DE4209216A1 - Humaner t-zell-marker ht6 - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den humanen T-Zell-Differenzierungsmarker HT6, Antikörper gegen diesen Marker sowie ein Verfahren zum Nachweis der Expression dieses Markers. Dies soll insbesondere der Differenzierung von T-Zellen und dem diagnostischen Nachweis einer Prädisposition für einen Insulin-abhängigen Diabetes mel­ litus und andere Autoimmunerkrankungen dienen.

Für eine Zelldifferenzierung sind diejenigen Oberflächenproteine von besonderer Bedeutung, die nur in der Membran spezieller Zel­ len oder einer besonderen Gruppe von Zellen vorkommen. Ein sol­ cher Oberflächenmarker ist RT6, ein Membranprotein, das von funktionell reifen T-Zellen von Ratten exprimiert wird. Da die Expression von RT6 nach Aktivierung von T-Lymphozyten durch Concanavalin A oder spezifisches Antigen zurückgeht, wird RT6 als Marker für ruhende T-Zellen angesehen (H. Thiele, in: Cell Surface Antigen Thy-1, Immunology, Neurology, and Therapeutic Applications; eds. A. Reifand M. Schlesinger, Marcel Dekker Inc., New York and Basel, 1989, 149-170). Bei der Ratte konn­ ten bislang zwei allele Formen, das partiell glykosylierte RT6.1 und das nicht glykosylierte RT6.2 nachgewiesen werden. Es gibt jedoch Hinweise, daß noch weitere polymorphe Formen des Oberflä­ chenantigens RT6 existieren (Koch et al., Immunology 65, (1988), 259-265). Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von RT6 mit der Aminosäuresequenz bekannter Proteine ergab keine signifikante Homologie zu bekannten T-Zell-Oberflächen- oder anderen Protei­ nen (Koch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 964- 967). Ein zu Ratten-RT6 homologer T-Zell Marker wurde inzwischen von Koch et al. in der Maus nachgewiesen (Koch et al., Nucl. Acids Res. 18 (1990), 3636). Mit einer RT6 Genprobe aus der Rat­ te konnte zwar unter "low stringency" Bedingungen eine Hybridi­ sierung mit der DNA verschiedener Tierarten sowie auch mit menschlicher DNA erhalten werden, unter den für einen spezifi­ schen Nachweis einzig relevanten höher stringenten Bedingungen hybridisiert die Genprobe jedoch lediglich mit DNA aus der Ratte oder der Maus (Koch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 964-967). Ein zu RT6 homologes Oberflächenantigen aus menschlichen T-Zellen wurde damit bislang noch nicht beschrie­ ben.

Von peripheren T-Zellen prädiabetischer Bio-Breeding Ratten, die einen Insulin-abhängigen Diabetes mellitus entwickeln, der so­ wohl klinisch als auch biochemisch dem menschlichen Insulin-ab­ hängigen Diabetes mellitus entspricht, wird das RT6 Oberflä­ chenantigen nicht oder nur geringfügig exprimiert (Greiner et al., J. Immunol. 136 (1986), 148-151, Thiele et al., Thymus 14 (1989), 137-154). Diese defekte RT6 Expression wurde mit der Pathogenese des Diabetes mellitus in diesen Tieren in Verbindung gebracht (Greiner et al., J. Immunol. 136 (1986), 148-151). Ein humanes Oberflächenantigen, welches eine Differenzierung zwischen funktionell reifen, ruhenden T-Lymphozyten einerseits und aktivierten T-Lymphozyten andererseits ermöglicht, könnte daher für die Früherkennung einer Prädisposition zu einem Insu­ lin-abhängigen Diabetes mellitus beim Menschen von großer Bedeu­ tung sein.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, einen humanen T-Zell-Marker, der eine Differenzierung von T-Lymphozyten ermöglicht, darzu­ stellen, sowie ein Verfahren zum Nachweis dieses Markers zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die in SEQ.ID.NO. 1 gezeigte Nukleotidsequenz oder eine dieser Sequenz im Rahmen der Degene­ ration des genetischen Codes entsprechende Sequenz, die zum spe­ zifischen Nachweis einer Subpopulation von T-Lymphozyten geeignet ist. Diese DNA-Sequenz codiert für ein neues Protein menschlicher T-Lymphozyten, das im weiteren als HT6 bezeichnet wird.

