DE4214245A1 - Tritiummarkierte fibrinogen-rezeptor-antagonisten, deren verwendung und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Tritiummarkierte fibrinogen-rezeptor-antagonisten, deren verwendung und verfahren zu ihrer herstellung

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DE4214245A1
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Hans-Dieter Schubert
Karl-Heinz Switek
Guenter Linz
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Description

Im Normalfall, d. h. bei intakten Blutgefäßen, ist die Auf­ rechterhaltung der Fließfähigkeit des Blutes dadurch gewähr­ leistet, daß keiner der maßgeblichen hämostatischen Mechanis­ men aktiviert ist. Zur Blutstillung bei Verletzungen werden folgende zwei Prozesse eingeleitet:
1. Die unmittelbar an der Gefäßläsion innerhalb von Sekunden einsetzende Thrombozytenaggregation, welche durch den sich bildenden Thrombus die Blutstillung initiiert, und
2. die etwas später eintretende Gerinnung, welche den Throm­ bus durch Bildung von Fibrinfäden stabilisiert.
Die Aggregation und die Gerinnung können nun auch bei nicht verletzten, aber etwa durch atherosklerotische Plaques ver­ änderten Gefäßwänden auftreten und verursachen so lebensbe­ drohende Krankheiten wie Herzinfarkt, Lungenembolie und Ge­ hirnschlag.
Eine logisch erscheinende Präventivmaßnahme wäre in diesen Fällen die Verhinderung der initialen Thrombusbildung. Ver­ schiedene Pharmazeutika, welche einzelne Wege der Thrombozy­ tenaggregation hemmen, wurden bisher ohne durchschlagenden Erfolg hierfür eingesetzt. Die gemeinsame Endstufe aller Ak­ tivierungswege ist die Bildung des Thrombus, welcher nach neuesten Erkenntnissen dadurch entsteht, daß Thrombozyten über die an ihrer Membran vorhandenen Fibrinogenrezeptoren durch das bifunktionale, fadenförmige Fibrinogen zusammen­ gehalten werden. Wenn es gelänge, diesen Vorgang zu unter­ binden, könnte die Thrombusbildung - unabhängig von der Art der Aktivierung - gehemmt werden (siehe Cahill, M. et al. in Brit. J. Clin. Pharmcol. 33, 3-9 (1992)).
Zur Suche nach Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten, welche den Fibrinogenrezeptor blockieren und somit die Bindung des Fi­ brinogens an die Thrombozyten hemmen, wird eine Methode be­ nötigt, um diese Bindung quantitativ bestimmen zu können. Eine Standardmethode ist die Verwendung von 125J-Fibrino­ gen und die Trennung von zellgebundenem und gelöstem Fibrino­ gen durch Zentrifugation. Dieses Verfahren hat folgende gra­ vierende Nachteile:
  • 1. Das verwendete Nukleotid ist ein y-Strahler
  • 2. Die Halbwertszeit beträgt nur 60 Tage
  • 3. Fibrinogen ist ein adhäsives Protein
  • 4. Die Bindung ist nicht vollständig reversibel
  • 5. Die Methode ist nicht anwendbar in Gegenwart von Plasma
  • 6. Die Thrombozyten müssen aktiviert werden
Für den praktischen Einsatz sind die Punkte 4 und 6 nicht sehr wichtig. Die Punkte 1 bis 3 bedingen jedoch umfangrei­ che Abschirmmaßnahmen, erschweren die Vorratshaltung bzw. bedingen Materialverluste und lassen die Verwendung von Pi­ pettierautomaten als kritisch erscheinen. Der größte Nachteil ist jedoch, daß die Methode in Gegenwart von Plasma infolge des hohen Fibrinogengehalts nicht anwendbar ist, da Plasma- Fibrinogen die Bindung von 125J-Fibrinogen an aktivierte Plättchen mit einer IC50 von 120 nM hemmt. Zur Messung der Bindung müssen daher gewaschene bzw. gelfiltrierte Thrombo­ zyten verwendet werden (siehe Harfenist, E.J. et al. in Blood 71, 132-136 (1988)).
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß es Fibrinogen-Re­ zeptor-Antagonisten gibt, die auch in Gegenwart von Plasma- Fibrinogen an den Fibrinogen-Rezeptor binden. Derartige Fi­ brinogen-Rezeptor-Antagonisten werden beispielsweise in der EP-A-0,372,486 und in der EP-A-0,381,033 sowie in den nicht vorveröffentlichten deutschen Patentanmeldungen P 40 35 961.1 (siehe auch Europäische Anmeldung 91 118 148.5, Case 5/1054), P 41 02 024.3 (siehe auch Europäische Anmeldung 92 101 007.0, Case 5/1056), P 41 07 857.8 (siehe auch Europäische Anmeldung 92 104 045.7, Case 5/1068), P 41 24 942.9 (Case 5/1074), P 41 27 404.0 (Case 5/1075), P 41 29 603.6 (Case 5/1076) und P 41 34 467.7 (Case 5/1077) beschrieben.
Als bevorzugte Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten kommen hier­ bei die Amidine der allgemeinen Formel
Ra - Rb (I)
in der
Ra eine 4-Amidinophenyl- oder 5-Amidino-pyrimid-2-yl-Gruppe und
Rb eine HOOC-D-C-B-A-Gruppe bedeuten, in der
A eine gegebenenfalls durch eine Methoxygruppe substi­ tuierte Phenylengruppe, in der zusätzlich eine oder zwei Methingruppen jeweils durch ein Stickstoffatom ersetzt sein können, eine gegebenenfalls an einem Kohlenstoff­ atom durch eine Methyl-, Ethyl- oder Trifluormethylgrup­ pe substituierte Imidazolon-di-yl-, Imidazolidinon-di­ yl-, Imidazolidin-dion-di-yl-, Triazolon-di-yl- oder 1,1-Dioxo-3,4-dihydro-1,2,5-thiadiazol-di-yl-gruppe, eine gegebenenfalls an einem der Stickstoffatome durch den Rest R1 substituierte Benzimidazol-di-yl-gruppe oder eine mit dem Stickstoffatom an den Rest B gebundene Aminocarbonylgruppe,
B eine Methylen-, Carbonyl-, Cyclohexylen-, Phenylen- oder Imidazol-di-yl-gruppe, eine über das Stickstoffatom an den Rest C gebundene Aminocarbonylgruppe, welche gleichzeitig am Stickstoffatom durch eine Methylgruppe substituiert sein kann, oder eine über das Sauerstoff­ atom an den Rest A gebundene Methylenoxygruppe,
C eine gegebenenfalls durch den Rest R2 substituierte Ethylengruppe, eine Cyclohexylengruppe, eine gegebenen­ falls am Stickstoffatom durch den Rest R3 substitu­ ierte Pyrrolidin-di-yl- oder Pyrrolidinon-di-yl-gruppe, eine Piperidin-di-yl-gruppe oder eine mit dem Stick­ stoffatom an den Rest D gebundene Aminocarbonylgruppe und
D eine Bindung, eine Methylen- oder Ethylengruppe dar­ stellen, wobei R1 eine Methyl-, 2-Piperazinoethyl-, 2-(3,4-Dimeth­ oxyphenyl)ethyl- oder 3-Thiomorpholinopropylgruppe, R2 eine Amino- oder Hydroxygruppe und R3 eine 3-Phenylpropyl-, Acetyl-, Methansulfonyl- oder Pyrrolidinocarbonylmethylgruppe darstellen,
deren Tautomere, deren Stereoisomere einschließlich deren Ge­ mische und deren Salze in Betracht.
