DE3920923A1 - Konzentrierte nikkomycine, verfahren zu deren herstellung und hierzu verwendbare neue adsorberharze - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Feinreinigung von Nikkomycin (X) und (Z) sowie von Gemischen der Nikkomycine (X) und (Z) mit Hilfe hochspe­ zifischer Adsorberharze.

Nikkomycin, seine Herstellung auf mikrobiologischem Wege mittels des Stammes Streptomyces tendae Ettlinger (CBS 354.75) und seine Verwendung als Pflanzenschutzmittel sind bekannt (DE-OS 25 37 028, US-PS 40 06 881 und US-PS 41 58 608).

Nikkomycine, wie auch deren strukturverwandte Polyoxine, können in die Chitinsynthese der Zellwände von Pilzen durch Hemmung des Enzyms Chitinsynthase eingreifen (Hector und Pappagianis, J. Bacteriol. 154, 488 (1983) sowie Hector und Braun, Antimicrobial Agents Chemother. 29, 389 (1986)).

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Nikkomycine - insbesondere in Kombination mit Azolantimykotika syner­ gistisch wirkend - gegen humanpathogene Pilze eingesetzt werden können, insbesondere bei parenteraler oder oraler Applikation der Wirkstoffkombination. Diese Ergebnisse sind Gegenstand einer noch nicht veröffentlichten Patentanmeldung.

Zur Verbesserung der Darreichungsform ist es erforder­ lich, die Nikkomycine in hochreiner Form zu isolieren.

Die auf mikrobiologischem Wege durch Fermentation und Aufarbeitung gewonnenen Nikkomycin-Gemische bestehen hauptsächlich aus Nikkomycinen der allgemeinen Formel (I)

wobei

R₂ Wasserstoff und

bedeuten.

Es ist bereits bekannt geworden (EP-A-00 41 180 und US- PS 45 52 954), daß man die Nikkomycine (X) und (Z) aus einem Kulturfiltrat der mikrobiellen Nikkomycin-Er­ zeugung oder aus Rohnikkomycin durch ein ein- oder zwei­ stufiges Verfahren an Ionenaustauschern auf einen Rein­ heitsgrad von in der Regel 40 bis 70, in einzelnen Fällen von 90, anreichern kann, bei Gesamtausbeuten von bis zu 85 Gew.-%.

Die nach den bekannten Verfahren erreichten Reinheits­ grade der Nikkomycine sind jedoch noch nicht befriedi­ gend. Für die pharmazeutische Verwendung wird ein Rein­ heitsgrad der Nikkomycine < 90 Gew.-%, bevorzugt < 95 Gew.-%, angestrebt.

Es wurde nun gefunden, daß eine weitere Aufreinigungs­ stufe mit Hilfe von neuen hochspezifischen Adsorber­ harzen zu höheren Reinheitsgraden der Nikkomycine X und Z geführt werden können, ohne daß dabei größere Mengen an Nikkomycinen verlorengehen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung der Nikkomycine (X) und (Z) unter Verwendung von perlförmigen makroporösen Mischpolymerisaten, er­ halten durch Polymerisation einer Monomerenmischung, die zu 20-100 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht an poly­ merisierbaren Monomeren, aus aliphatischen und/oder aro­ matischen Di- und Trivinylverbindungen besteht.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate auf der Basis von (Meth-) Acryl-Derivaten, Styrol-Derivaten, Kombinationen dieser Monomerengruppen oder Vinylpyridinen, N-Vinylpyrroli­ donen bzw. N-Vinylazolen, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Perlpolymerisation aus einer Monomerenmischung erhalten werden, die zu 20-100 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht an polymerisierbaren Monomeren, aus ali­ phatischen und/oder aromatischen Di- und Trivinylver­ bindungen besteht.

Die hochspezifischen neuen Adsorberharze sind solche auf Basis von (Meth-)Acryl-Derivaten, auf Basis von Styrol- Derivaten und besonders bevorzugt auf Basis von Kombina­ tionen dieser Monomergruppen. Ebenfalls einsetzbar sind spezielle Adsorberharze auf Basis anderer polymerisier­ barer Monomeren wie Vinylpyridine, N-Vinylpyrrolidone und N-Vinylazole wie beispielsweise N-Vinylimidazol.