Mit Hilfe dieser DNA-Sequenz ist es möglich, insbesondere solche T-Lymphozyten nachzuweisen, die durch Ti/CD3+, CD4+ und/oder CD45RA- gekennzeichnet sind (Knapp et al., Immunology Today 10 (1989), 253). Über diese DNA-Sequenz ist es weiterhin möglich, allele Varianten des HT6-Gens zu identifizieren und zu isolieren und sowohl die Expression des HT6-Gens auf der RNA-Ebene zu untersuchen als auch das HT6-Protein selbst auf rekombinante Weise herzustellen. Mit dem so erhaltenen Protein oder Fragmen­ ten dieses Proteins können dann Antikörper gegen das humane HT6- Protein erhalten werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis von RFLPs (Restriction Fragment Lenghts Polymorphisms) und/oder den Nachweis eines konformationellen Polymorphismus, wobei man die erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein Fragment dieser Sequenz verwendet. Der Nachweis von RFLPs erfolgt über einen klassischen Southern Blot, der Nachweis eines konformationellen Polymorphismus über eine Temperatur-Gradienten-Gel- Elektrophorese (TGGE, Wartell et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 2699-2705).

Zum Nachweis von RFLPs wird die zu untersuchende DNA mit einem Restriktionsenzym, vorzugsweise MboI, TaqI, MaeII und RsaI, ge­ spalten und die erhaltenen Fragmente in üblicher Weise über einen Sothern Blot identifiziert, wobei als Hybridisierungsprobe eine der in den Sequenzprotokollen 8-10 gezeigten Nucleotidse­ quenzen verwendet wird. Allele Varianten des HT6-Gens ergeben dabei ein anderes Bandenmuster, wenn als Folge des Polymorphis­ mus die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease verän­ dert und/oder neu eingeführt wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis von RFLPs, wobei man einen Southern Blot mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einem Teil dieser Sequenz hybridisiert. Als Hybridisierungsproben sind hierfür die in den Sequenzprotokollen 8-10 gezeigten Nucleotidsequenzen geeignet.

Ein weiteres Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten eines Gens ist der Nachweis eines konformationiellen Polymorphismus. Hierunter versteht man ganz allgemein Sequenzunterschiede alle­ ler Varianten eines Gens, unabhängig davon, ob diese Sequenz­ unterschiede zur Einführung, Veränderung und/oder Entfernung von Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen führen. Zum Nach­ weis eines solchen konformationellen Polymorphismus wird in parallelen Ansätzen die zu untersuchende DNA, sowie eine als Standard dienende DNA-Sequenz hitzedenaturiert und die erhalte­ nen denaturierten Einzelstränge dann zusammengegeben und in Lö­ sung hybridisiert. Hierdurch kommt es nicht nur zur Renaturierung der genau komplementären Stränge, sondern auch zu einer Hybridisierung der Einzelstränge der beiden allelen Varianten. Sofern sich diese allelen Varianten in ihrer Nukleo­ tidsequenz unterscheiden, sind diese Hybridisierungsprodukte nicht vollständig gepaart, sondern weisen ungepaarte oder fehl gepaarte Bereiche auf. Diese nicht vollständig gepaarten Hybri­ disierungsprodukte stellen Konformationen einer DNA-Doppelhelix dar, die über eine Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese von­ einander getrennt werden können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis eines konformationellen Polymorphismus, wobei Fragmente des HT6-Gens in einer Polymerase chain reaction amplifiziert werden und anschließend über eine Temperatur-Gradienten-Gel- Elektrophorese nachgewiesen werden. Für die Durchführung dieser Polymerase Chain reaction eignen sich die in den Sequenzproto­ kollen 11-13, sowie 14-16 gezeigten Primer für den sense- bzw. den antisense-Strang, wobei entweder einer der Primer gemäß SEQ.ID.NO. 11-12 und einer der Primer gemäß SEQ.ID.NO. 14-15 oder die Primer gemäß SEQ.ID.NO. 13 und 16 verwendet werden.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis eines konformationellen Polymorphismus, wobei Fragmente des HT6-Gens in einer Polymerase chain reaction amplifiziert werden und dabei als Primer für den sense- bzw. den antisense- Strang jeweils einer der in SEQ.ID.NO. 11-13, sowie einer der in SEQ.ID.NO. 14-16 gezeigten Primer verwendet wird und die erhal­ tenen Fragmente über eine Temperatur-Gradienten-Gel-Elektropho­ rese nachgewiesen werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Iso­ lierung alleler Varianten der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz durch Klonierung einer zu dieser Sequenz homologen DNA eines Spenders, der nach einem der beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren eine allele Variante des HT6-Gens aufweist, Identifi­ zierung der klonierten HT6-DNA durch Hybridisierung mit einer der in SEQ.ID.NO. 8-10 gezeigten Nucleotidsequenzen und Isolie­ rung der auf diese Weise identifizierten, klonierten allelen DNA-Sequenz.

