DE3873825T2

DE3873825T2 - Die proteinabsorption verbessernde stoffe.

Info

Publication number: DE3873825T2
Application number: DE8888108205T
Authority: DE
Inventors: Stanley Jay Dr Sarnoff; Burton E Dr Sobel
Original assignee: Survival Technology Inc
Current assignee: Meridian Medical Technologies Inc
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1988-05-21
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2008-05-22
Also published as: CA1335788C; DE3873825D1; AU627125B2; ATE79550T1; EP0292908A1; JPS63297331A; EP0292908B1; AU1616488A; IL86443A0; US4839170A

Description

Das US-Patent 4 658 830 (Sarnoff) beschreibt die Verwendung von Hydroxylamin und seiner Salze zur Verbesserung der Absorption eines selektiv auf Blutgerinnsel gerichteten Koronarthrombolytikums wie insbesondere t-PA (Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator) in den Blutfluß, insbesondere bei intramuskulärer Absorption. Diese Beschreibung ist im US-Patent 4 661 469 (Sarnoff) und in der am 27. Februar 1986 veröffentlichten internationalen Anmeldung WO 86/01109 erweitert worden. Ferner werden in der am 12. September 1986 veröffentlichten internationalen Anmeldung WO 86/05096 als die Absorption von t-PA verbessernde Mittel niedere Alkylamine, niedere Dialkylamine und deren nicht-toxische Salze beschrieben.
Das US-Patent 4 656 034 (Sarnoff) beschreibt ein Medikament (und dessen intramuskuläre Injektion), welches ein selektiv auf Blutgerinnsel gerichtetes Koronarthrombolytikum wie insbesondere t-PA, ein die Absorption verbesserndes Mittel, insbesondere Hydroxylamin oder ein nicht-toxisches Salz davon, und ein Mittel enthält, welches einer Reperfusionsschädigung vorbeugt, insbesondere Superoxiddismutase.
Eine frühzeitig nach beginnender Ischämie durch intravenöse Verabreichung von Aktivatoren des fibrinolytischen Systems induzierte Thrombolyse führt zur Unterdrückung eines Herzinfarkts, verbessert die Leistung der Herzkammern und verlängert das Leben. Ihre Wirksamkeit hängt davon ab, wie schnell sie nach Beginn der Ischämie verwirklicht wird. Die sofortige intramuskuläre Verabreichung eines lebensrettenden Medikaments, manchmal unter Verwendung von Autoinjektionsapparaten, hat sich bei der Notfallbehandlung von schweren allergischen Reaktionen und potentiell lethalen Arrhythmien als nützlich erwiesen.
Es ist zuvor festgestellt worden, daß die intramuskuläre Verabreichung von Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator (t-PA) zur Koronarthrombolyse ebenfalls durchführbar ist, vgl. die oben genannten Patente und Patentanmeldungen von Sarnoff sowie Sobel et al., "Coronary thrombolysis with facilitated absorption of intramuscularly injected tissue-type plasminogen activator," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 82, Seite 4258 (1985), sowie Fox et al., J. Amer. College of Cardiology, Band 7, Nr. 2, Februar 1986, Seite 52A, wo Methylamin HCl als ein die Absorption von t-PA verbesserndes Mittel beschrieben ist, und Fields et al., Circulation Oct. 1985 III 69, wo eine verbesserte Absorption von Proteinen mit Hydroxylamin gezeigt ist.
Es wurde gefunden, daß die Absorption von t-PA in Kaninchen durch Verwendung von Hydroxylamin und seiner nicht-toxischen Salze, insbesondere Hydroxylaminhydrochlorid und vorzugsweise gekoppelt mit lokaler elektrischer Stimulierung an der Injektionsstelle gesteigert wurde. Unter diesen Bedingungen wurden innerhalb von 5 Minuten frühe Spitzenwerte im Blut erhalten. Bei den geforderten hohen Konzentrationen könnten Hydroxylamin und seine Salze jedoch zu Methämoglobinämie, niedrigem Blutdruck, Tachykardie oder lokaler Verletzung führen.
In der internationalen Anmeldung WO 86/05096 werden als die Absorption von t-PA verbessernde Mittel Alkyl- und Dialkylamine und ihre nicht-toxischen Salze, vorzugsweise Methylaminhydrochlorid offenbart. Jedoch haben sich diese die Absorption verbessernden Mittel als nicht so wirksam wie Hydroxylamin und seine Salze erwiesen.
Es ist nun gefunden worden, daß durch Verwendung einer Kombination von Hydroxylamin oder eines nicht-toxischen Salzes davon und Methylamin oder eines nicht-toxischen Salzes davon eine schnelle und anhaltende erlängerte Steigerung der Absorption von nicht-intravaskulär, z.B. intramuskulär verabreichtem t-PA erreicht werden kann, selbst ohne Anwendung der elektrischen Stimulierung.
Es ist ferner gefunden worden, daß durch Verwendung von Methylamin oder eines nicht-toxischen Salzes davon zusammen mit Hydroxylamin oder einem nicht-toxischen Salz davon die Menge an Hydroxylamin oder des nicht-toxischen Salzes davon zur Herbeiführung der verbesserten Absorption von t-PA reduziert werden kann und damit werden die Nebenwirkungen von Hydroxylamin vermindert oder eliminiert. Gleichzeitig wird die Absorption von t- PA in einem größeren Ausmaß gesteigert, als durch Verwendung des Methylamins oder seines Salzes erwartet werden konnte, d.h. die Wirkung ist nicht lediglich additiv.
Beispiele der nicht-toxischen Salze von Hydroxylamin und Methylamin sind die Salze der Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Propionsäure und Succinsäure. Vorzugsweise werden Hydroxylaminhydrochlorid und Methylaminhydrochlorid verwendet.
Hydroxylamin oder das nicht-toxische Salz davon und Methylamin oder das nicht-toxische Salz davon werden normalerweise als wäßrige Lösungen intramuskulär verabreicht. Sie können aus einem einzigen Röhrchen als Mischdosis oder aus separaten Röhrchen verabreicht werden, wobei sie im letzteren Falle vorzugsweise im wesentlichen gleichzeitig verabreicht werden. Außerdem können sie als Einzeldosis gemeinsam mit dem t-PA aus dem selben Röhrchen oder getrennt von dem t-PA verabreicht werden, vorzugsweise im wesentlichen gleichzeitig.
Vorzugsweise wird die Kombination der die Absorption verbessernden Mittel (d.h. Hydroxylamin oder ein Salz davon und Methylamin oder ein Salz davon) mit dem t-PA vermischt, um eine einzelne Mischdosis zu bilden, die anschließend intramuskulär (i.m.) injiziert wird, wie es beispielsweise im Patent 4 658 830 von Sarnoff beschrieben ist.
Das Hydroxylamin oder das Salz davon wird vorzugsweise in einer molaren Konzentration von 0,079 verabreicht und das Methylamin oder das Salz davon wird vorzugsweise in einer molaren Konzentration von 0,63 verabreicht. Das Hydroxylamin oder das Salz davon kann mit einer Dosierung von 0,02 molar bis 0,79 molar verabreicht werden, wird aber vorzugsweise in einer Dosierung verabreicht, bei der die Nebenwirkungen des Hydroxylamins auf ein Minimum gehalten werden, d.h. unter 0,5 molar. Das Methylamin oder das Salz davon kann beispielsweise in einer molaren Konzentration von 0,02 bis 6,3, normalerweise in einer molaren Konzentration von mindestens 0,15 verabreicht werden.
Anders ausgedrückt, wird das Hydroxylamin oder das nichttoxische Salz davon in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Absorption von dem nicht-intravaskulär (z.B. intramuskulär) eingeführten t-PA zu verbessern, und das Methylamin oder das nicht-toxische Salz davon wird in einer Menge verabreicht, die ausreicht, die zu einer derart verbesserten Absorption von t-PA benötigte Menge von Hydroxylamin oder des nicht-toxischen Salzes davon zu verringern.
Ferner führt, wie oben ausgeführt, die Kombination von Hydroxylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon und dem Methylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon zu einer Verlängerung der erhöhten Blutwerte von t-PA.
In der der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Studie wurden Hydroxylamin, Methylamin und andere Amine sowie Vasodilatoren und andere Mittel alleine und in Kombination mit niedrigen Konzentrationen von Hydroxylamin in 250 Kaninchen und 13 Hunden untersucht, um ihre Wirkungen auf die Verbesserung der Absorption von intramuskulär verabreichtem humanem t-PA, auf Hämodynamik und auf mögliche verwirrende Wirkungen der Verbesserungsmittel auf nachweisbares menschliches t-PA-Antigen zu bestimmen. Bei der Kombination von Mitteln, Methylaminhydrochlorid mit niedrigen und physiologisch gut tolerierbaren Konzentrationen von Hydroxylaminhydrochlorid, wurde gefunden, daß sie ein schnelles Absorbieren von t-PA mit fibrinolytischer und persistierender koronarthrombolytischen Aktivität innerhalb von 5 Minuten nach intramuskulärer Injektion verstärkte und mindestens 6 Stunden lang in Hunden aufrechterhalten werden konnte, ohne eine starke Myonekrose an der Injektionsstelle, Methämoglobinämie, Tachykardie oder niedrigen Blutdruck zu induzieren. Weitere 31 Kaninchen und 6 Hunde wurden untersucht, nachdem ihnen Injektionen von Medium mit oder ohne verbessernde Mittel aber ohne t- PA verabreicht worden waren. Nachdem die besten Bedingungen anhand von Versuchen bestimmt worden waren, bei denen der Skelettmuskel an der Injektionsstelle freigelegt worden war, wurden intramuskuläre Injektionen ohne lokales elektrisches Stimulieren perkutan verabreicht, und der direkten Verabreichung in den freigelegten Muskel mit einer lokalen elektrischen Stimulierung gegenübergestellt.
Die Ergebnisse zeigen, daß anhaltende therapeutische Blutwerte von t-PA direkt nach intramuskulärer Injektion ohne lokale elektrische Stimulierung und unter Bedingungen ohne schwerwiegende lokale oder systemische Nebenwirkungen erreicht werden können, und daß Injektionen in großen Labortieren zu anhaltenden koronarthrombolytischen Wirkungen führen, die 6 Stunden andauern.
Die Ergebnisse zeigen ferner, daß die Kombination von Hydroxylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon und Methylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon auch bei der Verabreichung an Menschen für eine Verbesserung der Absorption und eines verlängerten Effekts von t-PA geeignet sein würde.

