DE4209620C1

DE4209620C1 - Verfahren zur Korrektur des Volumenfehlers ïV bei einem Pipettiersystem

Info

Publication number: DE4209620C1
Application number: DE4209620A
Authority: DE
Inventors: Dieter Dr Husar
Original assignee: Eppendorf Netheler Hinz GmbH; Eppendorf Geraetebau Netheler and Hinz GmbH
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 1992-03-25
Filing date: 1992-03-25
Publication date: 1993-12-16
Anticipated expiration: 2012-03-26
Also published as: EP0562358A2; EP0562358B1; US5481900A; EP0562358B2; EP0562358B8; DE59306907D1; EP0562358A3

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Korrektur des Volumenfehlers ΔV bei einem Pipettiersystem mit einer Kolbenhubpipette und einer darauf steckbaren Pipettenspitze.

Aus der DE 25 26 296 C3 ist ein Pipettiersystem bekannt, dessen Kolbenhubpipette einen Konus zum Aufstecken der Pipettenspitze hat. Die Pipettenspitze weist ausgehend von der Spitzenöffnung einen stark konischen und daran anschließend bis zur Aufstecköffnung einen schwächer konischen Abschnitt bezogen auf die Innenkontur auf. Eine derartige Pipettenspitze hat beim Eintauchen in ein tiefes und insbesondere schlankes Gefäß den Nachteil, daß eine sie tragende Pipette mit dem Gefäß Wandberührung bekommen und kontaminiert werden kann. Dies ist grundsätzlich bei einer Pipettenspitze nicht der Fall, die gemäß EP 0 182 943 A1 ausgehend von einer Spitzenöffnung eine lange zylindrische Nase, daran anschließend einen stark konischen und danach eine Aufstecköffnung aufweist.

Bei den genannten Pipettiersystemen erstreckt sich der Einstellbereich aufnehmbarer Flüssigkeitsmengen jeweils von der Spitzenöffnung aus über alle verschiedenen Abschnitte der Pipettenspitze hinweg. Ist ein geringer Kolbenhub eingestellt, wird Flüssigkeit nur in den stark konischen (oder zylindrischen) Anfangsbereich eingesogen. Bei größerem Kolbenhub wird der schwächer konische (oder der konische und danach der zylindrische) Bereich erreicht. Den Pipettiersystemen ist gemeinsam, daß sie im Zusammenwirken mit einer einstellbaren Kolbenhubpipette Flüssigkeitsvolumina aufnehmen, die unakzeptabel vom angezeigten Flüssigkeitsvolumen abweichen können, wobei die Abweichung über den Einstellbereich hinweg unterschiedlich möglich ist. Deshalb wird die Steigung einer Spindel der Kolbenhubpipette für die Einstellung des Kolbenhubes versuchsweise so ermittelt, daß die Richtigkeitsabweichung zwischen aufgenommenem und angezeigtem Flüssigkeitsvolumen über den gesamten Einstellbereich hinweg erträglich ist. Die resultierenden Richtigkeitsabweichungen werden hingenommen und sind allenfalls aufgrund nachträglicher Messungen feststellbar.

Daran ist außer der Vernachlässigung von Richtigkeitsabweichungen unbekannter Größe über den Einstellbereich hinweg nachteilig, daß die Abstimmung von Kolbenhubpipette und Pipettenspitze einen Wechsel der Pipettenspitze erschwert. Soll z. B. eine Kolbenhubpipette mit einer Pipettenspitze erstgenannter Art mit einer Pipettenspitze der zweitgenannten Art bestückt werden, so ist mit der gegebenen Spindelsteigung nicht mehr gewährleistet, daß die Richtigkeitsabweichungen über den Einstellbereich hinweg erträglich sind.