Dazu wird zunächst die genomische DNA eines Spenders, der eine allele Variante des HT6-Gens aufweist, isoliert und kloniert und solche Klone, die eine Sequenz des HT6-Gens aufweisen, durch Hybridisierung mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz nachgewie­ sen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind alle Varianten der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, erhältlich durch Klonierung einer zu dieser Sequenz homologen DNA eines Spenders, der nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren eine allele Variante des HT6- Gens aufweist, Identifizierung der klonierten HT6-DNA durch Hybridisierung mit einer der in den SEQ.ID.NO. 8-10 gezeigten Nukleotidsequenzen und Isolierung der auf diese Weise identifizierten klonierten allelen DNA-Sequenz.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen HT6-Proteins durch Inser­ tion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einer gemäß dem er­ findungsgemäßen Verfahren erhältlichen allelen DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, Transformation geeigneter Wirtszellen mit diesem Vektor, Kultivierung der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die eine Expression der heterologen DNA er­ möglichen und Gewinnung des rekombinant hergestellten HT6-Pro­ teins aus den Zellen oder dem Kulturüberstand. Die nicht glykosylierte Form des HT6-Proteins kann sowohl in prokaryonti­ schen als auch in eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden. Geeignete Expressionssysteme sind dem Fachmann geläufig. Vor­ zugsweise werden für das prokaryontische System das Plasmid pGEX und als Wirtszelle E.coli, für das eukaryontische System die Plasmide pSVL.GS und phCMV.BglII und als Wirtszelle CHO Zellen verwendet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das humane HT6-Pro­ tein, das von der in SEQ.ID.NO. 1 gezeigten DNA-Sequenz codiert wird.

Um Antikörper gegen HT6 zu erhalten, ist nicht unbedingt das vollständige HT6-Protein erforderlich. Die Immunisierung kann vielmehr auch mit immunologisch aktiven Fragmenten, die Epitope dieses Antigens umfassen, erfolgen. Vorzugsweise werden die durch die Sequenzprotokolle 2-7 charakterisierten Peptide für eine Immunisierung zur Herstellung von Antikörpern gegen das HT6-Protein verwendet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher immunogene Fragmente des humanen HT6-Proteins, welche aus der Gruppe der durch SEQ.ID.NO. 2-7 charakterisierten Peptide ausgewählt wur­ den.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen humanen HT6-Proteins oder der erfindungsgemäßen immunogenen Fragmente dieses Proteins können Antikörper gegen das humane Antigen HT6 erhalten werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper, gegen das humane HT6-Pro­ tein, welche erhältlich sind durch Immunisierung mit dem erfin­ dungsgemäßen humanen HT6-Protein oder einem erfindungsgemäßen immunogenen Fragment dieses Proteins.

Die Immunisierung erfolgt in den üblicherweise hierfür verwende­ ten Tieren nach bekannten Verfahren. Zur Herstellung polyklona­ ler Antikörper werden vorzugsweise Schafe, Hühner oder Kaninchen immunisiert, zur Herstellung monoklonaler Antikörper erfolgt die Immunisierung vorzugsweise in Mäusen oder Ratten. Polyklonale Antikörper werden aus dem Serum bzw. den Eiern der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren über eine Immunadsorption aufge­ reinigt. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper werden Milzzel­ len der immunisierten Tiere durch Fusionierung mit Myelomzellen oder durch EBV-Transformation immortalisiert und diejenigen immortalisierten Zellen, die einen Antikörper gegen das humane Antigen HT6 bilden, kloniert. Der monoklonale Antikörper wird dann aus dem Kulturüberstand der klonierten, immortalisierten Zellen nach üblichen Verfahren gewonnen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her­ stellung von polyklonalen Antikörpern gegen das humane HT6-Pro­ tein durch Immunisierung mit dem erfindungsgemäßen humanen HT6- Protein oder einem erfindungsgemäßen immunogenen Fragment dieses Proteins und Gewinnung der gewünschten Antikörper aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das humane HT6-Protein durch Immunisierung mit dem erfindungsgemäßen humanen HT6-Pro­ tein oder einem erfindungsgemäßen immunogenen Fragment dieses Proteins, Immortalisierung von Milzzellen der immunisierten Tie­ re, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die einen Antikörper gegen das humane HT6-Protein produzieren und Gewin­ nung der von den klonierten Zellen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.