Zur Herstellung dieser Adsorberharze, die zur Durchfüh­ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens der Feinreinigung von Nikkomycin X und Z eingesetzt werden können, werden als Vernetzer Polyvinylverbindungen wie beispielsweise DVB, TVB, Ethylenglykoldimethacrylat, N,N′-Divinylethy­ lenharnstoff und Methylenbisacrylamid eingesetzt. Die gewünschte Morphologie der Adsorberharze, d. h. Oberflä­ che, Porenvolumen, mittlerer Porendurchmesser, wird durch den Einsatz bekannter Porogene, wie sie beispiels­ weise von John R. Millar, NATO ASI Series E: Appl. Sci. 71, The Hague 1983, beschrieben wurden, erreicht. Der Anteil an Vernetzer kann zwischen 20 und 85 Gew.-%, der Anteil an Porogen 60 bis 200 Gew.-%, bevorzugt 100 bis 200 Gew.-%, jeweils bezogen auf eingesetztes Monomer, betragen.

Die Adsorberharze werden auf dem Wege der Perlpolymeri­ sation hergestellt, wie sie beispielsweise in Houben- Weyl, Band 14/1, Seite 133 ff., beschrieben ist. Durch die Kombination hydrophiler Polymerbausteine, wie bei­ spielsweise N-Vinylpyridin, Dimethylaminoethylmethacryl­ amid, Methylmethacrylat oder Ethylenglykoldimethacrylat, mit hydrophoben Polymerbausteinen, wie beispielsweise Styrol, Methylstyrol oder DVB (Divinylbenzol), lassen sich die erfindungsgemäßen hochspezifischen vernetzten Adsorberharze herstellen, die entsprechend den jeweili­ gen Anteilen der beschriebenen Monomere gegenüber Nikko­ mycinen ein spezifisches Adsorptions- und Elutionsver­ halten aufweisen.

Die bevorzugten hochspezifischen neuen Adsorberharze unterscheiden sich von den herkömmlichen, kommerziell verfügbaren Adsorberharzen wie zum Beispiel ®AMBERLITE XAD2 und XAD4 von Röhm und Haas; ®DIAION HP 20 von Mitsubishi und ®LEVATIT OC 1062 und OC 1064 von der Bayer AG dadurch, daß durch Kombination von hydrophob einzustufenden Styrol-Abkömmlingen wie beispielsweise Methylstyrol, Divinylbenzol (DVB) und Trivinylbenzol (TVB) mit vergleichsweise hydrophileren Monomeren wie beispielsweise Methacrylsäuremethylester, Dimethyl­ aminoethylmethacrylat, N-Methoxymethylmethacrylsäure­ amid, Ethylenglykoldimethacrylat oder N,N′-Divinylharn­ stoff überraschenderweise die Intensität der Wechselwir­ kungen zwischen Nikkomycine X und Z und der Polymer­ matrix der Adsorberharze derartig eingestellt wird, daß die Elution der gewünschten Nikkomycine mit Hilfe eines Wasser/Alkohol-Gradienten in vergleichsweise engen Eluatzonen erfolgt. Durch die starke Reduzierung des Tailing-Bereiches erreicht man eine wirtschaftlichere, qualitativ bessere Trennleistung.

Zur Herstellung derartiger Adsorberharze können die hydrophilen/hydrophoben Monomere im Verhältnis 1:1 (Gew.-Teile) eingesetzt werden. Es hat sich jedoch als vorteilhaft herausgestellt, daß ein Anteil von bis zu 30 und besonders von bis zu 20 Gew.-% hydrophiler Mono­ mere, bezogen auf den Gesamteinsatz an Monomeren, die Trennleistung der entsprechenden Adsorberharze günstig beeinflußt.

Eine weitere Optimierung der Trennleistung kann erreicht werden, wenn die hydrophilen Monomeranteile außerdem noch basische Zentren aufweisen. So sind beispielsweise Adsorberharze aus DVB, Styrol und Dimethylaminoethyl­ methacrylat besonders (Beispiel 3) für die Aufkonzen­ trierung der Nikkomycine X, Z geeignet.

Es ist auch möglich, Adsorberharze zu verwenden, deren Monomerbausteine nur aus Styrolabkömmlingen bestehen (Beispiel 2).

Bevorzugt sind perlförmige, makroporöse Mischpolymeri­ sate, deren Monomerenmischung zu 40-80 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht an polymerisierbaren Monomeren, aus aliphatischen und/oder aromatischen Di- und Tri­ vinylverbindungen besteht, sowie solche, in denen als polymerisierbare Monomerenbausteine Styrolabkömmlinge wie Ethylstyrol, Methylstyrol und/oder Divinylbenzol oder andere aromatische Verbindungen wie N-Vinyl­ pyridine, N-Vinylazole wie beispielsweise N-Vinylimi­ dazol eingesetzt werden.

Weiterhin bevorzugt sind perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate, in denen als copolymerisierbare Mono­ merenbausteine aliphatische Verbindungen wie beispiels­ weise (Meth-)Acrylester, (Meth-)Acrylamide, Acrylnitril oder N-Vinylpyrrolidon eingesetzt werden.

