DE4030191A1 - Waschvorrichtung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren, mit denen an einer Platte befestigte Stäbe mit Flüssigkeiten, bei­ spielsweise mit Waschpufferlösungen oder organischen Lösungs­ mitteln, gewaschen werden können oder mit denen man chemische oder biochemische Reagenzien auf die Stäbe einwirken lassen kann. Die Erfindung ist beispielsweise zur Anwendung bei Pep­ tidsynthesen und immunologischen Bestimmungsverfahren geeig­ net.

Nach dem Stand der Technik ist es bekannt, Peptide so zu syn­ thetisieren, daß eine erste Aminosäure auf eine feste Oberflä­ che kovalent gebunden wird, worauf eine zweite Aminosäure mit der ersten Aminosäure unter Bildung einer Peptidbindung umge­ setzt wird. Dies wird so lange fortgesetzt, bis das gewünschte Peptid erhalten worden ist. Dieses Verfahren ist beispiels­ weise in dem Aufsatz von R. Merrifield in J. Am. chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) beschrieben.

Es wurden Verfahren entwickelt, bei denen ein Peptid auf den Köpfen von Polyethylenstäben, die an einer Platte befestigt sind, synthetisiert wird. Dabei werden bestimmte Stufen in der Synthese, beispielsweise die Entfernung von Schutzgruppen und Wäschen, durch Waschen bzw. Spülen der Köpfe der Stäbe in Becken durchgeführt, die ein Reagenz oder eine Waschlösung enthalten.

Die Stäbe mit den daran gebundenen Peptiden können direkt wei­ terverwendet werden, beispielsweise bei immunologischen Be­ stimmungsverfahren. Auch in solchen Fällen wird eine Wäsche bzw. Spülung in einem Becken durchgeführt. Die an die Peptide gebundenen Moleküle werden ebenfalls durch Waschen bzw. Spülen der Stäbe in Becken entfernt.

Ein Nachteil der vorstehend beschriebenen Anordnung ist der hohe Verbrauch an teueren Reagenzien.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, den Ver­ brauch an diesen Reagenzien und dadurch auch die Kosten zu senken.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die in den Patentan­ sprüchen angegebenen Merkmale gelöst.

Ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, daß der zu waschende Stab in eine Rinne verbracht wird und Wasch- oder Reaktionsflüssigkeit durch die Rinne geführt wird. Am besten läßt man die Flüssigkeit in den Rinnen während des Waschvor­ ganges vor- und zurückfließen.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Vorrichtung mit einer Ventilanordnung verbunden, mit deren Hilfe die Ver­ mischung von Waschflüssigkeiten oder von Flüssigreaktions­ fluiden, die eine nach der anderen zugemessen werden sollen, vermieden wird.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher er­ läutert.

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht einer Waschvorrich­ tung und einer mit Stäben versehenen Platte, von oben gesehen,

Fig. 2 ist ein Querschnitt durch ein Becken und eine daran angepaßte und in dasselbe eingeführte Platte und

Fig. 3 ist eine schematische Darstellung eines in Verbindung mit der Waschvorrichtung verwendbaren Reagenzien­ systems.

Erfindungsgemäß werden die an der Platte angeordneten Kunst­ stoffstäbe mit Lösungen behandelt. Die Stäbe werden an der Platte befestigt, beispielsweise in einer Matrix, die einer gewöhnlichen 8×12 Mikrotitrationsplatte entspricht.

Die Waschvorrichtung umfaßt Rinnen, in die die Köpfe der Stäbe verbracht werden. Mindestens an den Stellen der Stäbe sind die Rinnen etwas breiter als der Dicke der Stäbe entspricht, damit die Waschflüssigkeit um die Stäbe herum und an ihnen vorbei fließen kann. Die Abstände, Anzahl und Länge der Rinnen hängt natürlich von der Art der verwendeten Platte ab, von der An­ zahl der Platten und von der Art und Weise, in der die Platten in der Vorrichtung angeordnet werden sollen.

Man läßt die Lösungen vorzugsweise durch eine gemeinsame Ver­ teilungskammer in die Rinnen fließen. In entsprechender Weise befindet sich am anderen Ende der Rinnen vorzugsweise eine ge­ meinsame Abführungskammer. Die Flüssigkeit wird in die Vertei­ lungskammer zugemessen, von wo sie durch die Rinnen in die Ab­ führungskammer geführt wird.