Aus der US 5 024 109 ist es bekannt, daß der Totraum eines Pipettiersystems zwischen dem Flüssigkeitsspiegel und dem Kolben der Pipette einen Volumenfehler bedingt, also eine Abweichung des tatsächlich eingesaugten Flüssigkeitsvolumens vom gewünschten Volumen zur Folge hat. Zur Kompensation dieses Fehlers wird das Pipettiersystem an einen Mikrocomputer angeschlossen, in dem bestimmte charakteristische Konstanten des Pipettiersystems, insbesondere der Querschnittsverlauf der Pipettierspitze usw. gespeichert sind. Nach Eingabe des Sollwertes für das einzusaugende Flüssigkeitsvolumen errechnet der Mikrocomputer zunächst die Höhe der Flüssigkeitssäule in der Pipettierspitze, dann mit Hilfe der Höhe den Volumenfehler, der zum Volumensollwert hinzuaddiert wird und berechnet hieraus den auszuführenden Kolbenhub. Ein derart aufwendiges System zur Fehlerkompensation ist nicht immer erwünscht. Außer dem erwähnten konischen Querschnittsverlauf der Pipettierspitze sind auch zylindrische Pipettierspitzen bekannt, z. B. aus der EP 0 199 466 A2.

Von dem vorgenannten bekannten System gemäß der US 5 024 109 zur Korrektur des Volumenfehlers ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, das ein Pipettiersystem so verbessert, daß über den gesamten Einstellbereich der aufzunehmenden Pipettierflüssigkeit hinweg auf einfache Weise genau gearbeitet werden kann.

Die Lösung dieser Aufgabe ist im Anspruch 1 angegeben. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß Pipettenproportionalitätsfaktor, Querschnittsverlauf entlang der Spitze, Totvolumen und gegebenenfalls Nullpunktsverschiebung der Anzeige für die Höhe der Richtigkeitsabweichungen über den Einstellbereich maßgeblich sind. Durch Abstimmung dieser Einflußfaktoren aufeinander ist es folglich möglich, im Einstellbereich für jedes aufgenommene Flüssigkeitsvolumen eine vorgegebene Richtigkeitsabweichung vom angezeigten Flüssigkeitsvolumen zu realisieren, die auch Null sein kann. Im Gegensatz zu herkömmlichen Pipettiersystemen werden nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 nicht mehr Richtigkeitsabweichungen durch Wahl der Spindelsteigung nach Vorgabe der übrigen Einflußgrößen minimiert, sondern sämtliche o. g. Einflußgrößen so aufeinander abgestimmt, daß vorgegebene Richtigkeitsabweichungen erreicht werden. Bei einem solchen Pipettiersystem ist dann für jedes angezeigte Flüssigkeitsvolumen der genaue Wert des aufgenommenen Flüssigkeitsvolumens bekannt. Infolgedessen kann der Kolbenhub mittels der Anzeige stets so eingestellt werden, daß das aufgenommene Flüssigkeitsvolumen dem beabsichtigten Volumen entspricht. Ferner lassen sich Pipettenspitzen an herkömmliche Kolbenhubpipetten so anpassen, daß vorgegebene Richtigkeitsabweichungen erreicht werden. Hierdurch kann im Bedarfsfalle ein Pipettiersystem mit einer verlängerten Pipettenspitze ausgerüstet werden, welche Wandberührungen und einhergehende Kontamination vermeidet. Umgekehrt ist es auch möglich, vorgegebene Richtigkeitsabweichungen durch Abstimmung einer Kolbenhubpipette auf vorhandene Pipettenspitzen sicherzustellen.

Die Richtigkeitsabweichung kann auf verschiedene Weise definiert werden. Für die praktische Handhabung besonders günstig ist die Vorgabe einer konstanten absoluten oder relativen Richtigkeitsabweichung, weil dann der Unterschied des aufgenommenen vom angezeigten Flüssigkeitsvolumen am einfachsten bestimmbar ist.

Soll ein herkömmliches Pipettiersystem insbesondere durch Austausch einer Pipettenspitze umgewandelt werden, kann eine Abstimmung erfolgen, die für jedes aufgenommene Flüssigkeitsvolumen eine vorgegebene Richtigkeitsabweichung vom aufgenommenen Flüssigkeitsvolumen des herkömmlichen Pipettiersystems anstatt vom angezeigten Flüssigkeitsvolumen bedingt. Dann sind die Unterschiede des pipettierten Flüssigkeitsvolumens vom herkömmlicherweise pipettierten Volumen bei gleicher Anzeige bekannt. Dieses Wissen kann für Vergleichsuntersuchungen mit geänderter Pipettenspitze interessant sein.