Besonders bevorzugt sind perlförmige, makroporöse Misch­ polymerisate, deren aromatischer Monomerenanteil zwischen 5 und 95% und deren Anteil an hydrophilem Monomeren bei 5-40% liegt.

Ganz besonders bevorzugt werden perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate, deren Anteil an hydrophilen Monomeren bei 5-20 % liegt.

Weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind die Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Ad­ sorberharze, insbesondere die Verfahren der Ansprüche 11 bis 25 und der folgenden Beispiele.

Es wurde gefunden, daß man das nach den bekannten Metho­ den vorgereinigte Nikkomycin X, Nikkomycin Z oder Nikko­ mycin X/Z-Gemisch auf einfache Weise mit hoher Selekti­ vität auf mehr als 90% Reinsubstanz anreichern kann, indem man die vorgereinigten Substanzen auf eine mit einem der vorgenannten Adsorberharze beschickten Säule aufträgt und mit einem Wasser/Alkohol-Gradienten elu­ iert und das erhaltene Produkt nach den üblichen Metho­ den isoliert. Als Alkoholkomponente kommen bevorzugt Methanol oder Ethanol in Frage. Hierbei ist es überra­ schend, daß die beschriebenen Adsorberharze eine sehr hohe Kapazität für die Nikkomycine besitzen, wohingegen z. B. ®Lewatit OC 1062 und OC 1064 (Bayer AG, Leverkusen, FRG), ®AMBERLITE XAD-2 und XAD-4 (Röhm und Haas) und ®DIAION HP 20 (Mitsubishi) nur eine unbefriedigende Ka­ pazität aufweisen, wodurch ein großer Teil des aufge­ tragenen Nikkomycins nicht gebunden wird und bereits mit Wasser eluierbar ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das z. B. mit einem stark sauren Ionenaustauscher oder einem schwach basischen Ionenaustauscher oder in einem zweistufigen Prozeß das mit beiden Ionenaustauscherarten vorgereinigte Nikkomycin (DE-OS 30 20 722, US-PS 45 52 954, EP-A-00 41 180) in einer weiteren Stufe an einem der oben beschriebenen Adsorberharze gereinigt.

Die wäßrige Lösung des Roh-Nikkomycins wird durch Säure- oder Basenzusatz auf einen pH-Wert von 4 bis 7, vorzugs­ weise 6 bis 7, eingestellt. Hierzu können anorganische Säuren (beispielsweise HCl) oder vorzugsweise organische Säuren, insbesondere aliphatische Carbonsäuren, wie Essigsäure oder Propionsäure, verwendet werden. Bevor­ zugt wird Essigsäure verwendet. Ebenso geeignet sind anorganische Basen (z. B. NaOH) oder vorzugsweise ver­ dünnte Ammoniaklösungen oder andere flüchtige Basen.

Das mit den Nikkomycinen beladene Adsorberharz wird mit Wasser gewaschen, bis das Eluat farblos ist. Vorzugsweise wird der Waschvorgang mehrfach wiederholt. Im Eluat erscheinen neben Salzen und unbekannten Substanzen die Hydrolyseprodukte der Nikkomycine, so z. B. die Nukleosi­ de Nikkomycin C_x und C_z und Hydroxypyridylhomothreonin.

Zur Elution des Nikkomycins X, Nikkomycins Z oder des Nikkomycins X/Z-Gemischs vom Adsorberharz eignet sich ein Gradient aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Alkohol, vorzugsweise Ethanol oder Methanol. Zur Unter­ drückung eines eventuell auftretenden Tailings kann die Alkoholkomponente Essigsäure, vorzugsweise 0,1-1 Gew.-%, enthalten.

Bei der Elution einer mit dem Nikkomycin X/Z-Gemisches beladenen Säule erhält man bei der Gradienten-Elution mit Lösungen steigender Alkoholkonzentration in den ersten Fraktionen eine bevorzugte Anreicherung von Nik­ komycin Z, während in später aufgefangenen Fraktionen bei höheren Alkoholkonzentrationen hauptsächlich Nikkomycin X angereichert wird. Auf diese Weise ist eine Trennung von Nikkomycin X und Z erreichbar. Die Isolierung des erhaltenen Produktes aus dem Eluat erfolgt nach den üblichen Methoden, z. B. durch Verdampfen des Lösungs­ mittels, vorzugsweise unter vermindertem Druck und durch Gefriertrocknung.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die Nikko­ mycine in hoher Reinheit und Ausbeute erhalten. Die geringen Substanzverluste erlauben eine mehrfache An­ wendung des Reinigungsprozesses, was zu Produkten mit weiter verbesserten Reinheitsgraden führt.

