urine, Clin. Chim. Acta 138, 275-282) mit der isolierten Verbindung bestätigt. Bei einem HPLC-Lauf betrug das Retentionsvolumen für beide Verbindungen auf der Develosil ODS-K-5-Säule 18,42 ml und auf der Nucleosil 10 SA- Säule 63,93 ml. Ein Vergleich der ¹H NMR- und UV-Spektren stützte ebenfalls die Annahme. Schließlich wurde auch noch festgestellt, daß die 1′,2′-Dihydroxypropylseitenkette des Oncopterin die (1′R,2′S)-Konfiguration, d. h. die L-Erythro- Konfiguration, aufwies, da sowohl die synthetische als auch die isolierte Verbindung die gleichen CD-Spektren aufwiesen (siehe Fig. 4; λ_max (nm) (Δ∈) : 380(-0,04), 333(-0,36), 289(-0,20), 269(-0,81), 259(-0,47), 242(-1,50) und 221(+3,00); Konzentration: 8,4 × 10^-5 mol/l in Wasser.

Zusammenfassend läßt sich somit feststellen, daß Oncopterin ein hochspezifisches Diagnostikum für Krebserkrankungen darstellt, das sich mit dem vorliegend beschriebenen Verfahren schnell und empfindlich nachweisen läßt. Aufgrund der Tatsache, daß der Nachweis im Mikromaßstab möglich ist, und keine teuren Reagentien und aufwendigen Apparaturen nötig sind, ist das vorliegende Bestimmungsverfahren für den routinemäßigen Einsatz in der Krebsdiagnostik hervorragend geeignet.

Claims (24)

1. Diagnostikum für cancerogene Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es 2-(3-Aminopropyl)-amino-4- hydroxy-6-[(1′R,2′S)-1′,2′-dihydroxypropyl]-pteridin ist.

2. Diagnostikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Säureamid vorliegt.

3. Diagnostikum nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Körperliquor, vorzugsweise Urin, gewonnen ist.

4. Diagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die cancerogene Erkrankung ein Gewebekrebs, vorzugsweise Lungenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs oder Eierstockkrebs ist.

5. Mittel, enthaltend 2-(3-Aminopropyl)-amino-4-hydroxy- 6-[(1′R,2′S)-1′,2′-dihydroxypropyl]-pteridin, zur quantitativen Bestimmung von Oncopterin in einem Körperliquor, vorzugsweise Urin.

6. Verfahren zum Nachweis der Verbindung 2-(3-Aminopropyl)-amino-4-hydroxy-6-[(1′R,2′S)-1′,2′- dihydroxypropyl]-pteridin in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Verbindung enthaltende Probe über eine Umkehrphasen- oder Kationenaustauscher-HPLC-Säule mittels einer sauren Elutionspufferlösung aufgetrennt und die Fluoreszenzintensität des Eluats, vorzugsweise bei einer Wellenlänge von 450 nm, bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe vor der Messung mit Säure hydrolisiert worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse mit 6 M Salzsäure für 2 Stunden bei 100°C durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit Urin ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Urin von an Krebs erkrankten Patienten stammt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Krebs ein Gewebekrebs, vorzugsweise Lungenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs oder Eierstockkrebs ist.

12. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Verbindung 2-(3-Aminopropyl)-amino-4-hydroxy-6-[(1′R,2′S)-1′,2′- dihydroxypropyl]-pteridin, dadurch gekennzeichnet, daß eine Konzentration im Vergleich mit Standardkonzentrationen bestimmt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung nach einem der in den Ansprüchen 6 bis 11 beschriebenen Verfahren gewonnen wurde.

14. Verfahren zur Isolierung von 2-(3-Aminopropyl)-amino- 4-hydroxy-6-[(1′R,2′S)-1′,2′-dihydroxypropyl]­ pteridin aus Körperliquor mit den folgenden Schritten:

• i) Auftragen eines Körperliquors, vorzugsweise Überstands von zentrifugiertem Körperliquor, auf eine Anionenaustauschersäule, Waschen der Säule und Eluierung der Säule mit einer Elektrolytlösung,
• ii) Auftragen des Eluats aus Schritt (i) auf eine Kationenaustauschersäule, Waschen der Säule und Eluierung der Säule mit einer sauren Lösung, und
• iii) Auftragen des Eluats aus Schritt (ii) auf eine Umkehrphasensäule und Eindampfen des Eluats zur Trockne.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Körperliquor, der vorzugsweise Urin ist, von einem Krebspatienten stammt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Krebs um einen Gewebekrebs, vorzugsweise Leber-, Lungen-, Prostata-, Blasen- oder Eierstockkrebs handelt.

17. 2-(3-Aminopropyl)-amino-4-hydroxy-6-[(1′R,2′S)-1′,2′- dihydroxypropyl]-pteridin, erhältlich durch die Schritte (i) bis (iii) von Anspruch 14.

18. Verbindung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Körperliquor Urin ist, der vorzugsweise von einem Krebspatienten stammt.

19. Verfahren zum Nachweis von Krebszellen, dadurch gekennzeichnet, daß im Körperliquor die Konzentration an der Verbindung 2-(3-Aminopropyl)-amino-4-hydroxy- 6-[(1′R,2′S)-1′,2′-dihydroxypropyl]-pteridin bestimmt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung nach einem der in den Ansprüchen 14 bis 16 beschriebenen Verfahren gewonnen wurde.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe vor der Konzentrationsbestimmung mit Säure hydrolisiert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse mit 6 M HCl für 2 Stunden bei 100°C durchgeführt wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren im Mikromaßstab durchgeführt wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Krebszellen von einem Gewebekrebs, vorzugsweise Leber-, Lungen-, Prostata-, Blasen- oder Eierstockkrebs stammen.