Mit Hilfe dieser Antikörper oder mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz ist es möglich, diejenigen Personen zu identifizie­ ren, die einen HT6-Expressionsdefekt haben. Dies ist insbesonde­ re als Hinweis auf eine Prädisposition für einen Insulin­ abhängigen Diabetes mellitus oder andere Autoimmunerkrankungen von Bedeutung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Analyse eines HT6-Expressiosdefekts bei Autoimmunerkrankun­ gen, sowie zur Differenzierung von T-Lymphozyten über den Nach­ weis der Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

Die Expression des humanen HT6-Gens kann prinzipiell sowohl über den Nachweis der exprimierten mRNA, also über den Nachweis der Transkription, als auch über den Nachweis des mit Hilfe dieser mRNA gebildeten Proteins bestimmt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Be­ stimmung der Expression des humanen HT6-Gens, wobei die Expres­ sion der DNA über den Nachweis der komplementären mRNA bestimmt wird.

Dieser Nachweis der mRNA kann entweder über die klassische Nor­ thern Blot Technik oder über eine quantitative Polymerase chain reaction erfolgen. Für den Nachweis über einen klassischen Nor­ thern Blot eignen sich die in den SEQ.ID.NO. 8-10 gezeigten Nukleotidsequenzen als Hybridisierungsproben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis der Expression des humanen HT6-Gens über den Nach­ weis der komplementären mRNA, wobei als Hybridisierungsproben eine der in den SEQ.ID.NO. 8-10 gezeigten Nukleotidsequenzen verwendet wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Be­ stimmung der Expression des humanen HT6-Gens über den Nachweis der komplementären mRNA, wobei dieser Nachweis über eine quanti­ tative Polymerase chain reaction erfolgt.

Für die Durchführung dieser quantitativen Polymerase chain reac­ tion haben sich die in den Sequenzprotokollen 11-13 sowie 14- 16 gezeigten Primer für den sense- bzw. antisense-Strang als besonders geeignet erwiesen, wobei entweder einer der Primer gemäß SEQ.ID.NO. 11-12 und einer der Primer gemäß SEQ.ID.NO. 14-15 oder die Primer gemäß SEQ.ID.NO. 13 und 16 verwendet werden.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung der Expression des humanen HT6-Gens über den Nachweis der komplementären mRNA, wobei dieser Nachweis über eine quantitative Polymerase chain reaction erfolgt und als Primer für den sense- bzw. antisense-Strang bei der quantitati­ ven Polymerase chain reaction jeweils einer der in SEQ.ID.NO. 11- 13 sowie einer der in SEQ.ID.NO. 14-16 gezeigten Primer ver­ wendet wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Be­ stimmung der Expression des humanen HT6-Gens über den Nachweis des in einer Probe enthaltenen humanen HT6-Proteins.

Der Nachweis des in der Probe enthaltenen HT6-Proteins erfolgt vorzugsweise in einem immunologischen Test über die Bestimmung der Reaktivität der Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper gegen das humane HT6-Protein.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung der Expression des humanen HT6-Gens über den Nachweis des in einer Probe enthaltenen HT6-Proteins, wobei dieser Nachweis in einem immunologischen Test mit Hilfe eines Antikörpers gegen das humane HT6-Protein erfolgt. Vorzugsweise erfolgt der immunologische Nachweis des HT6-Proteins über einen Enzyme-linked Immunosorbent-Assay (ELISA) unter Verwendung eines immobilisierten ersten Antikörpers gegen HT6 und eines markierten zweiten Antikörpers gegen HT6.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele zusammen mit den Figuren und Sequenzprotokollen näher erläutert.

SEQ.ID.NO. 1: zeigt die Nukleotidsequenz sowie die entsprechen­ de Aminosäuresequenz des humanen T-Zell-Markers HT6
SEQ.ID.NO. 2 bis 7: zeigen immunogene Fragmente des humanen HT6-Proteins
SEQ.ID.NO. 8 bis 10: zeigen Nukleotidsequenzen von Hybridisierungs­ proben für die Identifizierung alleler Varianten des HT6-Gens in Southern Blot oder für den Nach­ weis der HT6-mRNA über einen Northern-Blot
SEQ.ID.NO. 11 bis 16: zeigen Primer für die Identifizierung alleler Varianten des HT6-Gens in der TGGE, sowie für den Nachweis der HT6-mRNA über eine quantitative Polymerase chain reaction.

