FI84764C - Spolningsanordning. - Google Patents

Description

1 84764

HUUHTELUT ATTTETSTO

Keksintö kohdistuu laitteistoon ja menetelmään, jonka avulla levyyn kiinnitettyjä tappeja voidaan pestä nesteillä kuten pesupuskureilla tai orgaanisilla liuoksilla tai antaa 5 kemiallisten tai biokemiallisten reagenssien vaikuttaa tappeihin. Keksintö soveltuu käytettäväksi esimerkiksi peptidisynteeseissä ja immunologisissa määritysmenetelmissä.

On tunnettua syntetisoida peptidejä siten, että ensimmäinen aminohappo kiinnitetään kovalenttisesti kiinteälle pinnalle, 10 minkä jälkeen toisen aminohapon annetaan reagoida ensimmäisen kanssa peptidisidoksen muodostamiseksi. Näin jatketaan kunnes on saatu haluttu peptidi. Menetelmää on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Merrifield, R. , J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963).

15 On kehitetty menetelmiä, joissa peptidiä syntetisoidaan levyyn kiinnitettyjen polyetyleenitappien päihin. Synteesin tietyt vaiheet kuten suojaryhmien poisto ja pesut suoritetaan tällöin huuhtelemalla tappien päitä reagenssia tai pesuliuosta sisältävissä altaissa.

20 Tappeja niihin kiinnitettyine peptideineen voidaan suoraan käyttää esimerkiksi immunologisissa testimenetelmissä. Tällöinkin käytetään allaspesuja. Peptideihin sitoutuneet molekyylit myös poistetaan tappeja altaissa pesemällä.

Eräs edellä kuvatun järjestelyn haitta on kalliiden 25 reagenssien suuri kulutus.

Tämän keksinnön tarkoituksena onkin vähentää näiden reagenssien kulutusta ja siten alentaa kustannuksia.

Keksinnön tarkoitus aikaansaadaan patenttivaatimuksissa esitetyin keinoin.

30 Keksinnössä on olennaista, että huuhdeltava tappi sijoite taan kanavaan ja kanavan läpi johdetaan pesu- tai reaktiones-tettä. Parhaiten nestettä johdetaan kanavissa huuhtelun aikana edestakaisin.

Erään suoritusmuodon mukaan laitteistoon liittyy vent-.35 tiilijärjestely, jonka avulla peräkkäin annosteltavien pesu-tai reaktionesteiden toisiinsa sekoittuminen estetään.

Selityksen erityiseen osaan liittyvissä piirustuksissa kuvio 1 esittää perspektiivikuvana huuhtelulaitteistoa ja 2 84764 tappilevyä ylhäältä päin katsottuna, kuvio 2 esittää altaan ja siihen sijoitetun levyn poikkileikkausta ja kuvio 3 esittää kaavamaisesti pesulaitteiston yhteydessä käyttökelpoista reagenssijärjestelmää.

5 Keksinnön mukaisesti levyyn kiinnitettyjä muovitappeja käsitellään liuoksilla. Tapit on kiinnitetty levyyn esim. tavanomaista 8 x 12 mikrotitrauslevyä vastaavaan matriisiin.

Huuhtelulaitteistossa on kanavia, joihin tappien päät asetetaan. Kanavat ovat ainakin tappien sijoituskohdista 10 hieman tappien paksuutta leveämpiä, jotta huuhteluneste pääsee virtaamaan tappien ohi. Kanavien etäisyys, lukumäärä ja pituus riippuvat luonnollisestikin siitä, millainen on käytettävä levy ja montako ja miten niitä on tarkoitettu laitteeseen asetettavaksi.

15 Liuokset johdetaan kanaviin parhaiten yhteisen jakotilan kautta. Vastaavasti kanavien toisessa päässä on parhaiten yhteinen poistotila. Nestettä annostellaan jakotilaan, josta se kulkeutuu kanavien läpi poistotilaan.

Poistotilasta liuosta voidaan haluttaessa kierrättää ta-20 kaisin jakotilaan. Parhaiten kuitenkin liuosta johdetaan kanavien kautta edestakaisin jako- ja poistotilaan välillä kunnes liuos on vaikuttanut tappeihin halutun ajan.

Kanavissa voi olla huuhtelun tehostamiseksi tappien kohdalla turbulenssia aikaansaavia elimiä.

25 Haluttaessa kanavia voidaan yhdistää toisiinsa poikit- taiskanavien avulla.

Laitteen toimintaa ohjataan parhaiten tietokoneen avulla.

Altaaseen voidaan liittää huuhtelunesteen pinnankorkeuden tarkkailuanturi, jonka antamien signaalien avulla huuhtelu-30 prosessia voidaan ohjata.

