DE19507103C1 - Verfahren für die Züchtung von Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren für die Züchtung von MikroorganismenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Züchtung von
Mikroorganismen, die zum Abbau von bestimmten Schadstoffen
geeignet sind; bei welchem vorhandene Mikroorganismen in
einer wachstumsfördernden Nährlösung kultiviert, chemisch
und/oder physikalisch mutagen wirkenden Einflüssen ausge
setzt, unter wachstumsfördernden Bedingungen stabilisiert
und unter dem Einfluß der Schadstoffe unter wachstums
beschränkenden Bedingungen selektiert werden, wobei diese
selektierten Mikroorganismen an den Anfang des Prozesses
zurückgeführt werden.
Die Nutzung von Mikroorganismen zum biologischen Abbau von
Schadstoffen findet einen wichtigen Einsatz in der Alt
lastensanierung sowie in der Abwässer- und Luftreinigung,
bei denen die Schadstoffe durch die Mikroorganismen
zersetzt oder in andere Stoffe umgewandelt werden, deren
Entsorgung unproblematischer ist. Für den effizienten
biologischen Abbau von Schadstoffen geeignete Mi
kroorganismen müssen über die spezifische Abbaufähigkeit
hinaus eine optimale Schadstofftoleranz und eine möglichst
hohe Teilungsrate sowie genetische Stabilität aufweisen.
Zur Züchtung von Bakterienmutanten, die zum Abbau von
Schadstoffen befähigt sind, wird in DE 41 24 900 A1 ein
Verfahren offenbart, bei dem die Bakterien unter nicht
wachstumsbeschränkenden Bedingungen gezüchtet, einer muta
tionserzeugenden UV-Strahlung ausgesetzt und die mutierten
Bakterien dann unter wachstumsbeschränkenden Bedingungen
mit dem Schadstoff zusammengebracht werden. Gegebenenfalls
könnten die Mikroorganismen aus der Selektionsstufe in
einen ersten Reaktor überführt werden, in dem sie stabili
siert werden, um anschließend in der Mutationsstufe einer
erneuten UV-Strahlung ausgesetzt zu werden.
Es hat sich aber gezeigt, daß das Verfahren nach dem Stand
der Technik nicht zur Entwicklung solcher Mikroorganismen
populationen geeignet ist, die organische Verbindungen und
insbesondere komplexe Verbindungen abbauen können, weil
eine bzw. zwei mutagene Behandlungen nicht hinreichen, um
die Etablierung einer zum Abbau komplexer organischer Ver
bindungen geeigneten Mikroorganismenpopulation in vertret
barer Zeit zu erzielen. Dies ist zunächst ein prinzipielles
statistisches Problem, welches mit großer Wahrscheinlich
keit damit zusammenhängt, daß zum Abbau komplexer orga
nischer Schadstoffe mehrere Abbaureaktionen erforderlich
sind, die sequentiell verlaufen und bei denen Zwischen
produkte erzeugt werden, die unter Umständen für die Mikro
organismen toxischer sind als das Ausgangsprodukt. Die Zu
sammensetzung des Selektionsmediums ändert sich also im
Laufe der Zeit, so daß sich die Mikroorganismenpopulation
bezüglich der Abbaufähigkeit und der Schadstofftoleranz
immer wieder anpassen muß. Diese Anpassung nimmt einige
Zeit in Anspruch und führt dazu, daß der Prozeß insgesamt
länger dauert und daher unwirtschaftlich wird.
Das aus dem Stand der Technik vorbekannte Verfahren erfor
dert außerdem einen erheblichen apparativen Aufwand, weil
Kultivierung, mutagene Behandlung und Stabilisierung der
Mikroorganismenpopulation in unterschiedlichen Reaktoren
durchgeführt werden. Darüber hinaus werden die Mikroorga
nismen nach der Stabilisierung in einem nährstoffreichen
Medium zum Animpfen des schadstoffhaltigen Selektions
mediums direkt in den Selektionsfermenter überführt. So
kann es geschehen, daß in der der Selektion unterworfenen
Biomasse noch erhebliche Anteile an Nährsubstanzen enthal
ten sind, die in den Selektionsfermenter eingeschleppt wor
den sind und die die Selektion nachteilig beeinflussen,
weil diese Nährsubstanzen von den Mikroorganismen bevorzugt
als Nährstoffquelle genutzt werden. Die Selektion der
schadstoffabbauenden Mikroorganismen wird also erst ein
setzen, wenn die eingeschleppten Nährsubstanzen verbraucht
sind. Dies führt zunächst zu einer positiven Selektion der
Mikroorganismen, die den Schadstoff nicht abbauen können,
was eine zusätzliche Verzögerung des gesamten Selektions
prozesses zur Folge hat.
Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, das Verfahren der
eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß
einerseits die Kultivierung und Mutation unter wachstums
fördernden Bedingungen und andererseits die Selektion unter
wachstumsbeschränkenden Bedingungen exakt kontrollierbar
bleiben. Hierdurch soll es ermöglicht werden, mit geringe
rem apparativem Aufwand den natürlichen Evolutionsprozeß
möglichst eng und gezielt zu kanalisieren, um auf diese
Weise möglichst schnell Mikroorganismen mit den gewünschten
Eigenschaften züchten zu können.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ausgehend
vom Verfahren der eingangs genannten Art vor,
- - daß die Kultivierung, die mutagene Behandlung und die Stabilisierung simultan in einem Mutationsfermenter vorgenommen werden, der ein nährstoffreiches Grund medium enthält,
- - daß die Selektion in einem Selektionsfermenter er folgt, der ein nährstoffarmes, mit dem Schadstoff an gereichertes Grundmedium enthält,
- - daß dem Mutationsfermenter kontinuierlich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nähr stoffreichen Grundmedium des Mutationsfermenters be freit und in den Selektionsfermenter überführt wird,
- - daß dem Selektionsfermenter kontinuierlich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nähr stoffarmen Grundmedium des Selektionsfermenters be freit und in den Mutationsfermenter überführt wird,
- - daß das gesamte Verfahren nach Art eines sich wieder holenden Kreislaufes kontinuierlich in alternierenden Selektions- und Mutationsphasen abläuft,
wobei dem Mutationsfermenter einerseits und dem Se
lektionsfermenter andererseits rechnergesteuerte Re
gelkreise zugeordnet sind, durch welche die Fermen
tationsparameter in beiden Fermentern unabhängig
voneinander einstellbar sind.
Das Verfahren gemäß der Erfindung arbeitet in besonders
vorteilhafter Weise mit einem Doppelfermentersystem, in
welchem die beiden Prinzipien der Evolution - Selektion und
Mutation - einzeln optimiert stattfinden können. Dabei wer
den die Mikroorganismen in beiden Fermentern, welche sich
im Betrieb gegenseitig beimpfen, kontinuierlich in alter
nierenden Selektions- und Mutationsphasen kultiviert. Im
Mutationsfermenter kann durch ultraviolette Bestrahlung
und/oder Beigabe von mutagenen Chemikalien die Mutations
rate in der Kultur drastisch erhöht werden, während im Se
lektionsfermenter den geeigneten Mutanten gezielt zum
Schadstoffabbau geeignete Bedingungen verschafft werden.
Durch wiederholte mutagene Behandlungen wird die genetische
Vielfalt der Mikroorganismenpopulation erhöht, so daß sich
diese bezüglich Abbaufähigkeit und Schadstofftoleranz
schneller anpassen kann, wenn sich die Bedingungen im Se
lektionsreaktor, also das Verhältnis der Mengen an
Zwischenprodukten, im Laufe des Abbauprozesses ändert. So
erfährt die Entwicklung der Mikroorganismenpopulation durch
den Einsatz von Mutation und Selektion in einem zyklischen
Prozeß eine drastische Beschleunigung gegenüber der einzel
nen Mutation bzw. Selektion nach dem Stand der Technik.
Das Verfahren gemäß der Erfindung macht es somit möglich,
verhältnismäßig schnell ganze Biozönosen auf speziell defi
nierte Abbauleistungen und/oder Toleranzen hin zu generie
ren oder zu spezialisieren. Die Vorteile des Verfahrens
liegen in der quasi-natürlichen Erzeugung der Mikroorga
nismen durch gezielt gesteuerte Evolution. Das mindert, im
Gegensatz zu gentechnisch manipulierten Mikroorganismen,
das Risiko der Entstehung unwirksam gewordener Revertanten.
Der Einsatz rechnergesteuerter Regelkreise erlaubt es,
definierte chemische und verfahrenstechnische Bedingungen
reproduzierbar einzustellen und auf diese Weise für alle
Einzelprozesse die jeweils optimalen Bedingungen zu finden.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens
gemäß der Erfindung sieht vor, daß der Selektionsfermenter
(Fermenter 2) toxinstatisch arbeitet, d. h. daß im Laufe des
Prozesses die Schadstoffkonzentration konstant bleibt. Dies
hat einerseits den Vorteil, daß der Selektionsdruck über
den gesamten Prozeß hinweg konstant aufrechterhalten wird,
so daß nur solche Mikroorganismen wachsen können, die Tole
ranz gegenüber dem Schadstoff aufweisen bzw. den Schadstoff
abbauen können. Andererseits hat es ebenfalls den Vorteil,
daß sich in der Mikroorganismenpopulation schneller ein
biozönotisches Gleichgewicht einstellt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
arbeitet der Selektionsfermenter (Fermenter 2) turbido
statisch. In diesem Fall wird der Selektionsprozeß haupt
sächlich über die Biomasse im Selektionsfermenter ge
steuert.
