DE19507103C1 - Verfahren für die Züchtung von Mikroorganismen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Züchtung von Mikroorganismen, die zum Abbau von bestimmten Schadstoffen geeignet sind; bei welchem vorhandene Mikroorganismen in einer wachstumsfördernden Nährlösung kultiviert, chemisch und/oder physikalisch mutagen wirkenden Einflüssen ausge­ setzt, unter wachstumsfördernden Bedingungen stabilisiert und unter dem Einfluß der Schadstoffe unter wachstums­ beschränkenden Bedingungen selektiert werden, wobei diese selektierten Mikroorganismen an den Anfang des Prozesses zurückgeführt werden.

Die Nutzung von Mikroorganismen zum biologischen Abbau von Schadstoffen findet einen wichtigen Einsatz in der Alt­ lastensanierung sowie in der Abwässer- und Luftreinigung, bei denen die Schadstoffe durch die Mikroorganismen zersetzt oder in andere Stoffe umgewandelt werden, deren Entsorgung unproblematischer ist. Für den effizienten biologischen Abbau von Schadstoffen geeignete Mi­ kroorganismen müssen über die spezifische Abbaufähigkeit hinaus eine optimale Schadstofftoleranz und eine möglichst hohe Teilungsrate sowie genetische Stabilität aufweisen.

Zur Züchtung von Bakterienmutanten, die zum Abbau von Schadstoffen befähigt sind, wird in DE 41 24 900 A1 ein Verfahren offenbart, bei dem die Bakterien unter nicht­ wachstumsbeschränkenden Bedingungen gezüchtet, einer muta­ tionserzeugenden UV-Strahlung ausgesetzt und die mutierten Bakterien dann unter wachstumsbeschränkenden Bedingungen mit dem Schadstoff zusammengebracht werden. Gegebenenfalls könnten die Mikroorganismen aus der Selektionsstufe in einen ersten Reaktor überführt werden, in dem sie stabili­ siert werden, um anschließend in der Mutationsstufe einer erneuten UV-Strahlung ausgesetzt zu werden.

Es hat sich aber gezeigt, daß das Verfahren nach dem Stand der Technik nicht zur Entwicklung solcher Mikroorganismen­ populationen geeignet ist, die organische Verbindungen und insbesondere komplexe Verbindungen abbauen können, weil eine bzw. zwei mutagene Behandlungen nicht hinreichen, um die Etablierung einer zum Abbau komplexer organischer Ver­ bindungen geeigneten Mikroorganismenpopulation in vertret­ barer Zeit zu erzielen. Dies ist zunächst ein prinzipielles statistisches Problem, welches mit großer Wahrscheinlich­ keit damit zusammenhängt, daß zum Abbau komplexer orga­ nischer Schadstoffe mehrere Abbaureaktionen erforderlich sind, die sequentiell verlaufen und bei denen Zwischen­ produkte erzeugt werden, die unter Umständen für die Mikro­ organismen toxischer sind als das Ausgangsprodukt. Die Zu­ sammensetzung des Selektionsmediums ändert sich also im Laufe der Zeit, so daß sich die Mikroorganismenpopulation bezüglich der Abbaufähigkeit und der Schadstofftoleranz immer wieder anpassen muß. Diese Anpassung nimmt einige Zeit in Anspruch und führt dazu, daß der Prozeß insgesamt länger dauert und daher unwirtschaftlich wird.

Das aus dem Stand der Technik vorbekannte Verfahren erfor­ dert außerdem einen erheblichen apparativen Aufwand, weil Kultivierung, mutagene Behandlung und Stabilisierung der Mikroorganismenpopulation in unterschiedlichen Reaktoren durchgeführt werden. Darüber hinaus werden die Mikroorga­ nismen nach der Stabilisierung in einem nährstoffreichen Medium zum Animpfen des schadstoffhaltigen Selektions­ mediums direkt in den Selektionsfermenter überführt. So kann es geschehen, daß in der der Selektion unterworfenen Biomasse noch erhebliche Anteile an Nährsubstanzen enthal­ ten sind, die in den Selektionsfermenter eingeschleppt wor­ den sind und die die Selektion nachteilig beeinflussen, weil diese Nährsubstanzen von den Mikroorganismen bevorzugt als Nährstoffquelle genutzt werden. Die Selektion der schadstoffabbauenden Mikroorganismen wird also erst ein­ setzen, wenn die eingeschleppten Nährsubstanzen verbraucht sind. Dies führt zunächst zu einer positiven Selektion der Mikroorganismen, die den Schadstoff nicht abbauen können, was eine zusätzliche Verzögerung des gesamten Selektions­ prozesses zur Folge hat.

Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, das Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß einerseits die Kultivierung und Mutation unter wachstums­ fördernden Bedingungen und andererseits die Selektion unter wachstumsbeschränkenden Bedingungen exakt kontrollierbar bleiben. Hierdurch soll es ermöglicht werden, mit geringe­ rem apparativem Aufwand den natürlichen Evolutionsprozeß möglichst eng und gezielt zu kanalisieren, um auf diese Weise möglichst schnell Mikroorganismen mit den gewünschten Eigenschaften züchten zu können.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ausgehend vom Verfahren der eingangs genannten Art vor,

• - daß die Kultivierung, die mutagene Behandlung und die Stabilisierung simultan in einem Mutationsfermenter vorgenommen werden, der ein nährstoffreiches Grund­ medium enthält,
• - daß die Selektion in einem Selektionsfermenter er­ folgt, der ein nährstoffarmes, mit dem Schadstoff an­ gereichertes Grundmedium enthält,
• - daß dem Mutationsfermenter kontinuierlich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nähr­ stoffreichen Grundmedium des Mutationsfermenters be­ freit und in den Selektionsfermenter überführt wird,
• - daß dem Selektionsfermenter kontinuierlich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nähr­ stoffarmen Grundmedium des Selektionsfermenters be­ freit und in den Mutationsfermenter überführt wird,
• - daß das gesamte Verfahren nach Art eines sich wieder­ holenden Kreislaufes kontinuierlich in alternierenden Selektions- und Mutationsphasen abläuft,

wobei dem Mutationsfermenter einerseits und dem Se­ lektionsfermenter andererseits rechnergesteuerte Re­ gelkreise zugeordnet sind, durch welche die Fermen­ tationsparameter in beiden Fermentern unabhängig voneinander einstellbar sind.

Das Verfahren gemäß der Erfindung arbeitet in besonders vorteilhafter Weise mit einem Doppelfermentersystem, in welchem die beiden Prinzipien der Evolution - Selektion und Mutation - einzeln optimiert stattfinden können. Dabei wer­ den die Mikroorganismen in beiden Fermentern, welche sich im Betrieb gegenseitig beimpfen, kontinuierlich in alter­ nierenden Selektions- und Mutationsphasen kultiviert. Im Mutationsfermenter kann durch ultraviolette Bestrahlung und/oder Beigabe von mutagenen Chemikalien die Mutations­ rate in der Kultur drastisch erhöht werden, während im Se­ lektionsfermenter den geeigneten Mutanten gezielt zum Schadstoffabbau geeignete Bedingungen verschafft werden. Durch wiederholte mutagene Behandlungen wird die genetische Vielfalt der Mikroorganismenpopulation erhöht, so daß sich diese bezüglich Abbaufähigkeit und Schadstofftoleranz schneller anpassen kann, wenn sich die Bedingungen im Se­ lektionsreaktor, also das Verhältnis der Mengen an Zwischenprodukten, im Laufe des Abbauprozesses ändert. So erfährt die Entwicklung der Mikroorganismenpopulation durch den Einsatz von Mutation und Selektion in einem zyklischen Prozeß eine drastische Beschleunigung gegenüber der einzel­ nen Mutation bzw. Selektion nach dem Stand der Technik.

Das Verfahren gemäß der Erfindung macht es somit möglich, verhältnismäßig schnell ganze Biozönosen auf speziell defi­ nierte Abbauleistungen und/oder Toleranzen hin zu generie­ ren oder zu spezialisieren. Die Vorteile des Verfahrens liegen in der quasi-natürlichen Erzeugung der Mikroorga­ nismen durch gezielt gesteuerte Evolution. Das mindert, im Gegensatz zu gentechnisch manipulierten Mikroorganismen, das Risiko der Entstehung unwirksam gewordener Revertanten. Der Einsatz rechnergesteuerter Regelkreise erlaubt es, definierte chemische und verfahrenstechnische Bedingungen reproduzierbar einzustellen und auf diese Weise für alle Einzelprozesse die jeweils optimalen Bedingungen zu finden.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung sieht vor, daß der Selektionsfermenter (Fermenter 2) toxinstatisch arbeitet, d. h. daß im Laufe des Prozesses die Schadstoffkonzentration konstant bleibt. Dies hat einerseits den Vorteil, daß der Selektionsdruck über den gesamten Prozeß hinweg konstant aufrechterhalten wird, so daß nur solche Mikroorganismen wachsen können, die Tole­ ranz gegenüber dem Schadstoff aufweisen bzw. den Schadstoff abbauen können. Andererseits hat es ebenfalls den Vorteil, daß sich in der Mikroorganismenpopulation schneller ein biozönotisches Gleichgewicht einstellt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung arbeitet der Selektionsfermenter (Fermenter 2) turbido­ statisch. In diesem Fall wird der Selektionsprozeß haupt­ sächlich über die Biomasse im Selektionsfermenter ge­ steuert.