Besonders bevorzugt sind jedoch diejenigen Verbindungen der obigen allgemeinen Formel I, welche eine gute in vitro-Wir­ kung im Collagen-induzierten Aggregationstest aufweisen, wo­ bei die erfindungsgemäßen mit Tritium markierten Fibrinogen- Rezeptor-Antagonisten in diesem Test (siehe Huang, E.M. und Detwiler, T.C.: "Stimulus-Response Coupling Mechanisms" in Biochemistry of Platelets, Academic Press, Orlando, Florida 1986, Seiten 1-68) eine EC50-Wirkung von weniger als 500 nM aufweisen, insbesondere jedoch die Verbindungen
  • 1) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-(((4-(5-Amidinopyrimid-2-yl)-phe­ nyl) -oxymethyl) -3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
  • 2) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-1-Acetyl-5-((4′-amidino-4-biphenyl­ yl)-oxymethyl) -3-carboxymethyl-pyrrolidin,
  • 3) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl)-3-carboxymethyl-1-methansulfonyl-pyrrolidin,
  • 4) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
  • 5) 4-Amidino-4′-((trans-4-carboxycyclohexyl)-aminocarbonyl)­ biphenyl,
  • 6) 4-Amidino-4′-(N-(trans-4-carboxycyclohexyl)-N-methyl­ aminocarbonyl)-biphenyl,
  • 7) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-imida­ zolidin-2,4-dion,
  • 8) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4-me­ thyl-4-imidazolin-2-on,
  • 9) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4H- 1,2,4-triazol-3-on,
  • 10) 4-(4-Amidinophenyl)-2-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4H- 1,2,4-triazol-3-on,
  • 11) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-5-me­ thyl-4H-1,2,4-triazol-3-on,
  • 12) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-5- ethyl-4H-1,2,4-triazol-3-on,
  • 13) 2-(4-Amidinophenyl)-5-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-3,4- dihydro-2H, 5H-1,2,5-thiadiazol-1,1-dioxid,
  • 14) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-cyclohexyli­ imidazolidin-2-on,
  • 15) 2-(4-Amidinophenyl)-5-((2-carboxyethyl)-aminocarbonyl)- 1-(2-(piperazin-1-yl)-ethyl)-benzimidazol und deren Salze.
Ganz besonders bevorzugte Verbindungen sind
  • 1) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-(((4-(5-Amidinopyrimid-2-yl)-phe­ nyl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
  • 2) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-1-Acetyl-5-((4′-amidino-4-biphenyl­ yl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin,
  • 3) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl) -3-carboxymethyl-1-methansulfonyl-pyrrolidin,
  • 4) (35, 55)- und (3R,5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on und deren Salze.
Die vorstehend erwähnten Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten der allgemeinen Formel I weisen eine vergleichbare oder höhere Affinität gegenüber dem Rezeptor als 125J-Fibrinogen auf. Ihre Bindung an den Rezeptor wird durch Fremdproteine nicht gestört. Sie können daher, wenn in ihnen mindestens ein Atom durch ein detektierbares Atom, z. B. ein Wasserstoffatom durch ein Tritiumatom ersetzt ist, als Liganden im Fibrino­ gen-Rezeptor-Antagonisten-Bindungstest auch in Gegenwart von Plasma eingesetzt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit die neuen mit Tritium markierten Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten, die eine vergleichbare oder höhere Affinität gegenüber dem Rezep­ tor wie 125J-Fibrinogen besitzen und deren Bindung durch Fremdproteine nicht gestört wird, insbesondere die Verbin­ dungen der obigen allgemeinen Formel I, die in Gegenwart von Fremdprotein, z. B. von Albumin oder von Fibrinogen, eine Affinität (KD) von weniger als 500 nM gegenüber dem Rezep­ tor aufweisen, deren Verwendung als Liganden zur Bestimmung der Bindung von chemischen Substanzen an Fibrinogenrezeptoren insbesondere in Gegenwart von Fremdeiweiß und/oder unter­ schiedlichen Körperflüssigkeiten wie Blutplasma oder Urin und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Der erfindungsgemäße Fibrinogenbindungstest wurde beispiels­ weise unter Verwendung von (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenyl­ yl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on-(3-3H-4-bi­ phenylyl) (= 3H-BIBU 52 ZW) als Ligand wie folgt durchge­ führt:
Eine Suspension von Humanthrombozyten in Plasma wird mit 3H-BIBU 52 und verschiedenen Konzentrationen der zu testen­ den Substanz inkubiert. Der freie und gebundene Ligand wird durch Zentrifugation getrennt und durch Szintillationszählung quantitativ bestimmt. Aus den Meßwerten wird die Hemmung der 3H-BIBU 52-Bindung durch die Testsubstanz bestimmt.
Um beispielsweise die Verdrängung von 3H-BIBU 52 durch nichtmarkiertes BIBU 52 zu messen, wird aus einer Antikubi­ talvene Spenderblut entnommen und mit Trinatriumzitrat anti­ koaguliert (Endkonzentration 13 mM). Das Blut wird 10 Minu­ ten bei 170 × g zentrifugiert und das überstehende plättchen­ reiche Plasma (PRP) abgenommen. Das Restblut wird zur Gewin­ nung von Plasma noch einmal scharf abzentrifugiert. Das PRP wird mit autologem Plasma 1:10 verdünnt. 750 µl werden mit 50 µl physiologischer Kochsalzlösung, 100 µl Testsub­ stanzlösung, 50 µl 14C-Sucrose und 50 µl 3H-BIBU 52 bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert. Zur Messung der unspezifischen Bindung wird anstelle der Testsubstanz 30 µM BIBU 52 eingesetzt. Die Proben werden 20 Sekunden bei 10 000 × g zentrifugiert und der Überstand abgezogen. 100 µl hiervon werden zur Bestimmung des freien Liganden gemessen. Das Pellet wird in 500 µl 0.2N NaOH gelöst, 450 µl wer­ den mit 25 µl 5N HCl versetzt und gemessen. Das im Pellet noch verbliebene Restplasma wird aus dem 14C-Gehalt be­ stimmt, der gebundene Ligand aus der 3H-Messung. Nach Ab­ zug der unspezifischen Bindung wird die Pelletaktivität ge­ gen die Konzentration der Testsubstanz aufgetragen (siehe Abbildung 1) und die Konzentration für eine 50%ige Hemmung der Bindung ermittelt.
Die neuen mit Tritium markierten Fibrinogen-Rezeptor-Antago­ nisten erhält man nach literaturbekannten Verfahren, z. B.
  • a) durch katalytische Tritiierung einer ungesättigten Koh­ lenstoff-Kohlenstoff-Bindung mit Tritium,
  • b) durch hydrogenolytischen Austausch eines Halogenatoms, z. B. eines Chlor-, Brom- oder Jodatoms, gegen Tritium,
  • c) durch katalytischen Wasserstoff/Tritiumaustausch mit Tri­ tium,
  • d) durch katalytischen Wasserstoff/Tritiumaustausch in tri­ tiierten Lösungsmitteln oder
  • e) durch Tritiierung einer Vorstufe des herzustellenden Fi­ brinogen-Rezeptor-Antagonisten und anschließende Synthese des Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten.
Das Verfahren a) wird zweckmäßigerweise in einem Lösungsmit­ tel wie Methanol oder Ethanol, vorzugsweise jedoch in einem unpolaren Lösungsmittel wie Cyclohexan, Dioxan, Tetrahydro­ furan, Ethylacetat oder Dimethylsulfoxid in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie Palladium/Aktivkohle, Palladium­ mohr, Platin/Aktivkohle, Raney-Nickel oder Gemischen aus Pla­ tin und Rhodium, Ruthenium, Osmium oder Iridium auf Aktiv­ kohle mit Tritiumgas zweckmäßigerweise bei Raumtemperatur und unter Normaldruck bis zum Stillstand der Gasaufnahme durchgeführt. Anschließend wird zur Entfernung des labilen Tritiums vom Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel ab­ gezogen, der Rückstand in einem polaren Lösungsmittel auf­ genommen, 10 Minuten zum Rückfluß erhitzt und nach 12 Stun­ den bei Raumtemperatur das Lösungsmittel erneut abgezogen.
