DE3925183A1 - Proteine mit tnf-wirkung - Google Patents

Proteine mit tnf-wirkung

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Description

Die Erfindung betrifft neue Proteine mit TNF-Wirkung, deren Herstellung und deren Verwendung in der Therapie.
Von Carswell et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72,3666-3670, 1975] wurde berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde einem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) zugeschrieben. TNF zeigt auch eine cytostatische oder cytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden [Ruff und Gifford, Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981]. Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für den menschlichen TNF beschrieben [Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 260, 245-2354, 1985; Nedwin et al., Nucl. Acids Res. 13, 6361-673, 1985]. Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:
1970 wurde beschrieben, daß eine bestimmte Fraktion von Immunglobulin G die Fähigkeit besitzt, an polymorphonukleäre neutrophile Granulozyten zu binden und sie zur Phagozytose zu stimulieren (Najjar und Nishioka, Nature 228, 672-673, 1970). Diese Phagozytose-stimulierende Aktivität konnte auf ein Peptidfragment der schweren Kette des Leukokinins zurück­ geführt werden. Die Primärstruktur dieses Tuftsin genannten Peptids ist H₂N-THR-LYS-PRO-ARG-COOH. Dieses Tetrapeptid wird mittels zweier proteolytischer Enzyme - Tuftsin-Endocarboxidase und Leukokininase - aus dem leukophilen IgG freigesetzt und bindet an spezifische Tuftsin- Rezeptoren auf neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Makrophagen (Nishioka et al., Cancer Investigation 2, 39-49, 1984).
Ähnliche Eigenschaften wie Tuftsin besitzt das ebenfalls aus der schweren Kette von Leukokinin stammende Tetrapeptid Rigin mit der Primärstruktur N₂N-GLY-GLU-PRO-ARG-COOH (Veretennikova et al., Int. I. Peptide Prot. Res. 17, 430-435 (1981)).
Es wurde nun gefunden, daß man durch Anfügen von Partialsequenzen aus der schweren Kette von Leukokinin an den Aminoterminus des reifen humanen TNF Hybridproteine erhält, die vorteilhaftere Eigenschaften besitzen als das humane TNF selbst. Insbesondere die Fähigkeit des TNF, neutrophile Granulozyten zur Degranulation und Superoxid-Bildung zu stimulieren (Tsujimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 1094-1100, 1986; Klebanoff et al, J. Immunol. 136, 4220-4225, 1986), wird durch die beschriebenen neuen TNF-Hybridmoleküle selektiv verstärkt. Andere Eigen­ schaften des TNF wie z. B. die direkte Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen werden von dieser Wirkungsverstärkung nicht im gleichen Maß betroffen, so daß sich die neuen TNF-Hybridmoleküle besonders zur Beeinflussung von neutrophilen Granulozyten eignen.
Die Erfindung betrifft Proteine mit folgender Aminosäuresequenz:
worin
a, b, c, f, g, i 0 oder 1
d, h 0, 1, 2, 3 oder 4 und
e 1, 2, 3 oder 4
X ein Peptidfragment aus der schweren Kette des Leukokinins mit der Aminosäuresequenz Y-Pro-Arg-Z, worin Y eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins vorangehen, und Z eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins nachfolgen, sind.
In der schweren Kette des Leukokinins tritt ProArg an zwei Stellen auf. An diesen Stellen gehen dem ProArg folgende Aminosäuresequenzen voran:
HisAsnAlaLysThrLys und SerLysAlaLysGlyGln. Folgende Sequenzen folgen auf ProArg: GluGluGlnPheAsnSer und GluProGlnValTyrThr.
Unter diesen Proteinen sind diejenigen bevorzugt, in denen a, b, c, d, f, g, h, i=0, e=1 oder 2 und X= eine Teilsequenz aus 4 Aminosäuren (ThrLysProArg oder GlyGlnProArg) ist.
Die neuen Proteine lassen sich herstellen, indem man
  • a) einen Vektor herstellt, der die genetische Information für die Proteine gemäß Anspruch 1 enthält,
  • b) den Vektor vermehrt
  • c) die für Expression nötigen Signale in den Vektor einbaut,
  • d) den Vektor in einen Wirtsorganismus einbringt und
  • e) den Wirtsorganismus vermehrt und das Protein isoliert.
Zur Herstellung eines geeigneten Vektors geht man von der entsprechenden cDNA aus.
