FR2652286A1 - Dispositif et procede de lavage des tiges attachees en rangees a une plaque dans un appareil de laboratoire. - Google Patents

Abstract

Selon le procédé de l'invention, on introduit des tiges (6) à laver, attachées par une extrémité à une plaque (5), dans des conduits (4) prévus en correspondance avec la disposition des tiges (6) dans une cuve de lavage (2), ces conduits (4) étant plus larges que les tiges (6) et étant raccordés entre eux par des passages plus étroits et on fait passer une solution de lavage à travers ces conduits autour desdites tiges (6), dans une seule direction ou alternativement dans les deux directions, pendant la durée désirée; ce dispositif est utilisable en particulier dans la synthèse des peptides et pour la mise en œuvre des méthodes de tests immunologiques.

Description

L'invention concerne un dispositif et un procédé grâce auxquels Jes tiges qui sont attachées à une plaque peuvent être lavées à l'aide de liquides comme des solutions tampons de lavage ou des solvants organiques, ou grâce auxquels des réactifs chimiques ou biochimiques peuvent être mis en contact avec les tiges pour agir sur elles. L'invention convient, par exemple, pour être utilisée dans la synthèse des peptides et dans l'application des méthodes de tests et d'analyses immunologiques.

Il est connu dans l'état de la technique de synthétiser des peptides pour qu'un premier amino-acide soit lié de manière covalente à une surface solide, après quoi un second amino-acide est mis à réagir avec le premier amino-acide pour la formation d'une liaison peptidique.

Ce processus est poursuivi jusqu'à ce que le peptide désiré ait été obtenu. Ce procédé est décrit, par exemple, dans l'articledeMerrifield, R., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154(1963)
Des méthodes ont été mises au point selon lesquelles un peptide est synthétisé sur des têtes de tiges en polyéthylène attachées à une plaque. Par ce moyen, certaines opérations de la synthèse, comme l'élimination de groupes de protection et des lavages, sont effectués par le lavage des têtes des tiges dans des cuves qui contiennent un réactif ou une solution de lavage.

Les tiges avec les peptides qui y sont liés peuvent être utilisées directement, par exemple en application de méthodes de tests immunologiques. Dans ces circonstances aussi, un lavage dans une cuve est employé. Les molécules liées aux peptides sont alors éliminées par le lavage des tiges dans des cuves.

Un inconvénient de l'arrangement décrit cidessus est la consommation élevée de réactifs coûteux.

Par conséquent le but principal de l'invention est de diminuer la consommation de ces réactifs et en conséquence, de diminuer le coût des méthodes prévoyant leur emploi.

L'invention atteint le but indiqué par le fait que, pour le lavage de tiges attachées en rangées à une plaque, le dispositif de lavage comprend une cuve de lavage ayant un conduit respectivement pour chaque rangée de tiges dans lequel la rangée de tiges peut être placée pour qu'unie solution de lavage puisse circuler autour des tiges introduites dans les conduits, un moyen servant à faire circuler la solution de lavage à travers les conduits et des moyens servant à éliminer la solution de lavage des conduits.

Selon le procédé de l'invention pour le nettoyage de tiges attachées en rangées à une plaque, on introduit simultanément les tiges portées par la plaque dans une cuve de lavage qui comprend, pour chaque rangée de tiges, un conduit et on fait passer ensuite une solution de lavage à travers chacun des conduits autour des tiges plongées dans ces derniers.

Selon un mode de réalisation du dispositif de l'invention, celui-ci est raccordé à un ensemble de vannes grâce auquel un moyen mélangeant ensemble les liquides de lavage ou des fluides liquides de réaction à mesurer les uns après les autres peut être évité.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée maintenant, uniquement à titre d'exemple, d'un mode particulier de réalisation, en se reportant aux dessins annexés dans lesquels
- la figure 1 est une vue d'ensemble en perspective d'un dispositif de lavage conforme à l'invention avec une cuve de lavage et une plaque à laquelle des tiges sont attachées
- la figure 2 est une vue en coupe longitudinale de la cuve de lavage et de la plaque pourvue des tiges, de la figure 1,
- la figure 3 est une représentation schématique d'un réseau de circulation de réactifs utilisable avec le dispositif de lavage de la figure 1.

Conformément au procédé de l'invention, les tiges en matière plastique attachées à une plaque par une extrémité sont traitées à l'aide de solutions. Les tiges sont attachées à la plaque par exemple selon une disposition en matrice à 8 x 12 rangées en correspondance avec une plaque ordinaire de microtitration.