Das Verfahren b) wird vorzugsweise in einen- geeigneten Lö­ sungsmittel wie Wasser, Methanol, Ethanol, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, vorzugsweise jedoch in einem unpola­ ren Lösungsmittel wie Ethylacetat, Dioxan oder Tetrahydrofu­ ran, in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie 5% Pal­ ladium auf Aktivkohle, 10% Palladium auf Aktivkohle, Pal­ ladium, Platin, Palladiumdichlorid, 2% Palladium auf Ba­ riumcarbonat, Palladium/Bariumsulfat oder Raney-Nickel unter Zusatz eines Überschusses einer basischen Komponente wie Triethylamin, Pyridin, Chinolin, Natriumhydroxid, Kaliumcar­ bonat, Ammoniak, Magnesiumoxid oder Kalziumoxid mit Tritium­ gas bei 1 bis 5 bar und bei 20 bis 50°C, vorzugsweise bei 25°C, durchgeführt. Anschließend wird zur Entfernung des la­ bilen Tritiums vom Katalysator abfiltriert, das Lösungsmit­ tel abgezogen, der Rückstand in einem polaren Lösungsmittel aufgenommen, 10 Minuten zum Rückfluß erhitzt und nach 12 Stunden bei Raumtemperatur des Lösungsmittels erneut abgezo­ gen.
Das Verfahren c) wird vorzugsweise in einem geeigneten Lö­ sungsmittel wie Phosphat-Puffer pH 7, Wasser, Eisessig, Me­ thanol oder Ethanol in Gegenwart eines geeigneten Katalysa­ tors wie Palladiumdioxid/Bariumsulfat, Platin, Palladium, 5% Palladium auf Aktivkohle, 10% Palladium auf Aktivkohle, Platindioxidhydrat oder Palladium/Platindioxidhydrat mittels Rühren unter trägerfreiem Tritiumgas innerhalb von einer Stunde bis 20 Tage bei 20 bis 50°C, vorzugsweise bei 25°C, durchgeführt. Anschließend wird zur Entfernung des labilen Tritiums vom Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel ab­ gezogen, der Rückstand in einem polaren Lösungsmittel auf­ genommen, 10 Minuten zum Rückfluß erhitzt und nach 12 Stun­ den bei Raumtemperatur des Lösungsmittels erneut abgezogen und das so erhaltene Produkt mit Hilfe der HPLC gereinigt.
Das Verfahren d) wird in einem geeigneten tritiierten Lö­ sungsmittel wie HTO, 70%igem CH3COOT, CF3COOT, KOH/HTO, Dioxan/HTO, HTSO4/HTO/Wasser, CH3OT oder CH3CH2OT in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie Platindioxid, 5% Palladium auf Aktivkohle, 10% Palladium auf Aktivkohle, Palladium, Platin oder Raney-Nickel durch Erwärmen in einem geschlossenen Gefäß für ein bis 20 Stunden auf 100 bis 140°C durchgeführt. Anschließend wird zur Entfernung des labilen Tritiums vom Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel ab­ gezogen, der Rückstand in einem polaren Lösungsmittel aufge­ nommen, 10 Minuten zum Rückfluß erhitzt und nach 12 Stunden bei Raumtemperatur des Lösungsmittel wieder abgezogen und das so erhaltene Produkt mit Hilfe der HPLC gereinigt.
Die Vorstufen zur Herstellung tritiierter Fibrinogen-Rezep­ tor-Antagonisten nach dem Verfahren e) werden nach üblichen chemischen Methoden hergestellt, wobei jeweils die erfor­ derliche markierte Zwischenstufe nach den Verfahren a) bis d), vorzugsweise jedoch nach Verfahren a), hergestellt wird.
Bei den vorstehend beschriebenen Umsetzungen ist es beson­ ders vorteilhaft anstelle der freien Carbonsäure jeweils de­ ren Ester mit einem niederen Alkohol, z. B. deren Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl- oder tert.Butylester, insbeson­ dere den Methylester einzusetzen. Nach der Tritiierung wird dann der Ester mittels Hydrolyse, vorzugsweise in Gegenwart einer Base wie Natronlauge, z. B. in Gegenwart von Methanol/ 2N Natronlauge (6:1) bei Raumtemperatur, in die entsprechende freie Carbonsäure übergeführt.
Besonders vorteilhaft erhält man die Verbindungen
(3H) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-cyclohexyl)­ imidazolidin-2-on, ausgehend von 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2- carboxyethyl)-cyclohexyl) -imidazolin-2-on,
(3H) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-imi­ dazolidin-2,4-dion, ausgehend von 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4- (2-carboxyethenyl)-phenyl)-imidazolidin-2,4-dion und
(3H) 2-(4-Amidinophenyl)-5-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-3,4- dihydro-2H, 5H-1,2,5-thiadiazol-1,1-dioxid, ausgehend von 2- (4-Amidinophenyl)-5-(4-(2-carboxyethenyl)-phenyl)-3,4-dihydro- 2H, 5H-1,2,5-thiadiazol-1,1-dioxid,
durch katalytische Hydrierung gemäß Verfahren a) in Methanol oder Dimethylsulfoxid mit Tritiumgas unter Verwendung von 10% Palladium auf Aktivkohle als Katalysator,
die Verbindungen
(3H) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-(((4-(5-Amidinopyrimid-2-yl)­ phenyl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
(3H) (3S, 5S)- und (3R,5R)-1-Acetyl-5-((4′-amidino-4-biphe­ nylyl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin,
(3H) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)­ oxymethyl) -3-carboxymethyl-1-methansulfonyl-pyrrolidin,
(3H) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)­ oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
(3H) 4-Amidino-4′-((trans-4-carboxycyclohexyl)-aminocarbo­ nyl)-biphenyl,
(3H) 4-Amidino-4′-(N-(trans-4-carboxycyclohexyl)-N-methyl­ aminocarbonyl)-biphenyl und
(3H) 2-(4-Amidinophenyl)-5-((2-carboxyethyl)-aminocarbo­ nyl)-1-(2-(piperazin-1-yl)-ethyl)benzimidazol,
durch hydrogenolytischen Austausch von Halogen gegen Tritium gemäß Verfahren b) in einem geschlossenen Gefäß in Dimethyl­ formamid unter kräftigem Rühren bei einem Umgebungsdruck von 370 GBq trägerfreiem Tritiumgas,
die Verbindungen
(3H) 4-Amidino-4′-((trans-4-carboxycyclohexyl)-aminocarbo­ nyl)-biphenyl und
(3H) 4-Amidino-4′-(N-(trans-4-carboxycyclohexyl)-N-methyl­ aminocarbonyl) -biphenyl
durch katalytischen Wasserstoff/Tritiumaustausch in einem tritiierten Lösungsmittel gemäß Verfahren d) durch 20-stün­ dige Behandlung der untriierten Verbindung in Dioxan/HTO (1:1) in Gegenwart von Platindioxid bei 100°C,
die Verbindungen
(3H) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)- 4-methyl-4-imidazolin-2-on,
(3H) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4H- 1,2,4-triazol-3-on,
(3H) 4-(4-Amidinophenyl)-2-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4H- 1,2,4-triazol-3-on,
(3H) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carbozyethyl)-phenyl)- 5-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-on und
(3H) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-5- ethyl-4H-1,2,4-triazol-3-on,
durch Tritiierung einer Vorstufe des herzustellenden Fibri­ nogen-Rezeptor-Antagonisten und anschließende Synthese des Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten gemäß Verfahren e), vor­ zugsweise durch Behandlung einer Lösung von einem entspre­ chend substituierten 4-Amino-zimtsäure-methylester in Ethyl­ acetat mit 370 GBq trägerfreiem Tritiumgas in Anwesenheit von 10% Palladium auf Aktivkohle und anschließende Umset­ zung nach bekannten Methoden zu den 1,2,4-Triazol-3-onen bzw. Imidazol-2-onen,
wobei die so bevorzugt erhaltenen Methylester anschließend bei Raumtemperatur mit Methanol/2N Natronlauge hydrolysiert werden.
