DE3925183A1 - Proteine mit tnf-wirkung - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft neue Proteine mit TNF-Wirkung, deren Herstellung
und deren Verwendung in der Therapie.
Von Carswell et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72,3666-3670, 1975] wurde
berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit
Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine
hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte.
Diese Aktivität wurde einem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) zugeschrieben. TNF
zeigt auch eine cytostatische oder cytotoxische Wirkung gegenüber einer
Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale
menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden [Ruff und
Gifford, Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York,
1981]. Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für
den menschlichen TNF beschrieben [Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 260,
245-2354, 1985; Nedwin et al., Nucl. Acids Res. 13, 6361-673, 1985]. Aus
diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF
ableiten:
1970 wurde beschrieben, daß eine bestimmte Fraktion von Immunglobulin G
die Fähigkeit besitzt, an polymorphonukleäre neutrophile Granulozyten zu
binden und sie zur Phagozytose zu stimulieren (Najjar und Nishioka,
Nature 228, 672-673, 1970). Diese Phagozytose-stimulierende Aktivität
konnte auf ein Peptidfragment der schweren Kette des Leukokinins zurück
geführt werden. Die Primärstruktur dieses Tuftsin genannten Peptids ist
H₂N-THR-LYS-PRO-ARG-COOH. Dieses Tetrapeptid wird mittels zweier
proteolytischer Enzyme - Tuftsin-Endocarboxidase und Leukokininase - aus
dem leukophilen IgG freigesetzt und bindet an spezifische Tuftsin-
Rezeptoren auf neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Makrophagen
(Nishioka et al., Cancer Investigation 2, 39-49, 1984).
Ähnliche Eigenschaften wie Tuftsin besitzt das ebenfalls aus der schweren
Kette von Leukokinin stammende Tetrapeptid Rigin mit der Primärstruktur
N₂N-GLY-GLU-PRO-ARG-COOH (Veretennikova et al., Int. I. Peptide Prot.
Res. 17, 430-435 (1981)).
Es wurde nun gefunden, daß man durch Anfügen von Partialsequenzen aus der
schweren Kette von Leukokinin an den Aminoterminus des reifen humanen TNF
Hybridproteine erhält, die vorteilhaftere Eigenschaften besitzen als das
humane TNF selbst. Insbesondere die Fähigkeit des TNF, neutrophile
Granulozyten zur Degranulation und Superoxid-Bildung zu stimulieren
(Tsujimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 1094-1100, 1986;
Klebanoff et al, J. Immunol. 136, 4220-4225, 1986), wird durch die
beschriebenen neuen TNF-Hybridmoleküle selektiv verstärkt. Andere Eigen
schaften des TNF wie z. B. die direkte Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen
werden von dieser Wirkungsverstärkung nicht im gleichen Maß betroffen, so
daß sich die neuen TNF-Hybridmoleküle besonders zur Beeinflussung von
neutrophilen Granulozyten eignen.
Die Erfindung betrifft Proteine mit folgender Aminosäuresequenz:
worin
a, b, c, f, g, i 0 oder 1
d, h 0, 1, 2, 3 oder 4 und
e 1, 2, 3 oder 4
X ein Peptidfragment aus der schweren Kette des Leukokinins mit der Aminosäuresequenz Y-Pro-Arg-Z, worin Y eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins vorangehen, und Z eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins nachfolgen, sind.
a, b, c, f, g, i 0 oder 1
d, h 0, 1, 2, 3 oder 4 und
e 1, 2, 3 oder 4
X ein Peptidfragment aus der schweren Kette des Leukokinins mit der Aminosäuresequenz Y-Pro-Arg-Z, worin Y eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins vorangehen, und Z eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins nachfolgen, sind.
In der schweren Kette des Leukokinins tritt ProArg an zwei Stellen auf. An
diesen Stellen gehen dem ProArg folgende Aminosäuresequenzen voran:
HisAsnAlaLysThrLys und SerLysAlaLysGlyGln. Folgende Sequenzen folgen auf ProArg: GluGluGlnPheAsnSer und GluProGlnValTyrThr.