Nikkomycine mit einem Gehalt an Nikkomycin Z von 90 Gew.-% sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Bevorzugt sind Nikkomycine mit einem Gehalt an Nikkomy­ cin Z von 92 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt sind Nikkomycine, enthaltend 92 bis 95 Gew.-% Nikkomycin Z.

Die erfindungsgemäßen Nikkomycine eignen sich zur Her­ stellung von Arzneimitteln, die ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Herstellung der neuen Adsorberharze soll durch die folgenden Beispiele erläutert werden. Die Ausbeuten wurden durch HPLC bestimmt. Die Ausbeuteangaben beziehen sich jeweils auf den Gehalt des Produktes im eingesetzten Roh-Nikkomycin. Die Endprodukte wurden aus dem Eluat durch Gefrier­ trocknung gewonnen.

Herstellung der Adsorberharze Beispiel 1

Zu einer Lösung von 3,25 g Tylose MH 50 in 1500 ml Wasser werden 95,7 g 62,7%iges Divinylbenzol, 104,3 g Methacrylsäuremethylester und 3,0 g Benzoylperoxid sowie 300 g Methylisobutylketon gegeben. Nach 30minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Suspension unter Rühren für 15 h bei 70°C und 2 h bei 90°C gerührt. An­ schließend wird das abfiltrierte Perlpolymerisat mit vollentsalztem Wasser gewaschen und das Inertmaterial in einer Säure mit Methanol eluiert. Danach wird das Methanol durch vollentsalztes Wasser verdrängt. Nach dem Trocknen erhält man so 179 g eines Perlpolymerisates, welches zur erfindungsgemäßen Feinreinigung des Nikko­ mycins geeignet ist.

Beispiel 2

Analog des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens werden 200 g 80%iges Divinylbenzol in Gegenwart von 300 g Xylol und 2 g Benzoylperoxid perlpolymerisiert. Nach der Aufarbeitung erhält man 191 g Perlpolymerisat, welches zur erfindungsgemäßen Feinreinigung des Nikkomycins ge­ eignet ist.

Beispiel 3

Analog des im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens werden 127,6 g 62,7%iges Divinylbenzol, 52,4 g Styrol, 20,0 g Dimethylaminoethylmethacrylat in Gegenwart von 300 g Toluol und 3,0 g Porofor N in 1500 ml gesättigter Koch­ salzlösung und 3 g Tylose H 4000 perlpolymerisiert. Nach der Aufarbeitung erhält man 640 ml wasserfeuchtes Perl­ polymerisat, welches zur erfindungsgemäßen Feinreinigung des Nikkomycins geeignet ist.

Beispiel 4

Analog des im Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens werden statt 300 g Toluol 300 g Methylisobutylketon als Porogen eingesetzt. Nach der Aufarbeitung erhält man so 750 ml Perlpolymerisat, welches zur erfindungsgemäßen Feinrei­ nigung des Nikkomycins geeignet ist.

Beispiel 5

Analog des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens werden 127,6 g 62,7%iges Divinylbenzol, 52,4 g Styrol, 10 g Methacrylsäuremethylester und 10 g N-Methoxymethylmeth­ acrylsäureamid in Gegenwart von 300 g Toluol und 3 g Benzoylperoxid perlpolymerisiert. Nach der Aufarbeitung erhält man 153 g Perlpolymerisat, welches zur erfin­ dungsgemäßen Feinreinigung des Nikkomycins geeignet ist.

Beispiel 6

Analog des im Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens werden 127,6 g 62,7%iges Dinvinylbenzol, 52,4 g Styrol, 20,0 g 2-Hydroxyethylmethacrylat in Gegenwart von 300 g MIBK und 3,0 g Benzoylperoxid perlpolymerisiert. Nach der Aufarbeitung erhält man 890 ml wasserfeuchtes Perlpoly­ merisat, welches zur erfindungsgemäßen Feinreinigung des Nikkomycins geeignet ist.

Beispiel 7

Analog des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens werden 60 g Ethylenglykoldimethacrylat, 10 g N-Methoxymethyl­ methacrylsäureamid, 130 g Methacrylsäuremethylester in Gegenwart von 300 g Butylacetat und 3 g Benzoylperoxid perlpolymerisiert. Nach der Aufarbeitung erhält man 188 g getrocknetes Perlpolymerisat, welches zur erfin­ dungsgemäßen Feinreinigung des Nikkomycins geeignet ist (LGP 4010).

Beispiele für den Reinigungsprozeß Beispiel 8

Es wurde ein Nikkomycin mit einem Gehalt an Nikkomycin Z <95 Gew.-% angestrebt.

8,5 g eines 66gew.-%igen Nikkomycin Z (vorliegend als Acetat) wurden in 10 ml Wasser gelöst und mit verdünntem Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt.