Die Verbindungen (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxy­ methyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on(3-3H-4-biphenylyl) und
(3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxymethyl)-3-carboxyme­ thyl-pyrrolidin-2-on(3-3H-4-biphenylyl) erhält man vorzugs­ weise gemäß Verfahren b) durch hydrogenolytischen Austausch eines Halogenatoms in 3-Stellung des Biphenylkerns, zweck­ mäßigerweise des Bromatoms.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher er­ läutern:
Herstellung der Ausgangsverbindungen Beispiel A 3-Brom-4-cyano-4-hydroxybiphenyl
3,9 g 4′-Cyano-4-hydroxybiphenyl werden in 250 ml Chloroform bei Siedehitze gelöst. Zu dieser Lösung wird unter weiterem Rückflußkochen 1 ml Brom in 20 ml Chloroform getropft. Die farblose Lösung wird abgekühlt und eingedampft.
Ausbeute: 5,48 g (100% der Theorie),
Schmelzpunkt: 186-189°C
Rf-Wert: 0,66 (Kieselgel; 1,2-Dichlorethan/Essigester = 9:1)
Ber.:  C 56,96,  H 2,94,  N 5,11,  Br 29,15;
Gef.:  C 57,07,  H 3,15,  N 5,03,  Br 29,14
Beispiel B (S)-1-(Benzyloxycarbonyl)-5-((trityloxy)methyl)-2-pyrrolidinon
Eine Lösung von 160 g (S)-5-((Trityloxy)methyl)-2-pyrrolidi­ non in 1600 ml trockenem Tetrahydrofuran wird innerhalb von 35 Minuten bei -65°C mit 179 ml einer 2,5-molaren Lösung von Butyllithium in Hexan versetzt. Nach 10 Minuten wird bei -65°C eine Lösung von 66,8 ml Chlorameisensäure-benzylester in 100 ml trockenem Tetrahydrofuran zugetropft und eine Stunde gerührt. Dann wird mit 200 ml gesättigter Kochsalz­ lösung versetzt und das Tetrahydrofuran abrotiert. Der Rück­ stand wird zwischen 3,5 l Essigester und 200 ml Wasser ver­ teilt, die organische Phase abgetrennt und je zweimal mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet und einrotiert. Das Rohprodukt wird aus wenig Ethanol umkristallisiert.
Ausbeute: 181 g (82% der Theorie),
Schmelzpunkt: 103-105°C
Rf-Wert: 0,53 (Kieselgel; Cyclohexan/Essigester = 2:1)
Ber.:  C 78,19,  H 5,95,  N 2,85;
Gef.:  C 78,34,  H 6,00,  N 3,10
Beispiel C (3S, 5S)-1-(Benzyloxycarbonyl)-3-((methoxycarbonyl)methyl)- 5-((trityloxy)methyl)-2-pyrrolidinon
Zu einer Lösung von 40,0 g (S)-1-(Benzyloxycarbonyl)- 5-((trityloxy)methyl)-2-pyrrolidinon in 400 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran tropft man bei -65°C innerhalb von 20 Minu­ ten unter Rühren 81,3 ml einer 1-molaren Lösung von Lithium­ hexamethyldisilazid in Tetrahydrofuran. Nach 10-minütigem Rühren bei dieser Temperatur tropft man innerhalb von 30 Mi­ nuten eine Lösung von 7,5 ml Bromessigsäuremethylester in 50 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zu. Nach weiterem 45-mi­ nütigem Rühren bei -65°C läßt man die Reaktionslösung auf 0°C erwärmen und gibt 20 ml gesättigte Kochsalzlösung zu. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der verblei­ bende Rückstand in 750 ml Essigester aufgenommen. Die orga­ nische Phase wird dreimal mit Wasser und einmal mit gesät­ tigter Kochsalzlösung extrahiert, über Magnesiumsulfat ge­ trocknet und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird mit Cyclohexan/Essigester (2:1) über Kieselgel chromatographiert.
Ausbeute: 31,8 g (70% der Theorie),
Rf-Wert: 0,54 (Kieselgel; Cvclohexan/Essigester = 2:1)
Ber.:  C 74,58,  H 5,90,  N 2,49;
Gef.:  C 74,61,  H 6,09,  N 2,43
Beispiel D (3S,5S)-5-Hydroxymethyl-3-((methoxycarbony1)methyl)-2-pyrrolidinon
70,6 g (3S,5S)-1-(Benzyloxycarbonyl)-3-((methoxycarbonyl)­ methyl)-5-((trityloxy)methyl)-2-pyrrolidinon in 700 ml Me­ thanol werden 3,5 Stunden bei 50°C unter einem Wasserstoff­ druck von 5 bar mit 7 g eines Katalysators von 10% Palla­ dium auf Aktivkohle hydriert. Anschließend wird der Kataly­ sator abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zweimal mit 150 ml Petrolether verrührt und die Petrol­ ether-Phase abdekantiert. Das verbleibende Öl wird mit Me­ thylenchlorid/Methanol (10:1) über Kieselgel chromatogra­ phiert.
Ausbeute: 17,0 g gelbliches Öl (73% der Theorie),
Rf-Wert: 0,36 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol = 10:1)
Beispiel E (3S,5S)-5-((Methansulfonyloxy)methyl)-3-((methoxycarbonyl)­ methyl)-2-pyrrolidinon
Zu einer Lösung von 8,0 g (3S, 5S)-5-Hydroxymethyl-3-((meth­ oxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon und 4,95 ml Methansulfon­ säurechlorid in 100 ml Methylenchlorid tropft man bei 0°C innerhalb von 15 Minuten eine Lösung von 9,0 ml Triethylamin in 15 ml Methylenchlorid. Man rührt eine Stunde bei 0°C und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Zugabe von 20 ml Wasser wird die organische Phase abgetrennt und zwei­ mal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das Roh­ produkt wird mit Essigester/Methanol (15:1) über Kieselgel chromatographiert und der erhaltene Feststoff aus Methyl­ tert.butylether/Aceton umkristallisiert.
Ausbeute: 6,8 g (60% der Theorie),
Schmelzpunkt: 85-87°C
Rf-Wert: 0,42 (Kieselgel; Aceton/Petrolether = 4:1)
Ber.:  C 40,75,  H 5,70,  N 5,28,  S 12,09;
Gef.:  C 40,63,  H 5,50,  N 5,45,  S 12,01
Beispiel F 4:1-Gemisch von (3S, 5S)- und (3R,5S)-5-((3-Brom-4′-cyano- 4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((methoxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon
Eine Suspension von 7,0 g 3-Brom-4′-cyano-4-hydroxy-biphenyl und 10,5 g Cäsiumcarbonat in 150 ml Dimethylformamid wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 7,6 g (3S, 5S)-5-((Metharisulfonyloxy)methyl)-3-((methoxycarbonyl)­ methyl)-2-pyrrolidinon rührt man 2 Tage bei 55°C. Anschlie­ ßend wird das Lösungsmittel weitgehend eingedampft und der Rückstand mit Kochsalzlösung und verdünnter Salzsäure ver­ setzt. Man extrahiert die wäßrige Phase mit Essigester, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat und dampft ein. Das Rohprodukt wird mit Essigester über Kieselgel chro­ matographiert.