Materialien.

t-PA in Konzentrationen von 0,5 bis 50 mg/ml, hergestellt durch rekombinante DNA-Technologie (rt-PA), wurde von Genentech, Inc., South San Francisco bereitgestellt (Chargen BH004DAX, H9017 und 4869-42). Eine intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung des Arzneimittelträgers allein zeigte keine Wirkung auf funktionell oder immunradiometrisch nachweisbares t- PA im Plasma von Kaninchen oder Hunden (n = 31 Kaninchen und 6 Hunde). Ein intramuskuläres Verabreichen von t-PA und Arzneimittelträger führte in beiden Spezien innerhalb der ersten 30 Minuten zu keiner tatsächlichen Anhebung der Werte von t-PA im Plasma. Einige potentielle Verbesserungsmittel der Absorption, die aufgrund ihrer bekannten Wechselwirkung mit Proteaseinhibitoren oder ihrer bekannten schnellen Absorption ausgewählt wurden, wurden alleine oder in Kombination in Konzentrationen von 0,015M bis 1,20M unter Einschluß von Diethanolamin, Diethylamin, Dimethylamin, Ethanolamin, Ethylamin, Histamin, Hydroxylamin, Methoxyamin und Methylamin untersucht. Adenosin und Hydralazin wurden aufgrund ihrer Potentiellen Wirkung als Vasodilatoren, die den lokalen Blutfluß und damit die Absorption von t-PA steigern, ebenfalls untersucht. Desgleichen wurden hypertonische physiologische Kochsalzlösung (0,63M) und hypertonische physiologische Kochsalzlösung mit Methylamin untersucht. Bei einigen Versuchen wurde Hyaluronidase (Sigma , Typ IVS, 1000 U/mg) in das Injektionsmedium aufgrund seines möglichen Nutzens zur Erleichterung der Diffusion und Absorption eingeschlossen (1 mg/ml). Keines der Mittel beeinflußte weder immunologisch nachweisbares t-PA noch die funktionelle Aktivität von t-PA, obwohl t-PA in Plasma oder Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,4 bei 37ºC 1 Stunde lang vor Injektion in vitro inhibiert wurde.

Versuchstiere.