Beispiel 1: Identifizierung und Isolierung alleler Varianten des humanen HT6-Gens a) Nachweis eines restriction fragment length polymorphisms (RFLP)

In parallelen Ansätzen wird die in SEQ.ID.NO. 1 gezeigte DNA-Sequenz, sowie genomische DNA eines Spenders mit der potentiellen allelen Variante des HT6-Gens mit den Restrik­ tionsendonukleasen MboI, TaqI, MaeII und RsaI geschnitten.

Die erhaltenen Fragmente werden auf einem Agarosegel elek­ trophoretisch aufgetrennt und gemäß dem als Southern Blot bekannten Verfahren auf eine Membran übertragen. Nach Hybridisierung mit einer der in den Sequenzprotokollen 8-10 gezeigten Nukleotidsequenzen in markierter Form (DIG DNA Labeling kit, Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1175033) ist ein RFLP anhand eines unterschiedlichen Bandenmu­ sters erkennbar.

b) Identifizierung eines konformationellen Polymorphismus.

In parallelen Ansätzen wird die in SEQ.ID.NO. 1 gezeigte DNA-Sequenz, sowie 250 ng genomische DNA eines Spenders mit einer potentiellen allelen Variante des HT6-Gens als Tem­ plate für eine Polymerase chain reaction unter Verwendung der in SEQ.ID.NO. 11 oder SEQ.ID.NO. 13 gezeigten sense- bzw. der in SEQ.ID.NO. 14 oder SEQ.ID.NO. 16 gezeigten antisense Primer eingesetzt. Die amplifizierten Fragmente werden gemischt, bei 95°C hitzedenaturiert und bei 37°C renaturiert. Die erhaltenen Hybridisierungsprodukte werden dann über eine Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese (Wartell et al., Nucl. Acids Res. 18 (1990), 2699-2705) aufgetrennt, wobei ein konformaioneller Polymorphismus zu Hybridisierungsprodukten mit veränderten Laufeigenschaften führt.

c) Isolierung alleler Varianten des HT6-Gens

Genomische DNA wird von solchen Spendern, die in einem der Verfahren gemäß Beispiel 1a) und/oder Beispiel 1b) eine allele Variante des HT6-Gens aufweisen, nach üblichen Ver­ fahren kloniert und solche Klone, die eine Sequenz des HT6- Gens enthalten, durch Hybridisierung mit einer der in den Sequenzprotokollen 8-10 gezeigten Nukleotidsequenzen iden­ tifiziert.

Beispiel 2: Rekombinante Herstellung des humanen HT6-Proteins

Zur rekombinanten Herstellung des HT6-Proteins in einem pro­ kayontischen System wird die in SEQ.ID.NO. 1 gezeigte DNA-Se­ quenz in den Expressionsvektor pGEX (Pharmacia, Kat.-Nr. 27- 4801-01) ligiert. Mit dem so erhaltenen Plasmid wird E.coli transformiert. Die erhaltenen Klone, werden in üblicher Weise zur rekombinanten Herstellung des HT6-Proteins verwendet.

Zur rekombinanten Herstellung des HT6-Proteins in einem eukar­ yontischen System wird die in SEQ.ID.NO. 1 gezeigte DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor ligiert, der durch Ligation der Plas­ mide pSVL.GS und phCMV.BglII (Celltech Glutamine Synthetase Gene Amplification System, Celltech Ltd., Slough, Berkshire, England) konstruiert wird. Mit dem so erhaltenen Plasmid werden CHO-Zel­ len transformiert. Die erhaltenen Klone werden in üblicher Weise zur rekombinanten Herstellung des HT6-Proteins verwendet.

Beispiel 3: Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das humane HT6-Pro­ tein

Mit dem gemäß Beispiel 2 hergestellten rekombinanten HT6-Protein werden Balb/c-Mäuse intraperitoneal immunisiert. Diese Immuni­ sierung wird in ca. 4-wöchigen Abständen wiederholt. Die Immuni­ sierungsdauer beträgt insgesamt 6 Monate. Abschließend werden die Tiere noch zweimal mit HT6-Protein immunisiert, die letzte Immunisierung erfolgt dabei intravenös. Drei Tage nach dieser letzten Immunisierung erfolgt die Immortalisierung von Milzzel­ len der immunisierten Tiere mit der Myelomzellinie P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580).