Ausbeute: 7,4 g (65% der Theorie),
Rf-Wert: 0,51 (Kieselgel; Methylenczhlorid/Methanol = 15:1)
Ber.:  C 56,90,  H 4,32,  N 6,32,  Br 18,03;
Gef.:  C 56,58,  H 4,41,  N 6,17,  Br 17,92
Beispiel G
(3S, 5S)-5-((4′-Amidino-3-brom-4-biphenylyl)oxymethyl)- 3-((methoxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon-hydrochlorid In eine Lösung von 6,4 g des 4:1-Gemisches von (3S, 5S)- und (3R, 5S)-5-((3-Brom-4′-cyano-4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((meth­ oxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon in 250 ml wasserfreiem Methanol leitet man bei 0°C unter Rühren 2 Stunden Chlorwas­ serstoff ein. Nach 2-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum bei einer Badtemperatur von 30°C abgedampft. Der Rückstand wird in 250 ml wasserfreiem Methanol gelöst und nach Zugabe von 20 g Ammoniumcarbonat 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird über wenig Kieselgel filtriert und das Filtrat im Vakuum einge­ engt. Das Rohprodukt wird mit Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak (4:1:0,25) über Kieselgel chromatographiert. Man erhält als letzte Fraktion das isomerenreine Produkt als Hy­ drochlorid.
Ausbeute: 270 mg (4% der Theorie),
Rf-Wert: 0,16 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 4:1:0,25)
Beispiel H (3S, 5S)-5-((4-(5-Amidino-2-pyridyl)phenyl)oxymethyl)- 3-((tert.butyloxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon-hydrochlorid
2,1 g (3S,5S)-3-((tert.Butyloxycarbonyl)methyl)-5-((4- (5-cyano-2-pyridyl)phenyl)oxymethyl)-2-pyrrolidinon in 50 ml trockenem Methanol werden mit 8,5 ml 0,13 M Natriummethylat- Lösung 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es werden 63 µl Eisessig und dann 0,5 g Ammoniumchlorid zugegeben, und 2 1/2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Einengen wird durch Säulenchromatographie auf Kieselgel mit Methylenchlorid/Me­ thanol (6:1) gereinigt.
Ausbeute: 1 g (42% der Theorie),
Schmelzpunkt: 207°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,56 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol = 4:1)
Analog wird folgende Verbindung erhalten:
(3S, 5S)-5-((4-(5-Amidino-2-pyrimidyl)phenyl)oxymethyl)- 3-((tert.butyloxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 277-279°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,38 (reversed phase Kieselgel; Methanol/5%ige wäßrige Kochsalzlösung = 6:4)
Beispiel I
(3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethy1)-3-((methoxycar­ bonyl)methyl)-1-(3-phenylpropyl)-2-pyrrolidinon-hydrochloridsemihydr-at
140 g (3S, 5S)-5-((4′-Cyano-4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((meth­ oxycarbonyl)methyl)-1-(3-phenylpropyl)-2-pyrrolidinon werden in 1100 ml Methanol gelöst und auf -20°C abgekühlt. Man lei­ tet bei dieser Temperatur 4 Stunden lang Salzsäuregas unter Rühren ein und rührt weitere 16 Stunden bei Raumtemperatur nach. Man dampft das Lösungsmittel im Vakuum ab, wobei das rohe Iminoester-hydrochlorid als zähes Öl zurück bleibt (172 g). Dieses Rohprodukt wird in 1500 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 144 g Ammoniumcarbonat 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach fügt man weitere 48 g Ammon­ iumcarbonat zu und rührt für weitere 1 1/2 Stunden. Das Reaktionsgemisch wird unter Rühren mit methanolischer Salz­ säure auf pH 3,5 gebracht. Man engt nun im Vakuum auf etwa 800 ml ein und filtriert das ausgefallene Ammoniumchlorid ab. Das Filtrat wird nun bis zur beginnenden Kristallisa­ tion weiter eingeengt (auf etwa 350 ml). Nach beendeter Kri­ stallisation filtriert man den Niederschlag ab und wäscht mit 75 ml eiskaltem Methanol und schließlich mit Aceton und Ether nach. Durch Einengen der Filtrate erhält man eine weitere Fraktion. Beide Kristallisate werden vereinigt und aus Metha­ nol umkristallisiert.
Ausbeute: 128,7 g (83% der Theorie),
Schmelzpunkt: 184-187°C (Zers.)
Ber.:  C 66,11,  H 6,47,  N 7,71,  Cl 6,50;
Gef.:  C 65,98,  H 6,41,  N 7,67,  Cl 6,67
Analog werden erhalten:
1) (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethy1)-3-((meth­ oxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon × 1,25 HCl
Schmelzpunkt: ab 141°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,30 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol = 85:15)
Ber.:  C 59,07,  H 5,72,  N 9,84,  Cl 10,38;
Gef.:  C 58,96,  H 5,96,  N 9,68,  Cl 10,10
2) (3S, 5S)-1-Acetyl-5-((4′-amidino-4-bipheny1yl)oxymethyl) 3-((methoxycarbonyl)methyl)-pyrrolidin-hydrochlorid
Rf-Wert: 0,16 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol = 10:1)
Ber.:  C 61,95,  H 6,33,  N 9,42,  Cl 7,95;
Gef.:  C 61,76,  H 6,31,  N 9,11,  Cl 7,84
3) (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((meth­ oxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon-hydrochlorid-semihydrat
Schmelzpunkt: 138°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,52 (reversed phase Kieselgel (RP8); Methanol/ 10% wäßrige Kochsalzlösung = 6:4)
Ber.:  C 59,08,  H 5,90,  N 9,84,  Cl 8,31;
Gef.:  C 58,96,  H 6,19,  N 9,68,  Cl 8,93
4) (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethyl)-3- ((methoxycarbonyl)methyl)-1-((pyrrolidin-N-carbonyl)methyl)- 2-pyrrolidinon-hydrochlorid
Rf-Wert: 0,46 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol/konz. wäßriges Ammoniak = 30:10:2)
5) (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethyl)-1-methan­ sulfonyl-3-((methoxycarbonyl)methyl)-pyrrolidin-hydrochlorid
Rf-Wert: 0,24 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol = 10:1)
Ber.:  C 54,82,  H 5,85,  N 8,72,  Cl 7,36;
Gef.:  C 54,68,  H 5,82,  N 8,47,  Cl 7,20
Beispiel J 1-(6-(4-Amidino-phenyl)-3-pyridazinyl)-4-(2-methoxycarbonyl­ ethyl)-imidazol
Eine Mischung aus 1,1 g 1-(6-(4-Cyan-phenyl)-3-pyridazinyl)- 4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)-imidazol, 1500 ml absolutem Me­ thanol und 50 ml Methylenchlorid wird unter Rühren und Eis­ kühlung mit trockenem Chlorwasserstoff gesättigt. Man rührt weitere 16 Stunden bei Raumtemperatur und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand wird in 250 ml ab­ solutem Methanol aufgenommen und mit 8 g Ammoniumcarbonat versetzt. Man rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und dampft das Filtrat im Vakuum ein. Der Eindampfrückstand wird mit dem vorher gewonnenen Nieder­ schlag vereinigt und, säulenchromatographisch gereinigt (Elu­ tionsmittel: Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 2:1:0,25).
Ausbeute: 0,36 g (31% der Theorie),
Rf-Wert: 0,22 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 2:1:0,25)
Analog werden folgende Verbindungen erhalten:
1) 1-(6-(4-Amidino-phenyl)-3-pyridazinyl)-4-(2-hydroxy- 2-methoxycarbonyl-ethyl)-imidazol
Rf-Wert: 0,17 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 2:1:0,25)
2) 1-(6-(4-Amidino-phenyl)-3-pyridazinyl)-4-(2-amino-2-meth­ oxycarbonyl-ethyl)-imidazol-tris-trifluoracetat
Als Ausgangsprodukt dient 1-(6-(4-Cyan-phenyl)-3-pyridazi­ nyl)-4-(2-tert.butyloxycarbonylamino-2-methoxycarbonyl­ ethyl)-imidazol
Die rohe freie Base wird durch Aufnehmen in Methylenchlorid, Versetzen mit Trifluoressigsäure, Einengen und Reinigen über Kieselgel (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 2:1:0,25) in das Tris-trifluoracetat überführt.
