DE4019929A1 - Verfahren und vorrichtung zum einschliessen einer kernstroemung in einer huellstroemung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einschließen einer aus einer fluiden Teilchensuspension bestehenden, fadenartig dünnen Kernströmung mit einer Hüllströmung eines reinen, transparenten Fluids, insbesondere eines Elektrolyts. Sie betrifft ferner eine Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens sowie die Verwendung der Vorrichtung in einem Analysegerät und in einem Analysesystem.

Wenn im folgenden von mit der Kernströmung transportierten, zu analysierenden Teilchen gesprochen wird, kann es sich um anorganische oder organische, unbelebte oder belebte Materie handeln. Der Begriff "Teilchen" soll insbesondere auch lebende Zellen umfassen. Ferner wird im Verlauf des folgenden Textes im Zusammenhang mit der Bedeutung der Teilchen alternativ von der Epi- oder Auflichtmode einerseits und von der Direktlichtmode andererseits - also z. B. von einem Epilaser oder von einem Direktlaser - gesprochen. Diese Moden unterscheiden sich vor allem durch die Art der Erfassung desjenigen Lichts, das bereits mit dem jeweiligen Teilchen in Wechselwirkung getreten ist: Bei der Epimode wird ein Bereich des direkten (ursprünglichen) Strahls, z. B. gestreutes Licht, gemessen.

Eine Düsenkammer zum Erzeugen einer hydrodynamisch fokussierten Kernströmung in Kombination mit einer die Kernströmung einschließenden Hüllströmung wird erstmals von P. J. Crosland-Taylor, Nature, 3. Jan. 1953, Band 171, Nr. 4340, Seiten 37/38, beschrieben. In dieser Vorrichtung wird die Hüllflüssigkeit quasi radial durch zwei Eintrittslöcher am oberen Ende, das heißt am Stromaufende, eines zylindrischen Hohlraums mit vertikaler Achse injiziert, dessen Durchmesser größer als derjenige der Eintrittslöcher ist. Dieser Hohlraum wird heute als "Düsenkammer" bezeichnet. Unter dem Begriff "Fokussieren" wird im vorliegenden Zusammenhang eine Art radialen Einschnürens oder Bündelns der Kernströmung verstanden.

Nach Crosland-Taylor (a.a.O.) wird eine Suspension von Blutzellen - als Kernströmung - axial durch eine Injektionsnadel von 0,125 mm Durchmesser in die Düsenkammer hinein injiziert, und die Hüllströmung wird um die - heute als "Düse" bezeichnete - Nadel und damit auch um die Kernströmung herum gebildet, so daß sich die oben genannte Strömungskombination ergibt. Im Bekannten wird die vereinigte Strömung senkrecht nach unten gerichtet. Die hydrodynamisch fokussierte Blutzellensuspension, das heißt die Kernströmung, wird mit einem Mikroskop beobachtet; die Zellen können optisch gezählt werden, da sie ein auf sie gerichtetes Lichtbündel streuen. Nach dem Zählen verlassen die Zellen und die sie umgebende Hüllströmung die Düsenkammer radial durch ein Loch, das am Stromabende der Kammer vorgesehen wird.

Die die Blutzellen enthaltende Kernströmung hatte nach Angaben von Crosland-Taylor (a.a.O.) einen Durchmesser von etwa 10 µm, wobei der Durchmesser um etwa ±50% um den Durchschnittswert schwankte. In dem Aufsatz wird auch berichtet, daß die Kernströmung noch mehr schwankte, wenn nur ein Eingangsloch zum Einleiten der Hüllflüssigkeit benutzt wurde. (Hier und im folgenden wird sprachlich ein Unterschied zwischen der Hüllflüssigkeit selbst und der durch sie in der Düsenkammer gebildeten Strömungsform gemacht.) Diese Instabilität (der Kernströmung) kann dadurch erklärt werden, daß die in die (gefüllte) Düsenkammer hinein nachfließende Hüllflüssigkeit ihr Moment auf die bereits in der Kammer befindliche Flüssigkeit überträgt und dadurch eine langsame Rotation der Hüllströmung um die Düsenkammerachse erzeugt. Da die Nadel (bzw. Düse) seinerzeit wahrscheinlich nicht exakt in der Düsenkammerachse lag, verursachte die Rotation der Hüllströmung eine entsprechende Schwankung der die Blutzellen transportierenden Kernströmung.

Es gibt moderne, sogenannte "Jetanalysatoren", die in ähnlicher Weise wie der vorgenannte Analysator von Crosland-Taylor konstruiert werden, so daß die auch hier vorkommenden Stabilitätsprobleme zumindest teilweise auf die charakteristischen Instabilitäten der Kernströmung zurückzuführen sind, deren Ursache bereits an der frühen Version der Düsenkammer erkennbar ist.

Solche Schwankungen der Zentralströmung sind natürlich nur akzeptabel, wenn das Analysevolumen groß genug ist. Dazu gehören Objektive mit langer Brennweite, das heißt großer Tiefenschärfe. Da solche Objektive aber nur einen kleinen Bruchteil des am Teilchen gestreuten bzw. fluoreszend emittierten Lichts sammeln, wurde die modifizierte Düsenkammer, das heißt diejenige des Jettyps, in die Praxis eingeführt. Das war jedoch erst nach der Entwicklung von Hochleistungslasern möglich.

In dem Jetanalysator verjüngt sich die Düsenkammer an ihrem Stromabende in eine sehr dünne Kapillarröhre mit einem Innendurchmesser von etwa 0,1 mm. Wenn dieser Teil der Kapillarröhre UV-transparent (bis herunter zu etwa 200 nm) gemacht wird, ist die Kapillarröhre selbst als Analysevolumen geeignet. Die Brennebene des Objektivs kann auf der Mitte der Kapillarröhre angerichtet werden. Alternativ kann die Brennebene des Objektivs auch auf eine Position außerhalb der Kapillarröhren, wo die Jetströmung im freien Raum in einer Abwärtsrichtung fließt, ausgerichtet werden. Im Analysevolumen stehen jeweils die Kernströmung, die optische Achse des Objektivs und der Laserstrahl im wesentlichen senkrecht zueinander, derart, daß die Kernströmung annähernd in der Brennebene des Objektivs liegt; vgl. hierzu M. A. van Dilla et al., IEEE Transactions in Nuclear Science, 1977, NS-21, Seite 716.

Wenn die genannte Kapillarröhre - wie im Falle des Tropfenablenksortierers nach M. J. Fulwyler, Science, 1965, Band 150, Seite 910 - nicht transparent ist, wird das Analysevolumen in die offene Jetströmung gelegt. Die Instabilität der Strömung verursacht hier Probleme nicht nur bei der Analyse, sondern auch beim Sortierbetrieb, weil die durch die Instabilitäten erzeugte Störung der Jetströmung die Tropfenbildung nach Fulwyler (a.a.O.) stark beeinträchtigt und damit auch die Sortierqualität verschlechtert.

Ein zusätzlicher Nachteil der Jetanalysatoren besteht in dem Erfordernis von Hochleistungslasern. Diese Geräte sind recht kosten- und raumaufwendig, und das vollständige System erfordert für die nötige mechanische Stabilität einen optischen Tisch. Schließlich kann der Betrieb wegen der verwendeten Hochleistungslaser in einigen Fällen nur unter strengen Sicherheitsvorkehrungen stattfinden. Es ist daher mit Recht nach einer einfacher darstellbaren Alternative mit einer Beleuchtung niedrigerer Leistung und mit vereinfachten Betriebsbedingungen gesucht worden mit dem Ziel, den Teilchenanalysator als Tischgerät auszubilden.

Es ist klar, daß ein Hochleistungslaser nur dann durch eine UV-Lichtquelle geringer Intensität ersetzt werden kann, wenn man das Objektiv großer Brennweite und geringen Lichtsammelvermögens, das in dem Jetsystem benutzt wird, durch ein UV-Objekt mit höherer numerischer Apertur (etwa 1,3) ersetzen kann, dessen Lichtsammelfähigkeit entsprechend, vorzugsweise um mehr als eine Größenordnung, größer als diejenige der nach dem Stande der Technik zu verwendenden Objektive ist. In einem solchen Fall müßten sich die Teilchen der Kernströmung in einem ziemlich flachen Kanal von etwa 0,05 bis 0,1 mm Tiefe bewegen, so daß die Brennebene des genannten starken Objektivs noch auf die Kernströmung zu justieren ist. Zu berücksichtigen ist dabei eine Kanalabdeckung, z. B. mit einem Deckglas von 0,17 mm Dicke, bei einer Brennweite des starken Objektivs von nur etwa 0,24 mm.

Ein solches System wird in dem deutschen Patent P 19 19 628.2 beschrieben. Die entsprechenden Analyseergebnisse waren aber ziemlich schwach, weil die Kernströmung - als Folge der oben beschriebenen einfachen Düsenkammer - nicht stabil genug war, um jedes zu analysierende Teilchen exakt durch die Brennebene zu leiten. W. Dittrich und W. Göhde haben daher ein in der US-PS 37 38 759 beschriebenes Strömungssystem entwickelt, in welchem die Teilchen nicht in der Brennebene des starken UV-Objektivs, sondern senkrecht dazu bewegt werden.

Nach Dittrich und Göhde werden die Teilchen mit einer preiswerten und leicht zu betreibenden Hochdruckquecksilberlampe von 100 W beleuchtet, deren UV-Komponente etwa 10 mW besitzt. Es wurde eine Koehler-Beleuchtungsoptik in der Auflichtmode eingesetzt. Nach dem Durchqueren des Analysevolumens werden die Teilchen ziemlich abrupt durch eine sogenannte senkrecht zur optischen Achse des Objektivs und damit auch senkrecht zum Teilchenstrom fließende Reinigungsströmung in einen anderen Kanal weggespült, der die Fortsetzung des Kanals darstellt, aus dem die Reinigungsströmung kommt. Dieses Kanalsystem wird im Bekannten mit einem 0,17 mm dicken Deckglas überdeckt, wobei der genannte Zweigkanal auch als Ausgangskanal für die Teilchen/Elektrolyt-Mischung dient, welche unter dem Effekt einer Saugpumpe als Abfall in eine Sammelflasche fließt.

Offensichtlich bilden die Kanäle und das vertikale Loch in dem vorgenannten Strömungssystem, in welchem die Teilchen in Richtung der Brennebene fließen, ein Strömungssystem mit der Form eines vertikalen "T". Neben den vereinfachten Beleuchtungsbedingungen besteht ein klarer Vorteil dieses Systems darin, daß die kleinen Schwankungen der Kernströmungen keine großen Fehler bei der Teilchenanalyse verursachen, weil das Sichtfeld des Objektivs in der Nähe der optischen Achse ziemlich homogen ist. Aus diesem Grunde würde man recht gute Ergebnisse dieses Analysatortyps erwarten. Tatsächlich wird diese Erwartung aber nicht immer erfüllt.

Wegen des 90°-Zusammenstoßes der Kern/Hüll-Strömungskombination mit der Reinigungsströmung neigt das T-Strömungssystem zu Turbulenzen in der Nachbarschaft des Analysevolumens, wodurch die Analyse selbst beeinträchtigt werden kann. Daß einige Anwender trotzdem gute Ergebnisse mit diesem Analysatortyp erhalten, rührt wahrscheinlich davon her, daß es einen Geschwindigkeitsbereich gibt, in dem die Strömungen aufeinanderstoßen können, ohne erhebliche Turbulenzen im Analysevolumen zu erzeugen.

Ein anderer Nachteil der 90°-Ablenkung der Kern/Hüll-Strömungskombination wird bemerkt, wenn ein kleiner Faden in der Strömung mitgeführt wird. Wenn dieser Faden der Ablenkung der Strömungen nicht folgen und daher in dem Vereinigungsvolumen der Kanäle, das heißt um das Analysevolumen herum, festkleben sollte, kann er ein Verstopfen dieses Volumens und einen eventuellen vollständigen Stillstand des Analysatorbetriebs zur Folge haben. Daß solche Verstopfungen ziemlich oft auftreten, ist von direkten Beobachtungen sowohl dieses als auch anderer Strömungssysteme bekannt. Das Reinigen solcher Geräte ist oft mühsam und zeitaufwendig, nicht gerechnet den Streß, der sich bei der Arbeit mit einer derart unbefriedigenden Apparatur einstellt. Ein weiterer Nachteil des Strömungssystems von Dittrich und Göhde (a.a.O.) besteht darin, daß als Folge der beschriebenen Turbulenzströmung und als Folge des Raumaufwands für die angesetzte Düsenkammer, dieser Analysator nicht ohne weiteres mit derzeit bekanntem Teilchensortieren kombiniert werden kann. Das Teilchensortieren, insbesondere Zellsortieren, wird aber mehr und mehr notwendig.

Es gibt zwei weitere Arbeiten betreffend Zellanalysatoren, die der Vollständigkeit halber genannt werden sollen. Die eine dieser Arbeiten betrifft den Zweiparameteranalysator nach E. Severin et al., Cytometry, 1983, Band 3, Nr. 4, Seiten 308-310, in welchem ein Argonlaserstrahl auf das Strömungssystem von Dittrich und Göhde (a.a.O.) gerichtet wird. Dieser Laserstrahl erreicht die Kernströmung und damit die zu analysierenden Teilchen durch einen in den Grundkörper der Vorrichtung senkrecht zum Reinigungsausgangskanal geschnittenen Kanal. Die Autoren berichten nicht über experimentelle Ergebnisse. Ein wesentlicher Nachteil dieses Analysators besteht aber auf jeden Fall in der Nichtkombinierbarkeit mit einer der bekannten Sortiervorrichtungen.

Der andere noch zu diskutierende Analysator wird von H. B. Steen, Cytometry, 1980, Band 1, Nr. 1, Seiten 26-31, angegeben. Die Teilchen, hier Zellen der Latexkügelchen, werden mit einem aus einer Kern/Hüll-Strömungskombination bestehenden Jetstrom zur Oberseite eines in der Auflichtmode beleuchteten Mikroskopglases gespritzt. Das Fluoreszenzlicht wird mit einem UV-Objektiv relativ geringer Vergrößerung gesammelt. Das UV-Objektiv wird unter dem Deckglas an der Stelle, wo der Jetstrom und damit die Teilchen auf das Deckglas fallen, angeordnet. Für Kügelchen von 1,5 µm und Zellen von etwa 10 µm Durchmesser ergeben sich gute Resultate, jedoch kann auch dieser Gerätetyp nicht mit einem Sortierer kombiniert werden. Außerdem ist der Jetstrom sehr wahrscheinlich ebenso unstabil wie jener des vorstehend beschriebenen Jetanalysators, weil in beiden Fällen derselbe Düsenkammertyp eingesetzt wird.

