DE4124900A1

DE4124900A1 - Verfahren zur kontinuierlichen herstellung und verwendung von mutierten bakterien

Info

Publication number: DE4124900A1
Application number: DE19914124900
Authority: DE
Inventors: Gensen Kai; A Scott Weber; Wei-Chi Ying
Original assignee: Occidental Chemical Corp
Current assignee: Occidental Chemical Corp
Priority date: 1990-07-26
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1992-03-05
Also published as: JPH0568997A; FR2665180B1; GB2247012B; CA2046699A1; FR2665180A1; GB9115086D0; GB2247012A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur konti nuierlichen Herstellung von mutierten Bakterien und deren biologische Einwirkung auf einen in Wasser enthaltenen che mischen Stoff. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Ver fahren, in dem unter nicht-wachstumsbeschränkenden Bedingun gen gezüchtete Bakterien einer mutierenden Ultraviolett strahlung und danach unter wachstumsbeschränkenden Bedingun gen einem chemischen Stoff ausgesetzt werden. Ferner be trifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung die ses Verfahrens sowie die in diesem Verfahren erzeugten mu tierten Bakterien.

Das Vorhandensein von toxischen chemischen Stoffen in der Umwelt ist zunehmend in das öffentliche Interesse gerückt und ist jetzt der Gegenstand vieler Gesetze und Verordnun gen. Das Entfernen oder Vernichten dieser chemischen Stoffe kann hohe Kosten verursachen, insbesondere wenn die chemi schen Stoffe weit verbreitet und in geringen Konzentrationen vorhanden sind. Eine Methode zur Beseitigung solcher chemi schen Stoffe ist mit Hilfe von Mikroorganismen, die diese chemischen Stoffe aufspüren und biologisch abbauen.

Es ist bekannt, daß Bakterien, die in Gegenwart von schwer abbaubaren oder beständigen chemischen Stoffen leben, z. B. halogenierten organischen Verbindungen, eine Widerstandsfä higkeit gegen diese chemischen Stoffe entwickeln können und sogar fähig sein können, diese chemischen Stoffe biologisch abzubauen. Gene, die Enzyme codieren, welche die bei jedem Schritt eines Abbauwegs gebildeten chemischen Stoffe ab bauen, können mit Hilfe der Gentechnologie hergestellt wer den und in einen einzelnen Organismus eingefügt werden. Fer ner wurde gefunden, daß auch Mutationen zur Erzeugung von Bakterien mit verbesserter Fähigkeit für den biologischen Abbau solcher chemischen Stoffe verwendbar sind. Wenn ein geeignetes Bakterium isoliert und gezüchtet worden ist, kann es an den mit dem chemischen Stoff kontaminierten Ort ge bracht werden, um den chemischen Stoff zu einer weniger to xischen oder nicht-toxischen Verbindung biologisch abzu bauen.

Dennoch gibt es eine Reihe von Situationen, wo diese Techni ken nicht verwendbar sind. Zum Beispiel kann in industriel lem Abwasser ein Gemisch von chemischen Stoffen vorhanden sein und ihre Zusammensetzung und Konzentrationen können von Zeit zu Zeit durch eine Abänderung der industriellen Verfah ren variieren. In einer solchen Situation kann ein Bakte rium, das für den Abbau eines bestimmten chemischen Stoffes ausgerichtet ist, völlig nutzlos gegen andere chemische Stoffe sein. Die Bakterien können auch durch die Strömung des Abwassers schneller herausgespült werden als sie nach wachsen können, so daß sie innerhalb kurzer Zeit aus dem Ab wasser verschwinden können. Einige chemische Stoffe müssen in mehreren Schritten abgebaut werden und für jeden Schritt kann ein unterschiedliches Bakterium notwendig sein. Wenn das Gemisch von Bakterien auf einmal zugegeben wird, können unter diesen Umständen die Bakterien, die die späteren Ab bauschritte durchführen, sterben oder ausgespült werden, be vor die Bakterien, die die früheren Abbauschritte durchfüh ren, die in den späteren Schritten abzubauenden chemischen Stoffe erzeugt haben.