In der Regel steigt der Flüssigkeitsspiegel im Einstellbereich aufnehmbarer Flüssigkeitsvolumina stets bis in einen Arbeitsbereich der Pipettenspitze empor. Zum Ausgleich von Querschnittsänderungen einschließlich Unstetigkeitsstellen im Anfangsbereich der Pipettenspitze kann die Abstimmung eine Nullpunktsverschiebung des angezeigten Flüssigkeitsvolumens gegenüber dem Kolbenhub einbeziehen.

In der Praxis sind bisweilen Werte von Pipettenkorrekturfaktor, Totvolumen und gegebenenfalls Nullpunktsverschiebung vorgegeben, insbesondere wenn das Pipettiersystem durch Anpassung einer Pipettenspitze an eine vorhandene Kolbenhubpipette verwirklicht werden soll. Zum Erreichen der vorgegebenen Richtigkeitsabweichung kann dann eine Abstimmung des Querschnittsverlaufs entlang der Spitze auf die vorgegebenen Einflußgrößen genügen.

Ist der Arbeitsbereich der Pipettenspitze im wesentlichen zylindrisch, wird eine konstante absolute Richtigkeitsabweichung über den gesamten Einstellbereich aufnehmbarer Flüssigkeiten hinweg verwirklicht. Für eine kleine Spitzenöffnung und einen ausreichend großen Volumenbereich für die Aufnahme einstellbarer Flüssigkeitsmengen kann dieser einen sich allmählich erweiternden Übergangsbereich aufweisen. Der Übergangsbereich hat bevorzugt einen Übergangsradius oder Übergangskonus, wobei der Konuswinkel zur Vermeidung unerwünschter Effekte (Springbrunneneffekt) möglichst klein gehalten wird. Dem Übergangsbereich ist bevorzugt ein Arbeitsbereich nachgeordnet. Insbesondere für die Benutzung bei relativ langen und schlanken Gefäßen hat das Pipettiersystem eine Pipettenspitze mit einem dünnen Ansaugröhrchen angrenzend an die Spitzenöffnung. Dann hat die Spitze bevorzugt auch einen sich erweiternden Übergangs- sowie einen nachgeordneten Arbeitsbereich.

Zwecks Anpassung des Pipettiersystems an verschiedene Flüssigkeitsdichten oder Luftdrucke ist der Pipettenproportionalitätsfaktor einstellbar. Das ist im einfachsten Falle durch den Austausch einer Spindel für das Einstellen des Kolbenhubs durchführbar. Auch kommt dafür eine Anzeigeeinrichtung mit einer spreizbaren Skala in Betracht. Zu vorstehendem Zweck kann auch eine Nullpunktsverschiebung der Anzeige mittels ähnlicher Maßnahmen realisiert werden.

Ferner ist ein einstellbares Totvolumen vorgesehen.

Das ist insbesondere durch Austausch von Pipettenspitzen möglich, wobei eine Pipettenspitze für leichtere Flüssigkeiten bei gleichem Durchmesser länger ausgeführt werden muß. Zur Veränderung des Totvolumens können auch Zwischenstücke zwischen Kolbenhubpipette und Pipettenspitze einsetzbar sein.

Für eine Abstimmung der Einflußgrößen zum Erreichen der vorgegebenen Richtigkeitsabweichungen wird das nachfolgende physikalisch-mathematische Modell herangezogen: Das Kolbenvolumen V_Kolben einer Kolbenhubpipette ist um den Volumenfehler ΔV größer als das aufgenommene Flüssigkeitsvolumen V_Flüss..

V_Kolben = V_Flüss. + ΔV (A)

Der Volumenfehler resultiert daraus, daß die Flüssigkeitssäule am Luftpolster zwischen Flüssigkeitsspiegel und Kolben (="Totvolumen") hängt und nach unten zieht, wobei das Luftpolster entsprechend vergrößert wird.