Es gibt derzeit nur einen elektrischen Analysator bzw. Sensor von praktischem Wert, dessen ursprüngliche Version von W. H. Coulter in der Mitte der 50er Jahre erfunden worden ist (vgl. van Dilla et al., a.a.O.). Dieser Analysator wurde ursprünglich dazu benutzt, Teilchen zu zählen, die aus einem großen Behälter durch eine Blende in einen anderen großen Behälter gelangen. Der Querschnitt der Blende war nur wenig größer als derjenige der zu analysierenden Teilchen. Beide Behälter waren mit Elektrolyt gefüllt. In dem Stromaufbehälter enthielt der Elektrolyt außerdem die noch zu analysierenden Teilchen, während sich im anderen Behälter bereits analysierte Teilchen befanden. Durch Anlegen von Elektroden wurde ein durch die Öffnung führender elektrischer Stromkreis geschlossen. Ein wesentlicher Teil des Widerstandes dieses Stromkreises war auf die Blende konzentriert. Wenn also ein (nichtleitendes bzw. wesentlich schlechter als der Elektrolyt leitendes) Teilchen durch die Blende glitt, wurde ein plötzlicher Widerstandsanstieg im Flüssigkeitssystem als elektrischer Spannungs- bzw. Stromimpuls registriert.

In einer moderneren Version des zuletzt erläuterten Teilchenzählers (vgl. U. Zimmermann et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1976, Band 3, Seiten 58-83) werden Zellen in einer hydrodynamisch fokussierten Kernströmung eingeschlossen, die wiederum von einem teilchenfreien Hüllelektrolyten umgeben wird. Dadurch wird erreicht, daß die zu untersuchenden Teilchen durch das Zentrum der Öffnung fließen, wo das elektrische Feld bis zu einem hohen Grad homogen ist. Auf diese Weise wird eine genaue Klassifizierung der Zellen möglich, weil, wie sich experimentell ergeben hat, die Amplitude des beim Durchgang des Teilchens durch die Öffnung erzeugten elektrischen Impulses proportional zum Teilchenvolumen ist. In beiden Versionen gehen jedoch die Teilchen nach dem Passieren der Blende verloren, sie stehen daher für eine weitere Handhabung, z. B. zum Sortieren, nicht zur Verfügung.

Eine solche weitere Handhabung, insbesondere ein Sortieren, ist möglich in dem vom Erfinder entwickelten Strömungssystem gemäß US-PS 42 37 416. Dort bewegen sich die Teilchen mit der Kernströmung durch einen sehr engen Teil des geschlossenen Kanalsystems, das hier als Blende bezeichnet wird. Die Teilchen können also nach ihrem Volumen analysiert und in derselben Kernströmung weiter zu einem Sortiersystem geleitet werden; vgl. die ebenfalls auf den Anmelder zurückgehende US-PS 41 75 662. Im Bekannten kann der Sortierer in denselben Grundkörper wie der Analysator integriert werden, so daß das Analysieren und Sortieren auf der Basis derselben Teilchenmenge möglich wird. Experimente mit diesen Systemen führten zu ausgezeichneten Resultaten selbst bei Kombination mit optischen Lasern, die UV-Objektive großer numerischer Apertur und Vergrößerung enthielten und bei denen Auflicht nach dem Koehler-Beleuchtungssystem für eine gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfeldes des UV-Objektivs eingesetzt wurde.

Nach der US-PS 41 75 662 erfolgt das hydrodynamische Fokussieren und damit das Erzeugen der eingeschnürten Kernströmung in einer Düsenkammer, in die die Kernströmung durch eine sehr enge, mit einer Düse endende Kapillarröhre einfließt. An dieser Position kommt die Flüssigkeit der Kernströmung mit der Flüssigkeit der Hüllströmung in Kontakt. Die die Hüllströmung bildende Hüllflüssigkeit wird im Bekannten der Düsenkammer durch ein Loch von wenigen mm Länge zugeführt, welche nahezu senkrecht zu der Kapillarröhre bzw. deren Düse steht. Das Eingangsloch der Hüllflüssigkeit befindet sich am Stromaufende der Düsenkammer, an einer Stelle, an welcher das dünne Kapillarrohr ebenfalls in die Düsenkammer eintritt.

Wegen der beschriebenen Geometrie von Düsenkammer und darin hinreichendem dünnem Kapillarrohe nach der US-PS 41 75 662 bildet das Kapillarrohr selbst ein Hindernis im Strömungsweg der Hüllflüssigkeit. Tatsächlich spaltet das dünne Kapillarrohr die Hüllflüssigkeit in drei Strömungsteile auf. Ein erster Teilstrom erfährt eine etwa 90°-Wendung und fließt unter dem Kapillarrohr in Richtung auf dessen Düsenspitze, die anderen beiden Strömungsteile fließen als Unterteilstrom halb um das Kapillarrohr und treffen sich bei frontaler Kollision an der Oberseite des Kapillarrohrs. Die beiden Unterteilströme stoßen sich gegenseitig um etwa 90° wieder ab und fließen in Richtung auf die Düse, wo sich die drei Strömungsteile wiedervereinigen und die die aus der Düse kommende Kernströmung einschließende Hüllströmung bilden. Diese Kern/Hüll-Strömungs-Kombination passiert dann die oben genannte Blende.

Es sind mehrere Strömungssysteme gemäß US-PS 41 75 662 gebaut worden. Sie arbeiteten alle auf dieselbe Weise. Die Düsenkammer war nach einer Einlaufphase frei von Luftblasen, es ergab sich eine sehr stabile Kernströmung hoher Qualität. Durch Einbau von hydrodynamischem Widerstand in die Strömung der Kernflüssigkeit ließen sich Kernströmungsdurchmesser von bis herab zu 1 µm einstellen, die selbst bei Beobachtung durch ein Stereomikroskop mit 50facher Vergrößerung nicht schwankten. Die Zentralströmung wurde in diesen Fällen mit schwarzer Tinte gefärbt, um sie unterscheidbar von der umgebenden Hüllströmung zu machen.

In dem bekannten System konnte jedoch ein Betrieb der Düsenkammer frei von Luftblasen oft erst nach vielen Einschaltungen, das heißt Auffüllungen, erreicht werden, weil im allgemeinen Luftblasen in dem Teil der Düsenkammer gebildet werden, wo die dünne Kapillarröhre in die Düsenkammer eintritt, und zwar im allgemeinen in der Startphase, das heißt, wenn das leere Kanalsystem unter dem Saugeffekt einer an den Systemausgang, beispielsweise über Pufferflaschen und Silikonröhren, angeschlossenen Pumpe gefüllt wird. Es zeigte sich, daß diese Luftblasen unterschiedliche Größe besitzen und durch und während der frontalen Kollision der beiden Unterteilströme der Hüllflüssigkeit entstehen, wenn letztere in die leere Düsenkammer eintritt und diese Strömungsteile in Richtung auf den Kammerausgang, das heißt in Richtung auf die beschriebene Blende, abgelenkt werden. Da derartige Luftblasen die Position und die Form der Kernströmung ändern und die letztere sogar unstabil machen können, ist dieses Strömungssystem nicht sehr zuverlässig, und wegen dieser relativen Unvollkommenheit hat es nur am Rande Anwendung in der klinischen Praxis gefunden, weil dort stabile und zuverlässige Geräte für schnelle und zuverlässige Diagnosen gebraucht werden.

Aus dem vorbeschriebenen Stand der Technik ergibt sich folgendes: Große Düsenkammern, namentlich mit darin rotierender Flüssigkeit, sind unerwünscht, weil solche Strömungssysteme ein Schwanken bzw. Flackern der Kernströmung zur Folge haben. Scharfe (90°) Zusammenstöße von Kanälen und Strömungen müssen wegen der dadurch bedingten Turbulenzen und Luftblasen in solchen Systemen ebenfalls vermieden werden. Obwohl eine in der US-PS 41 75 662 beschriebene Düsenkammer relativ nahe an die Lösung der zugrundeliegenden Aufgabe, einen zuverlässigen und stabilen Betrieb zu gewährleisten, herankommt, läßt die Zuverlässigkeit der bekannten Düse noch zu wünschen übrig, das heißt es sollte eine neue Düsenkammer entwickelt werden, die im Sinne des Vorstehenden praktisch 100%ig zuverlässig ist, um den Streß, den der Betreiber mit weniger zuverlässigen Einrichtungen erfährt, zu vermindern.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht daher hauptsächlich darin, einen Durchflußteilchenzähler eingangs genannter Art zu schaffen, an den sich ein Teilchensortierer anschließen läßt und der im vorstehenden Sinne praktisch 100%ig stabil und zuverlässig ist. Insbesondere soll die Bildung von Luftblasen in der Düsenkammer sowohl in der Einschaltphase als auch im Dauerbetrieb praktisch ausgeschlossen werden. Weiterhin soll der Analysator selbst betreffend Ansprechvermögen, Wartung und Betrieb verbessert werden, und es soll die alternative und gleichzeitige Verwendung von Epi- und Direktbeleuchtung der in der Kernströmung fließenden Teilchen mit Hilfe von Lasern in ein und demselben Gerät ermöglicht werden.

Die erfindungsgemäße Lösung wird in Verfahrens-, Vorrichtungs- und Verwendungshauptansprüchen angegeben. Verbesserungen und weitere Ausgestaltungen werden in den Unteransprüchen beschrieben.

Durch die Erfindung wird ein hochstabiles und zuverlässiges Multiparameterdurchflußanalysegerät zum Untersuchen von Teilchen, insbesondere Zellen, geschaffen. Zur Erfindung gehören auch ein Verfahren sowie Mittel zum vollständigen Umschließen eines als Kernströmung bezeichneten, stabilen, dünnen Stromfadens mit einer anderen fluiden Strömung, der Hüllströmung. Die Kernströmung soll durch das Zentrum einer kleinen Röhre bzw. eines Kanals kapillarer Größe fließen. Die Vereinigung der beiden Strömungen soll in einer Düsenkammer erfolgen, deren Innenwände eine solche Geometrie besitzen, daß die Hüllströmung die kapillare Röhre zu jeder Zeit des Betriebs ohne jede Turbulenz und ohne Erzeugung von Luftblasen umgibt, bevor sie die aus der kapillaren Röhre kommende Kernströmung erreicht und umfängt.

In der Strömungskombination werden die zu analysierenden Teilchen in vorgegebene Analyseräume getragen. Dort tritt jedes Teilchen abhängig von seinen physikochemischen Eigenschaften mit mindestens einem Sensor in Wechselwirkung. Das Ergebnis einer solchen Wechselwirkung ist ein elektrisches Spannungssignal und/oder ein Stromimpuls im dem jeweiligen Sensor zugeordneten elektronischen System. Das Spannungssignal bzw. der Stromimpuls können weiter in anderen auf den betreffenden Sensor geschalteten elektronischen Einrichtungen analysiert werden.

Eine im vorliegenden Zusammenhang zu benutzende typische Einrichtung ist ein Multikanalanalysator, der dazu geeignet ist, die Zahl der Teilchen abhängig von einer durch den Sensor ermittelten physikalischen Größe darzustellen und/oder zu registrieren. Wenn beispielsweise die physikalische Größe das Teilchenvolumen (z. B. das Zellvolumen) ist, kann der Multikanalanalysator eine Volumenverteilung der suspendierten Teilchen liefern.

Normalerweise werden im erfindungsgemäßen Zusammenhang optische Sensoren eingesetzt. Die zu untersuchenden Teilchen werden in der strömenden Suspension mit Licht aus dem UV-Spektrum beleuchtet. Mit Hilfe eines UV-Mikroskopobjektivs wird das gestreute oder durch Fluoreszenz der vorher entsprechend gefärbten Teilchen emittierte Licht gesammelt. Derzeit ist nur ein einziger elektrischer Meßfühler zum Ermitteln der Teilchengröße bekannt.

Das Analysevolumen eines optischen Sensors ist definitionsgemäß gleich dem Produkt von Sichtfeld (Fläche) und Tiefenschärfe (Fokustiefe). Dieses Volumen ist oft ziemlich klein und/oder inhomogen. Daher soll die Kernströmung während des Betriebs des Analysators, wenn Teilchen - eines nach dem anderen - das Analysevolumen passieren, jederzeit sehr stabil sein. Die Erfindung bezieht sich daher auch auf eine verbesserte Düsenkammer, in der die Vereinigung von Kern- und Hüllströmung, ohne Turbulenzen und Luftblasen zu erzeugen, bewirkt wird, so daß eine extrem stabile und zuverlässige Kernströmung in der Düsenkammer hergestellt wird und eine nachgeschaltete Multiparameteranalyseeinrichtung entsprechend zuverlässig arbeitet.

Durch die Erfindung wird vor allem die Betriebsqualität des Analysators verbessert. Überdies wird aber außerdem die Wartung der Vorrichtung gegenüber dem bisherigen Stand der Technik vereinfacht. Aus dem Vorstehenden folgt, daß der Durchflußanalysator hauptsächlich in der Zytologie und in diesem Bereich bei der Krebsforschung Anwendung findet. Die Volumenanalyse ist auch sehr wichtig in der Aerosolforschung.

Durch die Erfindung werden unter anderem folgende Verbesserungen erreicht: Die in der Vorrichtung fließenden Strömungen werden so kurz wie möglich gemacht, um die Wahrscheinlichkeit des Entstehens von Turbulenzen nach dem Rayleigh-Prinzip auf ein Minimum zu beschränken. Die Strömungen treffen sich unter dem kleinstmöglichen Winkel. Scharfe (90°) Strömungsablenkungen werden überall vermieden, um Verstopfungen der Kanäle, die solche Ablenkungen hervorrufen, zu vermeiden. Der Durchmesser der Kernströmung ist nicht sehr viel größer als der Teilchendurchmesser, um für jedes Teilchen unabhängig von seiner Größe dieselbe Analysebedingung zu schaffen. Trotzdem kann der Durchmesser der Kernströmung, wenn das Analysevolumen groß genug ist, auch größer als der Minimalbetrag sein. Es werden keine scharfen Ecken oder Kanten im Strömungssystem zugelassen, weil solche Kanten dazu neigen, Luftblasen fest zu verankern. Diese würden nämlich wie feste Materialstücke auf die Strömung wirken und entsprechend ablenkend wirken.