Les pièces principales de l'appareil visible sur la figure 1 sont la base 1, la cuve de lavage 2, et l'ensemble 3 des réactifs.

La cuve de lavage comprend douze conduits de lavage 4 de sorte que cinq plaques 5 portant chacune des rangées de 8 x 12 tiges 6 peuvent etre mises en place pour être traitées en même temps.

Les conduits 4 sont pourvus de puits de lavage 7 respectivement pour chaque tige, le diamètre de chaque puits étant quelque peu plus grand que le diamètre de la tige correspondante 6. Entre les puits chaque conduit est plus étroit que les tiges. De cette façon la quantité de solution nécessaire pour le remplissage de chaque conduit peut être petite. Les puits de lavage produisent aussi une turbulence qui améliore le lavage des tiges.

A l'une des extrémités des conduits 4 il existe un volume commun de répartition 8 à partir duquel une solution peut circuler dans tous les conduits. D'autre part, à l'autre extrémité des conduits, il existe un espace commun d'évacuation 9 à partir duquel le liquide utilisé peut être évacué au moyen d'une tubulure 10. La solution employée passe dans l'espace de répartition 8 à partir d'un circuit de réactif en empruntant une tubulure d'admission 11.

La cuve de lavage peut être fermée au moyen d'un couvercle 12. te bord du couvercle est pourvu d'un joint d'étanchéité 13. De cette façon l'espace de lavage peut être fermé de manière étanche à l'air et, si nécessaire, le lavage peut être effectué, par exemple, dans une atmosphère de gaz inerte.

La cuve de lavage est fixée à la base par l'intermédiaire d'un mécanisme 5 engendrant un mouvement.

Au moyen de ce dernier, l'inclinaison de la cuve peut être modifiée dans la direction longitudinale des conduits, de sorte qu'il est possible d'imposer à la solution de circuler en sens alternés dans les conduits. Dans le dispositif représenté sur la figure 1, la cuve de lavage est articulée sur la base à la première extrémité des conduits mais naturellement il est possible aussi d'utiliser d'autres genres de dispositions pour incliner les conduits.

A la tubulure d'évacuation 10 de la cuve, est raccordée une branche verticale latérale 14 qui est munie d'un détecteur de niveau 15. Pendant le lavage, la tubulure d'évacuation est fermée de sorte que le niveau du liquide de la branche latérale est au même niveau que dans la cuve. Pendant le premier stade du lavage, l'extre- mité terminale de la cuve est abaissée de sorte que la solution circule jusqu'à l'extrémité d'évacuation et que le niveau dans la branche latérale s'élève. Quand la surface du liquide a atteint une certaine hauteur, le détecteur donne un signal pour le renversement du sens de l'inclinaison. De manière correspondante, quand le niveau du liquide a été abaissé jusqu'à une certaine valeur, la direction de l'inclinaison est inversée. Après la durée désirée de lavage ou le nombre désiré des inclinaisons, la solution est évacuée de la cuve.

En outre, dans l'arrangement visible sur la figure 2, chaque plaque 5 est pourvue à ses extrémités opposées de tiges de guidage 16 qui s'ajustent dans des évidements 17 prévus dans la cuve de lavage. Les tiges de guidage portent la plaque de telle sorte que les têtes 18 des tiges 6 ne viennent pas en contact avec le fond des puits. Les tiges de guidage empêchent aussi tout déplacement de la plaque pendant les inclinaisons.

La figure 3 montre un circuit de réactifs utilisables par exemple dans la synthèse de peptides, dans lequel des réactifs A, B et C peuvent être envoyés sous la pression d'un gaz inerte 19 (ici de l'azote) dans la tubulure d'admission 11 de la cuve de lavage.

A l'extrémité de cette tubulure d'admission 11 il existe une vanne 20 à travers laquelle seul le gaz peut passer dans cette tubulure Ensûite, sur la tubulure d'admission il existe une vanne trois voies 21 à travers laquelle le gaz circule dans cette tubulure, ou une solution passant par la vanne 20 y circule, ou le réactif A y est envoyé. De manière correspondante, par l'intermédiaire de vannes trois voies 22 et 23 du gaz peut être envoyé à partir de la vanne précédente,ou le réactif B ou C,respectivement. Bien entendu il est possible de raccorder aussi de la même façon un nombre plus élevé de flacons contenant des réactifs. Si nécessaire, la totalité de la tubulure d'admission peut être vidée des réactifs au moyen du gaz.