Vorzugsweise werden bei der Überführung von Biomasse von einem Fermenter in den anderen die Grundmedien der Biomasse ausgetauscht. Dieser Austausch der Grundmedien wird zweck­ mäßig in zwischen den Fermentern angeordneten Dialyse­ strecken vorgenommen. Auf diese Weise wird verhindert, daß Medium aus einem Fermenter in den anderen gelangt, wodurch den Mikroorganismen Nährstoffe angeboten würden, die gegen­ über den Schadstoffen bevorzugt benutzt werden, was zu einer Verzögerung des Selektionsprozesses führt. Darüber hinaus wird durch die schonende Anpassung an das neue Me­ dium, die in der Dialysestrecke stattfindet, erreicht, daß die "lag"-Phase bei jedem Fermenterwechsel verkürzt und so der gesamte Prozeß beschleunigt wird. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß durch den Austausch des Mediums zwischen dem Selektions- und dem Mutationsfermenter UV-absorbierende Substanzen entfernt werden, die im Selektionsmedium enthal­ ten oder im Rahmen des mikrobiellen Stoffwechsels her­ gestellt und in das Medium ausgeschieden worden sind und die bei Einsatz von UV-Strahlung als Mutagen die Muta­ tionseffizienz mindern können.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das Grundmedium (Grundmedium 1) des Mutationsfermenters (Fermenter 1) den abzubauenden Schad­ stoff. Der Mutationsfermenter arbeitet zweckmäßig toxin­ statisch.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung arbeitet der Mutationsfermenter (Fermenter 1) turbido­ statisch.

Ein Ausführungsbeispiel des Verfahrens gemäß der Erfindung wird im folgenden anhand der beigefügten Zeichnung erläu­ tert, die schematisch den Aufbau einer zur Durchführung des Verfahrens geeigneten Anlage darstellt.

Die in der Zeichnung dargestellte Anlage weist zwei Fermen­ tationsgefäße mit einer Kapazität von einem bis zwei Litern auf, die kontinuierlich betrieben werden können, nämlich den Mutationsfermenter (Fermenter 1) und den Selektions­ fermenter (Fermenter 2). Beide Fermenter sind mit folgender Standardsensorik ausgestattet: pH₁ und pH₂ für die pH- Werte, pO₁ und pO₂ für die Sauerstoffgehalte, T₁ und T₂ für die Temperatur und OD₁ und OD₂ für die optische Dichte. Zu­ sätzlich befindet sich in beiden Fermentern oder im Bypass beider Fermenter geeignete Sensorik zur Erfassung der ak­ tuellen Toxin ("Selektionssubstrat")-Konzentrationen. Der Fermenter 2 kann über eine Pumpe P₆ und eine nachgeschalte­ te Dialysestrecke, in der eine schonende Medienadaption er­ reicht wird, mit Mikroorganismen aus dem Fermenter 1 kon­ tinuierlich angeimpft werden. Ebenso wird der Fermenter I über eine Pumpe P₇ und eine nachgeschaltete Dialysestrecke mit Mikroorganismen aus dem Fermenter 2 angeimpft. Pumpen P₈ und P₉ versorgen die Dialysestrecken mit Grundmedium. Beide Fermenter werden mit Preßluft über Ventile V₁ und V₂ begast und sind mit regelbaren Rührwerken M ausgestattet. In den Dialysestrecken werden die in den jeweils anderen Fermenter zu überführenden Mikroorganismen von dem Grund­ medium des Herkunfts-Fermenters befreit und mit dem Grund­ medium des Ziel-Fermenters angereichert.

