DE4229866A1

DE4229866A1 - Ionenaustauscher

Info

Publication number: DE4229866A1
Application number: DE4229866A
Authority: DE
Inventors: Katsuo Komiya; Toshikuni Koga; Yoshio Kato
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1991-09-06
Filing date: 1992-09-07
Publication date: 1993-03-11
Anticipated expiration: 2012-09-08
Also published as: US5438077A; DE4229866C2; JPH0564748A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen zur Trennung und Reinigung eines biogenen Polymers, wie einem Protein oder einer Nukleinsäure, geeigneten Ionenaustauscher. Insbeson dere betrifft sie ein Packungsmaterial für die Flüssigchro matographie.

Zur Reinigung eines biogenen Polymers, insbesondere eines Proteins, wurde bisher häufig als Reinigungsverfahren die Ionenaustauscherchromatographie benutzt, wodurch die Ände rung der Eigenschaften der Probe gering ist.

Als Ionenaustauscher, der für diesen Zweck benutzt wurde, sei ein polysaccharidartiger Ionenaustauscher mit einem Cellulosebasismaterial genannt. Wird ein derartiger Ionen austauscher in eine Säule gepackt, so besitzt er schlechte Permeabilität, und sein Auflösungsvermögen ist ziemlich ge ring, da die Trägerteilchen nicht klein genug hergestellt werden können. Außerdem ist die Lebensdauer der gepackten Säule schlecht.

Ferner wurde ein Ionenaustauscher aus vernetzter Agarose oder einem vernetzten synthetischen Polymer als Basismaterial zu einem kommerziellen Produkt entwickelt. Ein derartiges Packungsmaterial besitzt jedoch den Nachteil, daß mit Zunahme seiner Festigkeit die Kapazität einer Probe, wie ein Protein, zu binden eher abnimmt. Zur Lösung dieser Auf gabe wurde vorgeschlagen, einen Ionenaustauscher unter Ver wendung eines halbstarren oder chemisch-modifizierten Sili cagels mit Hydroxylgruppen als Basismaterial herzustellen, auf das durch Pfropfpolymerisation ein Acrylamidderivat, ein Acrylsäureester oder Vinylacetat in Gegenwart eines Cer(VI)salzes als Katalysator unter Bildung eines Spacers aufgebracht wird. Es wurde angenommen, daß die Kapazität eine Probe zu binden hierdurch verbessert werden kann (EP-A- 3 37 144). Der in dieser Veröffentlichung offenbarte Ionenaus tauscher, in dem ein Oligomer eines Acrylamidderivats oder eines (Meth)acrylsäureesters als Spacer und chemisch-modifi ziertes Silicagel als Basismaterial verwendet werden, wird bei Kontakt mit einer starken Säure oder einer starken Base teilweise hydrolysiert, wodurch eine Abnahme der Ionenaus tauschkapazität oder der Kapazität ein Protein zu binden be obachtet wird. Das Waschen einer Trennsäule mit einer star ken Säure oder einer starken Base wird häufig zur Reinigung der Säule, insbesondere bei der Trennung und Reinigung eines biogenen Polymers, benutzt. Ferner kann Vinylacetat kaum pfropfpolymerisiert werden und die entstehenden Hydroxyl gruppen sind sekundäre Hydroxylgruppen und besitzen eine ge ringe Reaktivität, wodurch die Einführung von Ionenaustau schergruppen schwierig ist.

Unter den vorstehend erwähnten, verschiedenartigen Ionen austauschern ist kein Ionenaustauscher, der eine hervorra gende Säulenpermeabilität, eine hohe Kapazität Proteine zu binden und hervorragende chemische Stabilität gegenüber Reagentien besitzt, die zur Reinigung der Säule oder Regenerationsbehandlung verwendet werden.