Für die Isolierung der entsprechenden cDNA wurde die Monocyten-Zellinie HL 60 (ATCC Nr. CCL 240) wie beschrieben kultiviert (Pennica et al., Nature 312, 724-729, 1984), die mRNA nach Stimulierung isoliert und nach bekannten Verfahren in cDNA übersetzt.
Durch Einsetzen dieser cDNA in den kommerziell erhältlichen Klonierungs­ vektor Lambda gt 10 wurde eine cDNA-Bibliothek angelegt.
Mit Hilfe von radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden wurde ein cDNA- Klon identifiziert, der den kodierenden Teil des TNF-Gens enthält (Fig. 1).
Teile dieser Sequenz, die durch Restriktionserkennungsstellen leicht zugänglich sind, werden benutzt, um die in den Beispielen näher beschrie­ benen neuen TNF-Hybridgene zu klonieren (Fig. 1). Der Einbau der Genfrag­ mente in Klonierungsvektoren, beispielsweise in die handelsüblichen Plasmide pBR 322 und pBR 327 erfolgte in an sich bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten Kontrollregionen versehen werden, die eine Expression der Proteine ermög­ lichen. Die Transformation der so erhaltenen Hybridplasmide in geeignete Wirtsorganismen, vorteilhaft E. coli, ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben. Auch können die Hybridplasmide mit entsprechenden Signal­ sequenzen versehen werden, die die Sekretion der Polypeptide in das Periplasma von E. coli erlauben.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich, andere DNA-Sequenzen, z. B. chemisch synthetisierte TNF-Gene mit unter­ schiedlicher DNA-Sequenz, für die Expression von TNF-Hybridgenen zu benutzen.
Die neuen Hybridproteine mit TNF-Wirkung können als neue Wirkstoffe in der Therapie von malignen Erkrankungen des Menschen eingesetzt werden.
Beispiele Herstellung von Plasmiden 1. Herstellung eines Hybridplasmids, das das Genfragment für ein TNF-Derivat mit verändertem Amino-Terminus trägt
Ausgangsmaterial ist ein rekombinanter Phage mit der cDNA von TNF der nach dem von Pennica et al. (Nature 312, 724-729, 1984) beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Dazu wurde die menschliche Monocyten-Zellinie HL 60 (ATCC CCL240) mit Phorbolester (PMA) behandelt, um sie zur TNF-Produktion anzuregen. 4 h nach der Phorbolesterbehandlung wurde die RNA aus dieser Zellinie isoliert und daraus nach Maniatis: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seiten 224ff die cDNA hergestellt. Mit dieser cDNA wurde eine Genbank angelegt, wobei als Vektor der Lambda-Phage gt10 benutzt wurde. Mit Hilfe einer TNF-spezifischen, chemisch synthetisierten Oligonukleotidprobe, die radioaktiv markiert war, wurde die Genbank durch­ gemustert. Von einem dabei als positiv identifizierten Klon wurde durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Aval und Hind3 ein 578bp langes DNA- Fragment erhalten, das für die Aminosäuren 8 bis 157 des humanen TNF-Mole­ küls codiert. Dieses Fragment wurde durch Elektrophorese in einem 1% Agarosegel von den anderen entstandenen Fragmenten abgetrennt und aus dem Gel nach bekannten Verfahren eluiert [Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 164, 1982]. Das erhaltene Bruchstück wurde anschließend in einen Vektor eingebaut, der durch Spaltung des Plasmids pBR322 mit den Restriktionsendonukleasen Cla1 und Hind3 erhalten worden war. Das bei der Spaltung entstandene große Fragment wurde durch eine zweimalige Ethanol­ fällung rein erhalten.
Als Cla-Ava-Adaptor diente ein äquimolares Gemisch synthetisch herge­ stellter Oligonukleotide A1 und B1, die folgende Primärstruktur besitzen:
Man erhielt das neue Hybridplasmid pTNF-1, indem man 0,1 pMol des Vektor­ fragments, 0,2 pMol des 578 bp langen TNF-Fragments und jeweils 0,5 pMol A1 und B1 mit dem Enzym T4-DNA-Ligase verknüpfte (Fig. 1, An und Bn be­ deutet darin die Oligonukleotide A1, A2 . . . und B1, B2 . . .).