Somit liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von mutierten Bakterien bereitzustellen, die zur biologischen Einwirkung auf vorhandene chemische Stoffe befähigt sind.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Be reitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsge mäßen Vorrichtung werden kontinuierlich die erfindungsge mäßen mutierten Bakterien für den Zweck der Einwirkung auf einen chemischen Stoff erzeugt. Im Gegensatz zum Batchver fahren kann das erfindungsgemäße kontinuierliche Verfahren zur Optimierung der essentiellen Schritte zur Züchtung der Population, UV-induzierter Mutation und Stabilisierung und Vermehrung der mutierten Bakterien betrieben werden. Diese Erfindung überwindet viele der auftretenden Schwierigkeiten, wenn Bakterien als Batch zu dem chemischen Stoff zugegeben werden. Da die mutierten Bakterien kontinuierlich erzeugt werden, sollte z. B. der chemische Stoff wechseln, neu mu tierte Bakterien selektiert werden, die mit dieser neuen Verbindung überleben und darauf gezüchtet werden können. Die Verwendung von kontinuierlich erzeugten mutierten Bakterien erlaubt sogar die Zugabe von Bakterien in fließende Systeme, aus denen sie mit einer höheren Rate, als sie wachsen kön nen, ausgespült werden. Auch wenn der chemische Stoff schrittweise abgebaut wird, kann nach mutierten Bakterien selektiert werden, die die in den späteren Schritten erzeug ten chemischen Stoffe dann abbauen, wenn sie gebildet wer den.

Das erfindungsgemäße kontinuierliche Verfahren ermöglicht die Herstellung einer großen Zahl von Mutanten und ein auto matisches Absuchen nach dem besten Stamm bei einem viel kleineren benötigten Volumen. Wenn die Verweildauer eines Bakteriums in der erfindungsgemäßen kontinuierlichen UV-Mu tationskammer 1/25 eines Tages beträgt, dann würde z. B. in einem Batchverfahren ein 25 mal größerer Behälter zur Her stellung der gleichen Zahl von mutierten Bakterien benötigt. Wenn der Abbau des chemischen Stoffes eine drastische Ände rung der Bakterien erfordert, dann tritt diese Änderung in einem Batchsystem wahrscheinlich nicht ein, da in einem Batchsystem eine drastische Änderung auf einmal eintreten muß. Hingegen kann in dem erfindungsgemäßen kontinuierlichen Verfahren anstatt einer in den Bakterien auftretenden ein zelnen drastischen Änderung eine Reihe von kleinen Schritten auftreten, was viel wahrscheinlicher ist. Dies hat zur Folge, daß drastisch geänderte Bakterien in dem erfindungs gemäßen Verfahren leichter erzeugt werden.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer be stimmten bevorzugten Ausführungsform, die das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung zeigt.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Be ziehung zwischen der Bestrahlungszeit und Mu tationshäufigkeit zeigt (siehe nachfolgendes Beispiel 1).

Fig. 3 und 4 sind graphische Darstellungen, die die Bezie hung zwischen der Zeit und der p-CBA-Konzen tration zeigen (siehe nachfolgendes Beispiel 1).

In Fig. 1 wird eine Bakterienquelle über Leitung 1 dem Reak tor zugeführt. Beispiele der Quellen für die erfindungsgemäß verwendeten Bakterien beinhalten Abwasser, aktivierter Schlamm, Erdproben von kontaminierten Stellen oder ge eignete, im Handel erhältliche Bakterien. Vorzugsweise wer den dem Reaktor 2 eine Vielzahl von Bakterienarten zuge- führt, um eine möglichst hohe Wahrscheinlichkeit der Bildung verwendbarer Mutationen zu erhalten. Vorzugsweise werden auch Bakterien verwendet die an die Umgebung angepaßt sind, in der der chemische Stoff vorhanden ist, da diese Bakterien dem gewünschten mutierten Bakterium genetisch näher liegen können als Bakterien, die in einer anderen Umgebung leben. Reaktor 2 kann eine Einrichtung zur Schlammbehandlung oder einen für den erfindungsgemäßen Zweck geschaffenen speziel len Reaktor darstellen.