Die Fusion der Milzzellen mit der Myelomzellinie wird nach dem Standardverfahren gemäß J. of Imm. Meth. 39 (1980), 285-308 durchgeführt. Das Fusionsverhältnis Milzzellen : Myelomzellen ist dabei 1:1. Die Fusionsprodukte werden auf 24-er Kulturscha­ len der Firma Greiner mit 5×10⁴ Peritonealexsudatzellen der Maus ausgesät. Positive Primärkulturen (Bestimmung gemäß Beispiel 4) werden 2 Wochen nach Fusion mit Hilfe eines Fluoreszenz-akti­ vierten Zellsorters (Becton/ Dickinson) kloniert. Die Zellen werden dabei einzeln in 96-er Mikrotiterplatten abgelegt und mit HECS-Medium (Tecnomara) gefüttert. Als Kulturmedium wird an­ schließend handelsübliches RPMI-1640 Medium mit 10%igem fötalem Kälberserum verwendet.

Beispiel 4: Bestimmung der Spezifität der erhaltenen Antikörper

Um die Spezifität der Antikörper im Kulturüberstand der Hybri­ domzellen zu bestimmen, wird ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) durchgeführt.

Dazu werden 96-er Mikrotiterplatten (Nunc) mit 100 µl des ge­ mäß Beispiel 2 hergestellten rekombinanten HT6-Proteins oder einem der in SEQ.ID.NO. 2-7 bezeichneten HT6-Peptide (5 µg/ml in Carbonatpuffer, Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 726559) beschichtet, mit 100 µl Kulturüberstand (1:25 mit PBS (nach Dul­ becco und Vogt, J. Exp. Med. 99 (1954), 167-182) verdünnt) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und mit 3×350 µl, PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Danach wird mit POD markiertem Schaf-Anti-Maus IgG (10 mU; Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1317377) 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, mit 3×350 µl PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und die Nachweisreaktion mit 100 µl ABTS¢ (1 mg/ml, Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 756407) in 40 mmol/l Citratpuffer pH 4,4, der 3,25 mmol/l Natriumperborat enthält (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1204530) ausge­ löst. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden die Extinktionen in einem Photometer bei 405 nm bestimmt.

Beispiel 5: Bestimmung der HT6-mRNA mit Hilfe der Northern Blot Technik

Periphere Blutlymphozyten werden aus dem Blut über Ficoll Gra­ dienten Zentrifugation isoliert und RNA aus diesen Zellen nach der Methode von Chirgwin et al. gewonnen.

Nach Auftrennung der RNA auf einem denaturierenden Agarosegel wird die RNA auf eine Nylonmembran übertragen (Maniatis et al., Molecular Cloning).

Der Nachweis der HT6-mRNA erfolgt durch Hybridisierung mit einer der in SEQ.ID.NO. 8-10 gezeigten Hybridisierungsproben unter high stringency Bedingungen. Die Proben werden hierzu mit dem DIG DNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1175033) nach Angaben des Herstellers mit Digoxigenin markiert. Zum Nachweis von gebundener Hybridisierungsprobe wird der Nor­ thern Blots mit einem Konjugat aus einem anti-Digoxigenin Anti­ körper und Alkalischer Phosphatase inkubiert und anschließend gebundenes Konjugat über die Phosphatasereaktion nach Zugabe von 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT) nachgewiesen.

Beispiel 6: Bestimmung der HT6-mRNA über die quantitative Polymerase chain reaction