Diese Lösung wurde auf eine mit 900 ml des Adsorberhar­ zes gemäß Beispiel 3 gefüllte Säule (⌀ 5 cm×68 cm) mit einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/h aufgetragen. Der Adsorber wurde anschließend mit 4 l Wasser gewaschen.

Anschließend wurde das Nikkomycin Z durch Elution mit einem linearen Gradienten aus 2 l Wasser und 2 l Methanol, welcher 0,1 Gew.-% Essigsäure enthält, vom Addorber abgelöst.

Die Vereinigung der Fraktionen erfolgte nach DC auf Cellulose mit dem Laufmittel Isopropanol/H₂O/Essig­ säure = 60/40/0,5 (jeweils Volumenteile) oder gemäß der HPLC-Analyse.

Aus den vereinigten Fraktionen wurde am Rotationsver­ dampfer das Methanol abgezogen.

Zur Entfernung des Wassers und der nicht im Endprodukt (Nikkomycin-Acetat) vorliegenden Essigsäure wurde an­ schließend gefriergetrocknet.

Auflistung der einzelnen Fraktionen nach dem Spülen der Säule mit 4 l Wasser.

Die Gesamtausbeute an Nikkomycin Z beträgt 79%, dieje­ nige an 96%igem Nikkomycin Z 65%.

Beispiel 9 (Nikkomycin-Reinigung) Vorreinigung von Nikkomycin Z aus Fermenterbrühe von Streptomyces tendae an Lewatit SC 104 Na⁺

2 Fermenter à 2 m³ werden durch Zugabe von Essigsäure auf pH 4 eingestellt. Danach werden 700 Liter Lewatit SC 104 Na⁺-Form (Warenzeichen der BAYER AG, Leverkusen, Deutschland (BRD)) im Batch eingerührt und die Suspen­ sion für weitere 60 Minuten gerührt. Der mit Nikkomycin Z beladene Ionenaustauscher wird über eine Sieb­ schneckenzentrifuge abgetrennt, das Harz auf der Zentri­ fuge mit 8-10 m³ entsalztem Wasser gewaschen bis der Ab­ lauf blank, farblos und die Leitfähigkeit unter 0,05 mS×cm^-1 abgesunken ist. Auf das gewaschene Harz werden etwa 2 m³ entsalztes Wasser gegeben.

Das beladene Harz wird im Batch eluiert.

In einem Rührkessel werden 3,5 m³ entsalztes Wasser vor­ gelegt, das Harz zugegeben und die Leitfähigkeit des Überstandes durch Zugabe von ca. 2 m³ entsalztem Wasser auf < 0,05 mS×cm^-1 gehalten. Die Elution von Nikkomy­ cin Z erfolgt durch Zugabe von konzentrierter Ammoniak- Lösung bei einer Leitfähigkeit von 0,6 mS×cm^-1. Die Elution ist nach 30 Minuten Rühren beendet.

Die überstehende Lösung wird vom Harz über Siebdüsen ab­ getrennt und das Harz mit entsalztem Wasser nachgewa­ schen. Die Lösung wird sofort mit Essigsäure auf pH 6,5 eingestellt.

Die Ausbeute bezogen auf die Ausgangswerte in der Fermentationsbrühe beträgt 76,7% Nikkomycin Z.

Der Ionenaustauscher wird im Verhältnis 100 Liter Lewatit SC 104, mit 100 Liter entsalztem Wasser, 10 Liter Natronlauge und 6 kg Natriumchlorid regeneriert. Die Rührzeit bei den Regenerationsschritten beträgt 60 Minuten. Zuletzt wurde der Ablauf des Harzes unter pH 9 eingestellt.

Beispiel 10 Reinigung von Nikkomycin Z an einem schwach basischen Ionenaustauscher

Das vorgereinigte Eluat von Lewatit SC 104 wird im Batch weiter an einem schwach basischen Ionenaustauscher ge­ reinigt. Zum Eluat werden ca. 400 Liter Lewatit MP 64 Z II zugegeben. Die Suspension wird 3 Stunden bei pH 6,5 gerührt, der Überstand über Siebdüsen abgesaugt und das Harz anschließend mit ca. 4mal 1000 Liter entsalztem Wasser gewaschen, bis der Ablauf blank und farblos und unter einer Leitfähigkeit von 0,05 mS×cm^-1 ist. Das Waschwasser wird nach Analyse verworfen.

Zur Nikkomycin-Elution werden zum Harz 600 Liter ent­ salztes Wasser zugefügt, der pH-Wert mit Essigsäure auf 3,25 eingestellt, 30 Minuten bei diesem pH-Wert gerührt, anschließend mit 2mal 200 Litern entsalztem Wasser nachgewaschen, so daß insgesamt ca. 1000 Liter Nikkomycin Z-Eluat erhalten werden.