Eine organische Kohlenstoffquelle und eine Stickstoff- und Phosphor-Quelle für die Bakterien gelangt von den Nährstoff behältern 3 und 4 über die Leitungen 5 bzw. 6 zu einem ersten Reaktor 2. Die durch die Behälter 3 und 4 bereitge stellten Nährstoffe sind üblicher Art. Es ist notwendig, daß genügend Nährstoffe dem Reaktor 2 zugeführt werden, um den Bakterien im Reaktor 2 ein Wachstum unter nicht-wachstumsbe schränkenden Bedingungen zu ermöglichen (d. h. die Bakterien sind nicht lange genug im Reaktor, als daß eine ungenügende Zufuhr von Nährstoffen ihr Wachstum beschränken könnte). Nicht-wachstumsbeschränkende Bedingungen werden benötigt, damit die Bakterien replizieren, wenn sie den Reaktor 2 ver lassen, da replizierende Bakterien während der Replikation empfänglicher für Mutationen sind.

Wenn nicht ausreichend Nährstoffe im Reaktor 2 bereitge stellt werden, tendieren die Bakterien auch zur Bildung von Agglomeraten, die die Bakterien weniger empfänglich für Mu tationen machen. Natürlich sollte die Temperatur und der pH-Wert für das Wachstum von Bakterien geeignet sein, wie im Stand der Technik bekannt ist.

Von Reaktor 2 gelangen die replizierenden Bakterien über Leitung 7 in die Mutationskammer 8, wo die Bakterien einer Ultraviolett(UV)-Bestrahlung ausgesetzt werden, z. B. bei einer Wellenlänge von etwa 190 bis etwa 300 nm. Die Zeit, in der die Bakterien der UV-Strahlung ausgesetzt sind, sollte ausreichend lang sein, um Mutationen zu induzieren, aber nicht so lang, daß die Bakterien abgetötet werden. Die Expo sitionszeiten hängen von der verwendeten UV-Strahlungsquelle ab. Von der Mutationskammer 8 gelangen die Bakterien über Leitung 9 zu einem zweiten Reaktor 10.

Reaktor 10 vergrößert wesentlich den Wirkungsgrad und die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und wird insbe sondere benötigt, um den Abbauprozeß zu initiieren. Nachdem der Abbau eingesetzt hat, wird der Reaktor 10 im allgemeinen weniger benötigt, um alle erfindungsgemäßen Vorteile zu er reichen. Der Zweck von Reaktor 10 ist die Stabilisierung der Bakterienpopulation durch die Möglichkeit, jegliche Schäden, die in der Mutationskammer 8 eingetreten waren, zu reparie ren und zu replizieren, vorzugsweise mindestens zwei Genera tionen; vorzugsweise bleiben die Bakterien für mindestens 2 Stunden im Reaktor 10, um der Population eine Stabilisierung und Replikation zu ermöglichen. Bevorzugt werden so viele Nährstoffe im Reaktor 2 bereitgestellt, daß nicht alle Nähr stoffe im Reaktor 2 verbraucht werden und einige Nährstoffe durch die Mutationskammer 8 gelangen, so daß den Bakterien in Reaktor 10 das Wachstum unter nicht-wachstumsbeschränken den Bedingungen möglich ist (zusätzliche Nährstoffe können natürlich direkt dem Reaktor 10, falls notwendig, zugefügt werden). Die Bakterien verlassen den Reaktor 10 über Leitung 11 und werden in den dritten Reaktor 12 überführt.