Die erfindungsgemäße Düsenkammer soll wenigstens teilweise einen etwa rechteckigen Querschnitt besitzen, um eine Rotation der Hüllflüssigkeit zu verhindern. Außerdem wird die Düsenkammer an ihrem Austrittsende so verjüngt, daß ihr Querschnitt schließlich in den Querschnitt des Ausgangskanals übergeht. Die Wände der Düsenkammer und ebenso die Wände der anderen Kanäle werden mit einem nichtreflektierenden, nichtfluoreszierenden Schwarz ausgestattet, entweder weil die Wände entsprechend angestrichen werden oder weil die ganze Vorrichtung bzw. deren Grundkörper aus einem solchen Material begeht.

Der Ausgangskanal des erfindungsgemäßen Analysegeräts dient auch dazu, die Teilchen mit der Kernströmung von dem Analyseteil zu einem Sortierteil der Vorrichtung zu tragen, wenn diese Teile in demselben Gerätegrundkörper untergebracht werden; in letzterem Fall wird der Ausgangskanal als "Hauptkanal" bezeichnet.

Im allgemeinen wird jedes "notwendige" Hindernis im Weg der Strömung derart stromlinienförmig ausgebildet, daß die aufgespaltenen Strömungen nach dem Passieren des Hindernisses ohne jede merkliche Turbulenz, das heißt, ohne eine zu einer Instabilität des Analysatorbetriebs führende Unruhe, wiedervereinigt werden. Jeder Eingangskanal und Ausgangskanal soll so kurz wie möglich gemacht werden, um einen Einblick in diese Kanäle mit einem einfachen Mikroskop geringer Vergrößerung zu ermöglichen und um in der Lage zu sein, diese Löcher von jedem gelegentlich eingedrungenen Schmutz zu befreien. Die genannten Eingangs- und Ausgangskanäle sollen über flexible (z. B. aus Silikon bestehende) Leitungen mit den zugehörigen Flüssigkeitsbehältern verbunden werden. Diese Leitungen sollen an ihrem Eingang mit einem Siebfilter ausgestattet werden. Die kleinste Dimension der zugehörigen Filteröffnungen soll nicht größer als die kleinste Dimension des Querschnitts des Strömungssystems sein. Diese Vorsichtsmaßnahmen stellen sicher, daß das Strömungssystem des Analysators permanent mit einem Mikroskopdeckglas versiegelt werden kann, wobei hier - wie überall - nichtreflektierendes, nichtfluoreszierendes schwarzes Epoxid als Klebstoff benutzt werden soll.

In dem erfindungsgemäßen Multiparameterteilchenanalysegerät wird zwischen drei Einheiten klar unterschieden. Die erste Einheit ist der Sensor, der eine der physikochemischen Größen (Parameter) eines Teilchens in einen elektrischen Impuls umwandelt, dessen Amplitude proportional zu der Teilcheneigenschaft ist. Das dem Sensor zugeordnete Analysevolumen liegt in der zweiten Einheit, das heißt, im Ausgangskanal des Analysegeräts. Die zweite Einheit wiederum wird innerhalb der dritten Einheit angeordnet, das heißt in dem Analysegerät, worauf folgt, daß die beiden letzteren Einheiten funktionell durch die erste Einheit, das heißt den Sensor für ein Multiparameteranalysegerät, gekoppelt werden.

Der Grundkörper der Vorrichtung besitzt vorzugsweise - wenn auch nicht notwendig - die Form eines ziemlich flachen Zylinders, um die Bedingungen kurzer Eingangs- und Ausgangskanäle zu erfüllen. Diese Kanäle treten am Boden und/oder an den Seiten der Vorrichtung dort ein oder aus, wo die Mittel angeordnet sind, mit denen das Gerät an der Analyseeinrichtung befestigt wird. Aus den vorstehenden Gründen soll der Grundkörperdurchmesser der Vorrichtung ebenfalls so klein wie möglich sein. Die Vorrichtung soll aus einem nichtleitenden und nichtreflektierenden, nichtfluoreszierenden schwarzen Material bestehen, oder wenigstens alle aktiven Kanälwände sollen mit einem solchen Material bedeckt werden.

Die Analyseeinrichtung, das heißt die dritte Einheit, nimmt außerdem die verschiedenen optischen, mechanischen und elektrooptischen Vorrichtungen auf, die zum Betrieb der Analyseeinrichtung nötig sind.

Die verschiedenen aktiven Kanäle und die Düsenkammer werden entweder eingeschnitten, eingeformt, eingefräst usw. oder auf andere Weise in die glatte, polierte Oberseite des Grundkörpers der Vorrichtung eingebracht. Die Kanäle oder Hohlräume werden im allgemeinen Aktivräume genannt, weil die Kombination der verschiedenen Ströme bzw. die Teilchenanalyse oder das Teilchensortieren, wenn ein Sortierer mit Kernströmungsablenkung gemäß US-PS 41 75 622 im Analysator vorgesehen wird, in diesen Kanälen usw. stattfindet.

Die verschiedenen Analysevolumina werden im Ausgangskanal, nahe der Stromabseite der Düsenkammer, angeordnet. Dort soll der Ausgangskanal so weit sein, daß ein UV-Objektig großer numerischer Apertur und entsprechend großen Öffnungswinkels (etwa 120°) eine Teilchenbewegung in der Kernströmung "sehen" kann. Die Kernströmung soll ungefähr im Zentrum des Kanals ohne Behinderung durch dessen Seitenwände verlaufen, um sicherzustellen, daß das von dem jeweils zu analysierenden Teilchen emittierte fluoreszierende Licht durch das Weitwinkel-UV-Objektiv gesammelt wird.

Bei Berücksichtigung der erfindungsgemäßen Lehre kann die Kernströmung leicht so justiert werden, daß sie genau in der Brennebene fließt. Das zugehörige Kanalsystem verläuft nämlich parallel zum Deckglas und damit zur Brennebene des UV-Objektivs. Es gibt erfindungsgemäß aber auch die Möglichkeit, die Düsenkammer derartig zu formen, daß die Kernströmung im wesentlichen senkrecht zu der Brennebene durch diese Ebene fließt. Es gibt aber offenbar keinen Grund für die Teilchen, die genannte Brennebene senkrecht zu durchqueren.

Eine notwendige Bedingung für eine korrekte Analyse der Teilchen besteht darin, daß deren Durchmesser immer kleiner sind als die oben definierte Fokaltiefe bzw. Tiefenschärfe. Da die Tiefenschärfe von Objektiven großer numerischer Apertur und Vergrößerung sehr klein ist, das heißt etwa 10 bis 20 µm für ein Objektiv einer numerischen Apertur von A=1,30 beträgt, ist es für einen normalen Betrieb des Analysators erforderlich, daß die Teilchen parallel oder quasi parallel zu der Brennebene fließen. Hierfür ist gegebenenfalls eine extrem hohe Stabilität der Kernströmung erforderlich. Um diese Bedingungen zu erfüllen, wurde die erfindungsgemäße Düsenkammer geschaffen.

Die erfindungsgemäße Düsenkammer soll auf dieselbe Weise wie der Ausgangskanal in die Oberseite des Analysegeräts eingebracht, z. B. eingeschnitten, und mit demselben Deckglas wie der Ausgangskanal abgedeckt werden. Von oben sieht die Düsenkammer etwa aus wie ein länglicher Öltropfen, der sich in Richtung auf seinen Übergang zu dem Ausgangskanal verjüngt. Der Querschnitt der Düsenkammer soll eher rechteckig als kreisförmig sein. Die Düse soll in einem Düsenhalter so befestigt werden, daß sie leicht aus dem Analysegerät, das heißt aus der Düsenkammer, herausgenommen werden kann.

Der Eingangskanal der Hüllflüssigkeit (Elektrolyt) soll in die Düsenkammer am Boden von deren stromaufseitigem Ende mit einem bezüglich der Düse bzw. der Kammerachse erheblich kleineren Winkel als 90° eintreten, so daß die Hüllflüssigkeit schon beim Eintritt in die Düsenkammer unter einem Winkel von etwa 30° zu der Düse strömt. In der Tat bildet die Düse ein beträchtliches und notwendiges Hindernis im Weg des Stroms der Hüllflüssigkeit, das gilt ganz besonders in der Startphase, wenn die Kammer noch leer ist. Um daher durch diese Düse in der Startphase verursachte starke Turbulenzen und eine möglicherweise damit verbundene Entwicklung von Luftblasen zu eliminieren, wird der Übergang des Eingangskanals der Hüllflüssigkeit in der Wandung der Düsenkammer derart abgerundet, daß die Düsenkammer wie eine leicht gebogene Fortsetzung des Eingangslochs aussieht. Der Eingangskanal der Hüllflüssigkeit kann an seinem Anfang und außerhalb der Vorrichtung jeden beliebigen Querschnitt besitzen. Sein Querschnitt soll sich jedoch graduell (in Kanallängsrichtung) so ändern, daß an dem Übergang in die Düsenkammerwand quasi ein rechteckiger Querschnitt entsteht, der wiederum glatt in die Wandung übergehen soll.

Um die Möglichkeit der Ausbildung von Turbulenzen und damit des Entstehens von Luftblasen am Eingang des Eingangskanals in die Düsenkammer zu reduzieren, soll gemäß weiterer Erfindung nicht nur diese Zusammentreffstelle in der vorgenannten Weise geglättet werden, sondern es soll auch eine Ausfütterung spezieller Form zwischen der Oberseite der Düse und dem Deckglas angeklebt werden. Die Ausfütterung soll jedoch nicht an die Düse, sondern genau umgrenzt an das Stromaufende der Düsenkammerwandung und eventuell, wenn das Deckglas selbst auf die Oberseite der Analysatorvorrichtung geklebt wird, auch an das Deckglas geklebt werden.

Die zuletzt genannte erfindungsgemäße Ausfütterung soll solche gekrümmten Seiten haben, daß sie wie der Bug eines Flugzeugträgers aussieht. Mit Hilfe eines derartigen Flächensystems, das in bezug auf die durch die Düsenachse und den Ausgangskanal definierte Symmetrieebene symmetrisch sein soll, werden die beiden durch die Düse aufgespaltenen, vorher definierten Unterteilströme wieder glatt zusammengeführt. Ein anderer Teilstrom dieses Hüllflüssigkeit fließt - wie gesagt - sofort etwa parallel zur Düse in Richtung auf den Ausgangskanal. Die genannte Ausfütterung jedoch soll eine solche Form haben, daß die aufgespaltenen und nun vereinigten Unterteilströme und der zuletzt genannte untere Teilstrom schon die Düse selbst nach einem gewissen Strömungsweg vollständig und ohne Turbulenzen umhüllen, bevor sie in Berührung mit der Flüssigkeit der aus der Spitze der Düse fließenden Kernströmung kommen.

Wie sich durch Vergleich mit dem Stand der Technik nach der US-PS 41 76 662 ergibt, kann eine von vornherein stabile Kernströmung in einer solchen Düsenkammer nur erzeugt werden, wenn sich in der Startphase Luftblasen in den Bereichen nicht entwickeln, in denen erfindungsgemäß die spezielle Ausfütterung angebracht wird. Der Einsatz dieser Ausfütterung ist daher wohl begründet.

Nach ihrem Entstehen fließt die Kernströmung in den Ausgangskanal und trägt die zu analysierenden Teilchen in das jeweilige Analysevolumen. Nach dem Passieren dieser Analysevolumina fließt die Strömung entweder direkt in eine Abfallsammelflasche oder in einen anderen Teil der Vorrichtung, z. B. in einen Sortierer, in dem die Kernströmung zum Sortieren abgelenkt wird. Mit einem solchen Sortierer, der in der US-PS 41 75 662 beschrieben wird, läßt sich das erfindungsgemäße Analysegerät leicht kombinieren.

Das erfindungsgemäße Analysegerät kann natürlich auch in Kombination mit dem UV-Mikroskopsystem mit Auflichtbeleuchtung, wie es bereits im Zusammenhang mit dem Strömungssystem nach Dittrich und Göhde (a.a.O.) angegeben wird, eingesetzt werden. Ebenfalls soll dazu das Analysevolumen des UV-Mikroskops in dem geraden Ausgangskanal der Vorrichtung leicht stromabwärts der Zusammentreffstelle von Düsenkammer und Ausgangskanal positioniert werden. Der beträchtliche zusätzliche Vorteil dieser Kombination besteht darin, daß für das Analysevolumen im wesentlichen nichts anderes als ein gerader Kanal gebraucht wird. Die erfindungsgemäße Gerätekombination ist daher unvergleichlich einfacher als die von Dittrich und Göhde (a.a.O.) beschriebene Vorrichtung. Trotzdem umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung alle guten Eigenschaften, namentlich die optischen Eigenschaften, des genannten bekannten Systems. Wenn die genannte einfache erfindungsgemäße Vorrichtung mit dem in der US-PS 42 37 416 beschriebenen und weiter in der US-PS 41 75 662 erläuterten elektrischen Sensor kombiniert wird, können auch weitere Parameter, namentlich das Teilchenvolumen, analysiert werden. Eine solche Vorrichtung wird daher in Zukunft als kombiniertes Analysegerät bezeichnet werden.

Weiterhin kann eine zusätzliche Lichtquelle, namentlich ein Laser mit der Energie der genannten Quecksilberlampe vergleichbarer UV-Energie, mit der Quecksilberlampe in einer "und/oder"-Kombination über eine Zahl von Spiegeln und Linsen üblicher Art kombiniert werden. Der Vorteil eines derart "zuschaltbaren" Lasers, der im folgenden als Epilaser bezeichnet wird, besteht darin, daß sein räumlich gefilterter und homogenisierter Strahl in einen sehr dünnen und engen bandartigen Strahl umgeformt werden kann. Wenn dann der Strahl viel dünner als die Längsdimension des jeweils zu analysierenden Teilchens ist, wird nur ein kleiner Teil, ein dem Schlitz entsprechender Streifen des Teilchens, durch den Strahl beleuchtet, und, wenn das Teilchen passend gefärbt ist (z. B. mit einer fluoreszierenden Substanz), wird die Verteilung der gefärbten Einheit (DNA) oder Protein) innerhalb des Teilchens ermittelt, wenn das Teilchen am UV-Objektiv vorbeigleitet. Auf diese Weise können zusätzliche Informationen über die Teilchen-, insbesondere Zellstruktur, erhalten werden. Natürlich kann eine Lasereinrichtung mit einem Epilaser sowohl als einfache als auch als kombinierte Laservorrichtung benutzt werden.