Vorzugsweise werden bei der Überführung von Biomasse von
einem Fermenter in den anderen die Grundmedien der Biomasse
ausgetauscht. Dieser Austausch der Grundmedien wird zweck
mäßig in zwischen den Fermentern angeordneten Dialyse
strecken vorgenommen. Auf diese Weise wird verhindert, daß
Medium aus einem Fermenter in den anderen gelangt, wodurch
den Mikroorganismen Nährstoffe angeboten würden, die gegen
über den Schadstoffen bevorzugt benutzt werden, was zu
einer Verzögerung des Selektionsprozesses führt. Darüber
hinaus wird durch die schonende Anpassung an das neue Me
dium, die in der Dialysestrecke stattfindet, erreicht, daß
die "lag"-Phase bei jedem Fermenterwechsel verkürzt und so
der gesamte Prozeß beschleunigt wird. Ein weiterer Vorteil
besteht darin, daß durch den Austausch des Mediums zwischen
dem Selektions- und dem Mutationsfermenter UV-absorbierende
Substanzen entfernt werden, die im Selektionsmedium enthal
ten oder im Rahmen des mikrobiellen Stoffwechsels her
gestellt und in das Medium ausgeschieden worden sind und
die bei Einsatz von UV-Strahlung als Mutagen die Muta
tionseffizienz mindern können.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens enthält das Grundmedium (Grundmedium 1) des
Mutationsfermenters (Fermenter 1) den abzubauenden Schad
stoff. Der Mutationsfermenter arbeitet zweckmäßig toxin
statisch.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
arbeitet der Mutationsfermenter (Fermenter 1) turbido
statisch.
Ein Ausführungsbeispiel des Verfahrens gemäß der Erfindung
wird im folgenden anhand der beigefügten Zeichnung erläu
tert, die schematisch den Aufbau einer zur Durchführung des
Verfahrens geeigneten Anlage darstellt.
Die in der Zeichnung dargestellte Anlage weist zwei Fermen
tationsgefäße mit einer Kapazität von einem bis zwei Litern
auf, die kontinuierlich betrieben werden können, nämlich
den Mutationsfermenter (Fermenter 1) und den Selektions
fermenter (Fermenter 2). Beide Fermenter sind mit folgender
Standardsensorik ausgestattet: pH₁ und pH2 für die pH-
Werte, pO₁ und pO₂ für die Sauerstoffgehalte, T₁ und T₂ für
die Temperatur und OD₁ und OD₂ für die optische Dichte. Zu
sätzlich befindet sich in beiden Fermentern oder im Bypass
beider Fermenter geeignete Sensorik zur Erfassung der ak
tuellen Toxin ("Selektionssubstrat")-Konzentrationen. Der
Fermenter 2 kann über eine Pumpe P₆ und eine nachgeschalte
te Dialysestrecke, in der eine schonende Medienadaption er
reicht wird, mit Mikroorganismen aus dem Fermenter 1 kon
tinuierlich angeimpft werden. Ebenso wird der Fermenter I
über eine Pumpe P₇ und eine nachgeschaltete Dialysestrecke
mit Mikroorganismen aus dem Fermenter 2 angeimpft. Pumpen
P₈ und P₉ versorgen die Dialysestrecken mit Grundmedium.
Beide Fermenter werden mit Preßluft über Ventile V₁ und V₂
begast und sind mit regelbaren Rührwerken M ausgestattet.
In den Dialysestrecken werden die in den jeweils anderen
Fermenter zu überführenden Mikroorganismen von dem Grund
medium des Herkunfts-Fermenters befreit und mit dem Grund
medium des Ziel-Fermenters angereichert.
Der Mutationsfermenter (Fermenter 1) weist eine Bestrah
lungsmöglichkeit mittels UV auf. Die Strahlenpassage er
folgt durch ein Quarzfenster. Der Fermenter 1 wird über
einen Mischblock 1 sowie über Pumpen 10 (Wasser), P₁
(Medienkonzentrat) und P₂ (Nährsubstrat) mit Medium ver
sorgt. Eine Pumpe P₁₁ sorgt durch pegelgerechtes Abpumpen
in den Abwassertank für ein konstantes Volumen der Fermen
tationsbrühe.
Die Medienzufuhr in den Selektionsfermenter (Fermenter 2)
erfolgt über einen Mischblock 2 sowie Pumpen P₁₂ (Wasser),
P₃ (Medienkonzentrat), P₄ (Nährsubstrat) und P₅
("Selektionssubstrat"). Eine Pumpe P₁₃ sorgt durch pegel
gerechtes Abpumpen in einen Sammeltank für konstantes Volu
men der Fermentationsbrühe.