Das Eluat wird bei einer Badtemperatur von 80°C zuerst in einem Dünnschichtverdampfer, anschließend bei einer Badtemperatur von 60°C in einer Destillationsblase und zuletzt bei einer Badtemperatur von 50°C im Rotations­ verdampfer konzentriert. Das Konzentrat kann eingefroren werden.

Die Regeneration des schwach basischen Ionenaustauschers erfolgt nacheinander im Verhältnis pro 100 Liter Aus­ tauscher mit 400 Liter salzsaurer Lösung (100 Liter entsalztes Wasser und 9 Liter Salzsäure, 37%ig) und etwa 15 m³ entsalztem Wasser so lange, bis der pH-Wert im Ablauf der Säule über pH 4 liegt, 400 Liter alkalischer Lösung (100 Liter entsalztes Wasser und 6 Liter Natron­ lauge, 45%ig) so lange, bis der Ablauf über pH 12 liegt, ca. 14 m³ entsalztem Wasser bis der pH-Wert im Ablauf der Säule unter 8 liegt.

Beispiel 11 Reinigung von Nikkomycin Z an einem Absorberharz

280 g Nikkomycin (aus einer Nikkomycin Z-Fermentation), das in der üblichen Weise (Adsorption mit SC-104, wei­ tere Reinigung des Eluats mit einem schwach basischen Ionenaustauscher) angereichert wird, wurde in 30 l ent­ mineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wird mit ver­ dünnter Ammoniaklösung oder 5- bis 10%iger Essigsäure je nach pH-Wert der Ausgangslösung auf pH 6,25 eingestellt. Die über ein Seitz-AS-Filter vorfiltrierte Lösung wird auf eine mit 70 l Adsorberharz gemäß Beispiel 3 gefüll­ te Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 bis 70 l/Std. aufgetragen.

Säulenabmessungen

Volumen: 100 Liter; Höhe/m, unterer Durchmesser 30 cm, oberer Durchmesser 45 cm.

Der Austauscher wird anschließend mit etwa 5 Säulenvolu­ mina Wasser gewaschen (etwa 5 Säulen-Volumina) bis der Ablauf eine Leitfähigkeit von <0,05 mS×cm^-1 hat und farblos ist.

Anschließend wurde das Nikkomycin durch Elution mit einem linearen Gradienten aus Wasser/Methanol und Essigsäure vom Austauscher abgelöst. Der verwendete Gradient hat folgende Zusammensetzung:
Lösung A: 250 l entsalztes Wasser
Lösung B: 197,5 l Methanol, 2,5 l Essigsäure und 50 l entsalztes Wasser

Es wird ein Vorlauf von ca. 125 Litern aufgefangen, der nach HPLC-Analyse verworfen werden kann.

Dann wird der Hauptlauf in Fraktionen von je 12 Litern aufgefangen und diese getrennt gefriergetrocknet (siehe Abb. 1).

Nach der Elution von Nikkomycin Z wird ein Nachlauf von 40 Liter-Fraktionen gesammelt.

Die vereinigten Fraktionen werden am Rotationsverdampfer konzentriert. Bedingungen: Badtemperatur +50°C, Vakuum 20-40 mbar, Endvakuum etwa 20 mbar. Die Destillatlei­ stung beträgt <4 l/h.

Nach Gefriertrocknung der einzelnen Fraktionen wird die spezifische Aktivität der Substanzen durch HPLC (siehe Trennung und Analyse von Nikkomycin) bestimmt.

Ein optimales Trennergebnis erhält man an einer mit dem Harz gemäß Beispiel 3 gefüllten Säule. Zur mehrfachen Verwendung wird das Harz sorgfältig mit Methanol/HCl und anschließend mit NaOH/Wasser regeneriert.

Das Elutionsprofil ist in der Abb. 1 dargestellt. Die Hauptmenge der Aktivität wird zwischen 2 und 4 Säulenvolumen an Elutionsmittel mit hoher Reinheit eluiert.

Aus einer Lösung, die insgesamt 7,865 kg Nikkomycin ent­ hielt (bezogen auf 100%iges Nikkomycin), werden nach Chromatographie am Adsorberharz 3,993 kg 91,5%iges Nikkomycin Z erhalten (HPLC-Bestimmung). Die Stufenaus­ beute bezogen auf diese Fraktion beträgt 46,5%. Das restliche Nikkomycin Z befindet sich in den stärker verunreinigten Randfraktionen.