Zum Anregen von Lichtenergie in der Größenordnung von 1 W oder mehr kann jedoch die Auflichtmode (Epilaser) nicht benutzt werden. Aus Versuchen ist nämlich bekannt, daß wärmeempfindliches Material, das den Raum zwischen den Linsen des UV-Objektivs füllt, bei solchen Energien ausbrennt und dadurch das Objektiv für die weitere Benutzung unbrauchbar macht. In einigen Fällen ist trotzdem eine so hohe Lichtenergie erforderlich. Das ist der Fall bei der Analyse vieler Chromosomen und Bakterien, deren DNA-Betrag ziemlich klein ist. Es wird daher eine höhere Lichtanregungsenergie benötigt, wenn von den Teilchen ein für die Analyse genügend starkes Fluoreszenzlicht geliefert werden soll.

Eine weitere Variante des beschriebenen Systems - sowohl in der einfachen als auch in der kombinierten Version - wird erhalten, wenn ein Hochleistungslaser verwendet wird, der die Kernströmung und damit die zu analysierenden Teilchen direkt beleuchtet bzw. durchleuchtet. Gegebenenfalls soll der räumlich gefilterte und vergleichmäßigte Laserstrahl in ein Kanalsystem gerichtet werden, das aus zwei Halbkegeln mit einer gemeinsamen Achse besteht. Die gemeinsame Achse soll senkrecht zu der optischen Achse des UV-Objektivs und zu der Kernströmung, das heißt zu dem Ausgangskanal, gerichtet sein. Die beiden Halbkegel können in die Oberseite der Vorrichtung auf dieselbe Weise wie die Düsenkammer und der Ausgangskanal eingeschnitten werden. Die spitzen Enden der beiden Halbkegel, die an beiden Seiten des Ausgangskanals liegen, reichen dann an bzw. in die vertikalen entsprechend UV-transparenten Seitenwände des Kanals.

Aus der vorstehenden Beschreibung folgt, daß der genannte Direktlaserstrahl, die optische Achse des UV-Objektivs und die Kernströmung ein annähernd orthogonales Achsensystem bilden. In dieser Hinsicht ist das erfindungsgemäße Analysegerät ähnlich demjenigen des bekannten Jetanalysatorsystems. Das erfindungsgemäße System ist jedoch viel stabiler und zuverlässiger wegen seiner schwankungsfreien Kernströmung und wegen der Möglichkeit, ein UV-Objektiv einzusetzen, das 10mal so stark ist wie das im bekannten Analysator.

Die auch als Lichtkanäle bezeichneten Halbkegel müssen keinen kreisförmigen Querschnitt besitzen, ihr Querschnitt kann genauso gut rechteckig sein; ihr Öffnungswinkel soll so groß wie möglich sein, um auch das unter entsprechend großen Winkeln an den Teilchen bei der Passage durch den Strahl des Direktlasers gestreute Licht sammeln zu können. Der Querschnitt der beiden Lichtkanäle am Ausgangskanal soll in der Größenordnung von 0,1×0,1 mm² liegen, damit der Strahl des Direktlasers bequem durch den Austrittskanal hindurchtreten kann. Die Wände der Lichtkanäle sollen nichtreflektierend und nichtfluoreszierend schwarz sein. Diese Kegelkanäle selbst sollen mit einem UV-transparenten Material, z. B. einem Epoxid guter Qualität, das bis herunter zu 200 nm transparent ist, mit einem Stück Quarz geeigneter Form oder mit lichtleitenden Fasern der passenden Qualität gefüllt werden. Die äußeren Enden der Lichtkanäle werden gegebenenfalls flach geschliffen und poliert. Schließlich soll ein kleines Stück Deckglas aus einem Epoxid hoher Qualität auf die polierte Fläche aufgeklebt werden, um ein leicht zu reinigendes Fenster dieser Kanäle zu erhalten. Für den Fall der Anwendung von Direktlasern sehr hoher Energie wird Quarz als Füllung der Kanäle bevorzugt, und der Grundkörper der Vorrichtung wird aus Metall hergestellt, um eine bessere Kühlung zu gewährleisten.

Aus dem Vorstehenden folgt, daß ein von einem Hochleistungsdirektlaser kommender Laserstrahl durch einen der Halbkegel (Lichtkanäle) geht, in den Ausgangskanal eintritt, die Kernströmung durchquert und darin gegebenenfalls mit einem Teilchen in Wechselwirkung tritt. Das Ergebnis einer solchen Wechselwirkung ist eine partielle Streuung des Laserstrahls, wobei die Kleinwinkelstreukomponente von dem durchgehenden bzw. persistenten Strahl beim Verlassen des anderen Halbkegels (Lichtkanals) getrennt werden kann.

Die Komponente der Kleinwinkelstreuung des Direktlaserlichts wird benutzt, um das jeweilige Teilchen zu klassieren. Wenn das Teilchen gefärbt ist, sammelt das Weitwinkel-UV-Objektiv das von dem Teilchen kommende Fluoreszenzlicht. Das zugehörige Analysevolumen liegt um den Kreuzungspunkt von Direktlaserstrahl und Kernströmung. Da das hierbei wiederum einsetzbare Weitwinkelobjektiv etwa 10mal mehr Fluoreszenzlicht von einem gefärbten Teilchen sammeln kann als die in dem bekannten Jetsystem verwendbaren Objektive großer Brennweite, ist das erfindungsgemäße Direktbeleuchtungssystem entsprechend empfindlicher als das Jetsystem. Diese höhere Empfindlichkeit ist aber wichtig bei Analyse und Sortierung kleiner Teilchen, wie Zellen oder Chromosomen. Gegebenenfalls wird der Direktlaser zusammen mit den anderen Teilen der Analyseeinrichtung auf einen optischen Tisch montiert. Natürlich sind dann auch dieselben Sicherheitsvorkehrungen wie bei dem Jetsystem wegen der Verwendung von Hochleistungslasern zu treffen.

Da die Strahlen der Epilaser und der Direktlaser in der erfindungsgemäßen Einrichtung nahezu senkrecht zueinander stehen, kann eine sogenannte zweidimensionale Schlitzscananalyse ausgeführt werden. Voraussetzung dafür ist, daß beiden Strahltypen die Form eines sehr dünnen Bandes aufgezwungen und beide Strahltypen zugleich eingesetzt werden. Auf diese Weise können weitere Informationen über die innere Struktur der analysierten Teilchen erhalten werden. Mit Hilfe eines solchen Doppelschlitzscanning lassen sich Zellschwellungen oft von deformierten Zellen, welche letztere in einigen Fällen krebsartig sind, unterscheiden; vgl. L. L. Wheeles et al., J. Histochem. Cytochem., 1979, Band 27, Seite 596.

Wie gesagt, soll das Strömungssystem der erfindungsgemäßen Vorrichtung so konstruiert werden, daß jeder Teil des Inneren entweder direkt oder durch das Deckglas, das die Kanäle auf der Oberseite abdeckt, klar einzusehen ist. Die Einsehbarkeit soll dabei unabhängig davon bestehen, ob das System leer ist, oder ob darin Elektrolyt fließt. Außerdem soll jeder Teil des Systeminnern durch ein mechanisches Mittel, z. B. durch einen dünnen Draht, einen Faden oder einen Wasserstrahl erreichbar sein, derart, daß jedes unerwünschte Teilchen leicht aus dem Strömungssystem zu entfernen ist. Insbesondere das Innere der Düsenkammer kann auf diese Weise leicht erreicht werden, weil die Düse lösbar in den Düsenhalter gesteckt wird und daher die beiden Teile entsprechend leicht trennbar sind.

Wegen der guten Zugänglichkeit durch die Kanäle kann das Strömungssystem am Ende der Montage mit einem Deckglas unter Verwendung eines nichtreflektierenden und nichtfluoreszierenden schwarzen Epoxids permanent versiegelt werden. Da ferner das gesamte Innere des Kanalsystems ebenfalls die vorgenannten optischen Eigenschaften besitzen soll, wird die Hintergrundbeleuchtung entsprechend vermindert und damit das Signal-Rausch-Verhältnis beträchtlich im Vergleich zu früheren Vorrichtungen, bei denen das Deckglas lösbar mit einem Ring von Federn auf der Oberseite der Vorrichtung, eventuell unter Zwischenfügung von Vakuumfett zur besseren Abdeckung befestigt war, vergrößert. Versuche haben gezeigt, daß diese frühere Verfahrensweise zum Abdecken des Kanalsystems ziemlich unpraktikabel ist, weil es absurd erscheint, ein sorgfältig gereinigtes Deckglas auf die gefettete Oberseite der Vorrichtung zu setzen. Durch das erfindungsgemäß vorgesehene permanente Aufkleben des Deckglases auf die Oberseite der Vorrichtung werden die entsprechend mühevollen Arbeiten vollständig überflüssig.

Auch eine Routinereinigung der Vorrichtung innerhalb und außerhalb läßt sich leicht ausführen: Das Innere kann durch Spülen des Kanalsystems mit einem handwarmen Detergens, das man für einige Zeit durch das System fließen läßt, gereinigt werden. Die Oberfläche kann mit einem Baumwollkissen (Q-Tip), das in Reinigungsbenzin getaucht wird, geputzt werden, um die verwendete Immersionsflüssigkeit und anderen Schmutz abzutragen. Die gesamte Wartung der neuen Vorrichtung ist daher beträchtlich gegenüber dem Fall bekannter Einrichtungen, wie sie beispielsweise von Dittrich und Göhde (a.a.O.) angegeben werden.

Ein wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen "oben-transparenten" Kanalsystems liegt darin, daß eine mit schwarzer Tinte gefärbte, fadenartig dünne Kernströmung unter Verwendung eines Stereomikroskops deutlich von der sie einschnürenden Hüllströmung unterscheidbar ist. Hieraus folgt, daß Form und Größe der Kernströmung von ihrem Ausgangspunkt an der Spitze der Düse bis zu ihrem Ende am Ausgangsloch der Vorrichtung genau beobachtet werden können.

Form und Größe der Kernströmung können auf den jeweils passenden Querschnitt entweder durch Einstellung des Querschnitts der Düsenspitze oder durch Reduzieren des Flusses der die Kernströmung bildenden Flüssigkeit außerhalb der Vorrichtung gebracht werden. Dabei kann das Reduzieren entweder durch Vergrößern des hydrodynamischen Widerstands der Verbindungsleitung der Kernstromflüssigkeit oder durch Vermindern von deren Niveau relativ zum Niveau der Hüllflüssigkeit erfolgen. Sehr kleiner Querschnitte der Leitungen sollen jedoch wegen der Verstopfungsgefahr vermieden werden.

Die vorstehende Beschreibung der Analyseeinrichtung mit drei Lichtquellen zeigt, daß dieses System Schritt für Schritt aufgebaut werden kann, wobei zunächst mit einer einfachen Analyseeinrichtung mit lediglich einer Quecksilberlampe anzufangen und später entweder mit einem oder mit beiden der genannten Lasertypen fortzufahren ist. Diese "Dominostein"-Konstruktion macht es auch Forschergruppen mit geringem Budget möglich, mit der Zeit die komplizierteste Analyseeinrichtung aufzubauen.

Für eine Massenproduktion der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird ein Preßformverfahren zum Herstellen des Strömungssystems vorgeschlagen, weil die Tiefe der verschiedenen Teile des Systems unterschiedlich ist. Wenn also einmal eine Vorrichtung hoher Qualität entwickelt worden ist und eine Massenproduktion gewünscht wird, braucht von der Vorrichtung nur ein Negativ abgeformt zu werden, mit dessen Hilfe eine Vielzahl erfindungsgemäßer Vorrichtungen immer gleicher Qualität herzustellen ist.

Anhand der schematischen Darstellung von Ausführungsbeispielen werden Einzelheiten der Erfindung erläutert. Es zeigt

Fig. 1a eine Draufsicht auf ein Analysegerät;

Fig. 1b einen Schnitt längs der Linie Ib-Ib von Fig. 1;

Fig. 2a eine Draufsicht auf ein Analysesystem mit drei Hauptlichtquellen; und

Fig. 2b einen Aufriß des Systems nach Fig. 2a.

Die in Fig. 1b gekennzeichnete Schnittebene Ib-Ib stellt eine Symmetrieebene eines praktisch ausführbaren, hochstabilen und zuverlässigen Analysegeräts nach Fig. 1a dar. Die Symmetrieebene wird durch die Achse 1 eines zylindrischen Grundkörpers 2 des Geräts und durch die Mittellinie eines Ausgangskanals 3 definiert. Durch den Ausgangskanal 3 fließt eine Kernströmung 4. Diese ist eine hydrodynamisch fokussierte Fortsetzung der aus einer Düse 6 kommenden Flüssigkeit 5 der Kernströmung.

Im Ausführungsbeispiel gemäß Zeichnung besteht der Grundkörper 2 des erfindungsgemäßen Geräts aus einem Doppelmantelzylinder, also aus zwei konzentrischen Zylindern, von denen der äußere Zylinder einen Durchmesser von etwa 30 mm besitzt, während der Durchmesser des inneren Zylinders etwa 18 mm betragen kann. Letzterer begrenzt die Oberseite 7 des Geräts. Durch Wahl eines inneren Zylinders mit 18 mm Durchmesser wird der Gebrauch eines genormten Mikroskopdeckglases 8 ermöglicht, das ebenfalls einen Durchmesser von 18 mm besitzt.

Das Deckglas 8 überdeckt nicht nur den Ausgangskanal 3, sondern auch eine Düsenkammer 9 (Fig. 1b). Normalerweise soll das Deckglas 8 permanent auf die Oberseite 7 des Geräts geklebt werden. Zu Beginn der Gerätemontage kann das Deckglas 8 - für Zwecke der Erprobung - jedoch mit Hilfe eines (nicht gezeichneten) Rings fingerartiger Federn auf die Oberseite 7 gedrückt werden. Hierzu können drei Löcher 10, von denen eines in Fig. 1a dargestellt wird, und drei zugehörige Schrauben - vorzugsweise außerhalb des Durchmesserbereichs des inneren Zylinders - vorgesehen werden.