Der Mutationsfermenter (Fermenter 1) weist eine Bestrah­ lungsmöglichkeit mittels UV auf. Die Strahlenpassage er­ folgt durch ein Quarzfenster. Der Fermenter 1 wird über einen Mischblock 1 sowie über Pumpen 10 (Wasser), P₁ (Medienkonzentrat) und P₂ (Nährsubstrat) mit Medium ver­ sorgt. Eine Pumpe P₁₁ sorgt durch pegelgerechtes Abpumpen in den Abwassertank für ein konstantes Volumen der Fermen­ tationsbrühe.

Die Medienzufuhr in den Selektionsfermenter (Fermenter 2) erfolgt über einen Mischblock 2 sowie Pumpen P₁₂ (Wasser), P₃ (Medienkonzentrat), P₄ (Nährsubstrat) und P₅ ("Selektionssubstrat"). Eine Pumpe P₁₃ sorgt durch pegel­ gerechtes Abpumpen in einen Sammeltank für konstantes Volu­ men der Fermentationsbrühe.

Das System ist modular aufgebaut und erlaubt den Einsatz verschiedenster Typen von Selektionsreaktoren.

Sämtliche Pumpen sind für Dauerbetrieb ausgelegt und über geeignete Schnittstellen mit einem Prozeßleitsystem regel­ bar. Die Abwassertanks haben eine Kapazität von je 200 Li­ tern. Der Lufteintrag, die Rührerdrehzahl, die Basen- bzw. Säurenzufuhr und die Temperierung werden von beiden Fermen­ tersystemen autark und nicht über das Prozeßleitsystem ge­ regelt.

Claims (8)

1. Verfahren für die Züchtung von Mikroorganismen, die zum Abbau von bestimmten Schadstoffen geeignet sind, bei welchem vorhandene Mikroorganismen in einer wachstums­ fördernden Nährlösung kultiviert, chemisch und/oder physi­ kalisch mutagen wirkenden Einflüssen ausgesetzt, unter wachstumsfördernden Bedingungen stabilisiert und unter dem Einfluß der Schadstoffe unter wachstumsbeschränkenden Be­ dingungen selektiert werden, wobei diese selektierten Mi­ kroorganismen an den Anfang des Prozesses zurückgeführt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung, die mutagene Behandlung und die Sta­ bilisierung simultan in einem Mutationsfermenter (Fermenter 1) vorgenommen werden, der ein nährstoffreiches Grundmedium (Grundmedium 1) enthält,
daß die Selektion in einem Selektionsfermenter (Fermenter 2) erfolgt, der ein nährstoffarmes, mit dem Schadstoff angereichertes Grundmedium (Grundmedium 2) ent­ hält,
daß dem Mutationsfermenter (Fermenter 1) kontinuier­ lich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nährstoffreichen Grundmedium (Grundmedium 1) des Muta­ tionsfermenters (Fermenter 1) befreit und in den Selek­ tionsfermenter (Fermenter 2) überführt wird,
und daß dem Selektionsfermenter (Fermenter 2) kontinu­ ierlich in kleinen Mengen Biomasse entnommen wird, die von dem nährstoffarmen Grundmedium (Grundmedium 2) des Selek­ tionsfermenters (Fermenter 2) befreit und in den Muta­ tionsfermenter (Fermenter 1) überführt wird,
daß das gesamte Verfahren nach Art eines sich wieder­ holenden Kreislaufes kontinuierlich in alternierenden Se­ lektions- und Mutationsphasen abläuft,
wobei dem Mutationsfermenter (Fermenter 1) einerseits und dem Selektionsfermenter (Fermenter 2) andererseits rechnergesteuerte Regelkreise zugeordnet sind, durch welche die Fermentationsparameter in beiden Fermentern unabhängig voneinander einstellbar sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsreaktor toxinstatisch arbeitet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsreaktor turbidostatisch arbeitet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß bei der Überführung von Biomasse von einem Fermenter in den anderen die Grundmedien der Biomasse ausgetauscht werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Austausch der Grundmedien in zwischen den Fermen­ tern angeordneten Dialysestrecken vorgenommen wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegan­ genen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Grund­ medium (Grundmedium 1) des Mutationsfermenters (Fermenter 1) den abzubauenden Schadstoff enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mutationsfermenter (Fermenter 1) toxinstatisch ar­ beitet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mutationsfermenter (Fermenter 1) turbidostatisch arbeitet.