HisAsnAlaLysThrLys und SerLysAlaLysGlyGln. Folgende Sequenzen folgen auf ProArg: GluGluGlnPheAsnSer und GluProGlnValTyrThr.
Unter diesen Proteinen sind diejenigen bevorzugt, in denen a, b, c, d, f,
g, h, i=0, e=1 oder 2 und X= eine Teilsequenz aus 4 Aminosäuren
(ThrLysProArg oder GlyGlnProArg) ist.
Die neuen Proteine lassen sich herstellen, indem man
- a) einen Vektor herstellt, der die genetische Information für die Proteine gemäß Anspruch 1 enthält,
- b) den Vektor vermehrt
- c) die für Expression nötigen Signale in den Vektor einbaut,
- d) den Vektor in einen Wirtsorganismus einbringt und
- e) den Wirtsorganismus vermehrt und das Protein isoliert.
Zur Herstellung eines geeigneten Vektors geht man von der entsprechenden
cDNA aus.
Für die Isolierung der entsprechenden cDNA wurde die Monocyten-Zellinie
HL 60 (ATCC Nr. CCL 240) wie beschrieben kultiviert (Pennica et al.,
Nature 312, 724-729, 1984), die mRNA nach Stimulierung isoliert und nach
bekannten Verfahren in cDNA übersetzt.
Durch Einsetzen dieser cDNA in den kommerziell erhältlichen Klonierungs
vektor Lambda gt 10 wurde eine cDNA-Bibliothek angelegt.
Mit Hilfe von radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden wurde ein cDNA-
Klon identifiziert, der den kodierenden Teil des TNF-Gens enthält (Fig. 1).
Teile dieser Sequenz, die durch Restriktionserkennungsstellen leicht
zugänglich sind, werden benutzt, um die in den Beispielen näher beschrie
benen neuen TNF-Hybridgene zu klonieren (Fig. 1). Der Einbau der Genfrag
mente in Klonierungsvektoren, beispielsweise in die handelsüblichen
Plasmide pBR 322 und pBR 327 erfolgte in an sich bekannter Weise. Auch
können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten
Kontrollregionen versehen werden, die eine Expression der Proteine ermög
lichen. Die Transformation der so erhaltenen Hybridplasmide in geeignete
Wirtsorganismen, vorteilhaft E. coli, ist ebenfalls bekannt und eingehend
beschrieben. Auch können die Hybridplasmide mit entsprechenden Signal
sequenzen versehen werden, die die Sekretion der Polypeptide in das
Periplasma von E. coli erlauben.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich,
andere DNA-Sequenzen, z. B. chemisch synthetisierte TNF-Gene mit unter
schiedlicher DNA-Sequenz, für die Expression von TNF-Hybridgenen zu
benutzen.
Die neuen Hybridproteine mit TNF-Wirkung können als neue Wirkstoffe in der
Therapie von malignen Erkrankungen des Menschen eingesetzt werden.