Das erfindungsgemäße Gerät besitzt im Ausführungsbeispiel die Form eines flachen Zylinders, dessen Hilfe bei einem Durchmesser von etwa 30 mm nur etwa 8 mm betragen soll. Hieraus folgt, daß die verschiedenen Eingangs- und Ausgangskanäle ziemlich kurz sein können, wie es auch nach den oben erläuterten Konstruktionsprinzipien gefordert wird.

Das Material des Grundkörpers 2 soll vorzugsweise elektrisch nichtleitend sowie optisch nichtreflektierend und nichtfluoreszierend schwarz sein. Wenn diese Bedingung nicht ohne weiteres zu erfüllen ist, kann ein entsprechender Hartkunststoff zum Herstellen des Grundkörpers 2 verwendet werden. Die Wände der aktiven Kanäle, die auch als Hohlräume bezeichnet werden und in denen entweder die verschiedenen Strömungen kombiniert bzw. vereinigt werden oder die Teilchenanalyse stattfindet, sollen mit einer dünnen Schicht eines Materials mit den vorgenannten Eigenschaften bedeckt werden. Hierzu hat sich schwarzes Epoxid schon bewährt. Das Deckglas 8 soll - in der Endphase der Montage - mit derselben Epoxidart auf die Oberseite 7 geklebt werden.

In die untere Fläche des Teils mit größerem Durchmesser des Grundkörpers 2 wird vorzugsweise eine etwa V-förmige Nut 11 eingeschnitten. Mit Hilfe dieser Nut 11 und drei in einer (nicht gezeichneten) Bajonettfassung vorgesehenen Schrauben kann das Gerät in der Fassung fixiert werden. Die Bajonettfassung wiederum wird in einen Justierteil der Analyseeinrichtung angeordnet, in dem sie und mit ihr das Analysegerät in einer vorzugsweise horizontalen XY-Ebene derart zu verschieben ist, daß die Geräteachse 1 zumindest in eine Parallellage zur optischen Achse eines (nicht gezeichneten) UV-Objektivs gelangt, vorzugsweise aber mit der optischen Achse zusammenfällt.

In den Fig. 1a und 1b wird ein idealer Fall angenommen, in dem die Geräteachse 1 und die optische Achse des UV-Objektivs zusammenfallen, so daß sie beide mit der Ziffer 1 bezeichnet werden können. Unter dieser die Beschreibung vereinfachenden Bedingung gehen nicht nur die Kernströmung 4, sondern auch die optische Achse 1 und der Strahl 13 eines Direktlasers durch den Bereich einer Blende 12 des erfindungsgemäßen Geräts. Im gezeichneten Ausführungsbeispiel tritt der Direktlaserstrahl 13 von der rechten Seite der Kernströmung 4 her in das Gerät ein. Drei Einheiten bzw. Bestimmungen definieren ein quasi orthogonales Achsensystem an der Blende 12.

Für den Direktlaserstrahl 13 soll der Ausgangskanal 3 an der Blende 12 nicht nur auf der Oberseite 7 (durch das Deckglas 8), sondern auch an seinen vertikalen Seiten UV-transparent sein. Das wird durch zwei Fenster 14a und 14b erreicht, die aus demselben Material hergestellt werden können wie die Füllung der dem Laserstrahl 13 zugeordneten optischen Kanäle 15a und 15b. Das dem jeweiligen Laser gegenüberliegende Ende des optischen Kanals 15b soll mit einem kleinen Glasstück 16 (Fig. 1a) verschlossen werden. Gegebenenfalls soll das Glasstück 16 mit Hilfe des Materials des Füllmittels, das auch die Kanäle ausfüllt, auf das jeweilige Kanalende geklebt werden. Ein Epoxid hoher optischer Qualität ist als transparent bis herunter zu 200 nm bekannt und daher für den vorliegenden Zweck gut geeignet. Auch je ein passend geformter Quarzkeil kann in die Kanäle eingesetzt werden. Bevor jedoch die Kanäle gefüllt werden, sollen ihre Wände mit einem nichtreflektierenden und nichtfluoreszierenden schwarzen Material, vorzugsweise mit dem vorgenannten schwarzen Epoxid, bestrichen werden. Die Füllung soll zusammen mit der Oberseite 7 des Geräts geschliffen und poliert werden. Anschließend soll das Deckglas 8 auf die Oberseite 7 aufgeklebt werden.

In der angegebenen Anordnung befindet sich das UV-Objektiv senkrecht über der Oberseite 7 des Geräts, und die Brennebene des Objektivs verläuft parallel zu der Oberseite 7. Das UV-Objektiv kann daher mit Hilfe einer Feingewindeschraube so positioniert werden, daß die Kernströmung 4 die Brennebene diametral durchläuft.

Nach den erfindungsgemäßen Konstruktionsprinzipien und nach der obigen allgemeinen Beschreibung sind für eine Analyse hoher Qualität zwei Kriterien von großer Bedeutung, nämlich

• - die Tiefenschärfe des UV-Objektivs soll größer sein als der Durchmesser des zu untersuchenden Teilchens; und
• - die Kernströmung 4 soll bei jedem Betriebsbeginn und bei jedem Betrieb des Geräts in der Brennebene verlaufen.

Für Teilchen (z. B. Chromosomen) mit Durchmessern bis zu 20 µm wird das zweite Kriterium (das Stabilitätskriterium) gut erfüllt, wenn das ZEISS-NEOFLUAR-100/1,30-UV-Objektiv benutzt wird; letzteres wurde übrigens auch in dem aus der US-PS 37 38 750 (W. Dittrich und W. Göhde) bekannten System eingesetzt. Bei größeren Durchmessern können andere Objektive, z. B. das Objektiv NEOFLUAR 63/1,25 oder Objektive mit noch kleinerer Vergrößerung als 63, verwendet werden. Letztere Objektive besitzen eine größere Tiefenschärfe als die erstgenannten. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß Objektive mit geringerer Vergrößerung und einer geringeren numerischen Apertur ziemlich unerwünscht sind, weil sie entweder weniger Licht sammeln oder weil ihr Gesichtsfeld recht groß ist und daher die Anregung durch Auflicht geringer wird. Das wiederum hat ein kleineres Signal-Rausch-Verhältnis und damit eine Qualitätsminderung des Analysegeräts zur Folge. Daher sollte, wenn immer möglich, ein Hochleistungsobjektiv nach Art von NEOFLUAR 100/1,30 benutzt werden.

Erfindungsgemäß soll das Strömungssystem so konstruiert werden, daß die Kernströmung 4 extrem gut stabilisiert wird. Hierzu werden in der Düsenkammer 9 Ausfütterungen 17 und 18 vorgesehen. Ohne diese Ausfütterungen 17 und 18 besitzt die Düsenkammer 9 die Form des Bugs eines relativ einfachen Schiffs. Der Vorderteil 19 der Düsenkammer 9 ist zugespitzt und mit der Spitze auf den Ausgangskanal 3 ausgerichtet. Im allgemeinen ist der Querschnitt des Vorderteils 19 etwa rechteckig. Die wichtige Rolle der Ausfütterung 17 und 18 wird erst weiter unten beschrieben.

Die Düse 6 wird im allgemeinen aus einem flexiblen Kunststoffrohr hergestellt, um sie genau ausgerichtet positionieren zu können. Gegebenenfalls wird mit Hilfe der Düse 6 auch die Kernströmung 4 innerhalb einer Hüllströmung exakt ausgerichtet. Die Düse 6 wird mit Hilfe eines Düsenhalters 20 in das Stromaufende der Düsenkammer 9 gesteckt. Der Düsenhalter 20 wird in ein Langloch 21 gesetzt. Hierzu wird ein aus Gummi oder weichem Kunststoff (Silikon) bestehendes Rohr 22 vorgesehen, das den Düsenhalter 20 luftdicht, aber lösbar fixiert. An den Grundkörper 2 des Geräts wird ein kleines Stück 23 aus Hartkunststoff geklebt, um das Bohren eines geeigneten Langlochs 21 für den Düsenhalter 20 zu ermöglichen.

Nach Fig. 1a und 1b ist das Eintrittsströmungssystem der Suspension bzw. Flüssigkeit 24 der Kernströmung recht einfach: Die Flüssigkeit 24 wird in einen (nicht gezeichneten) offenen Behälter gefüllt, von dort aus gelangt die Flüssigkeit durch ein Siebfilter und ein kurzes, vorzugsweise aus Silikon bestehendes Rohr (nicht gezeichnet) in einen Eingangskanal 25 und fließt zur Spitze der Düse 6. Dort nimmt die hier gebildete Kernströmung 4 zuerst eine konische Form an, das heißt, die Flüssigkeit 5 wird durch die in Fig. 1a mit den beiden Strömungslinien angedeutete Hüllströmung 26 direkt und durch das zugespitzte Vorderteil 19 der Düsenkammer 9 indirekt fokussiert. Durch diesen Übergang und als Folge des Einschlusses in die Hüllströmung 26 wird die Flüssigkeit 5 in der Form der Kernströmung 4 fokussiert und als solche dem Analysevolumen im Bereich der Blende 12 zugeführt. Anschließend gelangt die Kernströmung 4 entweder zu einem Ausgangsloch oder zu einer Sortiervorrichtung, vorzugsweise zu einer Ablenksortiervorrichtung gemäß US-PS 41 75 662.

Während das Strömungssystem der die zu untersuchende Suspension transportierenden Kernströmung 4 relativ einfach ist, gilt dasselbe keinesfalls für das Strömungssystem zum Herstellen der durch die genannten Strömungslinien von Fig. 1a repräsentierten Hüllströmung 26. Tatsächlich rühren, wie frühere Untersuchungen zeigen, alle Schwierigkeiten, das heißt die Unzuverlässigkeit und Unstabilität anderer Analyseeinrichtungen, daher, daß die Kernströmung 4 auf ungeeignete Weise mit der Flüssigkeit 27 einer Hüllströmung 26 umgeben wird.

Bei der früheren Gerätekonstruktion werden zum genauen Einstellen des Strömungssystems mit dem Ziel einer zuverlässigen und stabilen Teilchenanalyse folgende Prinzipien verwendet: Die Kanäle und Strömungen sollen mit einem sehr kleinen Winkel aufeinanderstoßen, um Turbulenzen und damit die Erzeugung von Luftblasen, insbesondere auch schon bei Betriebsbeginn (also bei leerem Strömungssystem) auf praktisch den Wert Null zu reduzieren. Es sollen ferner keine abrupten Übergänge an Änderungen des Kanalquerschnitts vorkommen. Auch sonstige scharfe Kanten oder Ecken innerhalb des Strömungssystems, die eventuell erzeugte Luftblasen festhalten können, sollen vermieden werden. Der Querschnitt der Düsenkammer soll quasi rechteckig sein oder bei Verwendung zusätzlicher Ausfütterungen eine Form besitzen, die ein Zusammenführen vorher aufgespaltener Teilströmungen unter einem turbulenzfreien kleinen Winkel erlaubt.

Im folgenden wird gezeigt, daß das Strömungssystem nach Fig. 1a und 1b die vorgenannten Bedingungen für den Strom der Hüllflüssigkeit und für die Hüllströmung selbst erfüllt: Nach Fig. 1b tritt ein Strom der Hüllflüssigkeit 27 (im allgemeinen eine reine physiologische Kochsalzlösung oder destilliertes Wasser) durch einen Eingangskanal 28 unter einem Winkel kleiner als 90° in bezug auf die Achse der Düse 6 in den Grundkörper des Analysegeräts ein. Die Flüssigkeit 27 wird mit einem sehr feinen Sieb (nicht gezeichnet) gefiltert und dem Eingangskanal 28 aus einem flexiblen, vorzugsweise aus Silikon bestehenden Rohr (nicht gezeichnet) zugeführt.

Der Eingangskanal 28 der Hüllflüssigkeit 27 besitzt vorzugsweise einen am Anfang kreisförmigen Querschnitt mit in Richtung auf die Düse 6 abnehmendem Durchmesser. Eine dadurch bedingte Steigerung der Strömungsgeschwindigkeit (in Strömungsrichtung) ist im allgemeinen wünschenswert, weil auf diese Weise kleine Luftblasen von oft unbekannter Herkunft besser aus dem Strömungssystem ausgewaschen werden können. Von diesen Blasen ist bekannt, daß sie ziemlich fest an jeder Ecke oder scharfen Kante in der Wandung kleben und wie feste Materialteile wirken, so daß sie oft so beträchtliche Änderungen in dem Flüssigkeitsstrom erzeugen, daß der Betrieb der Vorrichtung insgesamt unmöglich wird. Gegebenenfalls kann die Situation nur durch Erneuerung der Elektrolytfüllung des Strömungssystems beherrscht werden.

Nach einer kurzen Distanz ändert sich der Querschnitt des Eingangskanals 28 von der Kreis- zu einer Rechteckform. Im Ausführungsbeispiel nach Fig. 1b beginnt dieser Übergang an der Linie 29, die die Projektion eines Halbkreises auf die Papierebene darstellt. Die allmähliche Verkleinerung des Querschnitts des verbleibenden Teils des Eingangskanals 28 wird teilweise hergestellt durch Abtragen, insbesondere Schneiden oder Fräsen, des oberen Teils des kreisförmigen Kanalquerschnitts zum Erzielen der annähernd rechteckigen Form und teilweise durch Auffüllen des unteren Teils mit der unteren Ausfütterung 18.

Für die weitere Beschreibung der Strömung der Hüllflüssigkeit 27 wird diese als theoretisch in einen unteren und einen oberen Teilstrom 31 bzw. 30 unterteilt betrachtet. Nach Fig. 1b fließt der untere Teilstrom 31 der Hüllflüssigkeit 27 glatt unter die Düse 6 bzw. deren Eingangskanal 25. Demgegenüber wird der obere Teilstrom 30 durch die Düse nochmals in zwei Teile aufgespalten. Diese beiden Unterteilströme 30′ und 30′′ fließen wieder oberhalb der Düse 6 glatt zusammen. Bei dieser Vereinigung spielt die erfindungsgemäße, gegenüber der Oberseite der Düse 6 vorgesehene obere Ausfütterung 17 eine wesentliche Rolle. Da diese obere Ausfütterung 17 nach Art eines Flugzeugträgerbugs geformt sein soll, zwingt sie die beiden Unterteilströme 30′, 30′′ dazu, sich unter einem so kleinen Winkel zu vereinigen, daß sie nicht frontal zusammenstoßen können, sondern eher tangential ineinander übergehen.