Keksinnön avulla saadaan huuhteluun tarvittavan liuoksen määrää huomattavasti vähennetyksi tavanomaiseen allashuuhte-luun verrattuna. Lisäetuna saavutetaan kaikkien tappien mahdollisimman samanlainen huuhtelu, kun virtausolosuhteet kul-35 lekin tapille ovat samanlaiset. Lisäksi voidaan suuremman virtausnopeuden ja turbulenssin avulla lyhentää huuhteluai-kaa tai parantaa lopputulosta.

Kuvion 1 mukaisen laitteiston pääosat ovat alusta 1, 3 84764 huuhteluallas 2 sekä reagenssijärjestelmä 3.

Huuhtelualtaassa on kaksitoista huuhtelukanavaa 4. Altaaseen voidaan asettaa kerrallaan käsiteltäviksi viisi levyä 5, joissa on 8 x 12 tappia 6.

5 Kanavissa 4 on kutakin tappia varten huuhtelukaivo 7, jonka halkaisija on hieman suurempi kuin tapin 6. Kaivojen välillä kanavat ovat tappeja kapeampia. Näin saadaan kanavan täyttämiseen tarvittava liuosmäärä pieneksi. Huuhtelukaivot myös aikaansaavat turbulenssia parantaen siten tappien huuh-10 telua.

Kanavien 4 alkupäässä on yhteinen jakotila 8, josta liuos virtaa kanaviin. Kanavien loppupäässä taas on yhteinen pois-totila 9, josta käytetty neste voidaan poistaa putken 10 kautta. Jakotilaan 8 liuos johdetaan reagenssijärjestelmästä 15 tuloputken 11 kautta.

Huuhteluallas on suljettavissa kannella 12. Kannen reuna on varustettu tiivisteellä 13. Näin saadaan huuhtelutila suljetuksi ilmatiiviisti ja huuhtelu voidaan tarvittaessa suorittaa esim. inertissä kaasutaasissa.

20 Huuhteluallas on kiinnitetty alustaan liikuttelukoneiston 5 välityksellä. Liikuttelukoneiston avulla voidaan altaan kaltevuutta kanavien pituussuunnassa muuttaa ja siten saada liuos virtaamaan kanavissa edestakaisin. Kuvion mukaisessa laitteessa huuhteluallas on saranoitu alustaan kanavien al-25 kupään kohdalta, mutta luonnollisesti voidaan käyttää myös muunlaisia järjestelyjä kanavien kallistamiseksi.

Altaan poistoputkeen 10 on liitetty pystysuora sivuhaara 14 ja siihen pintasensori 15. Poistoputki on huuhtelun aikana kiinni, jolloin nestepinta sivuhaarassa on samalla kor-30 keudella kuin altaassa. Huuhtelun ensimmäisessä vaiheessa altaan loppupäätä lasketaan, jolloin liuos virtaa poistopää-hän ja pinta sivuputkessa nousee. Kun pinta on saavuttanut tietyn tason, antaa sensori signaalin kallistussuunnan vaihtamiseksi. Vastaavasti nestepinnan laskiessa tietylle 35 tasolle vaihdetaan kallistussuuntaa. Halutun huuhteluajan tai kallistelukertojen jälkeen liuos poistetaan altaasta.

Kuvion 2 mukaisessa järjestelyssä nähdään lisäksi levyn päihin sijoitetut ohjainsauvat 16, jotka vastaavat altaassa 4 84764 oleviin koloihin 17. Ohjainsauvat kannattavat levyä siten, etteivät tappien 6 päät 18 ota kiinni kaivojen pohjaan. Sauvat myös estävät levyn liikkumisen kallistelun aikana.

Kuvio 3 esittää esim. peptidisynteesissä käytettävää rea-5 genssijärjestelyä, jossa reagensseja A, B ja C voidaan johtaa inertin kaasun 19 (tässä typen) paineen avulla huuhtelu-altaan tuloputkeen 11.

Tuloputken 11 päässä on venttiili 20, jonka kautta tulo-putkeen voidaan johtaa pelkkää kaasua. Seuraavana tuloput-10 kessa on kolmitieventtiili 21, jonka kautta tuloputkessa virtaa kaasua tai liuosta venttiililtä 26 tai putkeen johdetaan reagenssia A. Vastaavalla tavalla kolmitieventtiilien 22 ja 23 kautta voidaan johtaa kaasua edelliseltä venttiililtä tai reagenssia B tai vast. C. Vastaavalla tavalla voi-15 daan järjestelmään luonnollisesti kytkeä useampiakin rea-genssipulloja. Tarvittaessa koko tuloputki voidaan kaasun avulla puhdistaa reagensseista. Tällä järjestelyllä saadaan tuloputkeen kulloinkin tarvittavaa reagenssia ilman että se lainkaan sekoittuu putkistoihin jäävien muiden reagenssien 20 kanssa.

Kaasun painetta ja siten myös reagenssin annostelunopeut-ta voidaan säätää paineenalennusventtiilin 24 avulla. Lisäksi järjestelyssä on sulkuventtiili 25.