Ausgangsmaterial ist ein rekombinanter Phage mit der cDNA von TNF der nach
dem von Pennica et al. (Nature 312, 724-729, 1984) beschriebenen Verfahren
erhalten wurde. Dazu wurde die menschliche Monocyten-Zellinie HL 60
(ATCC CCL240) mit Phorbolester (PMA) behandelt, um sie zur TNF-Produktion
anzuregen. 4 h nach der Phorbolesterbehandlung wurde die RNA aus dieser
Zellinie isoliert und daraus nach Maniatis: Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982, Seiten 224ff die cDNA hergestellt. Mit dieser
cDNA wurde eine Genbank angelegt, wobei als Vektor der Lambda-Phage gt10
benutzt wurde. Mit Hilfe einer TNF-spezifischen, chemisch synthetisierten
Oligonukleotidprobe, die radioaktiv markiert war, wurde die Genbank durch
gemustert. Von einem dabei als positiv identifizierten Klon wurde durch
Spaltung mit den Restriktionsenzymen Aval und Hind3 ein 578bp langes DNA-
Fragment erhalten, das für die Aminosäuren 8 bis 157 des humanen TNF-Mole
küls codiert. Dieses Fragment wurde durch Elektrophorese in einem 1%
Agarosegel von den anderen entstandenen Fragmenten abgetrennt und aus dem
Gel nach bekannten Verfahren eluiert [Maniatis et al., Cold Spring Harbor
Laboratory, Seite 164, 1982]. Das erhaltene Bruchstück wurde anschließend
in einen Vektor eingebaut, der durch Spaltung des Plasmids pBR322 mit den
Restriktionsendonukleasen Cla1 und Hind3 erhalten worden war. Das bei der
Spaltung entstandene große Fragment wurde durch eine zweimalige Ethanol
fällung rein erhalten.
Als Cla-Ava-Adaptor diente ein äquimolares Gemisch synthetisch herge
stellter Oligonukleotide A1 und B1, die folgende Primärstruktur besitzen:
Man erhielt das neue Hybridplasmid pTNF-1, indem man 0,1 pMol des Vektor
fragments, 0,2 pMol des 578 bp langen TNF-Fragments und jeweils 0,5 pMol
A1 und B1 mit dem Enzym T4-DNA-Ligase verknüpfte (Fig. 1, An und Bn be
deutet darin die Oligonukleotide A1, A2 . . . und B1, B2 . . .).
Die Konstruktion erfolgte analog Beispiel 1 mit den neuen Oligonukleotiden
A2/B2, A3/B3, A4/B4 und A5/B5:
Man erhielt jeweils die neuen Hybridplasmide pTNF-2, pTNF-3, pTNF-4 und
pTNF-5.
Ausgangspunkt ist das in Beispiel 1 konstruierte Plasmid pTNF-1. Dieses
trägt eine singuläre Bgl2-Erkennungsstelle (AGATCT). Das Plasmid pTNF-1
wurde mit dem Restriktionsenzym Bgl2 geöffnet. Zu 0,1 pMol dieses
DNA-Fragments wurden 0,3 pMol eines äquimolaren Gemisches von synthetisch
hergestellten A6 und B6 hinzugefügt und durch eine durch T4-DNA-Ligase
katalysierte Reaktion verknüpft (Fig. 2).
Man erhielt das neue Hybridplasmid pTNF-1/6. Bei dieser Konstruktion
erhielt man auch Hybridplasmide, bei denen das Oligonukleotitfragment
A6/B6 nicht nur einmal sondern mehrfach hintereinander in das TNF-Gen
integriert war. Die Anzahl der integrierten Kopien ließ sich mit bekannten
DNA-Sequenzierungsverfahren bestimmen. Eine zweifache Integration des
A6/B6-Fragments ergab das TNF-Hybridplasmid pTNF-1/7; eine dreifache
Integration des Plasmid pTNF-1/8.
Transformations-kompetente E. coli-Zellen wurden mit 0,1 bis 1 µg der
Hybridplasmide gemäß Beispiel 1 bis 4 transformiert und auf Ampicillin
enthaltenden LB-Agarplatten ausplattiert. Anschließend ließen sich Klone,
die korrekt integrierte TNF-Teilsequenzen enthielten, durch Plasmid
schnellanalysen identifizieren [Maniatis et al, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982, Seite 366].
Die in den obigen Beispielen hergestellten Hybridplasmide werden an der
Cla1-Stelle geöffnet und mit synthetisch hergestellten Signalsequenzen für
die Genexpression versehen.
Mit den erhaltenen Hybridplasmiden wurden kompetente E. coli Zellen
transformiert (Maniakis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982,
Seite 249ff.). Der transformierte Wirtsorganismus wurde über Nacht bei
37°C in LB-Nährmedium fermentiert.