In früheren Vorrichtungen dieser Art, in denen eine obere Ausfütterung 17 fehlt, entwickelt sich an deren Stelle eine ziemlich große Luftblase. Die Blase entsteht in den früheren Geräten insbesondere fast immer in der Anfangsphase des Betriebs, das heißt, wenn das Strömungssystem unter der Wirkung einer an den Ausgang angeschalteten Saugpumpe mit Elektrolyt aufgefüllt wird. Offensichtlich rühren diese Blasen von der Frontalkollision der beiden Unterteilströmungen her. Wenn an dem genannten Ort eine Blase beobachtet wurde, war der Betrieb des Strömungssystems nicht akzeptabel, wenn sich jedoch eine solche Luftblase nicht bildete, konnten Kernströmungsdurchmesser bis herab zu 1 µm unter einem Stereomikroskop mit einer 50fachen Vergrößerung beobachtet werden; eine mit schwarzer Tinte kontrastierte Strömung schwankte überhaupt nicht. Das bedeutet, daß mit Hilfe eines Strömungssystems nach Fig. 1a und 1b ein Analysator hoher Zuverlässigkeit und Stabilität zu konstruieren ist, wenn man nur das Ausbilden von Luftblasen in der Anfangsphase des Strömungsbetriebs verhindert.

Die verschiedenen Teilströmungen und Unterteilströmungen 31 bzw. 30′ und 30′′ sollen sich weiterhin deutlich vor Erreichen der Düsenspitze miteinander vereinigen und die Düse 6 umgeben. Nur auf diese Weise läßt sich erreichen, daß die tatsächliche Hüllströmung 26 den konischen Teil 5 der Kernströmung korrekt einschließt und dann hydrodynamisch fokussiert.

Ferner ist es wünschenswert, wenn auch nicht unbedingt erforderlich, die Querschnittsdimensionen des Ausgangskanals 3 - nach Breite und Tiefe - so einzustellen, daß diese Maße proportional denjenigen des zugespitzten Vorderteils 19 der Düsenkammer 9 werden, weil nur in diesem Fall, wenn auch die Ausgangsöffnung der Düse 6 Kreisform besitzt, ein kreisförmiger Querschnitt der Kernströmung 4 zu erreichen ist. Diese Tatsache ist Folge der laminaren Strömung im zugespitzten Vorderteil 19 der Düsenkammer 9 und zugleich Folge des ganzen übrigen Strömungssystems.

Auch Kernströmungen mit anderen Querschnitten können durch Einstellen der Geometrie des Ausgangs der Düse 6 eingestellt werden. Während beispielsweise Strömungen mit kreisförmigem Querschnitt gut geeignet sind für runde oder langgestreckte Teilchen, werden bandartige Kernströmungen bevorzugt, wenn flache Teilchen horizontal oder vertikal orientiert werden sollen, wenn also der Querschnitt der Kernströmung 4 vergleichbar mit demjenigen der zu untersuchenden Teilchen oder Zellen ist. Auch läßt sich der Querschnitt der Kernströmung durch Wahl des hydrodynamischen Widerstandes im Anschlußrohr der Hüllstromflüssigkeit von außen einstellen bzw. vorgeben.

In den zuletzt genannten Fällen können bandförmige Laserstrahlen, die senkrecht zum Teilchenstrom gerichtet werden, zum ein- oder zweidimensionalen Schlitzscanning oder zum Multiplexen sehr geeignet sein (vgl. den oben angegebenen Aufsatz von Severin et al.), wenn beide Laser denselben Teil der Kernströmung 4 oder verschiedene Teile der letzteren beleuchten. Da die stabile Kernströmung 4 immer in der Brennebene des UV-Objektivs fließt, bewegt sich auch das jeweils zu untersuchende Teilchen in der Ebene. Auf diese Weise läßt sich also eine optimale Bedingung sowohl für die Beleuchtung als auch für die Ausrichtung des UV-Objektivs erreichen, so daß sich eine beträchtliche Verbesserung im Verhältnis zu früheren Strömungssystemen der beschriebenen Art ergibt.

Aus dem Vorstehenden folgt, daß die optische Achse 1 des UV-Objektivs, die hier als mit der Achse des Analysegeräts zusammenfallend angesehen wird, senkrecht zu der Oberseite 7 des Geräts und damit senkrecht zur Kernströmung 4 steht. Der Direktlaserstrahl 13 verläuft also etwa senkrecht zu der Achse 1. Wie schon gesagt, bilden die drei Achsen demgemäß annähernd ein orthogonales Koordinatensystem. Natürlich können in derselben Analyseeinrichtung mehr als ein Epilaser und/oder Direktlaser vorgesehen werden. Im Fall von zwei Direktlasern soll einer derselben auf einer Seite und der andere auf der anderen Seite einer einfachen Analyseeinrichtung plaziert werden. Die Strahlen sollen dann in bezug aufeinander gleich geneigt werden, um eine unerwünschte Kombination der persistenten und der gestreuten Teile der Strahlen, die in Fig. 1a mit 32 und 33 bezeichnet werden, zu vermeiden. Wie ebenfalls schon gesagt, kann der Strahl eines Direktlasers als Anregungsquelle für Fluoreszenzanalysen benutzt werden, wenn die Teilchen mit einer fluoreszierenden Substanz gefärbt werden. Außerdem oder stattdessen kann der unter einem kleinen Winkel (bis zu etwa 2°) vorwärtsgestreute Teil 33 des ursprünglichen Laserstrahls 13 zum Ausmessen von Teilchen verwendet werden.

Aus den Fig. 1a und 1b ergibt sich ferner, daß die Wartung des erfindungsgemäßen Geräts sehr einfach ist. Die verschiedenen Hohlräume, z. B. die Düsenkammer, die Eingangs- und Ausgangskanäle (der letztere wird nicht dargestellt) sind leicht beobachtbar, teilweise wegen der transparenten Oberseite des Geräts und teilweise, weil die Hohlräume im allgemeinen einen größeren Durchmesser als 1 mm besitzen. Durch Herausziehen aus dem Düsenhalter 20 wird das Innere der Düsenkammer 9 nicht nur besser sichtbar, sondern jeder Teil der Kammer wird für eine Reinigung von beliebigem Schmutz entweder mit einem Faden oder mit einem Wasserstrahl leicht erreichbar. Schmutz findet sich jedoch nur sehr selten in dem Innern der Hohlräume, weil die genannten Filter schon vor die Eingänge der die beiden Flüssigkeiten 24 und 27 zuleitenden Röhren bzw. Kanäle gesetzt werden. Bei einer solchen Wartung kann übrigens auch die Düse 6 beobachtet, ausgerichtet oder sogar durch eine andere Düse ersetzt werden; auf diese Weise kann also auch der Querschnitt der Kernströmung leicht verändert werden.

Wenn es sich bei der Vorrichtung um ein reines Analysegerät handelt, soll der Ausgangskanal 3 so kurz wie möglich sein, um die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung zu reduzieren. Wenn dagegen das Analysegerät mit einem Sortierer des Ablenktyps kombiniert werden soll, wird der Ausgangskanal etwa 1 bis 3 mm lang gemacht und "Hauptkanal" genannt. Auch dieser Teil der Vorrichtung kann auf die vorgenannte Weise eingesehen und erreicht werden, ebenso kann Schmutz leicht entfernt werden.

Auch die Düsenkammer 9 läßt sich leicht reinigen. Das gleiche gilt für die Außenseite des Geräts, weil dessen Oberflächen alle glatt sind und selbst mit einem Q-Tip (Kissen) zu reinigen sind. Der Deckel soll an seiner Außenseite gelegentlich mit Reinigungsbenzin geputzt werden, um unerwünschte Immersionsflüssigkeit abzuwaschen, während das Innere des Strömungssystems erfolgreich mit einem Detergens gereinigt werden kann, indem man dieses eine gewisse Zeit durch das gesamte System fließen läßt. Da kein Bedürfnis besteht, das Deckglas abzunehmen und alle Pflegearbeiten leicht von der Außenseite her auszuführen sind, ist die Gefahr einer Verstopfung beträchtlich vermindert. Auch diese Tatsache stellt einen großen Vorteil gegenüber vergleichbaren bekannten Systemen dar, weil dort das Abnehmen des Deckglases eine ziemlich zeitaufwendige und für das Gerät gefährliche Arbeit ist.

Die Fig. 2a und 2b zeigen eine Draufsicht bzw. eine Frontansicht eines Analysesystems, das auf einem optischen Tisch 41 steht. Die Hauptteile dieses Systems sind die Analyseeinrichtung 42 (doppelt umrahmtes Rechteck), ein Epilaser 43 und ein Direktlaser 44. Das in der Zeichnung angedeutete XYZ-Koordinatensystem hilft, die verschiedenen Richtungen zu definieren. Die X- und Y-Koordinatenachsen sollen in der Ebene des optischen Tisches 41 und daher auch in der Ebene von Fig. 2a liegen. Die Achsen X und Z liegen in der Ebene von Fig. 2b. Die Richtung der Z-Achse ist identisch mit der vertikalen Richtung.

Die Analyseeinrichtung 42 wird in fünf Hauptteile unterteilt gedacht. Hierzu gehören eine Hochdruckquecksilberlampe 45 von 100 W Leistung (Fig. 2a), die über eine im Lampengehäuse angeordnete (nicht gezeichnete) Kollektorlinse und nach Filterung durch ein optisches Filtersystem 46 etwa 10 mW Leistung im UV-Bereich liefert.

Wenn ein in Fig. 2a symbolisierter Spiegelschieber 47 in eine solche Position gebracht wird, daß die gestrichelte Linie 48 des Schiebers an der Strahlkreuzung 49 liegt, dann tritt der gefilterte UV-Strahl 50 in das erste geschlossene Gehäuse 51 ein. Dort werden zwei Linsen und wenigstens ein weiter unten genauer beschriebener Photomultiplier vorgesehen. Eine der Linsen aus dem Gehäuse 51 ist eine Justierlinse für eine Koehler-Optik und dient dazu, wenigstens einen Teil des Lichts des Quecksilberbogens der Lampe 45 so zu projizieren, daß die Koehler-Optik korrekt beleuchtet wird. Die Koehler-Optik umfaßt die andere Linse und das UV-Objektiv.

Das (nicht dargestellte) UV-Objektiv wird innerhalb eines zweiten geschlossenen Gehäuses 52 angeordnet, es kann mit Hilfe eines Feingewindes längs der vertikalen (Z-Achse) justiert werden, um seine Brennebene so auszurichten, daß die oben beschriebene Kernströmung in der Brennebene fließt. Der Gerätegrundkörper 2, in dem die Kernströmung mit den zu analysierenden Teilchen fließt, wird in einer Bajonettfassung 53 (Fig. 2b) zusammen mit den Einlaßröhren für die Suspensions- und Hüllstromflüssigkeiten 55a bzw. 55b befestigt. Die in Fig. 2b durch gestrichelte Linien innerhalb des Grundkörpers 2 angedeutete Bajonettfassung 53 wird in einem kleinen Mikroskoptisch von Scheibenform fixiert, der in einem lichtdichten Zylinder 54 angeordnet wird. In Fig. 2a werden der Grundkörper 2, die Bajonettfassung 53 und der lichtdichte Zylinder 54 als konzentrische gestrichelte Kreise dargestellt. Der kleine Mikroskoptisch und damit auch der Gerätegrundkörper 2 können horizontal, das heißt in der XY-Ebene, mit Hilfe von Feingewindeschrauben 56a und 56b, die der Y- bzw. X-Achse zugeordnet sind, justiert werden. Mit diesen beiden Schrauben kann die mit Hilfe eines Feingewindes zur optimalen Justierung vertikal zu verschiebende Blende 12 (Fig. 1a und 1b) unter dem UV-Mikroskop exakt positioniert werden.

Wenn es sich bei dem beschriebenen Gerät um ein Sortiergerät gemäß US-PS 41 75 662 handelt, kann mit Hilfe der Feingewindeschrauben 56a und 56b die ganze Länge zwischen der Blende 12 und der Kanalverzweigung des eigentlichen Sortierers bequem beobachtet werden, weil die Lichtquelle bei der Aufbeleuchtung (Epilicht) zusammen mit dem Sichtfeld des UV-Objektivs bewegt wird. In der Tat können Objektive im Sichtfeld des UV-Objektivs entweder gesehen werden, weil sie Teile des UV-Spektrums reflektieren oder weil sie mit einer Substanz gefärbt sind, die nur fluoreszieren, wenn ihre Moleküle mit einigen ganz speziellen Molekülen, z. B. DNA oder Zellprotein, zusammenkommen.

Ein Teil des reflektierten oder durch Fluoreszenz erzeugten Lichts wird durch das UV-Objektiv gesammelt und kann durch das Okular 57 (Fig. 2b) gesehen werden, wenn der Kippspiegel 58 um 45° relativ zur optischen Achse des Mikroskops, zu dem auch das UV-Objektiv gehört, geschwenkt wird. In der anderen Position des Kippspiegels 58 befindet sich der Spiegel außerhalb des Weges des gesammelten Lichts, so daß dieses durch die Kathode eines nicht gezeichneten Photomultipliers, der in dem ersten Gehäuse 51 angeordnet wird, gesammelt und in elektrische Energie umgewandelt wird. Wenn sich also eine passend gefärbte Zelle unter dem UV-Mikroskop vorbeibewegt, wird ein Fluoreszenzlicht erzeugt, das in dem Photomultiplier in einen elektrischen Impuls umgewandelt und in dem Photomultiplier nachgeschalteten elektrischen Einrichtungen weiterverarbeitet wird.

Im folgenden wird die Bezeichnung "Analyseeinrichtung" 42 benutzt, um die erfindungsgemäße Einrichtung mit dem Spiegelschieber 47 von herkömmlichen Analysatoren, die solche Teile (47) nicht besitzen, zu unterscheiden. Herkömmliche Analysatoren werden auch als Impulscytophotometer bzw. ICP bezeichnet.