HPLC-Analytik des Nikkomycins

Die HPLC-Analytik (C₁₈-"Reversed Phase"-Ionenpaar- Gradientenchromatographie) erwies sich als geeignetste Methode, um den Reinheitsgrad der Nikkomycinpartien zu bestimmen.

Die Gehaltsermittlung erfolgt bei der Hauptkomponente Nikkomycin Z (resp. X) durch Vergleich mit einem Nikko­ mycin Z (resp. X)-Standard (externer Lauf), bei den Nikkomycin-Nebenkomponenten zusätzlich mit Hilfe von relativ. "Response"-Faktoren.

Eingesetzt wurde das HPLC-Gerät von Hewlett-Packard (HP)1084 B mit dem variablen Wellenlängendetektor: 79875.

Analysenparameter

Claims (30)

1. Verfahren zur Reinigung der Nikkomycine (X) und (Z) unter Verwendung von perlförmigen, makroporösen Mischpolymerisaten, erhalten durch Perlpolymeri­ sation einer Monomerenmischung, die zu 20-100 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht an polymerisierbaren Monomeren, aus aliphatischen und/oder aromatischen Di- und Trivinylverbindungen besteht.

2. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate auf der Basis von (Meth-)Acryl-Derivaten, Styrol-Derivaten, Kombinationen dieser Monomerengruppen oder Vinyl­ pyridinen, N-Vinylpyrrolidonen bzw. N-Vinylazolen, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Perlpolymeri­ sation aus einer Monomerenmischung erhalten werden, die zu 20-100 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht an polymerisierbaren Monomeren, aus aliphatischen und/oder aromatischen Di- und Trivinylverbindungen besteht.

3. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono­ merenmischung zu 40-80 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht an polymerisierbaren Monomeren, aus aliphatischen und/oder aromatischen Di- und Tri­ vinylverbindungen besteht.

4. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate gemäß den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als polymerisierbare Monomerenbausteine Ethyl­ styrol, Methylstyrol und/oder Divinylbenzol oder andere aromatische Verbindungen wie N-Vinylpyri­ dine, N-Vinylazole wie beispielsweise N-Vinyl­ imidazol eingesetzt werden.

5. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate gemäß den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als copolymerisierbare Monomerenbausteine alipha­ tische Verbindungen (Meth-)Acrylester, (Meth-) Acrylamide, Acrylnitril oder N-Vinylpyrrolidon eingesetzt werden.

6. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate gemäß den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als copolymerisierbare Monomerenbausteine eine Mischung aus Monomerenbausteinen der Ansprüche 4 und 5 verwendet werden.

7. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der aro­ matische Monomerenanteil zwischen 5 und 95% liegt.

8. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an hydrophilen Monomeren gemäß Anspruch 5 bei 5- 40% liegt.

9. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an hydrophilen Monomeren gemäß Anspruch 5 bei 5-20% liegt.

10. Perlförmige, makroporöse Mischpolymerisate nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Di- oder Trivinylverbindungen Divinylbenzol, Trivinyl­ benzol, Ethylenglykoldimethacrylat, N,N′-Divinyl­ ethylenharnstoff, Methylenbisacrylamid oder Tri­ methylolpropantriacetat verwendet werden.

11. Verfahren zur Anreicherung von Nikkomycin (X) und (Z) aus einem Kulturfiltrat der mikrobiellen Nikko­ mycin-Erzeugung oder aus Rohnikkomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturfiltrat oder die Rohnikkomycinlösung auf einen pH-Wert zwischen etwa 5 und 7 einstellt und an ein Adsorberharz gemäß den Ansprüchen 2-10 adsorbiert und das adsorbierte Material mit einem Gradienten aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Alkohol eluiert, wobei die Alkoholkomponente zur Unterdrückung eines eventuell auftretenden Tailings eine niedere aliphatische Carbonsäure, vorzugsweise in einer Menge von 0,1- 1 Gew.-%, enthält.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Nikkomycin enthaltende wäßrige Lösung vor der Adsorption an das Adsorberharz mit Ammoniak oder einer anderen Base auf einen pH-Wert zwischen 5 und 7 bringt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeich­ net, daß man zur Elution von Nikkomycin (X) oder (Z) mit einem Gradienten aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Alkohol, vorzugsweise Ethanol oder Methanol, verwendet.

14. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeich­ net, daß man der Alkoholkomponente zur Unter­ drückung eines eventuell auftretenden Tailings Essigsäure, vorzugsweise in einer Menge von 0,1- 1 Gew.-%, zusetzt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Nikkomycin (X) und (Z) enthalten­ den Eluatlösungen am Rotationsverdampfer konzen­ triert und anschließend gefriertrocknet.