Die Änderungen von Volumen und Druck im Luftpolster lassen sich ausgehend von Totvolumen von Pipette und Spitze bei Umgebungsdruck mittels einer thermischen Zustandsgleichung beschreiben. Zur Berechnung von ΔV wird angenommen:
Ideales Gas, T=const.
damit gilt: p · V = const.
oder: p_o · V_t = (p_o-Δp) · (V_t + ΔV) (B)
mit: V_t = Luftpolster, Totvolumen von Pipette und Spitze
P_o = Außendruck, atmosphärischer Druck
Δ_p = Druckänderung entsprechend hydrostat. Druck der Flüssigkeitssäule in der Pipettenspitze
aus (B) folgt:

und:

weiter

und unter Berücksichtigung, daß

Δp«p_o

ergibt sich:

Totvolumen und atmosphärischer Druck werden als bekannt vorausgesetzt. Die Druckänderung Δp entspricht dem hydrostatischen Druck der Flüssigkeitssäule der Höhe h:

p = ρ · g · h (D)

mit:
ρ = spezifisches Gewicht
g = Erdbeschleunigung

Die Höhe h der Flüssigkeitssäule ist durch das pipettierte Flüssigkeitsvolumen und den Querschnittsverlauf der Pipettenspitze bestimmt:

mit Q (y) = Querschnitt im Abstand y von Spitzenöffnung

Aus (A), (C) und (D) folgt:

Mit (E) und (F) läßt sich die Abhängigkeit des Kolbenhubs V_Kolben vom aufgenommenen Flüssigkeitsvolumen V_Flüss. errechnen, ggfs. unter Zuhilfenahme numerischer Methoden.

Der Kolbenhub ist durch Anschläge begrenzt, deren Abstand sich mittels einer Spindel verstellen läßt, die mit der Anzeigeeinrichtung gekoppelt ist. Folglich besteht zwischen V_Kolben und dem angezeigten Flüssigkeitsvolumen V_Anz ein linearer Zusammenhang:

V_Kolben = a · V_Anz. + b (G)

mit a = Pipettenproportionalitätsfaktor
b = Nullpunktsverschiebung

Für den Zusammenhang von a und Spindelsteigung S gilt:

Aus (F) und (G) folgt:

Daraus ergibt sich für die absolute Richtigkeitsabweichung R_abs.:

mit: R_abs. = V_Flüss.-V_Anz.

Für die relative Richtigkeitsabweichung R_rel. gilt:

R_rel. = R_abs./V_Flüss. (J)

mit:

Mit (I) bzw. (J) und (E) können nun Pipettenproportionalitätsfaktor a, Nullpunktverschiebung b, Querschnittsverlauf Q (y) und Totvolumen V_t so aufeinander abgestimmt werden, daß jedem aufgenommenen Flüssigkeitsvolumen V_Flüss. eine vorgegebene Richtigkeitsabweichung R_abs. bzw. R_rel. zugeordnet ist. Speziell folgt bei zylindrischer Pipettenspitze aus (E):

V_Flüss. = Q · h (K)

mit: Q = const.

Aus (I) und (K) ergibt sich:

Soll die absolute Richtigkeitsabweichung R_abs. für alle V_Flüss. konstant sein, muß gelten:

und R_abs.=b/a

Mit dem Formelsatz (L) lassen sich sämtliche Bestimmungsgrößen festlegen.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen Zeichnungen. Es zeigt

Fig. 1 Zusammenwirken von Pipettenspitze und Kolbenhubpipette in einem Diagramm mit der Differenz von (angezeigtem) Flüssigkeitsvolumen und Kolbenhub auf der Ordinate und dem Kolbenhub auf der Abszisse;

Fig. 2 Pipettenspitzen P₁, P₂ und P₃ zu den Kurven A, B und C in Fig. 1;

Fig. 3 eine Pipettenspitze in stark vergrößertem, vierfach abgebrochenem Längsschnitt.