Um die Wirkungen von Verbesserungsmitteln auf die Absorption von t-PA in kleinen Tierarten unter den vielfältigen, für die Bewertung geforderten Bedingungen zu charakterisieren, wurden zunächst Versuche mit 250 nüchternen, männlichen New Zealand White-Kaninchen durchgeführt, die zwischen 1,9 und 2,5 kg wogen. Kaninchen wurden größeren Tieren vorgezogen, da die zur Verfügung stehende Gesamtmenge an t-PA begrenzt war. Bei einigen Versuchen wurde direkt in den freigelegten Muskel mit oder ohne lokales elektrisches Stimulieren injiziert, wie zuvor in dem oben genannten Artikel von Sobel beschrieben. Andere Versuche (n = 21) wurden mit perkutanen Injektionen durchgeführt. Bei diesen Versuchen wurden größere Konzentrationen und Mengen an t-PA perkutan und ohne elektrisches Stimulieren injiziert. Für die Kurzzeitstudien mit Kaninchen wurden die Tiere mit 10 mg/kg Natriumpentothal und 50 mg/kg α-Chloralose anästhesiert und zur Überwachung des arteriellen Blutdrucks über die Karotisarterie und zum Sammeln von Blutproben über die Jugularvene instrumentiert. Bei den meisten Versuchen wurden die Haut und subkutanes Gewebe, die die Sartoriusmuskeln bilateral überlagern, aufgeschnitten, der Muskel wurde freigelegt, t-PA oder der Arzneimittelträger allein wurde direkt in den freigelegten Muskel injiziert, und Blutproben wurden laufend im Abstand von 30 Minuten über das in der Jugularvene befindliche Katheter gesammelt. Bei einigen Tieren wurde der Blutfluß im Skelettmuskel gesteigert durch elektrisches Stimulieren des Muskels an der Injektionsstelle 30 Minuten lang mit 2,0 msec und Impulsen mit 9 bis 14 Volt bei einer Freqeuenz von 5/sec wie zuvor beschrieben.
Bei 21 Kaninchen und bei jedem der nachfolgend untersuchten 13 Hunde erfolgten die Injektionen perkutan ohne Freilegung des Muskels und ohne elektrisches Stimulieren, so daß die definierten, die Absorption begünstigenden Faktoren unter Bedingungen untersucht werden konnten, die die klinisch anwendbaren simulieren. Für diese Versuche wurden die Konzentrationen von t-PA im Injektionsmedium innerhalb des Bereichs von 5 mg/ml (Kaninchen) und 10 mg/kg (Hunden) eingestellt mit jeweils zwei Injektionen von 1 bzw. 2 ml.
Für die Studien an Hunden wurden die ungefähr 20 kg schweren Tiere mit 12,5 mg/kg Thiopentothal plus 60 mg/kg α-Chloralose nach Analgesie mit 1 mg/kg subkutan verabreichtem Morphinsulfat narkotisiert, über einen Endotrachialtubus mittels eines Harvard-Respirators mit Raumluft ventiliert, und hämodynamisch überwacht. Injektionen von 2 ml Aliquots von t-PA oder Arzneimittelträger allein wurden manuell und perkutan intramuskulär in den Sartoriusmuskel mit einer Spritze durch eine 21er rostfreie Nadel verabreicht. Für die Studien zur Koronarthrombolyse wurde zunächst eine Koronarthrombose mit einer thrombogenen Kupferschlinge induziert und die durch t-PA bewirkte Koronarthrombolyse angiographisch dokumentiert.
Um die kurzfristigen histologischen Wirkungen von intramuskulär injiziertem Arzneimittelträger mit t-PA zu bestimmen, wurden die Injektionsstellen der Kaninchen und Hunde sofort nach Erhalt der letzten Blutprobe herausgeschnitten und mit denen des kontralateralen Sartoriusmuskels verglichen, in welchen Arzneimittelträger ohne t-PA zur gleichen Zeit und in gleichem Volumen injiziert worden war. Die Gewebe wurden unverzüglich in Natriumphosphat gepuffertem 10 %-igem Formalin fixiert und in konventioneller Weise zur lichtmikroskopischen Untersuchung vorbereitet.
Für morphologische Studien über längerfristige lokale Effekte von Injektionen bei Kaninchen wurden die Injektionsstellen an der Oberfläche des Muskelgewebes mit Lissamingrün markiert, Hauteinschnitte wurden verschlossen, und man erlaubte es den Tieren, sich nach der Narkose und der Verabreichung von Arzneimittelträger mit oder ohne Verbesserungsmittel, t-PA oder beidem zu erholen. Kontroll- und Testgewebeproben (d.h. 1 cm dicke Stücke mit einem ungefähr 4 cm² großen Querschnittsbereich, denen Arzneimittelträger allein injiziert wurde, und einem kontralateralen Bereich, welchem Arzneimittelträger allein injiziert wurde, und einem kontralateralen Muskel, welchem Arzneimittelträger plus Verbesserungsmittel mit oder ohne t-PA injiziert wurde) wurden 48 bis 96 Stunden nach intramuskulärer Injektion im Rahmen einer Nekropsie erhalten, fixiert und als aufeinanderfolgende 5 um Sektionen für die Mikroskopie vorbereitet.
Für Studien über die Wirkungen der Verbesserungsmittel auf die Permeation radioaktiv markierter Tracer wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten mit Gewichten zwischen 200 und 450 g eingesetzt.

Analyse der Plasmaproben.

Immunradiometrisch nachweisbares humanes t-PA-Antigen wurde gemessen in aufeinanderfolgenden Blutproben, die über einen in der Jugularvene befindlichen Katheter in Citrat-Vacutainer-Röhrchen bei 0º bis 4ºC mit einer Endkonzentration an Citrat von 10 mM gesammelt worden waren. Das Plasma wurde mittels Zentrifugation bei 4ºC für 10 Minuten bei 1600 g abgetrennt und bis zur Analyse bei -20ºC aufbewahrt. t-PA-Antigene in Kaninchen wurden mit einem zweiseitigen immunradiometrischen Assay (IRMA)-Verfahren wie zuvor beschrieben analysiert, nachdem t-PA an Anti-t- PA Immunglobulin G, welches an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte absorbiert war, gebunden hatte und nachdem anschließend das I-Anti-t-PA an gebundenes t-PA gebunden hatte. Nach Entfernung von überschüssigem I-Anti-t-PA wurde die Menge an gebundenem I-t-PA mittels Gamma-Scintillationsspektrometrie bestimmt. Als Referenzstandards verwendetes Anti-t-PA Antiserum und gereinigtes humanes Melamom t-PA wurde von Professor Desire Collen bereitgestellt. Zweckmäßigerweise wurde das humane t-PA- Antigen in Hunden mit einem käuflich erhältlichen Enzym gekoppelten Immunoassay (ELISA)-Verfahren (American Diagnostica), standardisiert mit dem IRMA-Verfahren, analysiert. Da endogenes t-PA von Kaninchen oder Hunden nicht mit humanem t-PA in der eingesetzten ELISA-Analyse kreuzreagiert, beeinflußte es nicht die Ergebnisse.
Die funktionale Aktivität von t-PA wurde mit Fibrinplatten unter Anwendung eines modifizierten Mikrotiter-amidolytischchromogenen Verfahrens analysiert. Die Bereiche der Fibrinolyse auf den Platten wurden planimetrisch gemessen. Platten, die mit humanem Fibrinogen (KabiVitrum), Thrombin (Sigma ) und CaCl&sub2; (0,05M) präpariert waren, wurden Verdünnungsreihen von Euglobulinfraktionsproben ausgesetzt, die durch Verdünnung von citriertem Plasma (1:20) mit destilliertem Wasser, Einstellung des pH auf 5,8 für Hunde und 6,2 für Kaninchen mit Essigsäure, Zentrifugation und Lösung von Präzipitaten in Imidazol gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) enthaltend 0,8 % BSA hergestellt worden waren. Sie wurden bei 37ºC 18 Stunden lang inkubiert. Quantitative Analysen der funktionallen Aktivität von t-PA im Plasma wurden unter Anwendung des modifizierten Mikrotiter-amidolytischen Verfahrens durchgeführt. Beide Vorgehensweisen wurden unter Berücksichtigung der internationalen Referenzpräparation für t-PA (IRP-t-PA) standardisiert.
Die Auswirkungen von intramuskulär verabreichtem t-PA auf die fibrinolytische Aktivität in vivo wurde bei Hunden über 6 Stunden aufgezeichnet durch sequentielle Analysen von Fibrinogen, Plasminogen und α-Antiplasmin im Plasma.

Bestimmung der Veränderungen der vaskulären Permeabilität.