Der Spiegelschieber 47 wird in die Analyseeinrichtung 42 integriert, um eine Kombination des Strahls 59a des Epilasers 43 mit dem UV-Licht 50 der Quecksilberlampe 45 zu ermöglichen. Hierbei handelt es sich um eine neue Art der Strahlvereinigung. Der Epilaser 43 mit seinen verschiedenen Strahlteilen wird nur in Fig. 2a dargestellt. Der "rohe" Epilaserstrahl 59a tritt zunächst in ein Raumfilter 10517 00070 552 001000280000000200012000285911040600040 0002004019929 00004 1039860 ein, um unerwünschte Moden auszuscheiden und um eine über den Strahlquerschnitt gleichförmige Lichtverteilung zu erhalten. Das Raumfilter 60 kann auch ein Strahlverbraucher oder ein Strahldurchmesserverminderer sein, wenn das im speziellen Fall notwendig sein sollte. Es ist aus allgemeiner Erfahrung bekannt, daß ein solches Filter 60 in jedem Fall notwendig ist, wenn ein hochqualitativer Laserstrahl als Endprodukt gebraucht wird.

Im Strahlengang wird dem Raumfilter 60 eine Schlitzblende 61 mit gestrichelt angeordnetem Spalt nachgeschaltet. Darauf folgen eine Bikonvexlinse 62 und zwei zylindrische Plankonvexlinsen 63 und 64. Diese Linsen sind vorteilhaft zum Erzeugen eines Laserauflichtstrahls des gewünschten Querschnitts. Im herkömmlichen Fall, wo nur ein horizontaler, das heißt in der X-Richtung verlaufender Strahl mit kreisförmigem Querschnitt gebraucht wird, ist zusätzlich zum Raumfilter und Strahlexpander 60 (Strahlausbreiter) nur die Bikonvexlinse 62 erforderlich. Diese liefert einen Strahl 59b von z. B. 15 mm Durchmesser, der in den Y- und Z-Richtungen mit dem Strahlschieber 65 verschoben werden kann, um einen Strahl 59c zu erzeugen, den der Strahl 50 der Quecksilberlampe 45 kreuzt. Letztere beide Strahlen 50, 59c können vereinigt und gemeinsam in das erste geschlossene Gehäuse 51 geleitet werden, wenn der (erste) dichroitische Spiegel 66 des Spiegelschiebers 47 in die Strahlenkreuzung 49 verschoben wird.

Mit einem zweiten dichroitischen Spiegel 67 können zwei Epilaserstrahlen 59c und 59d mit unterschiedlichen UV-Spektralbändern vereinigt werden. Wenn der Epilaserstrahl 59d allein in die Analysatoreinrichtung 42 einzukoppeln ist, soll der Spiegel 67 total reflektierend sein. Hierbei wird die Vorrichtung zum Erzeugen des Epilaserstrahls 59d vorzugsweise mit den beschriebenen zusätzlichen Strahlformmitteln auf einem gemeinsamen festen Rahmen angeordnet. Auf diese Weise läßt sich ein Teilchenanalysesystem als Tischgerät erhalten, so daß ein aufwendiger optischer Tisch nicht gebraucht wird.

Nach Eintritt in das erste geschlossene Gehäuse 51 folgt der Epilaserstrahl demselben Weg, der vorher für den Strahl der Quecksilberlampe beschrieben worden ist. Natürlich darf die Strahlintensität im allgemeinen nicht höher sein als größenordnungsmäßig 10 mW, wenn sonst das den Raum zwischen den Linsen des UV-Objektivs füllende Material zerstört würde. Die beiden oben genannten Strahlen erreichen das Objektiv, nachdem sie durch einen im zweiten geschlossenen Gehäuse 52 angeordneten dichroitischen Spiegel reflektiert worden sind. Dieser letztere Spiegel soll eine solche Grenzwellenlänge besitzen, daß er die UV-Strahlen in das UV-Objektiv reflektiert, aber das von den durch die UV-Strahlen beleuchteten Teilchen ausgehende Fluoreszenzlichtspektrum durchläßt.

Offenbar stellt das UV-Objektiv in diesem System zugleich die Kondensorlinse für die Koehler-Beleuchtungsoptik als auch das Objektiv eines Mikroskops dar. Letzteres sammelt das von den Teilchen ausgehende Fluoreszenzlicht. Dieses Licht kann entweder durch das Okular 57 gesehen oder durch die Kathode von einem oder mehreren Photomultipliern, die mit dem Mikroskopsystem verbunden sind, gesammelt werden.

Wenn der total reflektierende Spiegel 68 an Stelle des ersten dichroitischen Spiegels 66 an der Strahlkreuzung 49 liegt, tritt nur der Strahl 59c und/oder 59d des Epilasers in den Analyseteil der Einrichtung ein. Wenn dieser Strahl gebraucht wird, ist es in jedem Fall wünschenswert, den einen gleichförmigen Kreisquerschnitt aufweisenden Laserstrahl 59c derart auf die Linse 62 zu justieren, daß der Strahl noch im wesentlichen gleichförmig ist, wenn er das jeweilige Teilchen beleuchtet. Die Linse 62 ist sehr wünschenswert, weil es sonst nur drei Linsen in zwei geschlossenen Gehäusen 51 und 52 (das UV-Objektiv eingeschlossen) gibt und weil aus einfachen Überlegungen der geometrischen Optik folgt, daß ein Strahl gleichförmigen Querschnitts, der durch eine gewisse Zahl von Linsen geleitet wird, seinen gleichförmigen Querschnitt nur behält, wenn eine gerade Zahl von Linsen verwendet wird. Die Linse 62 ist die vierte Linse im Weg des Epilaserstrahls, so daß dann eine gerade Zahl von Linsen vorliegt.

Mit den hochgereinigten Laserstrahlen können sehr kleine Strahlquerschnitte erhalten werden. Wie vorher beschrieben wurde, ist ein bandartiger Strahl vorteilhaft zum Schlitz- oder Spaltscanning, wobei der Schlitz dünner als die Längsausdehnung des zu analysierenden Teilchens sein soll. Ein solcher Strahl läßt sich aus dem Laserstrahl 59a bilden, wenn eine horizontale Schlitzblende 51 in den Strahlenweg des gefilterten und homogenisierten Strahls gesetzt wird. Die Linsen 63 und 64 nach Fig. 2a werden nur benötigt, wenn der Strahl zusätzlich in der Z- oder Y-Richtung gestaucht werden soll (vgl. L. L. Wheeles et al., a.a.O.).

Der horizontale Laserstrahl 59b bzw. 59c wird bei ebenfalls horizontal ausgerichteter ebener Fläche in den Analyseteil projiziert. Nach Reflexion durch den direkt vor dem Objektiv angeordneten dichroitischen Spiegel 66 verläuft der Strahl 59b bzw. 59c vertikal bzw. in Z-Richtung und mit seiner oberen Fläche senkrecht zu der in der positiven Y-Richtung fließenden Kernströmung. Wenn also dieser Strahl (59b/c) dünn genug ist im Verhältnis zur Längsausdehnung des jeweilig zu analysierenden Teilchens, wird nur ein dünner Querschnitt des Teilchens beleuchtet und analysiert. Das UV-Objektiv kann unter den genannten Bedingungen nämlich Fluoreszenzlicht nur von dem Bereich des Teilchens sammeln, der durch den UV-Anregungsstrahl (59b/c) mit Bandform des Epilasers beleuchtet wird. Wegen dieser "Epi"- bzw. Auflichtnatur ist es sehr leicht, mit einem solchen System zu arbeiten, weil die Beleuchtung der Teilchen und der Sammler des Fluoreszenzlichts durch dieselben Mittel ausgerichtet werden, nämlich durch die Feingewindeschrauben 56a und 56b zusammen mit den nicht gezeichneten Feingewindeschrauben zum vertikalen Justieren des UV-Objektivs.

Wenn das zu analysierende Teilchen so klein ist, daß die Beleuchtung weder der Quecksilberlampe 45 noch der Epilaser stark genug ist, dann kann ein Direktlaser 44 als Lichtquelle eingesetzt werden (Fig. 2a). Der Strahl 69a des Direktlasers 44 wird räumlich durch ein Filter 70 auf dieselbe Weise wie bei dem Epilaser gefiltert und durch eine Bikonvexlinse 71 oder eine vertikale Spaltblende 72 und/oder durch zylindrische Plankonvexlinsen 73 und 74 geformt. Auf diese Weise wird ein Strahl 69b erhalten, welcher durch einen Strahlschieber 75 in eine derartige Position zu bringen ist, daß der sich am Ende ergebende Direktlaserstrahl 13 (identisch mit dem Strahl 13 von Fig. 1a und b) durch ein kleines Loch in die Bajonettfassung 53 und eventuell in den Grundkörper 2 des Analysegeräts bzw. Sortiergeräts eintritt, wie das im einzelnen in Fig. 1a dargestellt wird.

Wenn der so hergestellte Direktlaserstrahl 13 ein in der Kernströmung 4 (Fig. 1a) in der positiven Y-Richtung bewegtes Teilchen trifft, wird er in einen im wesentlichen persistenten Hauptstrahl 32 und einen Streustrahl 33 aufgeteilt, wie das in Fig. 1a gezeigt wird. Wenn der Strahl 13 einen kreisförmigen Querschnitt besitzt, soll sein Durchmesser abhängig von der Größe des zu analysierenden Teilchens zwischen 0,02 und 0,2 mm variieren. Entsprechend soll der Querschnitt des Austrittskanals 3 (Fig. 1a) so gewählt werden, daß er das größte mit der Kernströmung mitgeführte Teilchen gerade noch fassen kann.

Das Schlitzscanning kann ebenfalls mit diesem Strahl ausgeführt werden, wenn dieser die Form eines horizontalen Bandes mit vertikal (z) ausgerichteten ebenen Flächen besitzt. Ebenso wie im Fall der Verwendung eines Epilasers soll auch beim Direktlaser der Strahl viel dünner als die Längsdimension des zu analysierenden Teilchens sein. Ein Direktlaserstrahl einer derartigen Form läßt sich mit Hilfe einer Schlitzblende 72 und/oder der Plankonvexlinsen 73 und 74 herstellen. Die Teile 72, 73 bzw. 74 fokussieren nämlich den ursprünglich zylindrischen Strahl längs der Y- und Z-Achsen und formen einen bandartigen, vertikal ausgerichteten Strahl, der ebenfalls vertikal zur Kernströmung steht.

Natürlich können die Epi- und Direktlaserstrahlen mit Bandform gleichzeitig benutzt werden, wenn ein zweidimensionales Schlitzscanning ausgeführt werden soll. Auf diese Weise können beispielsweise Zellschwellungen von deformierten Zellen, die oft krebsartig sind, unterschieden werden.

Da beide Laserstrahlen UV-Typ haben und daher für das menschliche Auge gefährlich sind, sollen alle Strahlen mit Röhren abgedeckt werden, die entweder nur halbdurchlässig oder überhaupt undurchlässig sind. Die kleinen Röhren 78 und 79, die nach Fig. 2a und b an beiden Seiten der Bajonettfassung 53 befestigt werden, sind für diesen Zweck besonders vorteilhaft, weil die verschiedenen Teile der Analysatoreinrichtung, wie z. B. das Okular 57, die Feingewindeschrauben 56a und b und die Eintrittsröhren 55a und b usw., die im Sichtfeld der jeweiligen Bedienungsperson liegen, um die Bajonettfassung 53 herum angeordnet werden.

Claims (30)

1. Verfahren zum Einschließen einer aus einer fluiden Teilchensuspension bestehenden, fadenartig dünnen Kernströmung (4) mit einer Hüllströmung (26) eines reinen, transparenten Fluids, insbesondere eines Elektrolyts, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit (24) der Kernströmung (4) durch einen in eine Düsenkammer (9) hineinreichenden ersten Eingangskanal (25) mit Austrittsdüse (6) in Richtung auf einen Ausgangskanal (3) in eine eine glatte, hydrophile bzw. aerophobe und stromlinienförmige Innenwandung aufweisende Düsenkammer (9) eingeleitet wird, daß die Flüssigkeit (27) der Hüllströmung (26) durch einen im Umfangsbereich des ersten Eingangskanals (25) in die Innenwandung mündenden zweiten Eingangskanal (28) in Form eines rotationsfreien, breiten Stroms mit mindestens dem Querschnitt der Düsenkammer (9) ebenfalls in letztere eingeleitet wird, daß der breite Strom an dem für ihn ein Strömungshindernis bildenden Körper des ersten Eingangskanals (25) mit Düse (6) durch Wahl eines kleinen Winkels relativ zur Längsrichtung des ersten Eingangskanals (25) in einen vor dem ersten Eingangskanal (25) zu diesem parallelisierten ersten Teilstrom (31) und zwei gegeneinander halb um den ersten Eingangskanal (25) fließende Unterteilströme (30′, 30′′) aufgespalten wird, daß diese drei Strömungsteile (30′, 30′′, 31) durch die Form der Wandung der Düsenkammer (9) und die Oberfläche des ersten Eingangskanals (25) mit Düse (6) unter einem kleinen Winkel in bezug aufeinander und auf den ersten Eingangskanal (25) vor dessen Austrittsdüse (6) als vollständige Umhüllung der Düse und als turbulenz- sowie luftblasenfreie, vollständige Füllung des Raums zwischen dem ersten Eingangskanal (25) und der umgebenden Innenwandung der Düsenkammer (9) wiedervereinigt werden, daß die so bereits fertig ausgebildete und beruhigte Hüllströmung (26) am stromabseitigen Ende der Austrittsdüse (6) nahezu tangential mit der Kernströmung (4) vereinigt wird und daß die Kernströmung (4) dann direkt durch die Hüllströmung (26) sowie indirekt durch die die Hüllströmung (26) umgebende Wandung der Düsenkammer (9) hydrodynamisch eingeschnürt bzw. fokussiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus der Düse (6) kommende Kernströmung (4) durch die hydrodynamisch bündelnde Wirkung der umgebenden Hüllströmung und der diese umgebenden, sich konisch in Strömungsrichtung verjüngenden Düsenkammerwandung radial eingeschnürt und dadurch in Strömungsrichtung beschleunigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Rotation der in die Düsenkammer (9) eingeführten Hüllströmungsflüssigkeit (27) dadurch verhindert wird, daß ein Teilstrom (30) der ankommenden Hüllflüssigkeit (27) in zwei gegeneinander um den zweiten Eingangskanal (25) mit Düse (6) fließende Unterteilströme (30′, 30′′) aufgespalten wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Düsenkammer (9) bei jedem Verfahrensstart vollständig frei von Luftblasen gehalten wird, indem - bei stromlinienförmiger Düsenkammerinnenwandung ohne scharfe Ecken oder Kanten - die gesamte im noch flüssigkeitsfreien Strömungssystem vorhandene Luft mit der Frontwelle der einströmenden Flüssigkeit durch Wahl einer entsprechend hohen Strömungsgeschwindigkeit herausgeschwemmt wird.