Rf-Wert: 0,18 (Kieselgel; Methylezichlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 2:1:0,25)
Beispiel K Di-(4-Amidino-4′-(5-methoxycarbonyl-pentyloxy)-biphenyl)-dihy­ drogencarbonat
Man überschichtet 75 ml Methanol mit 30 ml Petroläther und leitet unter Eiskühlung Chlorwasserstoffgas bis zur Sätti­ gung ein. Man trägt nun 2,1 g 4-Cyano-4′-(5-ethoxycarbonyl­ pentyloxy)-biphenyl ein und rührt 18 Stunden bei Raumtempera­ tur. Man engt im Vakuum zur Trockene ein, suspendiert den Rückstand in Methanol, setzt 5,36 g Ammoniumcarbonat zu und rührt 16 Stunden bei Raumtemperatur. Der erhaltene Nieder­ schlag wird abfiltriert und durch Verrühren mit Methylenchlo­ rid/Methanol (85:15) und Wasser gereinigt.
Ausbeute: 1,75 g (75% der Theorie),
Schmelzpunkt: 185-189°C (Zers.)
Ber. (× 0,5 H₂CO₃):  C 66,31,  H 6,74,  N 7,55;
Gef.:  C 66,75,  H 6,85,  N 7,41
Analog werden folgende Verbindungen erhalten:
1) 4-Amidino-4′-((4-methoxycarbonylmethyl-piperidino)­ carbonyl)-biphenyl-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 268-270°C
2) 4-Amidino-4′-((4-methoxycarbonylmethyl-piperidino)­ methyl)-biphenyl-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 148-150°C (Zers.)
3) 4-Amidino-4′-((4-methoxycarbonyl-cyclohexyl)-aminocarbo­ nyl)-biphenyl-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 302-305°C (Zers.)
4) 4-Amidino-4′-methoxy-3′-((4-methoxycarbonyl-cyclohexyl)­ aminocarbonyl) -biphenyl
Rf-Wert: 0,15 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol = 9:1)
5) 4-Amidino-4′-(N-(4-methoxycarbonyl-cyclohexyl)-N-methyl­ aminocarbonyl)-biphenyl-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 295-300°C
Beispiel L 1-(4′-Amidino-4-biphenylyl)-3-methoxycarbonylmethyl-imidazoli­ din-2-on-hydrochlorid
Zu 3,1 g 1-(4′-Cyano-4-biphenylyl)-3-methoxycarbonylmethyl­ imidazolidin-2-on gibt man 85 ml einer unter Eiskühlung ge­ sättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol. Die ent­ standene Suspension wird mit Petrolether überschichtet und 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man engt zur Trocke­ ne ein und trocknet noch 15 Minuten bei 1 mbar nach. Der Rückstand wird in 80 ml absolutem Methanol suspendiert, mit 2,7 g Ammoniumcarbonat versetzt und 16 Stunden bei Raumtem­ peratur gerührt. Man filtriert vom Niederschlag ab, engt die Mutterlauge ein und reinigt den Rückstand durch Säulenchro­ matographie an Kieselgel (Elutionsmittel: Methylenchlorid/ Methanol/konz.Ammoniak = 3:1:0,2).
Ausbeute: 0,7 g (20% der Theorie),
Schmelzpunkt: über 200°C
Rf-Wert: 0,53 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 3:1:0,2)
Analog werden folgende Verbindungen erhalten:
1) 1-(4-Amidino-phenyl)-3-(4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)­ cyclohexyl)-imidazolidin-2-on-hydrochlorid
Schmelzpunkt: über 200°C
Rf-Wert: 0,44 (Reversed Phase Platte RP8; Methanol/5%ige Natriumchloridlösung = 6:4)
2) 1-(4-Amidino-phenyl)-3-(4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)-phe­ nyl)-imidazolidin-2,4-dion-hydrochlorid
Schmelzpunkt: über 260°C
Rf-Wert: 0,19 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol = 9 : 1)
Ber.:  C 57,62,  H 5,08,  N 13,44,  Cl 8,50;
Gef.:  C 56,94,  H 5,03,  N 13,33,  Cl 8,99
3) 2-(4-Amidino-phenyl)-5-(4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)-phe­ nyl)-3,4-dihydro-2H, 5H-1,2,5-thiadiazol-1,1-dioxid-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 245-248°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,44 (Reversed Phase Platte RP8; Methanol/10%ige Natriumchloridlösung = 6:4)
4) 1-(4-Amidino-phenyl)-3-(4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)­ phenyl)-4-methyl-3H-imidazol-2-on-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 248°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,40 (Reversed Phase Platte RP8; Methanol/5%ige Natriumchloridlösung = 6:4)
5) 2-(4-Amidino-phenyl)-4-(4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)­ phenyl)-5-methyl-4H-1,2, 4-triazol-3-on-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 272-274°C
Rf-Wert: 0,37 (Reversed Phase Platte RP8; Methanol/5%ige Natriumchloridlösung = 6:4)
6) 2-(4-Amidino-phenyl)-5-ethyl-4-(4-(2-methoxycarbonyl­ ethyl)-phenyl)-4H-1,2,4-triazol-3-on-hydrochlorid
Schmelzpunkt: über 250°C
Rf-Wert: 0,36 (Reversed Phase Platte RP8; Methanol/10%ige Natriumchloridlösung = 6:4)
Ber.:  C 58,67,  H 5,63,  N 16,29,  Cl 8,25;
Gef.:  C 58,01,  H 5,65,  N 16,26,  Cl 9,14
7) 2-(4-Amidino-phenyl)-4-(4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)­ phenyl)-4H-1,2,4-triazol-3-on-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 275-277°C
Rf-Wert: 0,55 (Reversed Phase Platte RP8; Methanol/5%ige Natriumchloridlösung = 6:4)
8) 4-(4-Amidino-phenyl)-2-(4-(2-methoxycarbonyl-ethyl)­ phenyl)-4H-1,2,4-triazol-3-on-hydrochlorid
Schmelzpunkt: 289-291°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,49 (Reversed Phase Platte RP8; Methanol/5%ige Natriumchloridlösung = 6:4)
Beispiel M 2-(4-Amidino-phenyl)-5-((3-methoxycarbonyl-propyl)-aminocar­ bonyl)-1-methyl-benzimidazol-hydrochlorid
4,2 g 4-(4-(N-(4-Amidino-benzoyl)-methylamino)-3-nitro-benzo­ ylamino)-buttersäure-methylester werden in 100 ml Methanol gelöst, mit 10 ml etherischer Salzsäure und 0,5 g 10%iger Palladiumkohle versetzt und bei Raumtemperatur mit Wasser­ stoff von 5 bar Druck 22 Stunden behandelt. Man setzt weitere 0,3 g des Katalysators zu und läßt eine weitere Stunde rea­ gieren. Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat einge­ dampft und der Rückstand mit einer Mischung aus 100 ml Essig­ ester und 10 ml Methanol eine Stunde bei Raumtemperatur ver­ rührt, wobei die Substanz in kristalliner Form anfällt.