Für die Studien über die Wirkungen der die Absorption verbessernden Mittel auf den Permeabilitätsindex der Mikrovaskulatur, die vollkommen unabhängig von t-PA war, wurde die vaskuläre Permeabilität mit intravaskulären radioaktiv markierten Tracersubstanzen charakterisiert. Zwei kleine Tierarten (Kaninchen und Ratten) wurden eingesetzt, um radioaktiv markiertes Material zu begrenzen. Das Ausmaß, in dem die die Absorption von t-PA verbessernden Mittel die vaskuläre Permeabilität an der Stelle der intramuskulären Injektion der Verbesserungsmittel beeinflußten, wurde durch Austritt von intravaskulären Tracern in den extrazellulären Bereich wiedergespiegelt. Cr-markierte Erythrocyten (Cr-RBV) und Co-markiertes EDTA wurden als Markierungsstoffe für die intravaskulären bzw. extrazellulären Bereiche verwendet. Die Permeabilität der Verbesserungsmittel an der intramuskulären Injektionsstelle gegenüber intravaskulärem I-markierten BSA (I- BSA) wurde bestimmt durch Messung des Isotopenverhältnisses zwischen Gewebe und Blut (TBIR) von I/Cr (TBIR I/Cr). In analoger Weise wurde das TBIR von Co/Cr (TBIR-Co/Cr) angewendet, um die potentiell für I-BSA in Gewebe erreichbare Größe des extravaskulären Bereichs abzuschätzen. Freies I wurde aus den Injektaten über Sephadex Gelfiltration ausgeschlossen und die Radioaktivität in den Plasma- und Gewebefraktionen und Homogenaten zeigte sich zu mehr als 99 % als Protein gebunden, wie durch Präzipitation mit 5 % Trichloressigsäure nachgewiesen wurde.
In den ersten Versuchen dieses Typs wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten mit Gewichten zwischen 250 und 400 g mit Natriumpentobarbitol (40 mg/kg) narkotisiert. Die linke Oberschenkelvene und rechte Halsschlagarterie wurden freigelegt und mit Kanülen versehen. 5 Minuten vor der intramuskulären Injektion von Arzneimittelträger mit oder ohne Verbesserungsmittel wurde Cr-RBCs (150 uCi in 0,6 bis 0,8 ml einer Puffersuspension mit einem Hämatokrit von 40 %) in die Oberschenkelvene injiziert. Einigen Ratten wurde kolloidaler Kohlenstoff (1 ml einer 2 %- igen Suspension) über die Oberschenkelvene zur mikroskopischen Lokalisierung von Veränderungen endothelialer Verbindungspunkte injiziert, die möglicherweise durch intramuskuläre Injektion des Arzneimittelträgers mit oder ohne Verbesserungsmittel entstanden waren. I-BSA (13 uCi) und Co-EDTA (10 uCi) (jeweils 30 bis 50 ul) wurden intravenös injiziert und sofort danach wurde 0,1 ml des Arzneimittelträgers mit oder ohne die Absorption verbessernde Mittel intramuskulär in die bilateral freigelegten Sartoriusmuskeln injiziert. Etwa 6 Minuten nach der intramuskulären Injektion wurden 2 ml Blut aus der Halsschlagarterienkanüle in eine mit Heparin behandelte Spritze abgezogen zur mengenmäßigen Bestimmung der Blutwerte hinsichtlich der drei radioaktiv markierten Tracersubstanzen. Eine Minute später wurde das Herz entfernt, um den Kreislauf zu stoppen, und beide Injektionsstellen wurden herausgeschnitten. Die Radioaktivität des Blutes und des Skelettmuskels wurde mittels eines Dreikanal- Gamma-Scintillationsspektrometers mit automatischer Korrektur des Hintergrundes und des Spillovers quantifiziert. Die herausgeschnittenen Injektionsstellen von Tieren, denen kolloidaler Kohlenstoff gegeben worden war, wurden in 10 % gepuffertem Formalin fixiert. Nach Quantifizierung der Radioaktivität mittels Gamma-Scintillationsspektrometrie wurde das Gewebe zur lichtmikroskopischen Untersuchung aufbereitet, um endotheliale Verbindungsstellen zu identifizieren, die durch Ablagerung von Kohlenstoffpartikel in Gefäßwänden dargestellt werden.
Zusätzliche Versuche wurden mit männlichen New Zealand White-Kaninchen durchgeführt, die mit 150 mg/kg α-Chloralose narkotisiert und in gleicher Weise instrumentiert worden waren. Cr- RBCs (600 uCi in 4 ml einer gepufferten Suspension mit einem Hämatokrit von 40 %) und I-BSA (39 uCi) wurden über den Katheter in der Jugularvene 15 bis 20 Minuten vor dem intramuskulären Injizieren von t-PA Arzneimittelträger injiziert. Nachfolgend wurden 0,1 ml des t-PA Arzneimittelträgers intramuskulär in einen freigelegten Sartoriusmuskel und 0,1 ml des Arzneimittelträgers mit Absorptionsverbesserungsmittel in den kontralateralen Muskel injiziert. Fluorescein, 0,01 %, wurde in das Injektionsmedium eingeschlossen, um das spätere Identifizieren der Injektionsstelle zu vereinfachen. Zu ausgewählten Abständen nach intramuskulärer Injektion wurde eine Blutprobe aus der Halsschlagarterie abgezogen, das Herz wurde durch Bolus-Injektion von gesättigtem Kaliumchlorid ausgesetzt, beide Injektionsstellen wurden sofort unter Verwendung von ultraviolettem Licht markiert und herausgeschnitten, und die Radioaktivität im Blut und Gewebe wurde mittels Gamma-Scintillationsspektrometrie quantifiziert.
Die physiologischen Wirkungen der intramuskulär injizierten Verbesserungsmittel der Absorption von t-PA.
Die Wirkungen der auf Verbesserung der Absorption untersuchten Mittel auf die Herzfrequenz, den Arteriendruck und die Atmungsfrequenz wurden in Kaninchen untersucht. Reihenbestimmungen von arteriellen Blutgasen und pH-Werten wie von Hämoglobin und Methämoglobin wurden durchgeführt. Die zum Maximieren der Absorption in den Injektionsvolumina, die zum Lösen großer Mengen von t-PA benötigt wurden, erforderlich hohen Konzentrationen von Hydroxylamin führten zu massiver Methämoglobinämie, Hypoxämie, vorübergehender Tachykardie und zu niedrigem Blutdruck. Jedoch haben sich auf der Grundlage der Beobachtungen an Kaninchen, die einer lokalen elektrischen Stimulierung unterworfen wurden, 0,63M Methylaminhydrochlorid allein und 0,63M Methylaminhydrochlorid plus 0,079M Hydroxylaminhydrochlorid als besonders erfolgversprechende Mittel zur Verbesserung der Absorption von t- PA erwiesen.
Die in den nachfolgend durchgeführten längerfristigen Versuchen angewendeten Bedingungen wurden auf der Grundlage von Informationen ausgewählt, die aus Untersuchungen unterschiedlicher Gruppen von Kaninchen stammen, die zuerst durchgeführt wurden, um die Wirkungen der Absorption von t-PA auf das Volumen des Injektionsmediums per se (0,06 bis 4,0 ml, n = 13), auf den pH-Wert, die gesamte t-PA Dosis und die Konzentration eines gegebenen Verbesserungsmittels der Absorption mit konstant gehaltenem Injektionsvolumen (vier 1 ml Injektionen pro Kaninchen) und elektrischer Stimulierung (n = 27), und auf die Stimulierung mittels eines elektrischen Feldes an der Injektionsstelle (n = 22) zu definieren. Ausgehend von den Ergebnissen dieser kurzfristigen Versuche und von histologischen Befunden wurde Methylaminhydrochlorid (0,63M) allein oder in Kombination mit niedrigen Konzentrationen von Hydroxylaminhydrochlorid (0,079M) zur weiteren Bewertung in gesunden Kaninchen und Hunden ausgewählt, um die intramuskuläre Absorption von perkutan injiziertem t-PA zu verbessern.

Statistische Analyse.