Grâce à cet arrangement, il est possible de fournir à la tubulure d'admission le réactif qui est nécessaire à chaque moment particulier sans le mélanger aucunement avec les autres réactifs qui pourraient rester dans la tubulure.

La pression du gaz et aussi le débit des réactifs peuvent être régulés au moyen d'une vanne de réduction de pression 24. Le montage comprend en plus une vanne d'arrêt 25.

Dans la synthèse des peptides il est possible d'utiliser comme matière de départ des amino-acides protégés par des groupes de protection F-moc (9-fluorénylméthyloxycarbonyle). Quand le dispositif de l'invention est utilisé le processus suivant de lavage est mis en oeuvre au début de chaque cycle de synthèse.

- 1 x 130 ml de DMF (diméthylformamide), 5 mn d'agitation - 4 x 130 ml de méthanol, 2 mn d'agitation, -1 > < x 130 130 ml de DMF, 5 mn d'agitation, - 1 x 90 ml de pipéridine à 20 % dans DMF, 30 mn d'agitation - 2 x 130 ml de DMF, 5 mn d'agitation - 4 x 130 ml de méthanol, 2 mn d'agitation - séchage à l'azote, 15 mn - 2 x 130 ml de DMF, 5 mn d'agitation,
Lorsque la synthèse est achevée, les terminaisons amino peuvent acétylées selon la procédure suivante - 90 ml de DMF : anydride acétique : diisopropyléthylamine
(v/v/v = 50:5:1), 90 mn d'agitation - 1 x 130 ml de DMF, 2 mn d'agitation - 4 x 130 ml de méthanol, 2 mn d'agitation - séchage à l'azote, 15 mn.

Pour l'élimination des groupes de protection de la chacune latérale, la procédure suivante est employée: - 90 ml de TFA:phénol:éthanedithiol (v/v/v = 95:2,5:2,5), 4
heures, - 2 x 130 ml de diisopropyléthylamine à 5 %/dichlorométhane,
5 mn d'agitation, - séchage à 1' azote ; 15 mn - 2 x 130 ml d'eau distillée, 5 mn d'agitation.

Finalement, les tiges sont conservées dans un bain de méthanol pendant 18 heures.

Le peptide dérivé des protéines virales peut être utilisé pour le test des anticorps anti-virus correspondant au moyen de PELA. A cet effet, par exemple, la procédure de lavage suivante est employée - 90 ml d'antisérum dilué, 4 heures d'agitation - 8 x 130 ml d'une solution tampon de lavage - 90 ml de phosphatase alkaline conjuguée avec anti-Ig, 2
heures d'agitation, - 8 x 130 ml d'une solution tampon de lavage, 5 mn d'agita
tion,
Finalement, les tiges sont soumises au substrat dans une plaque de microtitration et la mesure est exécutée.

Quand des protéines liées au peptide sont à éliminer, la procédure suivante peut être employée - 6 x 90 ml d'une solution tampon de dislocation, 10 mn
d'agitation; - 4 x 130 ml d'eau distillée, 10 mn d'agitation - 4 x 130 ml de méthanol, 10 mn d'agitation, - 4 x 130 ml d'eau distillée, 10 mn d'agitation.

Pendant l'exécution de ces opérations à l'aide du dispositif de l'invention, on remarquera, en réexaminant les dessins, que les têtes des tiges sont placées dans les conduits; au moins à l'endroit des tiges, les conduits sont quelque peu plus larges que l'épaisseur des tiges afin que le liquide de lavage puisse circuler et passer en dérivation par rapport aux tiges. L'espacement, le nombre et la longueur des conduits dépendent naturellement du type de la plaque et des tiges, du nombre de plaques et de la façon dont les plaques sont disposées dans le dispositif
Les solutions passent dans les conduits de préférence à partir de l'espace commun de répartition.

De manière analogue, à l'autre extrémité des conduits, il existe de préférence un espace commun d'élimination. Le liquide est mesuré dans l'espace de répartition à partir duquel il coule à travers les conduits jusqu'à l'espace d'élimination.