16. Verfahren, gemäß Ansprüchen 11-15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die wäßrige Nikkomycin-Lösung durch Adsorption an einen sauren Ionenaustauscher und nachfolgende Elution mit einer schwachen Base vorreinigt.

17. Verfahren, gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeich­ net, daß die Lösung, die vorgereinigt wird, ein Kulturfiltrat der mikrobiellen Nikkomycin-Erzeugung darstellt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeich­ net, daß man als einen sauren Ionenaustauscher einen makroporösen oder gelförmigen Ionenaus­ tauscher aus mit Divinylbenzol vernetzten Poly­ styrolharz mit Sulfonsäuregruppierungen einsetzt.

19. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeich­ net, daß man als schwache Base zur Elution vom sauren Ionenaustauscher verdünnte Ammoniaklösung verwendet.

20. Verfahren gemäß den Ansprüchen 16-19, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die mit einem sauren Ionen­ austauscher vorgereinigte Nikkomycinlösung gegebe­ nenfalls am Rotationsverdampfer einkonzentriert, auf einen pH-Wert zwischen 4-7 einstellt und mit einem schwach basischen Ionenaustauscher behandelt, der aus der Gruppe der basischen makroporösen oder gelförmigen mit Divinylbenzol vernetzten Polysty­ rolharze, die teilweise oder vollständig mit primä­ ren, sekundären, tertiären oder quartären Stick­ stoffgruppen substituiert sind, der basischen ma­ kroporösen oder gelförmigen Polyacrylamide, basi­ schen makroporösen oder gelförmigen (Meth-)Acryla­ te, die umamidiert wurden, der basischen makroporö­ sen aminomethylierten Polystyrole, die mit 6% Di­ vinylbenzol vernetzt sind oder der basischen gel­ förmigen Dextrane besteht, und das adsorbierte Material mit einer verdünnten wäßrigen Lösung niederer aliphatischer Carbonsäuren eluiert und dadurch eine konzentrierte Lösung von Nikkomycin (X) oder (Z) erhält.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeich­ net, daß man als schwach basischen Ionenaustauscher ein makroporöses aminomethyliertes Polystyrol, welches mit Divinylbenzol vernetzt ist, einsetzt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Nikkomycin enthaltende wäßrige Lösung vor der Adsorption am schwach basischen Ionenaustauscher mit Essigsäure auf einen pH-Wert zwischen 4 und 7 bringt.

23. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nikkomycin enthaltende wäßrige Lösung vor der Adsorption am schwach basischen Ionenaus­ tauscher mit Essigsäure auf einen pH-Wert zwischen 6 und 7 bringt.

24. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeich­ net, daß man zur Elution von Nikkomycin (X) oder (Z) vom basischen Ionenaustauscher Essigsäure mit steigender Säurekonzentration verwendet.

25. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeich­ net, daß die Nikkomycinlösung, welche man mit dem basischen Ionenaustauscher behandelt, ein Kultur­ filtrat direkt aus der mikrobiellen Nikkomycin- Erzeugung ohne Vorreinigung darstellt.

26. Verfahren gemäß den Ansprüchen 16-19, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die verdünnte wäßrige Lösung aus einem Kulturfiltrat der mikrobiellen Nikkomy­ cin-Erzeugung mit einem makroporösen oder gelförmi­ gen sauren Ionenaustauscher aus mit Divinylbenzol vernetztem Polystyrolharz mit Sulfonsäuregruppen behandelt, um das biologisch aktive Material zu adsorbieren und dann mit verdünntem Ammoniak zu eluieren, die erhaltene Lösung mit Essigsäure auf einen pH-Wert zwischen 6 und 7 bringt und dann in einer 2. Reinigungsstufe mit dem schwach basischen Ionenaustauscher behandelt und die Elution vom basischen Ionenaustauscher mit Essigsäure steigen­ der Säuerkonzentration vornimmt und das Eluat nach Aufkonzentrierung und Entfernung der Essigsäure in einer dritten Reinigungsstufe gemäß den Ansprüchen 2-10 charakterisiertes Adsorberharz verwendet, die Nikkomycinlösung gemäß den Ansprüchen 11-15 adsor­ biert, mit einem Gradienten aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Alkohol, vorzugsweise Ethanol oder Methanol, eluiert und die Eluatlösung am Rota­ tionsverdampfer konzentriert und anschließend ge­ friertrocknet.

27. Nikkomycin mit einem Gehalt an Nikkomycin Z oder X von 90 Gew.-%.

28. Nikkomycin mit einem Gehalt an Nikkomycin Z oder X von 92 Gew.-%.

29. Nikkomycin, enthaltend 92 bis 95 Gew.-% Nikkomycin Z oder X.

30. Arzneimittel, enthaltend ein Nikkomycin der Ansprüche 27, 28 oder 29.