5. Vorrichtung zum Einschließen einer aus einer fluiden Teilchensuspension bestehenden, fadenartig dünnen Kernströmung (4) mit einer Hüllströmung (26) eines reinen, transparenten Fluids, vorzugsweise eines Elektrolyts, insbesondere zum Durchführen des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit einer Düse (6) ausgestatteter erster Eingangskanal (25) zum axialen Einleiten der Flüssigkeit (24) der Kernströmung (4) längs einer Achse einer eine glatte, hydrophile, stromlinienförmige Innenwandung aufweisenden Düsenkammer (9) in Richtung auf deren Ausgangskanal (3) vorgesehen ist, daß ein relativ großer Raumteil der Düsenkammer (9) durch die Düse (6) mit dem Eingangskanal (25) ausgefüllt ist, daß ein mit relativ kleinem Winkel in bezug auf die Düse in die Wandung der Düsenkammer (9) mündender zweiter Eingangskanal (28) für die Flüssigkeit (27) der Hüllströmung (26) vorgesehen ist, daß der erste Eingangskanal (25) der Düse (6) ein die aus dem zweiten Eingangskanal (28) bei Betrieb kommende Hüllflüssigkeit (27) in drei Ströme (30′, 30′′, 31) - von denen ein erster Teilstrom (31) vom zweiten Eingangskanal (28) aus parallel zu der Achse unmittelbar an der Düse (6) entlangfließt und die anderen gegeneinander halb um den ersten Eingangskanal (25) mit Düse (6) herumfließende Unterteilströme (30′, 30′′) bilden - aufspaltendes Hindernis darstellt, daß die Innenwandung der Düsenkammer (9) um die Düse (6) herum konisch in Richtung auf den in der Achse liegenden Düsenkammerausgang (3) so verjüngt ist, daß die drei ausgespaltenen Ströme (30′, 30′′, 31) bereits vor dem Kontakt mit der Kernströmung (4) eine vereinigte, hohle, turbulenzfreie Hüllströmung bilden, die den Raum zwischen der Düse (6) und der Innenwandung der Düsenkammer (9) vollständig ausfüllt und wegen der in Strömungsrichtung fortschreitenden Verjüngung der umgebenden Düsenkammerwandung eine hydrodynamisch fokussierende bzw. einschnürende Wirkung auf die bereits unmittelbar am Ausgang der Düse (6) umfaßte Kernströmung (4) ausübt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß oberhalb der Düse (6), dem zweiten Eingangskanal (28) gegenüber, an der Innenwandung der Düsenkammer (9) eine wie der Bug eines Flugzeugträgers geformte Ausfütterung (17) vorgesehen ist, die die Unterteilströme (30′, 30′′) zwingt, sich turbulenzfrei annähernd parallel zum ersten Teilstrom (31) wieder zu vereinigen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die die Form eines Flugzeugträgerbugs aufweisende Ausfütterung (17) der Düsenkammerwandung die Düse (6) nicht berührt, aber so nahe an der Düse (6) liegt, daß die beiden Unterteilströme (30′ 30′′) nahezu tangential ineinander in der Richtung parallel zu der Achse der Düsenkammer (9) zusammenfließen.

8. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Zuführen der Hüllflüssigkeit (27) vorgesehene zweite Einlaßkanal (28) einen in Richtung auf den Übergang in die Düsenkammerwandung abnehmenden Querschnitt besitzt und daß der Querschnitt zumindest am Übergang in die Düsenkammerwandung annähernd rechteckig ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Eingangskanal (28) an seiner der Düsenkammer (9) abgewandten Eintrittsseite einen von der Rechteckform abweichenden Querschnitt besitzt und daß am Übergang (29) zum rechteckigen Querschnittsbereich des Kanals eine zweite Ausfütterung (18) vorgesehen ist, die insbesondere den unmittelbar an der Düse (6) entlangfließenden ersten Teilstrom (31) der Hüllflüssigkeit (27) turbulenzfrei in die Richtung nahezu parallel zu der Achse der Düsenkammer (9) zwingt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlraum der Düsenkammer (9) eine leicht gebogene Fortsetzung des zweiten Eingangskanals (28) ist, die die eintretende Hüllflüssigkeit (27) nach Form und Querschnitt daran hindert zu rotieren.

11. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Querschnittsform der Kernströmung (4) durch Größe und Form des Querschnitts der Düse (6) im wesentlichen vorgegeben ist und daß dem äußeren Teil des Flusses der Kernströmung Mittel zum Feinjustieren des Kernströmungsquerschnitts durch Anpassen des hydrodynamischen Widerstands zugeordnet sind.

12. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel zwischen dem ersten Eingangskanal (25) und der Richtung, mit der die Strömung der Hüllflüssigkeit (27) am Übergang des zweiten Eingangskanals (28) zur Düsenkammer (9) in diesen eintritt, kleiner als 90° ist.

13. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich der äußere Querschnitt (Umfang) der Düse (6) in Richtung auf deren Austrittsende dort verjüngt, wo eine entsprechende Querschnittsverminderung bzw. Bündelung der die vereinigte Hüllströmung (26) umgebenden und bündelnden Düsenkammerwandung vorgesehen ist.

14. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine bis auf die Ein- und Ausgänge (25, 28, 3) vollständig geschlossene Düsenkammer (9) vorgesehen ist, die auf wenigstens einer ihrer Seiten mit einem für UV-Licht durchlässigen Deckglas (8) versiegelt ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlraum der Düsenkammer (9) und der zugehörigen Zufuhr- und Abfuhrkanäle in eine ebene und glatte Oberfläche eines Grundkörpers (2) eingelassen und mit einem auch gegenüber UV-Licht transparenten Mikroskopdeckglas (8) bedeckt ist, so daß die Düsenkammer (9) und die daran anschließenden Kanäle ein - bis auf die Kanalein- und -ausgänge - luftdichtes Strömungssystem bilden.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Teil der Düsenkammer (9) einschließlich der Ein- und Ausgangskanäle mit Hilfe eines gewöhnlichen Stereomikroskops einsehbar konstruiert ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Material oder wenigstens eine der Oberflächen der Hohlräume des Grundkörpers (2) entweder ein nichtreflektierender und nichtfluoreszierender schwarzer Kunststoff oder, wenn durch den Grundkörper (2) erhebliche Wärme abzuführen ist, aus einem Metall besteht, das dieselben optischen Eigenschaften wie der schwarze Kunststoff besitzt, und daß das Deckglas (8) auf der Oberseite (7) mit Hilfe desselben schwarzen Kunststoffs aufgeklebt ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Grundkörper (2) einen minimalen Durchmesser bzw. eine minimale Ausdehnung senkrecht zur Achse des Zylinders besitzt, daß in den Grundkörper (2) gebohrte Ein- oder Austrittskanäle (24, 28, 3) der Düsenkammer (9) so kurz sind, daß ihr Inneres durch ein Standardmikroskop relativ geringer Vergrößerung eingesehen werden kann und daß diese Kanäle unter einem sehr kleinen Winkel, z. B. weniger als 30°, auf den Hohlraum der Düsenkammer (9) treffen.

19. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Düse (6) auf einem hohlen Düsenhalter (20) montiert ist, der aus dem tragenden Grundkörper (2) herauszuziehen ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Düsenhalter (20) aus einem hohlzylindrischen Körper besteht, an dessen äußeres Ende bzw. Stromaufende ein flexibles Rohr angeschlossen ist, und daß das Rohr wiederum an seinem Stromaufende mit einem Filtersystem ausgestattet ist, dessen Mikroöffnungen nicht kleiner als die Größe des größten zu analysierenden oder zu behandelnden Teilchens der Suspension sind.

21. Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 20 in einem Analysegerät zum Zählen von in einem flüssigen Elektrolyten suspendierten Teilchen unter Berücksichtigung vorgegebener Eigenschaften, z. B. Teilchengröße, DNA und/oder Proteingehalt, wobei die Teilchen in der dünnen Kernströmung (4) fließen, die durch die klare, teilchenfreie Hüllströmung (26) eingeschlossen ist, wobei die Kernströmung zusammen mit der Hüllströmung durch verschiedene Analysevolumen fließt, in denen die Teilchen abhängig von ihren physikochemischen Eigenschaften mit einem Sensor zusammenwirken und wobei die Größe der zu analysierenden Quantität in einen proportionalen elektrischen Impuls transformiert wird, mit den folgenden weiteren Merkmalen:

• a) Mittel zum Einbau des Analysegeräts in ein Analysesystem, wo andere optische und elektrooptische Teile der Sensoren angeordnet sind,
• b) einen Ausgangskanal (3), der nicht nur an seiner mit dem Deckglas (8) verschlossenen Oberseite (7), sondern auch an einem Teil seiner beiden vertikalen Wände UV-transparent ist, wobei diesem Analysevolumen mindestens eine zusätzliche Beleuchtung der mit der Kernströmung (4) bewegten Teilchen durch entsprechende Laser zugeordnet ist; und
• c) ein Doppelkegellaserleitsystem mit zwei Halbkegeln (15a, 15b) von beliebiger Querschnittsgeometrie, die eine gemeinsame Achse und aufeinander zu gerichtete Spitzen besitzen und mit ihren Spitzen den Ausgangskanal (3) von beiden Seiten her dort erreichen, wo die UV-transparenten Seitenwände vorgesehen sind, wobei die beiden Halbkegel (15a, 6) mit einem UV-transparenten Material gefüllt und wenigstens an einer Basis mit einem dünnen Glasstück (16) verschlossen sind.

22. Analysegerät nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß bei sehr hoher Energie des verwendeten Laserstrahls das Doppelkegellaserleitsystem mit einem wärmebeständigen und UV-durchlässigen Material gefüllt ist, vorzugsweise mit einem angepaßt geformten Quarzstück, und daß der Grundkörper (2) oder die Beschichtung der Innenflächen des Grundkörpers (2) sowie des Doppelkegellaserleitsystems aus einem Metall mit so guten optischen Qualitäten wie nichtreflektierendes und nichtfluoreszierendes Schwarz besteht.

23. Analysegerät nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß der die verschiedenen Kanäle und Hohlräume enthaltende Grundkörper (2) die Form eines flachen Zylinders besitzt, der entweder aus Kunststoff oder Metall besteht, welches weder reflektierend noch fluoreszierend für irgendeinen Teil des zur Messung zu verwendenden elektromagnetischen Wellenspektrums ist, daß eine der ebenen Seiten des Grundkörpers (2) fein poliert ist, daß in diese Seite verschiedene Kanäle und Hohlräume durch Schneiden, Fräsen oder auf andere Weise in den Körper (2) eingebracht sind, daß die Wände der Kanäle und Hohlräume die erforderliche optische Qualität besitzen, daß ihre bei der Herstellung offene Oberseite bei normalem Betrieb mit einem UV-transparenten Mikroskopdeckglas (8) oder Quarzglas abgedeckt ist und daß selbst das Klebmaterial, mit dem das Deckglas (8) gegebenenfalls permanent auf der polierten Oberseite des Grundkörpers befestigt ist, die erforderliche optische Qualität besitzt.

24. Analysegerät nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der einen Auslaß im Stromabteil der Düsenkammer (9) definierende Ausgangskanal (3) die verschiedenen Analysevolumen beherbergt.

25. Analysegerät nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein UV-Mikroskop mit einem Objektiv hoher Vergrößerung und mit maximaler numerischer Apertur, aber mit kleiner Volumenschärfe derart auf den Ausgangskanal (3) gerichtet wird, daß die Kernströmung (4) und damit die zu analysierenden Teilchen in der Brennebene durch das Sichtfeld des Objektivs fließen, und daß ein Objektiv mit einer dem Betrag des Durchmessers des größten aus der Suspension zu analysierenden Teilchens übersteigenden Tiefenschärfe vorgesehen ist.

26. Analysegerät nach Anspruch 25, gekennzeichnet durch Mittel zum Vereinigen mindestens eines Laserstrahls mit dem Strahl einer herkömmlichen Quecksilberhochdrucklampe (45), die in der Auflichtmode arbeitet.

27. Analysegerät nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß einem Analysevolumen drei Lichtquellen zugleich zugeordnet sind.

28. Analysegerät nach mindestens einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Düsenkammer (9) an ihrem dem Deckglas (8) zugewandten Frontteil so ausgeschnitten ist, daß die zu analysierenden Teilchen das Sichtfeld unter irgendeinem Winkel kleiner als 90° mit Bezug auf das Feld durchqueren.

29. Analysegerät nach Anspruch 15 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Dimensionen des Grundkörpers (2) so klein sind und die Kanäle, Hohlräume und Löcher sich mit so kleinem Winkel miteinander vereinigen, daß das ganze Strömungssystem leicht durch ein Standardmikroskop zu beobachten ist und selbst bei permanent auf der polierten Oberfläche des Grundkörpers verklebtem Deckglas (8) jeder Teil des Strömungssystems mit einem sehr dünnen Draht oder Kunststoffaden oder mit einem Wasserstrahl zu erreichen ist.

30. Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 20 und des Analysegeräts nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 29 in einem Analysesystem zum Analysieren und Sortieren von in einem flüssigen Elektrolyten suspendierten Teilchen mit folgenden Merkmalen:

• a) ein herkömmliches UV-Mikroskop ausgestattet mit einer herkömmlichen Hochdruckquecksilberlampe (45), einer Koehler-Optik zum homogenen Beleuchten des Objekts nach der Auflichtmode sowie unter Verwendung wenigstens eines Photomultipliers zum Umwandeln des durch das zu analysierende Teilchen emittierten und durch das UV-Objektiv des Mikroskops gesammelten Fluoreszenzlichts in elektrische Impulse;
• b) das Zusammenwirken der Quecksilberlampe (45) mit mindestens einem Laser (43, 44) unter Verwendung von Spiegeln und Linsen, ebenfalls nach der Auflichtmode; und
• c) das zusätzliche oder alternative Einschalten mindestens eines Lasers (44) sehr hoher Leistung in der Direktmode.