In Fig. 1 repräsentieren die Kurve A₁ und A₂ das Verhalten von zylindrischen Pipettenspitzen P₁ gemäß Fig. 2. Bei diesen Pipetten nimmt der negative Volumenfehler -ΔV mit zunehmendem Kolbenhub linear zu. Dabei entspricht die Kurve A₁ einer Pipettenspitze mit kleinerem und die Kurve A₂ einer Pipettenspitze mit größerem Querschnitt.

Der Volumenfehler -ΔV der Pipettenspitze wird durch eine Abstimmung der Kolbenhubpipette kompensiert. Durch Einstellung des Pipettenproportionalitätsfaktors ist nämlich der Unterschied zwischen dem angezeigten Flüssigkeitsvolumen V_Anz. und dem Kolbenhub V_Kolben in Abhängigkeit vom Kolbenhub gerade so gewählt, daß das angezeigte Flüssigkeitsvolumen V_Anz. dem aufgenommenen Flüssigkeitsvolumen V_Flüss. entspricht. Hier ist die Kolbenhubpipette mit der Kurve K₁ und dem größeren Pipettenproportionalitätsfaktor a der Pipettenspitze mit der Kurve A₁ und die Kolbenhubpipette mit der Kurve K₂ der Pipettenspitze mit der Kurve A₂ zugeordnet. Das Diagramm veranschaulicht, daß für jeden Kolbenhub V_Kolben der Unterschied zwischen dem angezeigten Flüssigkeitsvolumen V_Anz. und dem aufgenommenen Flüssigkeitsvolumen V_Flüss. gleich Null ist.

Die Kurve B in Fig. 1 ist der Pipettenspitze P₂ von Fig. 2 zugeordnet. Diese hat angrenzend an die Spitzenöffnung ein dünnes Ansaugröhrchen, welches anfänglich bei geringem Kolbenhub ein relativ hohes Ansteigen der Flüssigkeitssäule bedingt. Infolgedessen ist in diesem Anfangsbereich auch der negative Volumenfehler -ΔV relativ hoch. Füllt die Flüssigkeitssäule das Ansaugröhrchen aus, ist beim Emporsteigen in das angrenzende zylindrische Arbeitsvolumen ein geringerer Anstieg des negativen Volumenfehlers zu verzeichnen.

Der Kurve C in Fig. 1 korrespondiert die Pipettenspitze P₃ der Fig. 2. Diese hat angrenzend an ein dünnes Ansaugröhrchen einen konischen Übergangsbereich zu einem zylindrischen Arbeitsvolumen. Somit schließt sich in der Fig. 1 angrenzend an den steilen Anfangsabschnitt ein Bereich abgeschwächter Steigung des Volumenfehlers für den Übergangsbereich an, der schließlich in einem Bereich schwacher Steigung für den zylindrischen Arbeitsabschnitt mündet.

Den Kurven B und C entspricht eine Kolbenhubpipette, bei der die Differenz von angezeigtem Flüssigkeitsvolumen V_Anz. zum Kolbenhub V_Kolben über den Kolbenhub durch die Kurve K₃ repräsentiert ist. Diese weist auf der Ordinate eine Nullpunktsverschiebung NV auf, d. h. beim Kolben in der Ausgangslage wird schon ein Flüssigkeitsvolumen V_Anz. angezeigt. Die Nullpunktsverschiebung ist so gewählt, daß bei einem Kolbenhub V_Kolben, der einen Anstieg der Flüssigkeiten im Arbeitsbereich der Pipettenspitze bedingt, gerade eine Kompensation des Volumenfehlers erreicht wird. Das System weist somit eine Fehlerkurve F auf, die von maximalem Anfangswert auf einen Wert Null fällt, der beim Anstieg der Flüssigkeitssäule bis in den Arbeitsbereich erreicht wird.

Die Pipettenspitze in Fig. 3 hat unten eine Spitzenöffnung 1 für Flüssigkeitsdurchtritt, an die sich ein dünnes Ansaugröhrchen 2 anschließt. Das Ansaugröhrchen 2 mündet in einen Übergangskonus 3, der anderenends mit einem erweiterten Arbeitsbereich 4 kommuniziert. Der Arbeitsbereich 4 mündet oben in einen Aufsteckkonus 5 mit einer Aufstecköffnung 6 für eine Kolbenhubpipette mit einstellbarem Kolbenhub.