Ausbeute: 3,7 g (100% der Theorie),
Schmelzpunkt: über 200°C
Rf-Wert: 0,65 (Reversed-Phase-Platte RP18; Methanol/5%ige wäßrige Natriumchloridlösung = 6:4)
Analog wird folgende Verbindung erhalten:
1) 2-(4-Amidino-phenyl)-5-((2-methoxycarbonyl-ethyl)-amino­ carbony1) -1-methyl-benzimidazol
Rf-Wert: 0,59 (Reversed-Phase-Platte RP18; Methanol/5%ige wäßrige Natriumchloridlösung = 6:4)
Beispiel N 2-( (4-Amidino-phenyl)-oxymethyl)-5(6)-methoxycarbonylmeth­ oxy-benzimidazol-hydrochlorid
2,4 g 2-( (4-Cyan-phenyl)-oxymethyl)-5(6)-methoxycarbonylmeth­ oxy-benzimidazol werden in 300 ml Methanol suspendiert. In die Mischung leitet man eine Stunde lang bei 0-10°C Salz­ säuregas ein und rührt 4 Stunden bei 15-20°C nach. Das Methanol wird im Vakuum abgedampft, der Rückstand mit 75 ml Methanol versetzt und dieses wiederum im Vakuum abdestil­ liert. Der Rückstand wird in 300 ml Methanol suspendiert, wonach man unter Rühren portionsweise 16,3 g Ammoniumcarbo­ nat zufügt und weitere 16 Stunden nachrührt. Die Reaktions­ mischung wird mit einer Mischung aus 3 Teilen Methanol und einem Teil konzentrierter Salzsäure auf pH4 gebracht. Man dampft zur Trockene ein und reinigt den Rückstand über Kie­ selgel (Elutionsmittel: Methylenchlorid/Methanol = 3:1 bis 0:1).
Ausbeute: 0,9 g (32% der Theorie),
Schmelzpunkt: 250°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,64 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol/Eis­ essig = 3:1:0,1)
Ber. × H₂O × HCl:  C 52,87,  H 5,18,  N 13,70,  Cl 8,67;
Gef.:  C 53,07,  H 5,02,  N 13,81,  Cl 8,80
Analog werden folgende Verbindungen erhalten:
1) 2-(4-Amidino-phenyl)-1-(2-(3,4-dimethoxy-phenyl)-ethyl)- 5-((2-methoxycarbonyl-ethyl)-aminocarbonyl)-benzimidazol­ hydrochlorid
Rf-Wert: 0,20 (Kieselgel; Essigester/Ethanol = 7:3)
2) 2-(4-Amidino-phenyl)-5-((2-methoxycarbonyl-ethyl)-amino­ carbonyl)-1-(2-piperazino-ethyl)-benzimidazol
Schmelzpunkt: 80°C (Zers.)
Rf-Wert: 0,14 (Kieselgel; Isopropanol/Wasser/konz. Ammoniak = 7:2:1, nach zweimaliger Entwicklung)
3) 2-(4-Amidino-phenyl)-5-((2-methoxycarbonyl-ethyl)-amino­ carbonyl)-1-(3-thiomorpholino-propyl)-benzimidazol
Rf-Wert: 0,18 (Kieselgel; Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak = 8:2:0,1)
Herstellung der Endprodukte Beispiel 1 (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((methoxy­ carbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon-hydrochlorid(3-3H-4-biphe­ nylyl)
In einer geschlossenen Apparatur wird eine Lösung von 25 mg (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-3-brom-4-biphenylyl)oxymethyl)- 3-((methoxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon-hydrochlorid in 0,5 ml Dimethylformamid in Gegenwart von 10 mg eines Kataly­ sators von 10% Palladium auf Aktivkohle unter kräftigem Rühren mit 370 GBq trägerfreiem Tritiumgas behandelt. Nach 4 Stunden ist die Aufnahme von Tritium beendet. Die Reaktions­ lösung wird mit weiterem Dimethylformamid verdünnt, der Ka­ talysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter verminder­ tem Druck bei 80°C abgezogen. Bei diesem Schritt wird der Großteil des labilen Tritiums entfernt. Zur Entfernung des restlichen labilen Tritiums wird der Rückstand in 50 ml ab­ solutem Ethanol aufgenommen, 3 Tage bei Raumtemperatur ste­ hengelassen und dann bei 35°C bei vermindertem Druck das Ethanol wieder vollständig abgezogen. Der Rückstand wird zur Lagerung in 50 ml absolutem Ethanol aufgenommen.
Radiochemische Ausbeute: 13,14 GBq (3,6% der Theorie bezogen auf eingesetzte Tritium-Gesamtaktivität)
Radiochemische Reinheit: 98,8% der Theorie
Bestimmungsmethode HPLC:
  Säule: 4 × 125 mm Kromasil 100, C 18, 5 µm
  Fluß: 1,5 ml/Minute
  Fließmittel A: 0,1% KH₂PO₄, pH 2,5 (H₃PO₄)
  Fließmittel B: Methanol
  Gradient: in 10 Minuten von 95% A nach 65% A, weiter 20 Minuten 65% A
Beispiel 2 (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((carboxyl)­ methyl)-2-pyrrolidinon(3-3H-4-biphenylyl)
Eine Lösung von 2,57 mg (1,577 GBq) (3S, 5S)-5-((4′-Amidino- 4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((methoxycarbonyl)-methyl)-2-pyrro­ lidinon-(3-3H-4-biphenylyl) in 6 ml Ethanol wird bei ver­ mindertem Druck bei 35°C eingeengt. Den Rückstand löst man in 300 µl Methanol und setzt 50 µl 2N Natronlauge zu (pH 12). Nach 12 Stunden bei Raumtemperatur wird erst mit 600 µl Wasser versetzt und dann Ammoniumchlorid bis zum pH 8 zugegeben. Anschließend werden nochmals 180 µl Wasser und 60 µl Methanol zugegeben und diese klare Lösung zur Reinigung auf RP-8 Dünnschicht-Fertigplatten (Fa. Merck; Fließmittel: 60% Methanol/40% 10%ige Kochsalzlösung) chro­ matographiert. Die im UV-Licht (254 und 366 nm) gut erkenn­ baren Bahnen mit der Titelverbindung werden unter den üb­ lichen Vorsichtsmaßnahmen von den noch feuchten Platten ab­ gekratzt, mit 4 ml Dimethylsulfoxid und 200 µl 1N Salzsäure gründlich ausgerührt. Die Suspension wird über ein Membran­ filter, Porenweite 0,5 µm, filtriert. Man erhält 3,5 ml Lösung der (3H)Titelverbindung.
Radiochemische Reinheit: 97,8% der Theorie
Bestimmungsmethode HPLC:
  Säule: 4 × 125 mm Kromasil 100, C 18, 5 µm
  Fluß: 1,5 ml/Minute
  Fließmittel A: 0,1% KH₂PO₄, pH 2,5 (H₃PO₄)
  Fließmittel B: Methanol
  Gradient: in 10 Minuten von 95% A nach 65% A, weiter 20 Minuten 65% A
Identität: Durch HPLC im Vergleich mit inaktivem, analysenreinem Material nachgewiesen.
Gehaltsbestimmung (UV-spektrophotometrisch): 0,371 mg/ml
Aktivitätskonzentration (Flüssigscintillationsmethode): 258,5 MBq/ml
Spezifische Aktivität: 256 GBq/mMol = 0,697 MBq/mg
Chemische Ausbeute: 1,298 mg (57% der Theorie)
Beispiel 3 (35, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((carboxy)­ methyl)-2-pyrrolidinon(3-3H-4-biphenylyl)
Eine Lösung von 2,14 mg (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)­ oxymethyl)-3-((methoxycarbonyl)methyl)-2-pyrrolidinon-hydro­ chlorid(3-3H-4-biphenylyl) in 5 ml Ethanol mit einer Ge­ samtradioaktivität von 1,314 GBg wird bei vermindertem Druck bei 35°C eingeengt. Den Rückstand löst man in 350 µl Me­ thanol und setzt 25 µl 2N Natronlauge zu (pH 12). Nach 12 Stunden bei Raumtemperatur werden die ausgefallenen Kristal­ le auf den Boden des Reaktionsgefäßes zentrifugiert und der klare Überstand abpipettiert. Der kristalline Rückstand wird 3 mal mit je 100 µl Methanol gewaschen, in 300 µl Dime­ thylsulfoxid und 40 µl 1N Salzsäure gelöst und anschließend mit weiterem Dimethylsulfoxid auf ein Gesamtvolumen von 3 ml gebracht.