1 l Fermentationsbrühe eines eine neue Substanz produzierenden E. coli-
Stamms wurden 30 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Rückstand wurde in
200 ml 0,4 M Argininhydrochlorid, 20 mM Natriumphosphat pH 8,5 aufgenommen
und 30 min mit Ultraschall behandelt. Die Suspension wurde mit 6 ml 2M
MnCl₂ versetzt und 45 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde
mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,9 gebracht und mit festem Ammonium
sulfat auf 60% Sättigung eingestellt.
Das Proteinpräzipitat wurde in 0,2 M Argininhydrochlorid pH 7,5 suspen
diert und gegen 0,4 M Argininhydrochlorid pH 7,5 dialysiert. Nach 16 h
wurde mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und auf das 5fache
Volumen mit Wasser verdünnt.
Diese Lösung wurde über eine mit 0,01 M Argininpuffer pH 8,5 äquilibrierte
®R-Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Die Elution erfolgte mit
0,02 M Na-Phosphat, 0,06 M NaCl. Das Eluat wurde nach dem Verdünnen auf
das 2,5fache über eine mit 0,02 M Na-Phosphat pH 8,0 äquilibrierte ®S-
Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Nach Waschen der Säule mit
Äquilibrierungspuffer erhielt man durch Elution mit 0,05 M Na-Phosphat,
0,1 M NaCl, 0,1 M Arginin pH 8,6 SDS-Polyacrylamidgel-elektrophoretisch
reines Protein.
So wurden folgende Verbindungen der Formel gemäß Anspruch 1 erhalten:
5 · 10³ frisch trypsinisierte, im exponentiellen Wachstum sich befindliche
Zellen wurden in 96-Loch-Platten in 150 µl komplettem Wachstumsmedium (MEM
mit Earles Salzen + 10% FCS, Flow Laboratories, Meckenheim), aus
plattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ in einer Wasserdampf-gesättig
ten Atmosphäre inkubiert. Die Substanzzugabe erfolgte am nächsten Tag in
25 µl komplettem Kulturmedium pro Kulturloch. Die Startkonzentration be
trug 10 ng/ml; titriert wurde seriell 2fach mit Doppelbestimmungen. Fol
gende Kontrollen wurden auf jeder Kulturplatte mitangelegt: a) nur Kultur
medium; b) Zellen mit Kulturmedium, aber ohne Substanz; c) ein titrierter
TNF-Standard bekannter biologischer Aktivität. Nach einer weiteren Inkuba
tion von 48 h bei den oben angegebenen Bedingungen wurden die überlebenden
Zellen mit einer Kristallviolettlösung (15 g Kristallviolett, 7 g NaCl
646 ml Ethanol, 172,8 ml 37%iges Formaldehyd auf 2 l mit H₂O aufgefüllt)
angefärbt. Dazu wurden nach dem Ausschlagen des Kulturmediums die Zellen
für 20 min mit 50 µl der Färbelösung bei Raumtemperatur versetzt. Die
Kulturplatten wurden danach so lange mit Wasser gewaschen, bis alle unge
bundenen Farbstoffanteile entfernt waren. Die gefärbten Zellen wurden
durch Zugabe von 100 µl Färbelösung (50% Ethanol, 0,1% Essigsäure)
lysiert und bei 540 nm photometrisch ausgewertet. Für die Substanzen
ergaben sich dabei in den getesteten Zellinien folgende Aktivitäten,
ausgedrückt in Einheiten pro mg Protein. Eine Einheit ist diejenige Menge
an Substanz, die eine 50%ige Lyse der behandelten Zellen induziert.
In der Tabelle bedeuten:
L-929 eine Maus-Fibrosarkom-Zellinie,
MCF-7 eine humane Mamakarzinom-Zellinie,
rh-TNF rekombinanter humaner TNF.
L-929 eine Maus-Fibrosarkom-Zellinie,
MCF-7 eine humane Mamakarzinom-Zellinie,
rh-TNF rekombinanter humaner TNF.