Der chemische Stoff von Behälter 13 wird über Leitung 14 dem Reaktor 12 zugeführt. Während ein Kontakt der Bakterien mit dem chemischen Stoff vorzugsweise erst nach deren Mutation erfolgen sollte, ist aber auch ein Kontakt der Bakterien mit dem chemischen Stoff vor der Mutation möglich, z. B. durch Zugabe des chemischen Stoffes in den Reaktor 2. Für eine ma ximale Zahl von Mutationen ist es wünschenswert, daß die Konzentration des chemischen Stoffes im Reaktor 12 nicht hemmend wirkt so daß hohe Wachstumsraten der Bakterien ein treten können.

Der chemische Stoff ist typischerweise eine halogenierte or ganische Verbindung, z. B. ein Dioxin oder PCB (polychlorier tes Biphenyl). Die mutierten Bakterien sind fähig, diese Verbindung als Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwenden, während die nicht-mutierten Bakterien dies nicht können. Ferner kann der chemische Stoff auch eine Verbindung sein, die unter Verwendung von Bakterien umgesetzt und/oder extra hiert werden soll.

Die Bioextraktion kann auch mit verschiedenen Metallen, wie Gold oder radioaktivem Strontium, und Nichtmetallen, wie Schwefel oder anderen anorganischen Substanzen, ausgeführt werden, so daß diese entweder aus der Umwelt entfernt oder wiedergewonnen werden. Die Bioextraktion kann die Solubili sation des chemischen Stoffes, die Nicht-Solubilisation des chemischen Stoffes, die Verdampfung des chemischen Stoffes, den Einbau des chemischen Stoffes in das Bakterium oder andere Verfahren umfassen.

In Reaktor 12 werden die Bakterien unter wachstumsbeschrän kenden Bedingungen gezüchtet (d. h. die Zeit, die die Bakte rien in dem Reaktor verbringen, ist lang genug, daß ihr Wachstum durch die Zufuhr von Nährstoffen eingeschränkt wird). Nicht ausreichende Nährstoffe sind für alle Bakterien bei ihrer maximalen Wachstumsrate vorhanden, so daß diejeni gen Bakterien, die zum Wachstum in Gegenwart des chemischen Stoffes befähigt sind, oder vorzugsweise zur Verwendung des chemischen Stoffes befähigt sind, überleben und replizieren, während die Populationen konkurrierender Bakterien reduziert werden. Von Reaktor 12 können die erfolgreich mutierten Bak terien kontinuierlich entfernt werden und über Leitung 15 einer Behandlungseinrichtung zugeführt oder anderweitig ver wendet werden. Der Reaktor 12 könnte auch selbst als Abwas serbehandlungseinrichtung, die schon den chemischen Stoff enthält, eingesetzt werden. Somit könnten die Bakterien von der Abwasserbehandlungseinrichtung 12 zum Reaktor 2 über führt werden, durch die Mutationskammer 8 geschickt und über Reaktor 10 wieder in die Abwasserbehandlungseinrichtung (Re aktor 12) in einem kontinuierlichen Verfahren zugeführt wer den.

Fig. 1 zeigt auch eine zusätzliche Vorrichtung, die in den nachstehend beschriebenen Beispielen verwendet wurde, um den Wirkungsgrad des erfindungsgemäßen Verfahrens festzustellen. Um die mutierten Bakterien mit nicht-mutierten Bakterien zu vergleichen, können nicht-mutierte Bakterien über Leitung 16 dem Reaktor 17 zugeführt werden, nachdem sie mit Wasser von Behälter 18, das über Leitung 19 zugeführt wird, verdünnt wurden (um gleiche Populationsdichten im Reaktor 12 und 17 zu erhalten). Der chemische Stoff kann von Behälter 17 über Leitung 20 zugesetzt werden und die Bakterien können den Re aktor 17 über Leitung 21 verlassen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Der Zweck dieses Experimentes ist die Bestimmung, ob UV-Be strahlung eine kontinuierlich fließende Population von Bak terien mutiert.