Die Gruppendaten sind als Mittelwerte ± SE (Standardabweichung) aufgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels Varianzanalyse bestimmt.
Intramuskuläres Injizieren von t-PA, Arzneimittelträger allein, oder Arzneimittelträger ergänzt mit irgendeinem der die Absorption verbessernden Stoffe ohne exogenes humanes t-PA führte in keinem der 31 Kaninchen und 6 Hunden innerhalb eines 30 bis 60 minütigen Beobachtungszeitraums zu immunradiometrisch nachweisbarem t-PA im Plasma. Eine Erhöhung der funktionellen Aktivität von t-PA im Plasma wurde trotz simulierter Operation, elektrischer Stimulierung an der Injektionsstelle oder Verabreichung von die Absorption verbessernden Mitteln in Abwesenheit von der Verabreichung von exogenem t-PA nachgewiesen.
Absorption von intramukulär injiziertem t-PA mit Medium, dem mögliche die Absorption verbessernde Mittel zugesetzt sind: Kurzfristige Wirkungen von Hydroxylamin und einigen möglichen die Absorption verbessernden Mitteln, ausgewählt aus organischen Aminen mit einer Konzentration von 0,36M im Injektionsmedium und von Hydrazalin (0,88 mM), Adenosin (7 mM) oder Hyaluronidase (1000 U/ml) in Konzentrationen, die gewählt wurden, um hämodynamische Störungen zu vermeiden, wurden in 120 Kaninchen untersucht. In Abwesenheit eines die Absorption verbessernden Mittels kam es 5 Minuten nach Injektion zur höchsten Konzentration von t-PA im Plasma und war schwer nachweisbar (8 ± 2 [SD] ng/ml, n = 3). Niedrige Werte wurden ebenfalls mit Ethylamin (16 ng/ml Maximum, n = 3) und Hyaluronidase (38 ng/ml, n = 2) beobachtet. Hydralazin oder Adenosin führten unabhängig voneinander zu einer Anhebung der t-PA Werte, jedoch lediglich in unbedeutender Weise = 3). Histamin (0,65 mg/kg) war unwirksam und führte zur Anhebung der t-PA Werte auf lediglich 18 ng/ml (n = 5). Unter den verbleibenden untersuchten Mitteln führten lediglich Diethylamin (88 ng/ml, n = 3), Methylamin (224 ± 32 ng/ml, n = 16) und Hydroxylamin (371 ± 44 ng/ml, n = 9) zu einer nachgewiesenen Steigerung der Absorption von t-PA. Methylamin 0,63 plus 0,315M Hydroxylamin steigerten die t-PA Werte im Plasma 5 Minuten nach Injektion maximal auf einen durchschnittlichen Wert von 562 ± 130 ng/ml (n = 9). Bei jedem dieser Versuche wurden vier separate Injektionsstellen aufgrund der geringen Masse der Kaninchenmuskel verwendet. Die Gesamtmenge an t-PA in dem injizierten Gesamtvolumen von 4 ml wurde analytisch als gleichbleibend (2,5 = 2,26 mg/kg Körpergewicht) bestimmt. Physiologische Kochsalzlösung in derselben Konzentration wie die von Hydroxylamin oder Methylamin (0,63M) verstärkte die Absorption von t- PA zu weniger als 30 %, verglichen mit der durch beide Amine induzierten (n = 6). Die Zugabe von 0,63M NaCl zu 0,63M Methylamin im Injektionsmedium führte zu keiner Steigerung der Absorption von t-PA über die durch Methylamin allein induzierte hinaus. Mit Hydroxylamin als einzigem die Absorption verbessernden Mittel und bei konstant gehaltener Menge an injiziertem t-PA (2,4 mg/kg) stellte sich der Spitzenwert an t-PA im Plasma innerhalb von 5 Minuten nach Injektion ein und erhöhte sich als Funktion des Gesamtvolumens der Injektion von 0,06 ml auf 1 ml und 4 ml (in 1 ml-Aliquots in vier Stellen) von 41 ± 12 auf 119 ± 33 bzw. 356 ± 48 ng/ml (n = 13). Bei konstant gehaltenem Volumen des 0,63M Methylamin enthaltenden Injektionsmediums (vier Injektionen a 1 ml in jedes Kaninchen) erhöhten sich die Spitzenwerte von t-PA im Plasma gleichbleibend mit Dosen, die von 2 bis 13 mg/kg reichten, von einem Durchschnittswert von 180 auf 936 ng/ml innerhalb von 5 Minuten bei jeder Dosis (Durchschnittswerte der Ergebnisse aus Doppelversuchen bei jeder Dosis, n = 26). Weitere Versuche (n = 22) zeigten, daß die durch Hydralazin hervorgerufenen Wirkungen mit denen der elektrischen Stimulierung vergleichbar waren, daß die beiden nicht additiv sind, und daß jeder erhöhte Spitzenwert von t-PA im Vergleich mit dem mit 0,63M Methylamin als einzigem Verbesserungsmittel erzielten sich im Durchschnitt zu 96 % entsprachen.
Mit Ausnahme von Hydralazin und Adenosin, die zu einem geringen Abfall des Arteriendrucks und zu ansteigender Herzfrequenz (beide weniger als 10 %) führten, war Hydroxylamin das Mittel, welches die beständigsten Wirkungen auf Arteriendruck oder Herzfrequenz ausübte, die über einen Zeitraum von 30 Minuten nach Injektion aufgezeichnet wurden (Tabelle 1). Tabelle 1 Hämodynamische Effekte von Methylamin und Hydroxylamin bei Kaninchen und Hunden Kontroll-Prozente zu ausgewählten Zeitabständen nach Injektion Grundwerte Injektionsmedium Kaninchen keins (Kontrolle) 0,63M Methylamin 0,63M Hydroxylamin Hunde ¹p < .05 im Vergleich mit Grundwerten.
Die Grundwerte sind Durchschnittswerte der Herzfrequenz (HR) und des durchschnittlichen arteriellen Blutdrucks (MAP). Die Ergebnisse nach Injektion sind als Prozentangaben der Kontrollwerte angegeben, um die Unterschiede von Tier zu Tier bezüglich der Grundwerte zu normalisieren. Die Injektionen von jeweils 1 ml in jede der vier freigelegten Stellen wurden durchgeführt, gefolgt durch lokale elektrische Stimulation. Hämodynamische Veränderungen wurden bei Kaninchen aufgrund des im Vergleich von Kaninchen zu Hunden höheren Verhältnisses des Injektionsvolumens und damit des Gehaltes an Methylamin, Hydroxylamin oder beiden in bezug auf das Körpergewicht stärker beobachtet. Eine Stunde nach Injektion überstieg Methämoglobin 11 % in Hunden, denen 0,63M Hydroxylamin gegeben worden war, aber war in Hunden nicht nachweisbar oder zu weniger als 0,6 %, denen 0,63M Methylamin allein oder 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin gegeben worden war. Es betrug 48 % in Kaninchen, denen Hydroxylamin (aber in Abwesenheit von Methylamin) gegeben worden war aufgrund der größeren Menge verabreichten Amins pro Körpergewicht.
Methoxyamin führte zu Methämoglobinämie, Hypoxämie und niedrigem Blutdruck. Hydroxylamin führte zu einem anfänglichen Abfall des mittleren Arteriendrucks von 10 bis 15 mm Hg mit einem 30 %-igen Anstieg der Herzfrequenz unmittelbar nach Injektion. Diese hämodynamischen Wirkungen erreichten ihren Höhepunkt nach 2 Minuten und nahmen nach etwa 5 Minuten ab. Anschließend sank der mittlere arterielle Druck deutlich im Zusammenhang mit profunder Hypoxämie (schwere Cyanose) und Methämoglobinämie mit einem Durchschnitt von 48 %. Keines der Tiere, denen physiologische Kochsalzlösung, Arzneimittelträger, t-PA und Arzneimittelträger, oder t-PA und Arzneimittelträger unter Zusatz von Methylamin (0,63M) oder unter Zusatz von 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin, die Kombination, welche als die zur Steigerung der Absorption am meisten erfolgsversprechende ausgewählt worden ist, und keine schädigenden hämodynamischen Effekte zeigt, injiziert worden war, zeigte signifikante hämodynamische Veränderungen oder Hypoxämie. Hydroxylamin, Methylamin und sämtliche anderen Mittel führten nicht zu einer immunradiometrisch nachweisbaren Veränderung von t-PA in Plasmaproben, denen humanes t- PA zugesetzt worden war und die 1 Stunde bei 37ºC inkubiert worden waren, unabhängig davon, ob sie sofort analysiert oder bei 0º bis 4ºC für eine Zeitdauer von 1 Monat gelagert worden waren.