Radiochemische Ausbeute: 425 MBq (32% der Theorie)
Chemische Ausbeute: 0,61 mg (32% der Theorie)
Identität: Durch HPLC im Vergleich mit inaktivem, analysen reinem Material nachgewiesen.

Claims (11)

1. Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten, die eine vergleichbare oder höhere Affinität gegenüber dem Rezeptor als 125J-Fi­ brinogen aufweisen und in Gegenwart von Fremdprotein eine Affinität (KD) von weniger als 500 nM gegenüber dem Rezep­ tor aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Fibrinogen- Rezeptor-Antagonisten mindestens ein detektierbares Atom enthalten.
2. Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten gemäß Anspruch 1, da­ durch gekennzeichnet, daß als detektierbares Atom Tritium anstelle von Wasserstoff verwendet wird.
3. Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Wasserstoffatom in einem Amidin der allgemeinen Formel Ra - Rb (I)in der
Ra eine 4-Amidinophenyl- oder 5-Amidino-pyrimid-2-yl-Gruppe und
Rb eine HOOC-D-C-B-A-Gruppe bedeuten,
A eine gegebenenfalls durch eine Methoxygruppe substi­ tuierte Phenylengruppe, in der zusätzlich eine oder zwei Methingruppen jeweils durch ein Stickstoffatom ersetzt sein können, eine gegebenenfalls an einem Kohlenstoff­ atom durch eine Methyl-, Ethyl- oder Trifluormethylgrup­ pe substituierte Imidazolon-di-yl-, Imidazolidinon-di­ yl-, Imidazolidin-dion-di-yl-, Triazolon-di-yl- oder 1,1-Dioxo-3,4-dihydro-1,2,5-thiadiazol-di-yl-gruppe, eine gegebenenfalls an einem der Stickstoffatome durch den Rest R1 substituierte Benzimidazol-di-yl-gruppe oder eine mit dem Stickstoffatom an den Rest B gebundene Aminocarbonylgruppe,
B eine Methylen-, Carbonyl-, Cyclohexylen-, Phenylen- oder Imidazol-di-yl-gruppe, eine über das Stickstoffatom an den Rest C gebundene Aminocarbonylgruppe, welche gleichzeitig am Stickstoffatom durch eine Methylgruppe substituiert sein kann, oder eine über das Sauerstoff­ atom an den Rest A gebundene Methylenoxygruppe,
C eine gegebenenfalls durch den Rest R2 substituierte Ethylengruppe, eine Cyclohexylengruppe, eine gegebenen­ falls am Stickstoffatom durch den Rest R3 substitu­ ierte Pyrrolidin-di-yl- oder Pyrrolidinon-di-yl-gruppe, eine Piperidin-di-yl-gruppe oder eine mit dem Stick­ stoffatom an den Rest D gebundene Aminocarbonylgruppe und
D eine Bindung, eine Methylen- oder Ethylengruppe dar­ stellen, wobei
R1 eine Methyl-, 2-Piperazinoethyl-, 2-(3,-4-Dimeth­ oxyphenyl)ethyl- oder 3-Thiomorpholinopropylgruppe, R2 eine Amino- oder Hydroxygruppe und R3 eine 3-Phenylpropyl-, Acetyl-, Methansulfonyl- oder Pyrrolidinocarbonylmethylgruppe darstellen, durch Tritium ersetzt ist,
deren Tautomere, deren Stereoisomere einschließlich deren Gemische und deren Salze.
4. Folgende Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten gemäß Anspruch 3:
1) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-(((4-(5-Amidinopyrimid-2-yl)-phe­ nyl) -oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
2) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-1-Acetyl-5-((4′-amidino-4-biphenyl­ yl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin,
3) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl) -3-carboxymethyl-1-methansulfonyl-pyrrolidin,
4) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
5) 4-Amidino-4′-((trans-4-carboxycyclohexyl)-aminocarbonyl)­ biphenyl,
6) 4-Amidino-4′-(N-(trans-4-carboxycyclohexyl)-N-methyl­ aminocarbonyl)-biphenyl,
7) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-imida­ zolidin-2,4-dion,
8) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4-me­ thyl-4-imidazolin-2-on,
9) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4H- 1,2, 4-triazol-3-on,
10) 4-(4-Amidinophenyl)-2-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-4H- 1,2,4-triazol-3-on,
11) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-5-me­ thyl-4H-1,2, 4-triazol-3-on,
12) 2-(4-Amidinophenyl)-4-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-5- ethyl-4H-1,2,4-triazol-3-on,
13) 2-(4-Amidinophenyl)-5-(4-(2-carboxyethyl)-phenyl)-3,4- dihydro-2H,5H-1,2,5-thiadiazol-1,1-dioxid,
14) 1-(4-Amidinophenyl)-3-(4-(2-carboxyethyl)-cyclohexyl)­ imidazolidin-2-on,
15) 2-(4-Amidinophenyl)-5-((2-carboxyethyl)-aminocarbonyl)- 1-(2-(piperazin-1-yl)-ethyl)-benzimidazol
und deren Salze.
5. Folgende Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 3:
1) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-(((4-(5-Amidinopyrimid-2-yl)-phe­ nyl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on,
2) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-1-Acetyl-5-((4′-amidino-4-biphenyl­ yl)-oxymethyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin,
3) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl)-3-carboxymethyl-1-methansulfonyl-pyrrolidin,
4) (3S, 5S)- und (3R, 5R)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)-oxyme­ thyl)-3-carboxymethyl-pyrrolidin-2-on und
deren Salze.
6. Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten der allgemeinen Formel I gemäß den Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein aromatisches Wasserstoffatom durch Tritium ersetzt ist.
7. (3S, 5S)-5-((4′-Amidino-4-biphenylyl)oxymethyl)-3-((car­ boxy)methyl)-2-pyrrolidinon(3-3H-4-biphenylyl) und dessen Salze.
8. Verwendung der markierten Fribrinogen-Rezeptor-Antagoni­ sten gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 zur Bestimmung der Bindung von chemischen Substanzen an Fibrinogenrezeptoren.
9. Verwendung der markierten Fribrinogen-Rezeptor-Antagoni­ sten gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 zur Bestimmung der Bindung von chemischen Substanzen an Fibrinogenrezeptoren in Gegen­ wart von Fremdeiweiß und/oder von Körperflüssigkeiten.
10. Verfahren zur Herstellung der Tritium markierten Fibri­ nogen-Rezeptor-Antagonisten gemäß den Ansprüchen 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in einen Fibrinogen-Rezeptor-An­ tagonisten gemäß den Ansprüchen 1 bis 7
  • a) durch katalytische Tritiierung einer ungesättigten Koh­ lenstoff-Kohlenstoff-Bindung,
  • b) durch hydrogenolytischen Austausch eines Halogenatoms,
  • c) durch katalytischen Wasserstoff/Tritiumaustausch,
  • d) durch katalytischen Wasserstoff/Tritiumaustausch in tri­ tiierten Lösungsmitteln oder
  • e) durch Tritiierung einer Vorstufe des herzustellenden Fi­ brinogen-Rezeptor-Antagonisten und anschließende Synthese des Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten
mindestens ein Tritiumatom anstatt von Wasserstoff einge­ führt wird und gewünschtenfalls anschließend ein so erhaltenes Isomerenge­ misch in seine Enantiomere aufgetrennt wird und/oder
eine so erhaltene tritiierte Verbindung in ihr Salz überge­ führt wird.
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