Die experimentelle Vorrichtung besteht aus einem Plexiglas reaktor (2 in Fig. 1) und einer UV-Mutationskammer (8 in Fig. 1), die ein oder zwei Modelle einer UV-Lampe von Spectronics Corporation, Modell 11SC-1, mit einer durch schnittlichen Strahlungsintensität von 4500 uw/cm² und Mo dell 11SC-2 mit 2000 uw/cm² bei 254 nm, bei 1,91 cm Abstand enthält. Die Verweildauer in der Mutationskammer wird durch die Strahlungsdosis bestimmt.

Die Zusammensetzung der Nährlösung für den Kulturreaktor ist ein mit 1,25 g/Liter Fructose versetztes Basismedium: Zusammensetzung der mineralischen Stamm-Nährlösung:

Bestandteil
Menge
konz. H₂SO₄\|10 ml
Fe₂(SO₄)₂ · nH₂O	8,6 g
MnCl₂ · 4 H₂O	2 g
ZnSO₄	0,81 g
CuSO₄ · 5 H₂O	0,81 g
CoCl₂ · 6 H₂O	0,24 g
Na₂MoO₄	0,21 g
H₃BO₄	0,08 g
destilliertes Wasser auf	1 Liter

Zusammensetzung des Basismediums:

Bestandteil
Menge
(NH₄)₂SO₄\|0,2 g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,2 g
CaSO₄ · 2 H₂O	0,01 g
M.N.S.S.*)	0,5 ml
KH₂PO₄/Na₂HPO₄-Puffer (pH 7,2)	0,04 M
EDTA (Dinatriumsalz)	5×10^-6M
destilliertes Wasser auf	1 Liter
*) M.N.S.S. = mineralische Stamm-Nährlösung

Für die Quantifizierung der Mutationsvorrichtung mit konti nuierlichem Fluß wird die Mutationshäufigkeit des Systems bestimmt. Die Mutationshäufigkeit, d. h. die Zahl der Mutan ten geteilt durch die Zahl der Überlebenden, wird als Funk tion der Strahlendosis bestimmt. Die Mutanten werden durch ihre Fähigkeit zum Wachstum auf das Antibiotikum Streptomy cin enthaltenden Platten nachgewiesen. Die Mutationshäufig keit als eine Funktion der Bestrahlungsdauer wird mit der natürlichen Mutationshäufigkeit der verwendeten Population für diese Experimente verglichen. Die natürliche Mutations häufigkeit beträgt 1,14×10^-7. Wie in Fig. 2 dargestellt, wird als eine optimale Mutationshäufigkeit für die Modell 11SC-1-Lampe ein Zeitraum von ungefähr 55 Sekunden bestimmt. Dieser Wert entspricht 3,5·10^-4, was erheblich höher liegt als die natürliche Mutationshäufigkeit. Eine vergleichbare erhöhte Mutationshäufigkeit weist auch die andere Lampe auf, wobei ein optimaler Wert bei ungefähr 25 Sekunden liegt.

Beispiel 2

In diesem Experiment besteht die Mutationsvorrichtung mit kontinuierlichem Fluß aus der in Beispiel 1 verwendeten Vor richtung sowie aus den in Fig. 1 dargestellten Reaktoren. Die Plexiglasreaktoren werden in Reihe mit der UV-Mutations kammer angeordnet, die zwischen dem ersten Reaktor R1 (2 in Fig. 1) und dem zweiten Reaktor R2 (10 in Fig. 1) plaziert ist.

Der vierte Reaktor R4 (17 in Fig. 1) wird mit einer ver gleichbaren Menge von Bakterien wie R3 (12 in Fig. 1) mit R1 als Inokulationsquelle versetzt. Da die Konzentration von Bakterien in R1 größer ist als in R2, wird die Zufuhr von R1 zu R4 mit destilliertem Wasser verdünnt. Die Verweildauer in R3 und R4 wird durch Kontrolle der Zufuhrraten zu diesen Re aktoren gleichgehalten. Die Konzentration der Zielverbindung in R4 ist äquivalent zu der in R3.