Das System ist modular aufgebaut und erlaubt den Einsatz
verschiedenster Typen von Selektionsreaktoren.
Sämtliche Pumpen sind für Dauerbetrieb ausgelegt und über
geeignete Schnittstellen mit einem Prozeßleitsystem regel
bar. Die Abwassertanks haben eine Kapazität von je 200 Li
tern. Der Lufteintrag, die Rührerdrehzahl, die Basen- bzw.
Säurenzufuhr und die Temperierung werden von beiden Fermen
tersystemen autark und nicht über das Prozeßleitsystem ge
regelt.
Claims (8)
1. Verfahren für die Züchtung von Mikroorganismen, die
zum Abbau von bestimmten Schadstoffen geeignet sind, bei
welchem vorhandene Mikroorganismen in einer wachstums
fördernden Nährlösung kultiviert, chemisch und/oder physi
kalisch mutagen wirkenden Einflüssen ausgesetzt, unter
wachstumsfördernden Bedingungen stabilisiert und unter dem
Einfluß der Schadstoffe unter wachstumsbeschränkenden Be
dingungen selektiert werden, wobei diese selektierten Mi
kroorganismen an den Anfang des Prozesses zurückgeführt
werden,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Kultivierung, die mutagene Behandlung und die Sta
bilisierung simultan in einem Mutationsfermenter (Fermenter
1) vorgenommen werden, der ein nährstoffreiches Grundmedium
(Grundmedium 1) enthält,
daß die Selektion in einem Selektionsfermenter (Fermenter 2) erfolgt, der ein nährstoffarmes, mit dem Schadstoff angereichertes Grundmedium (Grundmedium 2) ent hält,
daß dem Mutationsfermenter (Fermenter 1) kontinuier lich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nährstoffreichen Grundmedium (Grundmedium 1) des Muta tionsfermenters (Fermenter 1) befreit und in den Selek tionsfermenter (Fermenter 2) überführt wird,
und daß dem Selektionsfermenter (Fermenter 2) kontinu ierlich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nährstoffarmen Grundmedium (Grundmedium 2) des Selek tionsfermenters (Fermenter 2) befreit und in den Muta tionsfermenter (Fermenter 1) überführt wird,
daß das gesamte Verfahren nach Art eines sich wieder holenden Kreislaufes kontinuierlich in alternierenden Se lektions- und Mutationsphasen abläuft,
wobei dem Mutationsfermenter (Fermenter 1) einerseits und dem Selektionsfermenter (Fermenter 2) andererseits rechnergesteuerte Regelkreise zugeordnet sind, durch welche die Fermentationsparameter in beiden Fermentern unabhängig voneinander einstellbar sind.
daß die Selektion in einem Selektionsfermenter (Fermenter 2) erfolgt, der ein nährstoffarmes, mit dem Schadstoff angereichertes Grundmedium (Grundmedium 2) ent hält,
daß dem Mutationsfermenter (Fermenter 1) kontinuier lich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nährstoffreichen Grundmedium (Grundmedium 1) des Muta tionsfermenters (Fermenter 1) befreit und in den Selek tionsfermenter (Fermenter 2) überführt wird,
und daß dem Selektionsfermenter (Fermenter 2) kontinu ierlich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nährstoffarmen Grundmedium (Grundmedium 2) des Selek tionsfermenters (Fermenter 2) befreit und in den Muta tionsfermenter (Fermenter 1) überführt wird,
daß das gesamte Verfahren nach Art eines sich wieder holenden Kreislaufes kontinuierlich in alternierenden Se lektions- und Mutationsphasen abläuft,
wobei dem Mutationsfermenter (Fermenter 1) einerseits und dem Selektionsfermenter (Fermenter 2) andererseits rechnergesteuerte Regelkreise zugeordnet sind, durch welche die Fermentationsparameter in beiden Fermentern unabhängig voneinander einstellbar sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Selektionsreaktor toxinstatisch arbeitet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Selektionsreaktor turbidostatisch arbeitet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch ge
kennzeichnet, daß bei der Überführung von Biomasse von
einem Fermenter in den anderen die Grundmedien der Biomasse
ausgetauscht werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der Austausch der Grundmedien in zwischen den Fermen
tern angeordneten Dialysestrecken vorgenommen wird.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegan
genen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Grund
medium (Grundmedium 1) des Mutationsfermenters (Fermenter
1) den abzubauenden Schadstoff enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mutationsfermenter (Fermenter 1) toxinstatisch ar
beitet.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mutationsfermenter (Fermenter 1) turbidostatisch
arbeitet.
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PCT/EP1995/000752 WO1995023845A1 (de) | 1994-03-02 | 1995-03-01 | Verfahren für die züchtung von mikroorganismen |
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Legal Events
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D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
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