Von der Abführungskammer kann die Flüssigkeit, falls ge­ wünscht, in die Verteilungskammer zurückgeführt bzw. umgewälzt werden. Am besten wird die Lösung jedoch zwischen der Vertei­ lungskammer und der Abführungskammer so lange hin- und herge­ führt, bis die Lösung über die gewünschte Zeitspanne hinweg auf die Stäbe eingewirkt hat.

Um die Wäsche bzw. Spülung der Stäbe zu intensivieren, können die Rinnen mit Turbulenz erzeugenden Mitteln versehen werden.

Gewünschtenfalls können die Rinnen mit Hilfe von Querrinnen untereinander verbunden werden.

Die Arbeitsweise der Vorrichtung wird am besten mit Hilfe ei­ nes Computers gesteuert.

Das Becken kann mit einem Detektor zur Überwachung des Spie­ gels der Waschflüssigkeit versehen werden, wodurch der Wasch­ vorgang mittels der von dem Überwachungsdetektor abgegebenen Signale gesteuert und kontrolliert werden kann.

Durch die Erfindung kann die zum Waschen bzw. Spülen erforder­ liche Lösungsmenge im Vergleich mit einer herkömmlichen Wäsche in einem Becken beträchtlich verringert werden. Als weiterer Vorteil wird eine Wäsche bzw. Spülung aller Stäbe von größt­ möglicher Gleichmäßigkeit erzielt, da die Strömungsbedingungen bei jedem der Stäbe identisch sind. Darüber hinaus kann durch erhöhte Strömungsgeschwindigkeit und Turbulenz die Waschdauer kürzer gehalten bzw. das Ergebnis verbessert werden.

Die Hauptteile der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung sind der Sockel 1, das Waschbecken 2 und das Reagenzsystem 3.

Das Waschbecken umfaßt zwölf Waschrinnen 4. In das Becken kön­ nen fünf Platten 5 gleichzeitig zur Behandlung eingestellt werden, wobei jede Platte 8×12 Stäbe 6 aufweist.

Die Rinnen 4 sind mit je einem Waschschacht 7 für jeden Stab versehen, wobei der Durchmesser des Schachtes etwas größer ist als der Durchmesser des Stabes 6. Zwischen den Schächten sind die Rinnen etwas enger als die Stäbe. Auf diese Weise kann die zum Füllen der Rinne erforderliche Lösungsmenge gering gehal­ ten werden. Die Waschschächte erzeugen außerdem Turbulenz, wo­ durch die Wäsche bzw. Spülung der Stäbe verbessert wird.

An den Eingangsenden der Rinnen 4 befindet sich eine gemein­ same Verteilungskammer 8, aus der die Lösung in die Rinnen fließt. Andererseits befindet sich an den Ausgangsenden der Rinnen eine gemeinsame Abführungskammer 9, aus der die ver­ brauchte Flüssigkeit durch die Rohrleitung 10 entfernt werden kann. Die Lösung fließt von dem Reagenzsystem durch das Zu­ leitungsrohr 11 in die Verteilungskammer 8.

Das Waschbecken kann mittels eines Klappdeckels 12 verschlos­ sen werden. Der Deckelrand ist mit einer Dichtung 13 versehen. Auf diese Weise kann der Waschraum luftdicht verschlossen wer­ den und, falls nötig, kann die Wäsche bzw. Spülung beispiels­ weise unter einer Inertgasphase durchgeführt werden.

Das Waschbecken ist mit dem Sockel über einen Bewegungsmecha­ nismus 5 verbunden. Mittels des Bewegungsmechanismus kann die Neigung des Beckens in Längsrichtung der Rinnen verändert wer­ den, wodurch die Lösung gezwungen wird, in den Rinnen hin und her zu fließen. Bei der in der Zeichnung wiedergegebenen Vor­ richtung ist das Waschbecken schwenkbar auf dem Sockel im Be­ reich der Eingangsenden der Rinnen befestigt, aber es ist na­ türlich ebenfalls möglich, andere Anordnungen zu verwenden, um die Rinnen in eine bestimmte Neigung zu versetzen.

Mit dem Abflußrohr 10 des Beckens ist ein vertikaler Seitenarm 14 verbunden, der mit einem Füllstandssensor 15 versehen ist. Während des Waschvorgangs wird das Abflußrohr verschlossen, wodurch der Flüssigkeitsspiegel in dem Nebenarm auf derselben Höhe steht wie in dem Becken. In der ersten Waschstufe wird das Abflußende des Beckens abgesenkt, wodurch die Lösung zum Abflußende strömt und der Flüssigkeitsspiegel in dem Nebenarm ansteigt. Wenn der Flüssigkeitsspiegel eine bestimmte Höhe er­ reicht hat, gibt der Sensor ein Signal zur Umkehrung der Nei­ gungsrichtung. Wenn in entsprechender Weise der Flüssigkeits­ spiegel auf eine bestimmte Höhe abgesenkt wird, wird die Nei­ gungsrichtung wieder umgekehrt. Nach der gewünschten Wasch­ dauer oder der gewünschten Anzahl von Neigungsänderungen wird die Lösung aus dem Becken entfernt.