Der Inhalt aller Reaktoren wird gut gemischt und mit feuch ter Luft durchlüftet. Die Verteilung zwischen den Reaktoren erfolgt unter Verwendung von positiven Trennungspumpen über Vinylschläuche. Weitere Parameter betreffend das Volumen, Zufuhrrate, Verweildauer und weitere Bedingungen sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Wenn sich ein relativ stabiler Zustand in R1 eingestellt hat, ist die gezüchtete Population gekennzeichnet durch viele Stämme, eine exponentielle Wachstumsphase, eine le bensfähige Zellzahl von ungefähr 10⁸ bis 10⁹ Kolonie-bilden den Einheiten (CFUs)/ml der Kulturflüssigkeit und eine Ge samtkonzentration von organischem Kohlenstoff (TOC) in der wäßrigen Phase von etwa 200 mg/Liter. Eine lebensfähige Zellzahl von 10⁸ bis 10⁹ CFU/ml ist bevorzugt, um ausrei chende Mengen von Bakterien für das Mutationsexperiment sicherzustellen. Die zurückbleibende TOC-Konzentration der wäßrigen Phase wird für das Wachstum der mutierten Bakterien in R2 benötigt.

Das experimentelle System wird zum Austesten der benötigten Menge von Mutanten zum Erhalt eines p-Chlorbenzoesäure (p-CBA) abbauenden Stammes betrieben. Eine Mischkultur von Bak terien aus R1 wird gerührt, in der UV-Kammer bestrahlt und danach zum Absuchen nach der gewünschten Mutante in R2 ge pumpt. Zum Zeitpunkt 0 werden R3 und R4 mit dem Basismedium und 100 mg/Liter p-CBA aufgefüllt. Die p-CBA-Stammlösung von 1 g/Liter wird kontinuierlich mit der Kulturmenge aus R2 versetzt und die Konzentration von p-CBA wird periodisch in R3, wo die Selektion durchgeführt wird, und R4, der als Kon trolle für das kontinuierliche Mutationssystem dient, gemes sen.

Die folgende Tabelle zeigt, daß p-CBA-abbauende Mutanten in dem Mutationssystem entstanden sind:

Offensichtlich werden mindestens zwei Typen von Mutanten während der Durchführung des Experiments gebildet. Die Mu tante, die in den ersten 70 Stunden erscheint, weist eine relativ niedrige biologische Abbaugeschwindigkeit auf, wäh rend der zweite Mutantentyp, der danach erscheint, eine viel schnellere Geschwindigkeit aufweist.

Mit der gleichen Bakterienquelle wird eine Batchuntersuchung im Kolben durchgeführt. Die gesamten Batchproben werden in zwei Teile getrennt. Teil A wird mit 5 ml einer aus R2 ent nommenen mutierten Kultur inokuliert, während 50 ml der mu tierten Kultur aus der gleichen Quelle in Teil B inokuliert wird. Für jeden Teil werden sieben Wiederholungen ausge führt. Eine vergleichbare Menge von nicht-bestrahlten Bakte rien aus R1 wird als Kontrolle für die Batchuntersuchung verwendet. Es ist zu erwarten, daß ein biologischer Abbau in einigen der Kolben zu beobachten ist, so daß eine statisti sche Berechnung ausgeführt werden könnte, um die Wahrschein lichkeit von benötigten Mutanten unter diesen experimentel len Bedingungen abzuschätzen. Es ist jedoch kein biologi scher Abbau in einer der 385 ml-Kulturen von mutierten Bak terien zu beobachten.

Zur Bestätigung der Funktion des Reaktors R2 wird das System ohne R2 betrieben. Wie in Fig. 3 dargestellt, wird kein er heblicher biologischer Abbau von p-CBA während der Zeit ohne R2 beobachtet. Fig. 4 zeigt, daß der Reaktor R2 sehr hilfreich für die Initiierung des biologischen Abbaus von p- CBA ist; wenn der biologische Abbau vollständig eingesetzt hat, kann der Reaktor R2 von dem Behandlungssystem ohne nachteilige Auswirkung auf die Behandlungsleistung entfernt werden.