Die vorstehend erwähnten, verschiedenartigen Aufgaben können dadurch gelöst werden, daß als Basismaterial für einen Ionenaustauscher ein Polymermaterial verwendet wird, das ein unlösliches, vernetztes Polymer mit alkoholischen Hydroxyl gruppen ist, und dessen elektrostatischen Wechselwirkungen mit einem wasserlöslichen Protein in einer neutralen Puffer lösung im wesentlichen vernachlässigbar sind, zu dem Basis material ein Polyglycidylether eines Polyols oder ein Epiha lohydrinaddukt eines Polyols und/oder ein durch eine Additi onsreaktion oder eine Dehydrohalogenation einer derartigen Verbindung hergestelltes Oligomer als Spacer hinzugefügt wird, und daß die Ionenaustauschergruppen in den Spacer ein gebaut werden.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Ionenaustauscher zur Verfügung, der Teilchen eines unlöslichen, vernetzten Poly mers mit alkoholischen Hydroxylgruppen als Basismaterial und ein Glycidyladdukt eines Polyols und/oder dessen Oligomers als Spacer umfaßt, wobei die Ionenaustauschergruppen an den Spacer gebunden sind.

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen näher beschrieben.

Das erfindungsgemäß verwendete, unlösliche, vernetzte Poly mer ist ein unlösliches, vernetztes Polymer mit alkoholi schen Hydroxylgruppen. Bevorzugt ist ein hydrophiler Gelfil trationsträger, wie ein halbstarres Gel oder ein vernetztes Agarosegel, das hauptsächlich aus einem hydrophilen Poly(meth)acrylsäureester oder einem Polyvinylalkohol be steht.

Es ist wichtig, daß das erfindungsgemäß verwendete, unlösli che, vernetzte Polymer eine gute Permeabilität aufweist, da es oft als Packungsmaterial für Säulen verwendet wird. Demgemäß besitzt es vorzugsweise eine kugelförmige Teilchenform. Um eine angemessene Kapazität zur Bindung einer Probe sicherzustellen, sind ferner eine geeignete Porengröße und Porosität erforderlich, so daß ein aufzubereitendes Protein in die Poren im Inneren des Trägers eindringen kann. Der durchschnittliche Porendurchmesser be trägt vorzugsweise etwa 30 nm bis etwa 1000 nm. Die Porosi tät sollte unter Berücksichtigung des Gleichgewichts der me chanischen Festigkeit und der Oberfläche des Basismaterials gewählt werden. Die Porosität beträgt vorzugsweise 30 bis 95%, obwohl sie von den physikalischen Eigenschaften des Basismaterials abhängt. Bezüglich elektrostatischer Wechsel wirkungen sind Ionenaustauschergruppen, falls sie von Anfang an auf dem Basismaterial vorhanden sind, von Einfluß auf die Ionenaustauschergruppen, die später eingebaut werden, was die Bestimmung der Trennbedingungen erschwert. Daher ist die Austauschkapazität des Basismaterials vorzugsweise nicht größer als 0,05 mEq pro ml.

In der vorliegenden Erfindung wird als Spacermaterial ein Polyglycidylether eines Polyols oder das Umsetzungsprodukt eines Epihalohydrins mit einem Polyol verwendet. Das Polyol kann beispielsweise ein nichtionischer Alkohol, wie Ethylen glykol, Glycerin, 1,4-Butandiol, Sorbit, Polyethylenglykol (Polymerisationsgrad nicht größer als 9) oder Propylenglykol (Polymerisationsgrad nicht größer als 3) sein. Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Polyolderivaten können vorzugsweise Epihalohydrin oder Glycidol in Kombination verwendet werden, obwohl das Gewichtsverhältnis einer derartigen zusätzlichen Verbindung kleiner sein sollte als das des Polyolderivats.

Die Ionenaustauschergruppen, die in den Spacer eingebaut sind, sind vorzugsweise Anionenaustauschergruppen, wie quar täre Ammoniumgruppen oder primäre bis tertiäre Aminogruppen, oder Kationenaustauschergruppen, wie Sulfonsäuregruppen oder Carbonsäuregruppen. Solange Anionen- und Katio nenaustauschergruppen nicht gemischt werden, können mehrere Arten von Ionenaustauschergruppen gemischt vorhanden sein. Werden Anionen- und Kationenaustauschergruppen gemischt, sollten die im Unterschuß verwendeten Gruppen weniger als ein Drittel Äquivalente der im Überschuß verwendeten Gruppen be tragen.