2. TNF-Hybridmoleküle mit Tuftsin und Rigin
Die Konstruktion erfolgte analog Beispiel 1 mit den neuen Oligonukleotiden A2/B2, A3/B3, A4/B4 und A5/B5:
Man erhielt jeweils die neuen Hybridplasmide pTNF-2, pTNF-3, pTNF-4 und pTNF-5.
3. Herstellung von Hybridplasmiden, die die Gene für Leukokinin-TNF- Hybridproteine tragen
Ausgangspunkt ist das in Beispiel 1 konstruierte Plasmid pTNF-1. Dieses trägt eine singuläre Bgl2-Erkennungsstelle (AGATCT). Das Plasmid pTNF-1 wurde mit dem Restriktionsenzym Bgl2 geöffnet. Zu 0,1 pMol dieses DNA-Fragments wurden 0,3 pMol eines äquimolaren Gemisches von synthetisch hergestellten A6 und B6 hinzugefügt und durch eine durch T4-DNA-Ligase katalysierte Reaktion verknüpft (Fig. 2).
Man erhielt das neue Hybridplasmid pTNF-1/6. Bei dieser Konstruktion erhielt man auch Hybridplasmide, bei denen das Oligonukleotitfragment A6/B6 nicht nur einmal sondern mehrfach hintereinander in das TNF-Gen integriert war. Die Anzahl der integrierten Kopien ließ sich mit bekannten DNA-Sequenzierungsverfahren bestimmen. Eine zweifache Integration des A6/B6-Fragments ergab das TNF-Hybridplasmid pTNF-1/7; eine dreifache Integration des Plasmid pTNF-1/8.
4. Transformation der Hybridplasmide
Transformations-kompetente E. coli-Zellen wurden mit 0,1 bis 1 µg der Hybridplasmide gemäß Beispiel 1 bis 4 transformiert und auf Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatten ausplattiert. Anschließend ließen sich Klone, die korrekt integrierte TNF-Teilsequenzen enthielten, durch Plasmid­ schnellanalysen identifizieren [Maniatis et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seite 366].
5. Produktion der Proteine
Die in den obigen Beispielen hergestellten Hybridplasmide werden an der Cla1-Stelle geöffnet und mit synthetisch hergestellten Signalsequenzen für die Genexpression versehen.
Mit den erhaltenen Hybridplasmiden wurden kompetente E. coli Zellen transformiert (Maniakis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seite 249ff.). Der transformierte Wirtsorganismus wurde über Nacht bei 37°C in LB-Nährmedium fermentiert.
6. Reinigung der Proteine
1 l Fermentationsbrühe eines eine neue Substanz produzierenden E. coli- Stamms wurden 30 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 200 ml 0,4 M Argininhydrochlorid, 20 mM Natriumphosphat pH 8,5 aufgenommen und 30 min mit Ultraschall behandelt. Die Suspension wurde mit 6 ml 2M MnCl₂ versetzt und 45 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,9 gebracht und mit festem Ammonium­ sulfat auf 60% Sättigung eingestellt.
Das Proteinpräzipitat wurde in 0,2 M Argininhydrochlorid pH 7,5 suspen­ diert und gegen 0,4 M Argininhydrochlorid pH 7,5 dialysiert. Nach 16 h wurde mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und auf das 5fache Volumen mit Wasser verdünnt.
Diese Lösung wurde über eine mit 0,01 M Argininpuffer pH 8,5 äquilibrierte ®R-Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Die Elution erfolgte mit 0,02 M Na-Phosphat, 0,06 M NaCl. Das Eluat wurde nach dem Verdünnen auf das 2,5fache über eine mit 0,02 M Na-Phosphat pH 8,0 äquilibrierte ®S- Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Nach Waschen der Säule mit Äquilibrierungspuffer erhielt man durch Elution mit 0,05 M Na-Phosphat, 0,1 M NaCl, 0,1 M Arginin pH 8,6 SDS-Polyacrylamidgel-elektrophoretisch reines Protein.