Bei der Vorrichtung gemäß Fig. 2 sind die Führungsstäbe 16 an den Enden der Platten zu sehen, die in entsprechende Ausneh­ mungen 17 passen, die im Becken vorgesehen sind. Die Führungs­ stäbe stützen die Platte in der Weise ab, daß die Köpfe 18 der Stäbe 6 nicht mit den Schachtböden in Berührung kommen. Die Führungsstäbe verhindern außerdem Bewegungen der Platte wäh­ rend der Neigungsphasen.

Fig. 3 zeigt ein Reagenzsystem, wie es beispielsweise bei ei­ ner Peptidsynthese Verwendung findet, worin die Reagenzien A, B und C mittels des Druckes eines Inertgases 19 (hier Stick­ stoff) in das Einlaßrohr 11 des Waschbeckens geleitet werden können.

Am Ende des Einlaßrohrs 11 befindet sich ein Ventil 20, durch welches Gas alleine in das Einlaßrohr eingeleitet werden kann. Als nächstes befindet sich in dem Einlaßrohr ein Dreiwegehahn 21, durch welchen Gas oder eine vom Ventil 20 kommende Lösung oder das Reagenz A in das Rohr fließt. In entsprechender Weise kann durch die Dreiwegehähne 22 und 23 entweder Gas vom vor­ hergehenden Hahn oder die Reagenzien B oder C geleitet werden. In entsprechender Weise ist es natürlich auch möglich, eine größere Anzahl von Behältern mit Reagenzien an das System an­ zuschließen. Wenn nötig, kann das ganze Einlaßrohr mit Hilfe von Gas gespült und von Reagenzien befreit werden. Mit dieser Anordnung ist es möglich, das jeweils zu einer bestimmten Zeit erforderliche Reagenz in das Einlaßrohr einzuspeisen, ohne es mit anderen Reagenzien, die in dem Rohrsystem etwa zurückblei­ ben können, zu vermischen.

Der Gasdruck und ebenso die Zumeßrate der Reagenzien können mittels eines Druckminderventils 24 eingestellt werden. Die Vorrichtung umfaßt außerdem ein Absperrventil 25.

Bei einer Peptidsynthese ist es möglich, Aminosäuren als Aus­ gangsmaterial zu verwenden, die mit F-moc (9-Fluorenyl­ methyloxycarbonyl)-Schutzgruppen geschützt sind. Wenn die er­ findungsgemäße Vorrichtung verwendet wird, wird das folgende Waschverfahren zu Beginn jedes Synthese-Zyklus durchgeführt:

• - 1×130 ml DMF (Dimethylformamid), 5 Minuten schütteln
• - 4×130 ml Methanol, 2 Minuten schütteln
• - 1×130 ml DMF, 5 Minuten schütteln
• - 1×90 ml 20%-Piperidin in DMF, 30 Minuten
• - 2×130 ml DMF, 5 Minuten schütteln
• - 4×130 ml Methanol, 2 Minuten schütteln
• - Stickstoff-Trocknen, 15 Minuten
• - 2×130 ml DMF, 5 Minuten schütteln.

Nach Fertigstellung der Synthese können die endständigen Ami­ nogruppen acetyliert werden, wobei das folgende Verfahren an­ gewandt wird:

• - 90 ml DMF : Acetanhydrid : Diisopropylethylamin (v/v/v = 50 : 5 : 1), 90 Minuten schütteln
• - 1×130 ml DMF, 2 Minuten schütteln
• - 4×130 ml Methanol, 2 Minuten schütteln
• - Stickstoff-Trocknen, 15 Minuten.

Zum Entfernen der Seitenkettenschutzgruppen wird das folgende Verfahren angewandt:

• - 90 ml TFA : Phenol : Ethandithiol (v/v/v = 95 : 2,5 : 2,5), 4 Stunden
• - 2×130 ml 5%-Diisopropylethylamin/Dichlormethan, 5 Minu­ ten schütteln
• - Stickstoff-Trocknen, 15 Minuten
• - 2×130 ml destilliertes Wasser, 5 Minuten schütteln.

Schließlich werden die Stäbe in einem Methanolbad 18 Stunden lang gehalten.