Um den erfindungsgemäßen Ionenaustauscher herzustellen, wer den die vernetzten Polymerteilchen des Basismaterials in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel dispergiert. Dann werden das Spacerrohmaterial und ein Alkalimetallhydro xid hinzufügt, woran sich eine Additionsreaktion unter stark alkalischen Bedingungen zur Epoxidaktivierung anschließt. Schließlich werden die Ionenaustauschergruppen in den Spacer eingebaut und die restlichen Epoxidringe mit Wasser unter alkalischen oder sauren Bedingungen geöffnet. Abhängig von der Art des gewünschten Ionenaustauschers können das Basismaterial, das Spacerrohmaterial und das Rohmaterial zum Einbau der Ionenaustauschergruppen gemischt werden, und die Additionsreaktion und der Einbau der Ionenaustauschergruppen können unter stark alkalischen Bedingungen durchgeführt werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Ionenaustauscher besitzen hervorragende Säulenpermeabilität und eine hohe Kapazität zur Bindung eines Proteins. Zusätzlich weisen sie hervorra gende chemische Stabilität gegenüber Reagentien auf, die zum Reinigen der Säule oder für Regenerationsbehandlung ver wendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird nun näher durch Beispiele be schrieben.

Beispiel 1 Herstellung eines starken Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen Gelfiltra tionschromatographiemediums (GFC) mit alkoholischen Hydro xylgruppen (Toyo Pearl HW65F, hergestellt von der TOSOH CORPORATION, durchschnittlicher Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 70 ml Wasser suspendiert. 120 g Glycerinpolyglycidylether (Denacol EX-314, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K.K.) und 30 g Natriumsulfit werden hin zugefügt. Das Gemisch wird 8 Stunden bei 55°C gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1n Salzsäure dispergiert und die Dispersion bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der dabei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher weist eine Ionenaustauschkapazität von 0,08 mEq/ml auf und zeigt die Kapazität, 101 mg/ml Lysozym in einer 20 mM Phosphatpufferlösung von pH 6,0 zu binden. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Zonen austauschkapazität und die Kapazität Lysozym zu binden ge messen, wobei Änderungen kleiner als 5% gefunden werden.

Beispiel 2 Herstellung eines schwachen Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml vernetzte Agaroseteilchen (Sepharose CL4B, hergestellt von Pharmacia Company) in 50 ml Wasser suspendiert. 150 g Trimethylolpropantriglycidylether (Epiol TMP-100, hergestellt von Nippon Oil and Fat Company Limited), 80 g Diethylaminoethanol und Natriumhydroxid wer den hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 40°C 5 Stunden gerührt und gemischt. Das Umsetzungsprodukt wird wiederholt dekan tiert, wobei der Feststoff mit Wasser gewaschen wird. An schließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml einer 0,1M Natriumcarbonatlösung dispergiert und die Dispersion wird bei 30°C 8 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird filtriert. Der Feststoff wird mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher hat eine Ionenaustauschkapazität von 0,11 mEq/ml und zeigt eine Kapa zität, 120 mg/ml Rinder-Serum-Albumin (BSA) in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3 zu binden. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen. 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxidlösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach werden die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden gemessen, wobei Änderungen von weniger als 5% gefunden wer den.

Beispiel 3 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW55F, herge stellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 30 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 120 g Sorbit polyglycidylether (Denacol EX-611, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K.K.), 20 g Trimethylaminhydrochlorid und 9 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 45°C 6 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der auf diese Weise erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Fest stoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert und die Disper sion wird bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Pro dukt wird abgenutscht und der auf diese Weise erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,30 mEq/ml und zeigt eine Kapa zität, BSA zu binden, von 83 mg/ml in einer 50 mM Trissalz säurepufferlösung von pH 8,3. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurück gewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach wird die Ionenaus tauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei Änderungen kleiner als 5% gefunden werden.

Beispiel 4 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, herge stellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) mit 1,4-Dioxan gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 80 ml 1,4-Dioxan suspendiert. 70 g Glycerinpolyglycidylether (Denacol EX-314, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K.K.), 11,3 g Trimethylaminhydrochlorid und 4,6 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 45°C 12 Stunden gemischt und gerührt. Das Reakti onsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Fest stoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1N Salzsäure dispergiert und die Dispersion bei 50°C 2 Stunden gemischt und gerührt. Das Pro dukt wird abgenutscht und der Feststoff mit Wasser gewaschen. Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,26 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, BSA zu binden, von 135 mg/ml in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml des Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei Änderungen kleiner als 5% gefunden werden.