Histopathologische Effekte von Injektionen mit elektrischer Stimulierung.

Bei Kaninchen.

Injektionen von t-PA in Arzneimittelträger allein (n = 4) führten zu lediglich geringfügigen Skelettmuskeltraumata, die histologisch nachweisbar waren und durch lokalisierte interstitielle Hämorrhagie und mikrofokale Myonekrose bestätigt wurden, wobei die Muster denen von mechanischen Traumata per se (d.h. das Einführen der Nadel und Injektion eines inerten Trägers in den Muskel) entsprachen. Diese Abweichungen waren nicht von denen unterscheidbar, die mit Injektionen des Arzneimittelträgers allein oder mit isotonischer Kochsalzlösung beobachtet wurden (n = 6).
Hydroxylamin (0,63M in 1,0 ml, injiziert in eine Stelle) führte zu einer wesentlichen Muskelnekrose (n = 27 Tiere), die 48 Stunden nach Injektion sichtbar wurde. Eine Injektion dieses Mittels führte zu einzelnen Bereichen von Skelettmuskelnekrose, umgeben von schmalen Säumen interstitieller Hämorrhagie. Das Ausmaß der Nekrose war proportional zum Injektionsvolumen aber nicht von der Anwesenheit oder Abwesenheit von t-PA beeinflußt. Selbst die stärkste beobachtete Verletzung beschränkte sich auf die unmittelbare Nachbarschaft der Injektionsstelle. Demgegenüber führte 0,63M Methylamin zu einer bemerkenswert geringeren lokalen Verletzung bei Injektionsvolumina im Bereich von 0,06 bis 10 ml/Stelle (n = 23). In den meisten Fällen war die 48 Stunden nach Injektion aufgetretene Verletzung nicht größer als die nach Injektion mit t-PA Arzneimittelträger allein beobachtete. Bei einigen Stellen, in die ein Volumen von 1 ml von 0,63M Methylamin injiziert worden war, wurden geringfügige Myonekrosen und interstitielle Hämorrhagien in direkter Nähe zur Nadeleinstichstelle beobachtet.

Bei Hunden.

Eine Injektion von 0,63M Methylamin (n = 8) oder Methylamin plus einer niedrigen Konzentration von Hydroxylamin (0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin) (n = 8) führte bei Hunden zu lediglich bescheidenen morphologischen Veränderungen einschließlich interstitieller Ödeme, Hämorrhagie und akuter Entzündung. Fokale Myonekrose war minimal oder nicht vorhanden. Das jeweilige Ausmaß von interstitiellem Ödem, Hämorrhagie und Entzündung wurde mit dem jeweiligen Injektionsvolumen in Beziehung gesetzt. In allen Fällen waren derartige Abnormitäten auf die unmittelbare Nachbarschaft zur Injektionsstelle beschränkt. Das Ausmaß der morphologischen Abnormität und Myonekrose war bei den Stellen nicht größer, in die Methylamin oder die Kombination von Methylamin und einer niedrigen Konzentration an Hydroxylamin injiziert worden war, als in Skelettmuskeln, in die der Arzneimittelträger allein injiziert worden war. Die histologischen Effekte nach perkutanen Injektionen ohne elektrisches Stimulieren entsprachen denen, die bei Injektionen mit jedem der die Absorption verbessernden Mittel, gefolgt von elektrischem Stimulieren beobachtet worden waren.

Ergebnisse der perkutanen intramuskulären Injektionen.

Zusammengefaßt zeigten die Ergebnisse der zuerst untersuchten 229 Kaninchen, daß 0,63M Methylamin oder 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin die Absorption von t-PA nach direkter Injektion in den freigelegten Muskel, gefolgt durch lokales elektrisches Stimulieren an der Injektionsstelle erleichterte, ohne schwerwiegende lokale Effekte oder physiologische Veränderungen herbeizuführen. Demgemäß wurden zusätzliche Untersuchungen bei 21 Kaninchen durchgeführt, die eine perkutane Injektion ohne Freilegung des Muskels und ohne elektrisches Stimulieren erhalten hatten. Die Menge an t-PA im Injektionsmedium wurde erhöht, um eine Gesamtdosis von 4 mg/kg zu erhalten. Zwei Injektionen von jeweils 1 ml wurden jedem Tier verabreicht. Spitzenwerte von t-PA im Plasma tauchten innerhalb von 5 Minuten auf und lagen im Durchschnitt bei 134 ± 21 mit 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin (n = 8), eine Kombination von die Absorption verbessernden Mitteln, die sich als die wirksamste erwies. Physiologische Kochsalzlösung (0,63M) oder der Arzneimittelträger allein führten zu keiner wesentlichen Anhebung innerhalb des 30 minütigen Beobachtungszeitraums nach Injektion. Diese Ergebnisse bestätigten, daß man sofort nach intramuskulärer Injektion therapeutische Blutwerte von t-PA erreichen kann, ohne elektrisch zu stimulieren oder den Muskel durch Hauteinschnitte freizulegen. Sie zeigten, daß Spitzenwerte im Blut innerhalb von 5 Minuten nach Injektion mit den spezifischen erfindungsgemäßen, die Absorption verbessernden Mitteln, die die vaskuläre Permeabilität steigern, erreicht werden konnten.

Die Absorption von intramuskulär injiziertem t-PA und seine funktionellen Konsequenzen bei Hunden.