A partir de ce dernier espace, si on le désire, le liquide peut ne pas être éliminé immédiatement mais mis en recirculation jusqu'à l'espace de répartition. En fait, la solution est mise en circulation de manière optimale à travers les conduits selon des mouvements de va et vient entre l'espace de répartition et l'espace d'élimination jusqu'à ce que cette solution ait agi sur les tiges pendant la durée désirée,
Pour intensifier le lavage, les conduits peuvent être pourvus en face des tiges d'éléments qui produisent une turbulence.

il est possible,si on le juge utile, d'inter- connecter les conduits au moyen de canaux transversaux.

Le fonctionnement du dispositif est contrôlé de la meilleure façon à l'aide d'un ordinateur. La cuve de lavage peut être pourvue d'un détecteur surveillant le niveau du liquide de lavage et la totalité de l'opération peut être commandée à l'aide des signaux fournis par ce détecteur de surveillance.

Grâce au dispositif de l'invention, la quantité de solution nécessaire au lavage peut être considérablement réduite en comparaison d'un lavage classique dans une cuve classique. Comme avantage supplémentaire, un lavage de toutes les tiges à une uniformité maximale est obtenu étant donné que les conditions de mise en contact avec les solutions sont identiques pour toutes les tiges. En outre, en faisant appel à un débit accru et à la turbulence, il est possible de raccourcir la durée du lavage ou d'améliorer le résultat.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS

   -1. Dispositif de lavage pour le lavage de tiges attachées en rangées à une plaque, à l'aide d'une solution de lavage ou d'un réactif, caractérisé en ce qu'il comprend - une cuve de lavage pourvue d'un conduit (4) pour chacune des rangées de tiges, celles-ci pouvant être introduite dans un conduit correspondant de manière que la solution de lavage puisse passer autour des tiges dans le conduit, - un moyen pour faire passer la solution de lavage dans les conduits ainsi que - un moyen pour éliminer des conduits la solution de lavage.
2. 2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que dans les conduits, en face des tiges, les moyens (7) sont prévus pour produire une turbulence ou pour intensifier le débit de la solution de lavage dans la région des tiges.
3. 3. Dispositif selon la revendication 2 caractérisé en ce que les conduits sont constitués par des trous (7) ayant une section droite quelque peu supérieure à celle des tiges avec des parties plus étroites de raccordement des trous.
4. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen pour la recirculation de la solution de lavage ou pour des passages alternés en va et vient de la solution à travers les conduits.
5. 5. Dispositif selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il comprend un moyen (5) pour incliner alternativement en sens opposés la cuve de lavage dans la direction longitudinale des conduits.
6. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend un détecteur (15) pour surveiller le niveau du liquide de lavage.
7. 7. Dispositif selon les revendications 5 et 6 caractérisé en ce qu'il comprend un moyen (5) pour inverser la direction de l'inclinaison de la cuve en fonction du niveau de la surface de liquide de lavage.
8. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la cuve de lavage peut être fermée de manière hermétique au moyen d'un couvercle (12) et en ce qu'il comprend un moyen (19) pour l'introduction d'un gaz inerte dans la cuve.
9. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, afin de faire passer la solution de lavage à travers les conduits, il existe une tubulure d'admission (11) avec une première vanne trois voies (21) dont les branches communiquent respectivement avec un premier flacon de solution de lavage cependant qu'une seconde branche communique à travers une vanne d'arrêt (20) avec une bouteille qui contient un gaz inerte ou un liquide afin de nettoyer ladite tubulure d'admission.
10. 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que la tubulure d'admission est pourvue en plus d'une seconde vanne trois voies (22) dont l'une des branches communique avec la première vanne trois voies (21) cependant qu'une seconde branche communique avec un second flacon de liquide de lavage.
11. 11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend un moyen (19) pour faire passer la solution de lavage dans les conduits, ce moyen agissant à l'aide d'un gaz sous pression.
12. 12. Dispositif selon les revendications 9 et 11 caractérisé en ce que le gaz sous pression (19) est utilisé à la fois pour faire passer la solution de lavage et pour le nettoyage de la tubulure d'admission.
13. 13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il existe en correspondance sur la cuve de lavage en dehors des conduits et sur la plaque (5), des moyens de guidage (16,17) pour la tenue de la plaque à sa position correcte par rapport à la cuve de lavage.
14. 14. Procédé pour le lavage à l'aide d'une solution de tiges attachées en rangées à une plaque, caractérisé en ce qu'on place cette plaque dans une cuve de lavage qui comprend un conduit en correspondance avec chaque rangée de tiges et en ce qu'on fait passer la solution de lavage à travers les conduits en dérivation par rapport aux tiges.