Beispiel 5 Herstellung eines starken Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW75F, herge stellt von TOSOH CORPOPATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 500 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 50 g Glycerin polyglycidylether (Denacol EX-314, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K.K.), 9 g Epichlorhydrin und 6 g Natriumhydro xid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 50°C 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff wird aufeinanderfolgend mit Wasser, Aceton und Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 100 ml Wasser dispergiert und 30 g Natriumsulfit werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 55°C 8 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert und die Dispersion wird bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,13 mEq/ml und zeigt eine Kapa zität, Lysozym zu binden, von 70 mg/ml in einer 20 mM Phos phatpufferlösung von pH 6,0. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 0,5 M Natrium chlorid gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückgewon nen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach wird die Ionenaus tauschkapazität und die Kapazität, Lysozym zu binden, gemessen, wobei Änderungen von kleiner als 5% gefunden wer den.

Beispiel 6 Herstellung eines schwachen Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, herge stellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 50 ml Wasser suspendiert. 100 g Ethylen glycerinpolyglycidylether und 2 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 50°C 5 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff aufeinanderfolgend mit Wasser, Aceton und Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 50 ml Wasser dispergiert. 60 g Natriummonochlor acetat und 30 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Ge misch wird bei 50°C 4 Stunden gerührt und gemischt. Das Pro dukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,14 mEq/ml und zeigt eine Kapa zität, Lysozym zu binden, von 95 mg/ml in einer 20 mM Phos phatpufferlösung von pH 6,0. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 0,5 M Natrium chlorid, gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückge wonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaus tauschkapazität und die Kapazität, Lysozym zu binden, gemes sen, wobei Änderungen von weniger als 5% gefunden werden.

Vergleichsbeispiel 1 Herstellung eines starken Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW75F, herge stellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 500 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 23 g Epichlor hydrin und 6 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Ge misch wird bei 50°C 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff wird aufeinanderfolgend mit Wasser, Aceton und Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 100 ml Wasser dispergiert. 30 g Natriumsulfit werden hinzugefügt und das Gemisch wird bei 55°C 8 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert, und das Gemisch wird bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,13 mEq/ml und zeigt eine Kapa zität, Lysozym zu binden, von 35 mg/ml in einer 20 mM Phos phatpufferlösung von pH 6,0. Die Kapazität, Protein zu binden, beträgt die Hälfte der Kapazität von Beispiel 5. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, ent haltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml einer 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach wird die Ionenaus tauschkapazität und die Kapazität, Lysozym zu binden, gemes sen, wobei Änderungen von weniger als 5% gefunden werden.

Vergleichsbeispiel 2 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, herge stellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 23 g Epichlor hydrin und 6 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Ge misch wird bei 50°C 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Re aktionsprodukt wird abgenutscht, und der hierbei erhaltene Feststoff wird mit Wasser und 1,4-Dioxan gewaschen. An schließend wird der gesamte Feststoff in 80 ml 1,4-Dioxan suspendiert. 22,6 g Trimethylaminhydrochlorid und 9,2 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 40°C 12 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert und die Dispersion bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,20 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, BSA zu binden, von 50 mg/ml in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3. Die Kapazität, Protein zu binden, beträgt die Hälfte der Kapazität, Protein zu binden, von Beispiel 4. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 N Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml einer 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaus tauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei Änderungen von kleiner als 5% gefunden werden.

Vergleichsbeispiel 3 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, herge stellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 700 ml Wasser suspendiert. 113 g N,N- Trimethylammoniumethylacrylamid werden hinzugefügt. Die Tem peratur wird auf 25°C eingestellt, und Sauerstoff wird durch Argon im Reaktionsgefäß ersetzt. 100 ml 0,4 N Cäsiumnitratammoniumlösung in 1 N Salpetersäure werden hinzugefügt. Das Gemisch wird 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff aufeinanderfolgend mit Wasser, 10%iger Essigsäure, enthaltend 0,2 M Natriumsulfit, 0,2 N Natriumacetat und Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher hat eine Ionenaustauschkapazität von 0,15 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, BSA zu binden, von 70 mg/ml in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3. Die Kapazität, Protein zu binden, beträgt die Hälfte der Kapazität, Protein zu binden, von Beispiel 4. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 N Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen.