Periphere Blutlymphozyten werden aus dem Blut über Ficoll Gra­ dienten Zentrifugation isoliert. Aus diesen Zellen wird nach der Methode von Chirgwin et al. RNA gewonnen und mit dem in SEQ.ID.NO. 16 gezeigtem antisense Primer hybridisiert. Ein kom­ plementärer DNA-Strang wird durch Inkubation mit Reverser Trans­ kriptase aus Maus Moloney Leukämievirus hergestellt. Die Polymerase chain reaction erfolgt durch Zugabe des in SEQ.ID.NO. 11 gezeigten HT6 sense-Primers und hitzestabiler Taq-DNA-Polyme­ rase. Nach 15 Amplifikationszyklen wird 1 µl aus der Reaktion entnommen und in ein frisches Reaktionsgemisch überführt, wel­ ches neben Taq-DNA-Polymerase als Primer die intern gelegenen sense- und antisense-Primer gemäß SEQ.ID.NO. 12 bzw. SEQ.ID.NO. 16 enthält. Nach weiteren 15 Amplifikationszyklen werden die Reaktionsprodukte in einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen. Der unter SEQ.ID.NO. 13 gezeigte Primer wird mit Hilfe des Enzyms Terminale Transferase (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 220 582) an seinem 5′-Ende mit Digoxygenin-dUTP (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 1093 088) nach Angaben des Herstellers markiert. Der so markierte Primer wird als Hybridisierungsprobe verwendet. Zum Nachweis von gebundener Hybridisierungsprobe wird der Blot mit einem Konjugat aus einem Anti-Digoxygenin-Antikörper und alkalischer Phosphata­ se inkubiert und anschließend gebundenes Konjugat über die Phos­ phatase-Reaktion nach Zugabe von AMPPD® (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 1 357 328) photochemisch nachgewiesen. Die belichteten Filme werden densitometrisch ausgewertet.

Beispiel 7: Immunologischer Nachweis des humanen HT6-Proteins a) Beschichten von Mikrotiterplatten oder Teströhrchen mit einem ersten Antikörper gegen das HT6-Protein

Ein erfindungsgemäßer Antikörper gegen das humane HT6-Protein wird über seine Aminogruppen mit D-Biotinyl-ε-amidocapronsäure- N-hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1008960) oder über Tyrosinreste mit Diazo-p-aminobenzoylbiocytin (DBB; Calbiochem) gemäß den Angaben des Herstellers biotiny­ liert.

Anschließend werden 150 µl des biotinylierten Antikörpers (0,5 µg/ml in PBS) mit einer Streptavidin beschichteten festen Phase (Mikrotiterplatte oder Teströhrchen, Herstellung nach EP-A 03 44 578) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen.

b) Inkubation mit dem Analysenmaterial

Periphere Lymphozyten werden aus dem Blut von Probanden über Ficoll Gradienten Zentrifugation isoliert und durch 0,5% Tri­ ton X-100 in TBS 20 Minuten bei 37°C lysiert. Probandenserum oder die durch Zentrifugation geklärten Zellsolubilisate werden seriell mit PBS, das 0,5% BSA (Rinderserumalbumin) enthält, verdünnt und 100 µl dieser Verdünnung zu dem nach a) immobili­ sierten Antikörper pipettiert. Als Positivkontrolle werden 100 µl eines rekombinant hergestelltes HT6-Protein verwendet. An­ schließend wird 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und schließlich mit 3×350 µl PBS/0,05% Tween 20 ge­ waschen.

c) Nachweisreaktion

Zum Nachweis von gebundenem HT6-Protein aus dem Analysenmaterial wird mit 100 µl eines Peroxidase-markierten zweiten Antikörpers gegen das HT6-Protein, der ein anderes Epitop als der gemäß a) immobilisierte Antikörper erkennt, für 1 Stunde bei Raumtempera­ tur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3× mit 350 µl PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Danach werden 100 µl ABTS¢ zugege­ ben und nach 30minütiger Inkubation bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405 nm gemessen.

Beispiel 8: Nachweis von HT6 exprimierenden Zellen über Immunfluoreszens

Periphere Blutlymphozyten werden mit einem gemäß Beispiel 7 (a) biotinylierten erfindungsgemäßen Anti-HT6-Antikörper 30 Minuten bei 4°C inkubiert, 3× in PBS gewaschen und mit Streptavidin- FITC 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend werden die Zel­ len 3× in PBS gewaschen und im fluoreszenzaktivierten Zell­ sorter (Becton/Dickinson) analysiert.

Claims (21)

1. DNA-Sequenz des HT6-Gens gemäß SEQ.ID.NO. 1 oder eine dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Sequenz.

2. Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis von RFLPs und/oder den Nachweis eines konformationellen Polymorphismus, wobei man eine DNA- Sequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Fragment dieser Sequenz verwendet.

3. Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis von RFLPs, wobei man einen Southern-Blot mit der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder einem Fragment dieser Sequenz hybridisiert.

4. Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis eines konformationellen Polymorphismus, wobei Fragmente des HT6-Gens in einer Polymerase chain reaction amplifiziert werden und anschließend über eine Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese nachgewiesen werden.

