DE4035597A1 - If-zellkulturinkubationsplatte - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den Aufbau einer Zellkulturinkubationsplatte, die für den Einsatz im Immunofluoreszenztest (IF) geeignet ist.

Eine der wichtigsten Methoden in der Virologie ist der direkte Virusnachweis in Patientenmaterial. Als Voraussetzung für diese Methode benötigt man einen geeigneten Zellrasen, den man noch lange nach der Infektion in Erwartung des zytopathischen Effektes (CPE) betrachten kann. dieses morphologische Kriterium der Virusinfektion tritt jedoch nicht immer auf.

Nach einer gewissen Zeit, in Abhängigkeit von der Art des Virus nach Tagen bis Wochen, bzw. nach dem Auftreten des CPE folgt der zweite methodische Schritt: die Typisierung des Virus. Dazu wird meist als Neutralisationstest der sehr weit verbreitete Immunofluoreszenztest (IF) eingesetzt, es könnte aber auch eine andere Technik genutzt werden.

Bei der Untersuchung einer größeren Menge von klinischem Material benutzt man bekannterweise zur Anzucht der Zellen anstelle der üblichen Roux-Flaschen Inkubationsplatten. Ein CPE tritt aber nie in allen Untersuchungsreihen gleichzeitig auf. Außerdem lassen sich zum Typisieren nicht die zuerst erschienenen Zellen mit CPE einsetzen, weil sie nur sehr schwer direkt für den IF-Test zu gewinnen sind.

Es sind drei Methoden zur Vorbereitung von Präparaten von infizierten Zellkulturen für die Immunofluoreszenztechnik bekannt. Die älteste Methode ist die Anzüchtung von diploiden humanen embryonalen Fibroblasten auf Deckgläschen, die in 25 ml Roux-Flaschen mit breitem Hals lagen. Nach dem Anwachsen der Fibroblasten konnte man den Rasen mit dem Virus infizieren und warten, bis ein zytopathischer Effekt auftrat. Dann wurden die Deckgläschen entnommen, getrocknet und fixiert, auf die passende Größe geschnitten und auf Objektivträger geklebt. Diese Vorbereitung erfordert viel Zeit und präzise Handarbeit. Die zweite Methode ist für die Vorbereitung von großen Mengen von Objektträgern entwickelt worden. Mit einer Schablone werden auf die Oberfläche von Objektträgern Glyzerintropfen in zwei Reihen aufgebracht und dann mittels Spray ein PTFE-Film aufgetragen. Der Film wird getrocknet, das Glyzerin abgewaschen und die Objektivträger sind bereits zur Zellbesiedlung, die durch Auftragen einzelner Tropfen Inkubationsmedium auf PTFE- freie Flächen erfolgt. Die weitere Bearbeitung erfolgt wie bei der ersten Methode.

Als dritte Methode werden handelsübliche mit buntem Lack beschichtete Objektträger verwendet, die, wie in der zweiten Methode beschrieben, lackfreie Flächen enthalten, die für die Zellanzucht geeignet sind.

Die Methoden 2 und 3 sind nur für kurze Inkubationszeiten von 1-2 Tagen geeignet, weil ein Tropfen Medium sogar in feuchtigkeitsgeregelten Brutschränken sehr schnell verdunstet. Die sonst für die Zellzucht gut geeigneten "96 wells Inkubationsplatten" können für Immunfluoreszenzuntersuchungen nicht benutzt werden, weil Fluoreszenzmikroskope große Objektive haben, die möglichst nah am Objekt stehen müssen. Letztere passen jedoch nicht in die Vertiefungen der Wells.

Ziel der Erfindung ist es, die langzeitige Inkubation von Zellen in einem größeren Volumen von Zellzuchtmedium zu gewährleisten mit der Möglichkeit, später die Zellrasen ohne räumliche Behinderung für Objektive eines Fluoreszenzmikroskops im Immunfluoreszenztest zu betrachten. Diese Platten sollen außerdem die Möglichkeit bieten, beim Einsatz größerer Serien die einzelnen Reihen zu bearbeiten, ohne die Inkubationsbedingungen der anderen Reihen zu beeinflussen.

Aufgabe der Erfindung ist es, solche Bedingungen zu schaffen, daß Zellen während ihres Wachstums und der Infektion wie in bekannten Inkubationsplatten betrachtet und später die gleichen Zellen im Immunofluoreszenztest beurteilt werden können. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die vertikalen Wände der Grundplatte durch eine konstruktive Möglichkeit entfernt werden können. Das Anbringen der vertikalen Wände an die Grundplatte läßt sich technologisch unterschiedlich gestalten: durch dünne Stege, durch Ankleben, durch Schweißen. Ihre Entfernung erfolgt entsprechend der Technologie durch Brechen oder Abreißen.

Die zweite Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung einer Möglichkeit dafür, die einzelnen Reihen von Inkubationskammern zu untersuchen, ohne die Bedingungen in den anderen Inkubationskammern zu beeinflussen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Inkubationskammern nach Durchtrennung der entsprechenden Verbindungsbrücken über den Reißkanälen der benötigten Trennstrecke auf der Grund- und Deckplatte reihenweise abgebrochen werden.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, daß auf der IF-Zellkulturinkubationsplatte langzeitige Inkubationen von Zellrasen und deren Kontrolle unter dem Lichtmikroskop jederzeit möglich ist. Durch die einzelne Abdeckung der Inkubationskammern werden die Verdunstung von Inkubationsmedium und die Kontaminationsgefahr wesentlich reduziert. Durch die konstruktive Möglichkeit, die Inkubationskammern reihenweise von der IF-Zellkulturinkubationsplatte abzutrennen, kann klinisches Material rationell an unterschiedlichen Tagen und unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden.