So wurden folgende Verbindungen der Formel gemäß Anspruch 1 erhalten:
7. Cytotoxische Aktivität der neuen Polypeptide
5 · 10³ frisch trypsinisierte, im exponentiellen Wachstum sich befindliche Zellen wurden in 96-Loch-Platten in 150 µl komplettem Wachstumsmedium (MEM mit Earles Salzen + 10% FCS, Flow Laboratories, Meckenheim), aus­ plattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ in einer Wasserdampf-gesättig­ ten Atmosphäre inkubiert. Die Substanzzugabe erfolgte am nächsten Tag in 25 µl komplettem Kulturmedium pro Kulturloch. Die Startkonzentration be­ trug 10 ng/ml; titriert wurde seriell 2fach mit Doppelbestimmungen. Fol­ gende Kontrollen wurden auf jeder Kulturplatte mitangelegt: a) nur Kultur­ medium; b) Zellen mit Kulturmedium, aber ohne Substanz; c) ein titrierter TNF-Standard bekannter biologischer Aktivität. Nach einer weiteren Inkuba­ tion von 48 h bei den oben angegebenen Bedingungen wurden die überlebenden Zellen mit einer Kristallviolettlösung (15 g Kristallviolett, 7 g NaCl 646 ml Ethanol, 172,8 ml 37%iges Formaldehyd auf 2 l mit H₂O aufgefüllt) angefärbt. Dazu wurden nach dem Ausschlagen des Kulturmediums die Zellen für 20 min mit 50 µl der Färbelösung bei Raumtemperatur versetzt. Die Kulturplatten wurden danach so lange mit Wasser gewaschen, bis alle unge­ bundenen Farbstoffanteile entfernt waren. Die gefärbten Zellen wurden durch Zugabe von 100 µl Färbelösung (50% Ethanol, 0,1% Essigsäure) lysiert und bei 540 nm photometrisch ausgewertet. Für die Substanzen ergaben sich dabei in den getesteten Zellinien folgende Aktivitäten, ausgedrückt in Einheiten pro mg Protein. Eine Einheit ist diejenige Menge an Substanz, die eine 50%ige Lyse der behandelten Zellen induziert.
In der Tabelle bedeuten:
L-929 eine Maus-Fibrosarkom-Zellinie,
MCF-7 eine humane Mamakarzinom-Zellinie,
rh-TNF rekombinanter humaner TNF.
8. Stimulation der Sauerstoffradikal-Freisetzung von polymorphonukleären neutrophilen Granulozyten (PMN)
Polymorphonukleäre neutrophile Granulozyten (PMN) wurden aus heparinisier­ tem Blut von gesunden Spendern durch ®Dextran-Sedimentation (®Dextran T250, 1 g, 60 min, Raumtemperatur) und anschließende Trennung über einen®Percoll zwei-Stufen-Gradienten (60%/68% ®Percoll, 4°C, 600 g, 30 min) isoliert. Die Zellen aus der 60%/68% Interphase wurden zweimal in HBSS ohne Ca2+/Mg2+ mit 0,1% HSA gewaschen und dann im selben Puffer in einer Konzentration von 5 · 10⁶ Zellen/ml aufgewahrt. Die Chemolumineszenzmessung (CL) wurde in einem Luminometer bei 37°C mit Lucigenin (100 µm), HBSS mit je 1 mM Ca2+ und Mg2+ und 0,1% HSA in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml und 2,5 · 10⁴ PMN-Zellen pro Probe mit und ohne TNF bzw. TNF-Derivat vorgenommen.
Die Ergebnisse basieren auf der Integration der Impulse über 30 min und die Aktivitäten der TNF-Derivate wurden relativ zu TNF (=1,0) angegeben. Die Stimulation der Sauerstoffradikal-Freisetzung von PMN in Gegenwart von TNF oder TNF-Derivaten wurden in Prozent der Basisaktivität (ohne Cytokin) für jede Messung berechnet. TNF und TNF-Derivate wurden miteinander bei einer Konzentration von 1 mg Cytokin/ml verglichen.

Claims (8)

1. Proteine, gekennzeichnet durch folgende Aminosäuresequenz: worin
a, b, c, f, g, i 0 oder 1
d, h 0, 1, 2, 3 oder 4
e 1, 2, 3 oder 4
X ein Peptidfragment aus der schweren Kette des Leukokinins mit der Aminosäuresequenz Y-Pro-Arg-Z, worin Y eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins vorangehen, und Z eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins nachfolgen,
sind.
2. Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
3. DNA, codierend für ein Protein gemäß Anspruch 1.
4. Vektor, enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 3.
5. Wirtsorganismus, enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 4.
6. Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus nach Anspruch 5 züchtet und das Protein daraus isoliert.
7. Proteine gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
8. Verwendung der Proteine gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen wowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen.
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