Obwohl es möglich ist, daß die gewünschte Mutante irgendwann nach 72 Stunden erscheint, kann daraus gefolgert werden, daß das System mit R2 zumindest wirkungsvoller als ohne R2 ist.

In weiteren Experimenten wird das System auf die Hervorbrin gung von Populationen getestet, die zum Abbau von p-CBA, 2,4-Dichlorbenzoesäure (2,4-DCBA) und Chlorendicsäure (HET) (1,4,5,6,7,7-Hexachlorbicyclo(2,2,l)-hept-5-en-2,3-dicarbon säure; CAS-Nummer 115-28-6) befähigt sind. Diese Experimente unterscheiden sich von den vorstehend beschriebenen durch die getesteten Populationen, die von R3 erhalten wurden. Kontrollpopulationen werden von R4 erhalten. Weder R3 noch R4 erhalten die Zielverbindung. Von R3 und R4 des Systems erhaltene Populationen werden mit dem Basismedium bzw. den chemischen Stoffen in 500 ml-Kolben gemischt und auf eine Schüttelvorrichtung eingebracht.

Alle mutierten Proben zeigen einen biologischen Abbau, der mit COD (chemischer Sauerstoffbedarf) und Chlorid-Tests be stätigt wird. Der biologische Abbau von p-CBA ist in weniger als 25 Tagen für jede der replizierten Mutanten beendet und der Abbau von 2,4-DCBA ist in etwa 35 Tagen beendet. Bei den erhaltenen p-CBA-Kontrolldaten ergibt sich eine gewisse Un einheitlichkeit. In einem Kontrollkolben startet die Kon trollpopulation den biologischen p-CBA-Abbau nach etwa 25 Tagen. Eine niedrigere Rate des biologischen Abbaus wird für diese Kontrolle beobachtet, bezogen auf die für die mutier ten Populationen beobachtete Rate. Somit kann der Abbau, der in dieser Kontrollprobe eintrat, als ein spontanes Ereignis betrachtet werden. Kein biologischer Abbau von p-CBA wird in der anderen Kontrolle während der Testdauer von 65 Tagen be obachtet.

Die Untersuchung der Ergebnisse des biologischen Abbaus von Chlorendicsäure ergibt, daß die mutierten Kulturen eine Re aktion verursachen, die von den nicht-mutierten Kontrollen nicht erreicht wird. Ein Hinweis auf diese Reaktion sind die erhöhten relativen Absorptionsmessungen. In drei der mutier ten Replikate wird die Reaktion nach ungefähr 4 Tagen der Reaktionszeit initiiert. Eine erhöhte relative Absorption wird für das vierte mutierte Replikat am 8. Tag beobachtet. Bei keiner der Kontrollen wird ein Anstieg der relativen Ab sorption bemerkt.

Für eine weitere Beurteilung der Wahrscheinlichkeit des bio logischen Abbaus von Chlorendicsäure durch die mutierten Po pulationen werden die Konzentrationen von Chlorendicsäure, TOC und Chlorid in zwei Replikaten nach 20 Tagen Reaktions zeit gemessen. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Während der Testdauer von 20 Tagen fällt die Chlorendicsäu rekonzentration von 210 mg/Liter auf 166 und 145 mg/Liter für H1 bzw. H2-Populationen, was eine Verringerung des Ge halts an Chlorendicsäure von 21 und 31% darstellt. Die Ge samtkonzentration von organischem Kohlenstoff fällt auch während des gleichen Zeitraums von einer anfänglichen Kon zentration von 58 mg/Liter auf 45 und auf 43 mg/Liter für H1 bzw. H2, was eine Verringerung von 22 und 26% darstellt. Ein zusätzlicher Hinweis auf den biologischen Abbau von Chlorendicsäure kann aus den Chloridfreisetzungs-Daten ent nommen werden. Chlorid wird in allen Testkolben freigesetzt, die Kulturen von mutierten Bakterien enthalten. Der Mittel wert beträgt 7,34 mg/Liter Cl^-1.