Eine wirksame Koronarthrombolyse mit t-PA erfordert frühes und anhaltendes Anheben der t-PA Werte im Plasma. Um nachzuweisen, daß beides erreicht werden kann und um den funktionellen Einfluß von intramuskulärem t-PA auf das fibrinolytische System und auf Koronarthromben nachzuweisen, wurden zusätzliche Versuche mit Hunden durchgeführt.
Die ersten Ergebnisse zeigten, daß intramuskuläres Verabreichen von großen Mengen t-PA (10 mg/kg) in zwei simultanen Injektionen von jeweils 2 ml in Gegenwart von die Absorption verbessernden Mitteln nicht zu einer Anhebung der t-PA Werte im Plasma kurz nach Injektion führte. Somit lagen die durchschnittlichen Werte 15 Minuten nach Injektion trotz der großen Menge verabreichten t-PAs bei lediglich 44 ng/ml (n = 2). 90 Minuten oder mehr nach den Injektionen wurden jedoch in jedem der beiden Hunde (n = 10 Messungen pro Hund) anhaltende Steigerungen der Werte beobachtet, die im Durchschnitt bei 339 ± 42 und 622 ± 86 (SD) ng/ml lagen. Diese waren über den gesamten Untersuchungszeitraum von 6 Stunden gleichbleibend. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus den untersuchten 250 Kaninchen und diesen beiden Hunden erschien es uns wahrscheinlich, daß die Reaktion von intramuskulär gegebenem t-PA zweiphasisch verläuft. Eine frühzeitige Absorption schien von der Gegenwart des die Absorption verbessernden Mittels abhängig zu sein. Spätere Steigerungen im Plasma schienen darauf hinzuweisen, daß der langsame Eintritt von t-PA in die Zirkulation relativ von der Gegenwart oder Abwesenheit eines Verbesserungsmittels abhängt. Dieses wurde anhand von Versuchen mit Hunden bestätigt, denen 10 mg/kg t-PA intramuskulär mit Arzneimittelträger allein, 0,63M Methylamin, oder 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin verabreicht wurde. Steigerungen von t-PA innerhalb von 20 Minuten waren ohne Verbesserungsmittel geringfügig und erreichten lediglich Durchschnittswerte von 32 ng/ml (n = 3), bescheidene Ergebnisse mit 0,63m Methylamin, im Durchschnitt 126 ng/ml (n = 3), und hervorhebenswerte Werte mit einem Durchschnitt von 297 ng/ml (n = 3) mit 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin. Intramuskuläres Injizieren von t-PA mit 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin führte sowohl zu einem Verbesserungsmittel-abhängigern Spitzenwert als auch zu anhaltenden Steigerungen, die über die gesamte Beobachtungszeit von 6 Stunden anhielten, wohingegen mit dem Arzneimittelträger allein lediglich die späten Steigerungen offensichtlich waren. Die Steigerungen von t-PA-Antigen im Plasma wurden begleitet durch eine Anhebung der funktionellen Aktivität und entsprachen im wesentlichen dem gemessenen Verhältnis von funktioneller zur antigenen Aktivität des injizierten t-PAs. Somit lag das Verhältnis der funktionellen Aktivität gegenüber t-PA-Antigen im Plasma nach intramuskulärer Injektion von t-PA mit Methylamin und Hydroxylamin im Durchschnitt bei 0,31 ± 0,02 (SD) IU/ng (n = 44 Proben, erhalten über 6 Stunden nach Injektion von 3 Hunden). Die Größenordnung und das Fortbestehen der Steigerungen von t-PA im Plasma stimmen überein mit der Bioverfügbarkeit von ungefähr 50 % von injiziertem t-PA in dem untersuchten Zeitraum von 6 Stunden. Zirkulierendes Fibrinogen fiel nicht in nachweisbarer Weise ab, obgleich α&sub2;-Antiplasmin zu 70 % über 6 Stunden abfiel, was die fortdauernde Steigerung der funktionellen Aktivität von t-PA wiederspiegelt.
Während die Werte des t-PA im Blut der Hunde ohne Verbesserungsmittel nach 15 Minuten bei lediglich 44 ng/ml lagen und es 2 Stunden und 40 Minuten dauerte, um 240 ng/ml zu erreichen, lag der t-PA Spiegel im untersuchten Hund bei Verwendung des Verbesserungsmittels (0,079M) Hydroxylaminhydrochlorid zusammen mit 0,63M Methylaminhydrochlorid nach 5 Minuten bei etwa 200 ng/ml und erreichte innerhalb von 15 Minuten etwa 300 ng/ml.
Wirkungen auf Koronarthrombolyse. Wie in dem Abschnitt Material und Methoden angedeutet, wurden Koronarthromben bei Hunden mittels perkutan eingeführten, in der Koronararterie befindlichen Kupferschlaufen induziert. Die Schlaufen sind besonders thrombogen und induzieren folglich innerhalb 2 ± 1 (SD) Minuten eine fortdauernde Koronarthrombose (n = 17 Kontrollhunde, denen kein t-PA gegeben wurde). Eine vollständige Behandlung mit Heparin führte zu keiner Rekanalisierung der verschlossenen Koronararterie.
Um zu bestimmen, ob 10 mg/kg intramuskulär verabreichtes t- PA mit 0,63M Methylamin plus 0,079M Hydroxylamin zu schnell eintretenden koronarthrombolytischen Wirkungen mit einer über längere Zeiträume andauernden biologischen Aktivität führten, wurden 2 Hunde untersucht, bei denen Koronarthrombosen mit Kupferschlaufen induziert worden waren. Verstopfende Gerinnsel wurden angiographisch bestätigt und Thrombolyse wurde herbeigeführt durch zwei gleichzeitige perkutan-intramuskuläre Injektionen von jeweils 2 ml t-PA (10 mg/kg Gesamtdosis) in 0,63M Methylaminhydrochlorid plus 0,079M Hydroxylaminhydrochlorid 7 bis 10 Minuten nach dokumentierter Thrombose. Bei beiden Hunden trat eine Auflösung des Gerinnsels innerhalb von 60 Minuten trotz fortdauernder Anwesenheit der intrakoronar thrombogenen Kupferschlaufen ein. Ferner waren die koronarthrombolytischen Effekte über einen Beobachtungszeitraum von 6 Stunden nach einer einzelnen intramuskulären Verabreichung von t-PA offensichtlich, obgleich kein Heparin verabreicht worden war, was bestätigt wurde durch wiederholtes Rekanalisieren nach der durch die thrombogene Kupferschlaufe induzierten erwarteten episodischen Reokklusion. Diese Ergebnisse zeigen, daß (1) wesentliche Steigerungen der t-PA Werte im Plasma innerhalb von Minuten nach intramuskulärer Injektion erreicht werden können, wenn die Absorption verbessernde Mittel eingesetzt wurden, und daß (2) thrombolytische Wirkungen für mindestens 6 Stunden nach Injektion fortdauern.

Zusammenfassend ist festgestellt worden:

(1) Intramuskulär verabreichtes t-PA wird in Abwesenheit von die Absorption verbessernden Mitteln langsam absorbiert, wobei die Plasmawerte im wesentlichen lediglich langsam ansteigen aber für etwa 6 Stunden fortdauern.
(2) Der Einschluß von Hydroxylamin oder eines Salzes davon in das Injektionsmedium führt zu einer sofortigen Absorption von t-PA mit einer bemerkenswerten Anhebung der t-PA Werte im Plasma, die innerhalb von 5 Minuten nach Injektion eintritt.
(3) Konzentrationen von Hydroxylamin, die zur frühzeitigen und optimalen Steigerung der Absorption benötigt werden, führen zu lokaler Verletzung, Methämoglobinämie und hämodynamischen Veränderungen insbesondere bei Kaninchen im Vergleich mit Hunden aufgrund der größeren Menge verabreichten Mittels pro Kilogramm Körpergewicht.
(4) Eine rasche Absorption von t-PA wird durch Methylamin oder einem Salz davon erleichtert, wobei dieses Mittel sind, die nicht zu schwerwiegenden lokalen Effekten oder systemischen Veränderungen führen, wie sie mit hohen Konzentrationen von Hydroxylamin beobachtet werden.
(5) Die Kombination von Methylamin oder einem Salz davon mit einer geringen Konzentration an Hydroxylamin oder einem Salz davon verbessert die anfängliche Absorption über die mit Methylamin oder einem Salz davon allein erreichte hinaus, ohne zu schwerwiegenden lokalen oder systemischen Effekten zu führen.
(6) Eine wesentliche anfängliche Absorption von t-PA wird mittels perkutan-intramuskulären Injektionen in gesunde Kaninchen und Hunde ohne lokales elektrisches Stimulieren ausgelöst.
(7) Nach intramuskulärer Injektion mit den bestimmten Verbesserungsmitteln absorbiertes t-PA ist in Hunden über einen Beobachtungszeitraum von 6 Stunden funktionell aktiv, wie sich aus funktionellen Analysen der Aktivität von t-PA im Plasma, Verbrauch von α&sub2;-Antiplasmin in vivo und sequentiellen Koronarangiogrammen, welche die wiederholte Auflösung von Gerinnseln demonstrieren, ergibt, selbst wenn eine thrombogene intrakoronäre Kupferschlaufe an seiner Stelle verbleibt und kein Heparin verabreicht wird.
Bei sämtlichen in dieser Anmeldung beschriebenen experimentellen Arbeiten wurden sowohl das Hydroxylamin als auch das Methylamin als deren Hydrochloridsalze eingesetzt.
Die Zusammensetzungen können die genannten Materialien umfassen, aus diesen im wesentlichen bestehen oder bestehen.