Peptidisynteesissä voidaan käyttää lähtöaineena F-moc 25 (9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli) -suojattuja aminohappo ja. Piirustuksen mukaista laitetta käytettäessä suoritetaan kunkin synteesisyklin alussa seuraava huuhteluproseduuri.

1 x 130 ml DMF (dimetyyliformamidi), 5 min.

4 x 130 ml metanoli, 2 min.

30 - 1 x 130 ml DMF, 5 min.

1 x 90 ml 20 % piperidiini-DMF, 30 min.

- 2 x 130 ml DMF, 5 min.

4 x 130 ml metanoli, 2 min. typpikuivaus, 15 min.

35 - 2 x 130 ml DMF, 5 min.

Synteesin jälkeen aminoterminaalit voidaan asetyloida, jolloin käytetään seuraavaa proseduuria: 90 ml DMF:etikkahappoanhydridi:di-isopropyylietyyli- 5 84764 amiini (V:V:V = 50:5:1), 90 min.

1 x 130 ml DMF, 2 min.

4 x 130 ml metanoli, 2 min. typpikuivaus, 15 min.

5 Sivuketjun suojaryhmiä poistettaessa käytetään seuraavaa proseduuria: 90 ml TFA:fenoli:etaaniditioli (V:W:V = 95:2,5:2,5), 4 h.

2 x 130 ml 5 % di-isopropyylietyyliamiini/diklorime-10 taani, 5 min.

- typpikuivaus, 15 min.

2 x 130 tislattu vesi, 5 min.

Lopuksi tappeja pidetään metanolissa 18 h.

Tappeihin kiinnitettyä viruksen proteiineista johdettua . . 15 peptidiä voidaan käyttää vasta-aineiden määrittämiseen EIA:n avulla. Tällöin käytetään esim. seuraavaa huuhteluproseduu-ria: - 90 ml laimennettu antiseerumi, 4 h 8 x 130 ml pesupuskuri 20 - 90 ml alkaliinifosfataasikonjugoitu anti-Ig, 2 h 8 x 130 ml pesupuskuri, 5 min.

Lopuksi tapit altistetaan substraatille mikrotitrausle-vyllä ja suoritetaan mittaus.

Peptidiin sitoutuneita proteiineja poistettaessa voidaan 25 käyttää seuraavaa proseduuria: 6 x 90 ml irrotuspuskuri, 10 min.

4 x 130 ml tislattu vesi, 10 min.

4 x 130 ml metanoli, 10 min.

4 x 130 ml tislattu vesi, 10 min.

Claims (10)

1. Huuhtelulaitteisto levyyn jonottain kiinnitettyjen tappien huuhtelemiseksi pesu- tai reagenssiliuoksella, jota laitteistoa käytetään esimerkiksi peptidisyntee-5 seissä ja immunologisissa määritysmenetelmissä, tunnettu siitä, että laitteistossa on - huuhteluallas, jossa on kullekin tappijonolle kanava (4) johon tappijono voidaan sijoittaa siten, että kanavassa voidaan tappien pään (18) ohi johtaa huuhtelu- 10 liuosta, laitteisto (8) huuhteluliuoksen johtamiseksi kanaviin, sekä laitteisto (9) huuhteluliuoksen johtamiseksi pois kanavista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laitteisto, tunnet tu siitä, että kanavissa on tappien kohdalla välineet (7) turbulenssin aikaansaamiseksi tai voimistamiseksi huuhteluliuoksen virtaukseen tappien kohdalle.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen laitteisto, tunnet- 20 tu siitä, että kanavat muodostuvat poikkileikkauk seltaan tappeja hieman suuremmista rei1istä (7) ja näitä yhdistävistä kapeammista kanavan osista.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että siinä on laitteisto huuhtelu- 25 liuoksen kierrättämiseksi tai edestakaisin johtamiseksi kanavien läpi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että siinä on laitteisto (5) altaan edestakaisin kallistamiseksi kanavien pituussuunnassa.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen laitteis to, tunnettu siitä, että siinä on sensori huuhtelunesteen pinnankorkeuden tarkkailemiseksi (15).

6 84764

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että allas on suljettavissa ilma- 3. tiiviisti kannella (12) ja että siinä on laitteisto (16) inertin kaasufaasin aikaansaamiseksi altaaseen.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen laitteis- 7 84764 to, tunnettu siitä, että laitteistossa huuhteluliuoksen johtamiseksi kanaviin on tulokanava (11) ja siinä ensimmäinen kolmihaaraventtiili (18), jonka yksi haara on yhdistetty ensimmäiseen huuhteluliuossäiliöön ja toinen 5 haara sulkuventtiilin (17) kautta inerttiä kaasua tai nestettä sisältävään säiliöön tulokanavan puhdistusta varten.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että siinä on paineistetun kaasun 10 avulla toimiva laitteisto (16) huuhteluliuoksen johtami seksi kanaviin.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että siinä on ohjauslaitteisto (16, 17. levyn pitämiseksi altaassa oikealla paikallaan. 15 β 84764