Claims

1. Bakterienmutanten, befähigt zum Abbau eines toxischen chemischen Stoffes, erhältlich durch Behandlung der ge züchteten Bakterien mit einer Mutations-erzeugenden ultravioletten Strahlung.

2. Verfahren zur kontinuierlichen biologischen Einwirkung auf einen in Wasser enthaltenen chemischen Stoff, umfas send

1) die Züchtung von Bakterien unter nicht-wachstumsbe schränkenden Bedingungen;
2) das Behandeln der gezüchteten Bakterien mit einer Mutations-erzeugenden ultravioletten Strahlung; und
3) das Zusammenbringen der mutierten Bakterien mit dem chemischen Stoff unter wachstumsbeschränkenden Be dingungen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in dem der chemische Stoff in Schritt (1) vorhanden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, in dem der chemische Stoff in Schritt (1) oder Schritt (2) nicht vorhanden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, in dem der chemische Stoff eine halogenierte organische Verbindung ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, umfassend zwischen den Schritten (2) und (3) einen zusätzlichen Schritt zur Replikation der mutierten Bakterien mit min destens zwei Teilungen unter nicht-wachstumsbeschränken den Bedingungen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem die Replikation für mindestens zwei Stunden erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, in dem die Bakterien aus einer den chemischen Stoff enthaltenden Quelle erhalten werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, in dem die Konzentration des chemischen Stoffes in Schritt (3) nicht für eine Hemmung des Wachstums der Bakterien aus reicht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, in dem die Bakterien in Schritt (1) von einem aktivierten Schlamm enthaltenden biologischen Reaktor stammen, wobei der chemische Stoff eine oder mehrere der biologisch abbau baren Verbindungen in dem aktivierten Schlamm ist, und die mutierten Bakterien von Schritt (3) dem biologischen Reaktor wieder zugeführt werden.

11. Verfahren zur Beschleunigung des biologischen Abbaus von halogenierten organischen Verbindungen in Schlamm, wobei der Schlamm in einem biologischen Reaktor durch eine an gepaßte Population von Bakterien behandelt wird, umfas send

1) den kontinuierlichen Durchlauf eines Teils des Schlammes, der die Bakterien enthält von dem biolo gischen Reaktor zu einem ersten Reaktor, in dem das Wachstum der Bakterien stimuliert wird;
2) den Durchlauf des Schlammes aus dem ersten Reaktor zu einem UV-Mutationsreaktor, in dem die Bakterien im Schlamm einer UV-Strahlung ausgesetzt werden, die eine Mutation der Bakterien verursacht;
3) den Durchlauf des Schlammes aus dem UV-Mutationsre aktor zu einem zweiten Reaktor, in dem das Wachstum der mutierten Bakterien stimuliert wird; und
4) die Zurückführung des Schlammes aus dem zweiten Re aktor zu dem biologischen Reaktor.

12. Vorrichtung zur kontinuierlichen biologischen Einwirkung auf einen in Wasser enthaltenen chemischen Stoff, umfas send

1) einen ersten Reaktor zur Züchtung von Bakterien unter nicht-wachstumsbeschränkenden Bedingungen;
2) Mittel um die gezüchteten Bakterien einer Mutation erzeugenden ultravioletten Strahlung auszusetzen; und
3) einen zweiten Reaktor, in dem die mutierten Bakte rien mit dem chemischen Stoff unter wachstumsbe schränkenden Bedingungen zusammengebracht werden.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, umfassend Mittel zur Re plikation der mutierten Bakterien mindestens zwei Tei lungen vor dem Zusammenbringen der mutierten Bakterien mit dem chemischen Stoff.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, umfas send

1) einen biologischen Reaktor für die Behandlung von aktiviertem Schlamm durch die Bakterien;
2) Mittel zum Ableiten eines Teils des aktivierten Schlamms aus dem biologischen Reaktor zu dem ersten Reaktor; und
3) Mittel zum Zurückführen der mutierten Bakterien in den biologischen Reaktor.