5. Verfahren zum Nachweis von allelen Varianten des HT6-Gens über den Nachweis eines konformationellen Polymorphismus, wobei Fragmente des HT6-Gens in einer Polymerase chain reaction amplifiziert werden und als Primer für den sense- bzw. den antisense-Strang jeweils einer der in SEQ.ID.NO. 11-13, sowie einer der in SEQ.ID.NO. 14-16 gezeigten Primer verwendet wird und die erhaltenen Fragmente über eine Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese nachgewiesen werden.

6. Verfahren zur Isolierung alleler Varianten der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 durch Klonierung einer zu dieser Sequenz homologen DNA eines Spenders, der nach einem der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-5 eine allele Variante des HT6- Gens aufweist, Identifizierung der klonierten HT6-DNA durch Hybridisierung mit einer der in den SEQ.ID.NO. 8-10 gezeig­ ten Nukleotidsequenzen und Isolierung der auf diese Weise identifizierten, klonierten allelen DNA-Sequenz.

7. Allele Variante der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, erhältlich durch Klonierung einer zu dieser Sequenz homologen DNA eines Spenders, der nach einem der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-5 eine allele Variante des HT6- Gens aufweist, Identifizierung der klonierten HT6-DNA durch Hybridisierung mit einer der in den SEQ.ID.NO. 8-10 gezeigten Nukleotidsequenzen und Isolierung der auf diese Weise identifizierten klonierten allelen DNA-Sequenz.

8. Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen HT6- Proteins durch Insertion der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder einer gemäß Anspruch 6 erhältlichen DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, Transformation geeigneter Wirts­ zellen mit diesem Vektor, Kultivierung der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die eine Expression der heterologen DNA ermöglichen und Gewinnung des rekombinant hergestellten humanen HT6-Proteins aus den Zellen oder dem Kulturüberstand.

9. Humanes HT6-Protein, das von der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 codiert wird.

10. Immunogene Fragmente des humanen HT6-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe der durch SEQ.ID.NO. 2-7 charakterisierten Peptide.

11. Polyklonaler Antikörper gegen das humane HT6-Protein, er­ hältlich durch Immunisierung mit dem humanen HT6-Protein gemäß Anspruch 9 oder einem immunogenen Fragment dieses Proteins gemäß Anspruch 10.

12. Monoklonaler Antikörper gegen das humane HT6-Protein, er­ hältlich durch Immunisierung mit dem humanen HT6-Protein gemäß Anspruch 9 oder einem immunogenen Fragment dieses Proteins gemäß Anspruch 10.

13. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern ge­ gen das humane HT6-Protein durch Immunisierung mit dem humanen HT6-Protein gemäß Anspruch 9 oder einem immunogenen Fragment dieses Proteins gemäß Anspruch 10 und Gewinnung der gewünschten Antikörper aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren.

14. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das humane HT6-Protein durch Immunisierung mit dem humanen HT6-Protein gemäß Anspruch 9 oder einem immunogenen Frag­ ment dieses Proteins gemäß Anspruch 10, Immortalisierung von Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die einen Antikörper gegen das humane HT6-Protein produzieren, und Gewinnung des von den klonierten Zellen produzierten Antikörpers nach bekannten Verfahren.

15. Verfahren zur Analyse eines HT6-Expressionsdefekts bei Autoimmunerkrankungen, sowie zur Differenzierung von T- Lymphozyten dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 bestimmt.

16. Verfahren nach Anspruch 14 dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression der DNA über den Nachweis der komplementären mRNA bestimmt.

17. Verfahren nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hybridisierungsprobe verwendet, die durch eine der in SEQ.ID.NO. 8-10 gezeigten Nukleotidsequenzen charakteri­ siert ist.

18. Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression der DNA über eine quantitative Polymerase chain reaction bestimmt.

19. Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß man als Primer für den sense- bzw. antisense-Strang bei der quantitativen Polymerase chain reaction jeweils einen der in SEQ.ID.NO. 11-13, sowie einen der in SEQ.ID.NO. 14- 16 gezeigten Primer verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression der DNA über den Nachweis des in einer Probe enthaltenen HT6-Proteins durchführt.

21. Verfahren nach Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet, daß man das in der Probe enthaltene HT6-Protein in einem immunolo­ gischen Nachweisverfahren mit Hilfe eines Antikörpers gegen das humane HT6-Protein gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 nachweist.