Das von Virusproteinen abgeleitete Peptid kann zur Bestimmung entsprechender Anti-Virus-Antikörper mittels EIA verwendet werden. Hierfür wird beispielsweise das folgende Waschverfah­ ren angewandt:

• - 90 ml verdünntes Antiserum, 4 Stunden schütteln
• - 8×130 ml Waschpufferlösung
• - 90 ml alkalische Phosphatase conjug. Anti-Ig, 2 Stunden schütteln
• - 8×130 ml Waschpufferlösung, 5 Minuten schütteln.

Schließlich werden die Stäbe dem Substrat in einer Mikrotitra­ tionsplatte unterworfen, und die Messung wird durchgeführt.

Wenn an Peptid gebundene Proteine entfernt werden, kann das folgende Verfahren angewandt werden:

• - 6×90 ml Spaltpufferlösung, 10 Minuten schütteln
• - 4×130 ml destilliertes Wasser, 10 Minuten schütteln
• - 4×130 ml Methanol, 10 Minuten schütteln
• - 4×130 ml destilliertes Wasser, 10 Minuten schütteln.

Claims (14)

1. Waschvorrichtung zum Waschen von an einer Platte in Reihen befestigten Stäben mittels einer Wasch- oder Reagenzlösung, gekennzeichnet durch

• - ein Waschbecken, das mit je einer Rinne (4) für jede Reihe von Stäben versehen ist, in welche Rinne die Reihe von Stäben eingebracht werden kann, so daß Waschlösung durch die Rinne und an den Stäben vorbeigeführt werden kann,
• - Mittel zur Zuführung der Waschlösung in die Rinnen sowie
• - Mittel zum Entfernen der Waschlösung aus den Rinnen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den Rinnen den Stäben zugewandte Mittel (7) zur Erzeugung von Turbulenz oder zur Intensivierung von Turbulenz in der Strö­ mung der Waschlösung im Bereich der Stäbe vorgesehen sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rinnen Löcher (7) mit einem etwas größeren Durchmesser als demjenigen der Stäbe sowie engere Verbindungsbereiche umfas­ sen.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeich­ net durch Mittel zur Umwälzung der Waschlösung oder zum Hin- und Herführen der Lösung in den Rinnen.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Mittel (5), mit denen dem Becken in Längsrichtung der Rinnen unter­ schiedlich gerichtete Neigungen verliehen werden können.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeich­ net durch einen Sensor (15) zum Überwachen des Flüssigkeits­ spiegels der Waschflüssigkeit.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, gekennzeichnet durch Mittel (5) zur Umkehrung der Richtung der Neigung in Abhängig­ keit von dem Flüssigkeitsspiegel.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Becken mittels eines Klappdeckels (12) luftdicht verschlossen werden kann, sowie dadurch, daß die Vorrichtung Mittel (19) zur Erzeugung einer Inertgasphase in dem Becken umfaßt.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie zur Zuführung der Waschlösung in die Rinnen eine Einlaßrohrleitung (11) aufweist, die mit einem ersten Dreiwegehahn (21) versehen ist, von welchem ein Weg mit einem ersten Waschlösungsbehälter verbunden werden kann, wäh­ rend ein zweiter Weg über ein Absperrventil (20) mit einem Be­ hälter verbunden werden kann, der Inertgas oder Flüssigkeit zur Reinigung der Einlaßrohrleitung enthält.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einlaßrohrleitung (11) einen zweiten Dreiwegehahn (22) aufweist, von dem ein Weg mit dem ersten Dreiwegehahn (21) verbunden werden kann, während ein zweiter Weg mit einem zwei­ ten Behälter mit Waschflüssigkeit verbunden werden kann.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekenn­ zeichnet durch Mittel zum Hindurchführen der Waschlösung durch die Rinnen, wobei diese Mittel mit unter Druck stehendem Gas betrieben werden.

12. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 11, dadurch gekennzeich­ net, daß unter Druck stehendes Gas (19) sowohl zum Hindurch­ führen der Waschlösung als auch zum Reinigen der Einlaßrohr­ leitung verwendet wird.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekenn­ zeichnet durch Führungsmittel (16, 17) zum Halten der Platte in ihrer korrekten Lage in dem Becken.

14. Verfahren zum Waschen bzw. Spülen von an einer Platte in Reihen angeordneten Stäben mit einer Lösung, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Platte in ein Becken verbracht wird, das je eine Rinne für jede Reihe von Stäben aufweist, und daß Wasch­ lösung so durch die Rinne geführt wird, daß sie an den Stäben vorbeifließt.