Durch die entfernbaren vertikalen Wände der Inkubationskammer ist die Betrachtung der Zellrasen im Fluoreszenzmikroskop auch nach langzeitiger Inkubation möglich.

Zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und nachfolgend näher beschrieben. Es zeigen Fig. 1a einen Querschnitt durch die Bruchplatte und Fig. 1b eine Draufsicht der Bruchplatte nach Fig. 1a. Die Bruchplatte nach Fig. 1a und 1b besteht aus einer Grundplatte 1 und der Deckplatte 7.

Auf der festen und durchsichtigen Grundplatte 1 sind erhabene kreisförmige oder rechteckige Inkubationsflächen 2 angelegt. Die Inkubationsflächen 2 sind von einer vertikalen Wand 3 so umgeben, daß der Steg 4 zwischen Inkubationsfläche 2 und Wand 3 äußerst dünn ist. Die Unterseite der Grundplatte 1 ist so geformt, daß die Grundplatte 1 zwischen den Inkubationsflächen 2 durch Reißkanäle 5 unterteilt ist, die Verbindungsbrücken 6 haben. Ebenso ist auch die Oberfläche der Deckplatte 7 aufgebaut. Die Unterseite der Deckplatte 7 hat festsitzende vertikale Wände 8, die die Vertikalwände 3 der Inkubationsflächen 2 umschließen. Die Deckplatte 7 ist von der Grundplatte 1 abnehmbar, sie gewährleistet die Sterilität der Inkubationskammer 9 und reduziert extrem die Verdunstung.

Die Inkubationskammern 9 werden wie üblich mit Zellen besiedelt. Nachdem der Zellrasen geschlossen ist, was durch mikroskopische Betrachtung kontrolliert wird, wird er mit Versuchsmaterial beimpft, bebrütet und unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Die einzelnen Reihen von Inkubationskammern 9 kann man jetzt an unterschiedlichen Tagen bearbeiten und auch verschiedenes Material gleichzeitig auf einer Platte untersuchen. Durch doppelte Abgrenzung der Inkubationsflächen 2 mittels vertikaler Wände 3 (an der Grundplatte) und 8 (an der Deckplatte) wird nicht nur die Verdunstung extrem reduziert, sondern auch die Kontaminationsgefahr. Zur weiteren Untersuchung kann man die einzelnen Reihen von Inkubationskammern 9 von der Bruchplatte trennen. Dazu zerbricht man die entsprechenden Verbindungsbrücken 6 über den Reißkanälen 5 der benötigten Trennstrecke auf der Unterseite der Grundplatte 1 und auf der Oberseite der Deckplatte 7 und bricht die Platte über einer Tischkante wie eine Schokoladentafel ab. Danach werden die Zellen getrocknet, fixiert und mit den notwendigen Chemikalien inkubiert. Vor der Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop müssen die vertikalen Wände entfernt werden. Durch kräftiges Drücken auf die Wände 3 wird der Steg 4 zerbrochen und die vertikalen Wände 3 können abgenommen werden. Dadurch wird die Platte 1 so flach wie normale Objektträger, was die sofortige problemlose Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop ermöglicht.

Die halbfeste Platte nach Fig. 2a (Querschnitt) und Fig. 2b (Draufsicht) hat rechteckige oder runde Inkubationsflächen, die im Gegensatz zur Bruchplatte nach Fig. 1a und 1b nicht erhaben sind.

Die Inkubationsflächen 2 der Inkubationskammer 9 sind durch vertikale Wände 3 voneinander getrennt. Die Vertikalwände 3 sind durch Ankleben oder Schweißen an der Grundplatte befestigt, sie sind aus flexiblem Material und lassen sich von der Grundplatte 1 abreißen oder abziehen.

Der Aufbau der Deckplatte 7 und der Unterseite der Grundplatte 1 ist mit deren Aufbau bei der Bruchplatte identisch, beide haben die gleichen Reißkanäle 5 mit den Verbindungsbrücken 6. Dadurch ist die Möglichkeit gegeben, die einzelnen Reihen von Inkubationskammern 9 von der Platte abzubrechen und einzeln zu bearbeiten.

Es ist empfehlenswert, die Platten in drei Versionen herzustellen:

• 1. 2 _* 6 Inkubationsflächen mit jeweils 5 mm Durchmesser ohne Reißkanäle
• 2. 4 _* 6 Inkubationsflächen mit jeweils 16 mm Durchmesser mit Reißkanälen
• 3. 8×12 Inkubationsflächen mit 5 mm Durchmesser mit Reißkanälen

Claims (2)

1. IF-Zellkulturinkubationsplatte mit Inkubationsflächen (2), gekennzeichnet dadurch, daß die vertikalen Wände (3) zwischen den Inkubationsflächen (2) entfernbar sind und daß die Reißkanäle (5) mit Verbindungsbrücken (6) auf der Grundplatte (1) und der Deckplatte (7) angebracht sind.

2. IF-Zellkulturinkubationsplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Reihen von Inkubationsflächen (2) von der Grundplatte (1) abzutrennen sind, ohne daß die Sterilität gefährdet oder die Bedingungen in den anderen Inkubationskammern (9) verändert werden.