Im Einstellbereich aufnehmbarer Flüssigkeitsmengen steigt die Flüssigkeit durch die Spitzenöffnung 1 und das Ansaugröhrchen 2 sowie den Übergangskonus 3 stets bis in den Arbeitsbereich 4 empor. Um über den gesamten Einstellbereich eine etwa konstante absolute Richtigkeitsabweichung der aufgenommenen Flüssigkeitsmenge von der angezeigten Flüssigkeitsmenge zu realisieren, ist die Pipettenspitze im Arbeitsbereich 4 innen etwa kreiszylindrisch geformt.

Zur besseren Entformbarkeit beim Spritzgießen ist sowohl im Bereich des Ansaugröhrchens 2, als auch im Arbeitsbereich 4 eine geringfügige Konizität vorgesehen, welche die angestrebte Richtigkeitsabweichung praktisch nicht beeinträchtigt. Der Übergangskonus besitzt einen deutlichen Konuswinkel, der zur Vermeidung eines Springbrunneneffektes ca. 7° beträgt.

Die Pipettenspitze hat typischerweise eine Gesamtlänge von etwa 100 mm, wovon etwa 25 mm auf das Ansaugröhrchen 2 entfallen. Der Durchmesser wächst von ca. 0,5 mm in der Spitzenöffnung 1 auf ca. 3 mm zu Beginn des Arbeitsbereiches 4 an.

Claims

1. Verfahren zur Korrektur des Volumenfehlers ΔV bei einem Pipettiersystem mit einer Kolbenhubpipette und einer darauf steckbaren Pipettenspitze, wobei die Kolbenhubpipette Einstelleinrichtungen zur Veränderung des Kolbenhubs sowie Anzeigeeinrichtungen für das jeweils pipettierte Flüssigkeitsvolumen hat und das Verhältnis von Kolbenhub zum angezeigten Flüssigkeitsvolumen durch einen Pipettenproportionalitätsfaktor a bestimmt ist, die Pipettenspitze eine Spitzenöffnung, einen damit verbundenen Volumenbereich für die Aufnahme einstellbarer Flüssigkeitsvolumina und eine damit verbundene Aufstecköffnung für die Kolbenhubpipette aufweist und zwischen Spitzenöffnung und Kolben ein Totvolumen V_t ausgebildet ist, wobei der Volumenfehler ΔV daraus resultiert, daß das Totvolumen V_t zwischen dem Flüssigkeitsspiegel und dem Kolben der Pipette durch das Gewicht der Flüssigkeitssäule in der Pipettenspitze vergrößert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Korrektur des Volumenfehlers ΔV durch bauliche Abstimmung und Einstellung des Totvolumens V_t, des Pipettenproportionalitätsfaktors a und des Querschnitts Q einer Pipettenspitze mit zylindrischem Arbeitsbereich derart erfolgt, daß der Volumenfehler ΔV kompensiert wird und das von den Anzeigeeinrichtungen angezeigte Flüssigkeitsvolumen V_Anz. dem aufgenommenen Flüssigkeitsvolumen V_Flüss. oder einer vorgegebenen Abweichung entspricht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstimmung eine Nullpunktverschiebung des angezeigten Flüssigkeitsvolumens gegenüber dem Kolbenhub einbezieht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pipettenspitze verwendet wird, bei der der Volumenbereich für die Aufnahme einstellbarer Flüssigkeitsmengen einen sich allmählich erweiternden, insbesondere dem Arbeitsbereich vorgeordneten Übergangsbereich insbesondere mit Übergangskonus oder Übergangsradius aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pipettenspitze verwendet wird, bei der angrenzend an die Spitzenöffnung ein dünnes Ansaugröhrchen vorhanden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pipette verwendet wird, bei der durch variable Einstellung des unteren Kolbenhubanschlages ein variables Totvolumen einstellbar ist.