20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natrium hydroxidlösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelas sen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei gefunden wird, daß die Austauschkapazität um 15% abgenommen hat und die Kapazität, BSA zu binden, um 10% abgenommen hat.

Anwendungsbeispiel 1

Das in Beispiel 1 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150·16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Phos phatpufferlösung von pH 6,0 equilibriert. Ein Gemisch, ent haltend 10 mg Ribonuclease, 5 mg Cytochrom C und 5 mg Lysozym, wird einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 500 mM Natriumchloridlösung unterworfen, wobei eine hervorra gende Trennung erzielt wird.

Anwendungsbeispiel 2

Das im Beispiel 4 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150·16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Pipera zinsalzsäurepufferlösung von pH 8,3 equilibriert. 2 mg eines käuflich erhältlichen β-Lactoglobulins werden einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 300 mM Natriumchloridlösung un terworfen, wobei eine hervorragende Trennung von β-Lactoglo bulin A und B erzielt wird.

Anwendungsbeispiel 3

Das in Beispiel 6 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150·16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Phos phatpufferlösung von pH 6,0 equilibriert. Ein Gemisch von Agiotensin I, II und III jedes in einer Menge von 0,03 mg wird einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 500 mM Na triumchloridlösung unterworfen, wobei eine hervorragende Trennung erzielt wird.

Anwendungsbeispiel 4

Das im Beispiel 4 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150·16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Tris salzsäurepufferlösung von pH 8,3 equilibriert. Ein Gemisch, umfassend 4 mg einer käuflich erhältlichen Carbonsäureanhy drase, 8 mg Transferrin, 10 mg Ovoalbumin und 10 mg Trypsin inhibitor werden einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 500 mM Natriumchloridlösung unterworfen, wobei eine hervor ragende Trennung erzielt wird.

Wie vorher beschrieben, besitzt der erfindungsgemäße Ionen austauscher eine hervorragende Fähigkeit, biogene Polymere zu trennen, hervorragende Säulenpermeabilität, eine große Kapazität zum Binden von Proteinen und hervorragende chemische Stabilität.

Claims

1. Ionenaustauscher, umfassend Teilchen eines unlöslichen, vernetzten Polymers, mit alkoholischen Hydroxylgruppen als Basismaterial und ein Glycidyladdukt aus einem Polyol und/oder dessen Oligomers als Spacer, wobei die Ionenaustauschergruppen an den Spacer gebunden sind.

2. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die unlösli chen, vernetzten Polymerteilchen porös sind, einen mitt leren Porendurchmesser von etwa 30 nm bis etwa 1000 nm aufweisen und eine kugelförmige Form besitzen.

3. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 2, wobei die unlösli chen, vernetzten Polymerteilchen eine Porosität von 30 bis 95% aufweisen.

4. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die Ionenaus tauschkapazität des unlöslichen, vernetzten Polymers nicht größer als 0,05 mEq/ml ist.

5. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei das unlösliche, vernetzte Polymer ein hydrophiler Gelfiltrationsträger ist.

6. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei der Spacer ein Polyglycidylether eines Polyols oder das Reaktionspro dukt eines Polyols mit einem Epihalohydrin ist.

7. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 6, wobei das Polyol ein Ethylenglykol, Glycerin, 1,4-Butandiol, Sorbit, Poly ethylenglykol mit einem Polymerisationsgrad von nicht größer als 9 oder Propylenglykol mit einem Polymerisa tionsgrad von nicht größer als 3 ist.

8. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die Ionenaus tauschergruppen quartäre Ammoniumgruppen, primäre bis tertiäre Aminogruppen oder deren Gemische sind.

9. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die Ionenaus tauschergruppen Sulfonsäuregruppen, Carbonsäuregruppen oder deren Gemische sind.