Polymorphonukleäre neutrophile Granulozyten (PMN) wurden aus heparinisier
tem Blut von gesunden Spendern durch ®Dextran-Sedimentation
(®Dextran T250, 1 g, 60 min, Raumtemperatur) und anschließende Trennung
über einen®Percoll zwei-Stufen-Gradienten (60%/68% ®Percoll, 4°C,
600 g, 30 min) isoliert. Die Zellen aus der 60%/68% Interphase wurden
zweimal in HBSS ohne Ca2+/Mg2+ mit 0,1% HSA gewaschen und dann im selben
Puffer in einer Konzentration von 5 · 10⁶ Zellen/ml aufgewahrt. Die
Chemolumineszenzmessung (CL) wurde in einem Luminometer bei 37°C mit
Lucigenin (100 µm), HBSS mit je 1 mM Ca2+ und Mg2+ und 0,1% HSA in einem
Gesamtvolumen von 0,5 ml und 2,5 · 10⁴ PMN-Zellen pro Probe mit und ohne TNF
bzw. TNF-Derivat vorgenommen.
Die Ergebnisse basieren auf der Integration der Impulse über 30 min und
die Aktivitäten der TNF-Derivate wurden relativ zu TNF (=1,0) angegeben.
Die Stimulation der Sauerstoffradikal-Freisetzung von PMN in Gegenwart von
TNF oder TNF-Derivaten wurden in Prozent der Basisaktivität (ohne Cytokin)
für jede Messung berechnet. TNF und TNF-Derivate wurden miteinander bei
einer Konzentration von 1 mg Cytokin/ml verglichen.
Claims (8)
1. Proteine, gekennzeichnet durch folgende Aminosäuresequenz:
worin
a, b, c, f, g, i 0 oder 1
d, h 0, 1, 2, 3 oder 4
e 1, 2, 3 oder 4
X ein Peptidfragment aus der schweren Kette des Leukokinins mit der Aminosäuresequenz Y-Pro-Arg-Z, worin Y eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins vorangehen, und Z eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins nachfolgen,
sind.
a, b, c, f, g, i 0 oder 1
d, h 0, 1, 2, 3 oder 4
e 1, 2, 3 oder 4
X ein Peptidfragment aus der schweren Kette des Leukokinins mit der Aminosäuresequenz Y-Pro-Arg-Z, worin Y eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins vorangehen, und Z eine direkte Bindung oder eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren ist, die dem Pro-Arg in der Sequenz der schweren Kette des Leukokinins nachfolgen,
sind.
2. Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
3. DNA, codierend für ein Protein gemäß Anspruch 1.
4. Vektor, enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 3.
5. Wirtsorganismus, enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 4.
6. Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus nach Anspruch 5 züchtet
und das Protein daraus isoliert.
7. Proteine gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von
Krankheiten.
8. Verwendung der Proteine gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von
neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen wowie zur
Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und
Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen.
Priority Applications (5)
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---|---|---|---|
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EP90910668A EP0485407A1 (de) | 1989-07-29 | 1990-07-20 | Proteine mit tnf-wirkung |
JP2509985A JPH04507241A (ja) | 1989-07-29 | 1990-07-20 | Tnf―作用を有する蛋白質 |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE3925183A DE3925183A1 (de) | 1989-07-29 | 1989-07-29 | Proteine mit tnf-wirkung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3925183A1 true DE3925183A1 (de) | 1991-02-07 |
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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- 1989-07-29 DE DE3925183A patent/DE3925183A1/de not_active Withdrawn
-
1990
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- 1990-07-20 EP EP90910668A patent/EP0485407A1/de not_active Withdrawn
- 1990-07-20 JP JP2509985A patent/JPH04507241A/ja active Pending
- 1990-07-20 CA CA002051124A patent/CA2051124A1/en not_active Abandoned
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8130 | Withdrawal |