Beispiel 1

In der nachfolgenden Tabelle 2 bestand das eingesetzte Verfahren darin, den Kaninchen im wesentlichen gleichzeitig Lösungen aus 2 Röhrchen intramuskulär zu injizieren, wobei jedes Röhrchen 1 ml Lösung enthielt. Jedes Röhrchen enthielt 2 mg/kg Körpergewicht t-PA (d.h. jedes Kaninchen erhielt eine Gesamtdosis von 4 mg/kg Körpergewicht) und jedes, den Kaninchen 1, 2 und 3 verabreichtes Röhrchen enthielt 0,63M Methylaminhydrochlorid und 0,079M Hydroxylaminhydrochlorid. Die Lösungen waren mit Argininphosphat auf pH 7,2 gepuffert.
In der Tabelle ist MA die Abkürzung für Methylaminhydrochlorid und HA die Abkürzung für Hydroxylaminhydrochlorid.
Die Abkürzung ELISA steht für Enzym-gekoppeltes Immunoassay und bezeichnet das eingesetzte Verfahren zur Analyse des im Blut zur angegebenen Zeit in Minuten verbleibenden t-PAs, wobei die Menge an t-PA in Nanogramm pro Milliliter angegeben ist. Tabelle 2 Inhalt der Lösung Kaninchen ml injiziert ELISA-Ergebnisse ng/ml t-PA Zeit (Minuten)
Während die Erfindung in erster Linie die Verbesserung der Absorption von intramuskulär injiziertem t-PA betrifft, wird sie ebenfalls als geeignet betrachtet, die Absorption von anderen Gerinnsel-selektiven Protein-thrombolytischen Mitteln zu steigern, wie in den oben genannten Patenten und Anmeldungen von Sarnoff angegeben.

Beispiel 2

Bei der Tabelle 3 bestand das eingesetzte Verfahren darin, jedem Hund im wesentlichen gleichzeitig eine t-PA und Verbesserungsmittel enthaltende Lösung intramuskulär zu injizieren. Jeder Hund erhielt ein gesamtes Injektionsvolumen von 4 ml enthaltend 10 mg/kg t-PA Körpergewicht. Die Lösung wurde an zwei getrennten Stellen verabreicht (d.h. 2 ml pro Stelle). Die eingesetzte Kombination von Verbesserungsmitteln war entweder 0,63M Methylaminhydrochlorid oder 0,63M Methylaminhydrochlorid und 0,079M Hydroxylaminhydrochlorid. Die Lösungen waren mit Argininphosphat auf pH 7,2 gepuffert.
In der Tabelle ist MA die Abkürzung für Methylaminhydrochlorid und HA die Abkürzung für Hydroxylaminhydrochlorid.
Die Abkürzung ELISA steht für Enzym-gekoppeltes Immunoassay und bezeichnet das eingesetzte Verfahren zur Analyse des im Blut zur angegebenen Zeit in Minuten verbleibenden t-PAs, wobei die Menge an t-PA in Nanogramm pro Milliliter angegeben ist. Tabelle 3 Inhalt der Lösung Hund ml injiziert mg/ml t-PA analysiert ELISA-Ergebnisse (ng/ml t-PA) Zeit (Minuten)
Der Begriff t-PA oder Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator, wie er in den Ansprüchen verwendet wird, wird in seinem funktionalen Sinne verwendet und schließt nicht nur natürliches t-PA sondern auch Modifikationen und Derivate von t-PA ein, die Plasminogen zu Plasmin hauptsächlich am Gerinnsel und nicht im systemischen Kreislauf umwandeln. Die eingeschlossenen Modifikationen und Derivate können ferner eine länger andauernde Aktivität aufweisen und/oder weniger Verbesserungsmittel der Absorption erforderlich machen und/oder selektiver auf Gerinnsel gerichtet sein und/oder schneller wirksam sein als natürliches t-PA.

Claims

1. Packung, die (1) t-PA, (2) Methylamin oder ein nicht-toxisches Salz davon und (3) Hydroxylamin oder ein nicht-toxisches Salz davon enthält, wobei die Menge an Hydroxylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon ausreicht, um die Absorption von dem t-PA in das Blut zu steigern, wenn es einem Säugetier nicht-intravaskulär verabreicht wird, und wobei die Menge an Methylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon ausreicht, um die Menge an Hydroxylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon, die erforderlich ist, um eine gesteigerte Absorption von t-PA zu erhalten, zu reduzieren.

2. Packung nach Anspruch 1, in der ein nicht-toxisches Salz von Methylamin und ein nicht-toxisches Salz von Hydroxylamin eingesetzt sind.

3. Packung nach den Ansprüchen 1 oder 2, in der Methylaminhydrochlorid und Hydroxylaminhydrochlorid eingesetzt sind.

4. Packung, die eine wäßrige Lösung mit einer Konzentration von 0,02 bis 0,79 Mol pro Liter an Hydroxylamin oder einem nicht-toxischen Salz davon und eine wäßrige Lösung mit einer Konzentration von 0,02 bis 6,3 Mol pro Liter an Methylamin oder einem nicht-toxischen Salz davon enthält.

5. Packung nach Anspruch 4, in der das Hydroxylamin oder Salz davon und das Methylamin oder Salz davon zusammen in einer einzigen Lösung vorliegen.

6. Packung nach Anspruch 4, in der sich die Lösung von Hydroxylamin oder dem Salz davon in der Packung in einem ersten Behältnis befindet und sich die Lösung von Methylamin oder dem Salz davon in der Packung in einem zweiten Behältnis befindet.

7. Packung nach Anspruch 4, in der eine wäßrige Lösung eines Hydroxylaminsalzes und eine wäßrige Lösung eines Methylaminsalzes eingesetzt sind.

8. Packung nach Anspruch 7, in der Hydroxylaminhydrochlorid und Methylaminhydrochlorid vorliegen.

9. Packung nach den Ansprüchen 4 oder 8 einschließlich t-PA.

10. Verwendung einer Kombination von (1) Methylamin oder einem nicht-toxischen Salz davon und (2) Hydroxylamin oder einem nicht-toxischen Salz davon, wobei das Hydroxylamin oder das nicht-toxische Salz davon in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Absorption eines Gerinnsel-selektiven Protein-thrombolytischen Mittels zu steigern, und wobei das Methylamin oder das nicht-toxische Salz davon in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Menge an Hydroxylamin oder dem nicht-toxischen Salz davon, welche erforderlich ist, um eine gesteigerte Absorption des Protein-thrombolytischen Mittels zu erhalten, zu reduzieren, zur Herstellung eines Medikaments zur intramuskulären Verabreichung eines Gerinnsel-selektiven Protein-thrombolytischen Mittels an ein daran bedürftiges Säugetier und zur Steigerung der Absorption des Gerinnsel-selektiven Protein-thrombolytischen Mittels in das Blut.

11. Verwendung nach Anspruch 10, bei der ein nicht-toxisches Salz von Methylamin und ein nicht-toxisches Salz von Hydroxylamin vorhanden ist.

12. Verwendung nach Anspruch 10, bei der Methylaminhydrochlorid und Hydroxylaminhydrochlorid vorhanden sind.