DE3832713A1

DE3832713A1 - Colony stimulating factor (= csf)

Info

Publication number: DE3832713A1
Application number: DE3832713A
Authority: DE
Inventors: Heinrich Dr Aschauer; Hans Dr Loibner; Dieter Dr Scholz; Gunther Dr Seidl; Erich Ing Wasserbauer
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1988-09-27
Filing date: 1988-09-27
Publication date: 1990-03-29

Description

Colony stimulating factor (=CSF)

Das rekombinate Herstellungsverfahren für GM-CSF produziert dieses Protein als Gemisch dreier unterschiedlicher Substanzen, die sich in der N-terminalen Sequenz unterscheiden. Die Hauptsubstanz, die dem natürlichen GM-CSF entspricht, ist bekannt und besitzt die dem humanen GM-CSF identische Sequenz:

Die Erfindung betrifft die beiden anderen Komponenten, die jeweils um eine Aminosäure kürzer bzw. länger sind:

Diese beiden GM-CSF′s mit unterschiedlichen N-terminalen Aminosäuren können aus dem E. coli Fermentationsgemisch isoliert werden.

Zur Fermentation verfährt man beispielsweise folgendermaßen: In einem 70-l-Fermenter mit 35 l Arbeitsvolumen wird der E. coli Keim angezüchtet.

Vorkultur 1: Im Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl) wird bei 121°C 20 Minuten autoklaviert, dann wird eine sterile 1%ige Tetracyclinlösung bis zu einer Endkonzentration von 12,5 mg/l zugesetzt, mit 50 µl der tiefgekühlten Kultur beimpft und bei 37°C und 200 UpM 8 Stunden inkubiert.

Vorkultur 2: 6 g/l Na₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH₄Cl werden bei 121°C 20 Minuten autoklaviert. Dann werden 1 ml/l 1 M MgSO₄, 1 ml/l 0,1 M CaCl₂, 1 ml/l 0,1% Vitamin B1-Lösung, 1,25 ml/l 1% Tetracyclinlösung und 10 ml/l 0,25% Tryptophanlösung zugesetzt, durch ein 0,2-µ-Filter filtriert und schließlich noch 2 g/l 50% Glucose beigefügt. 250 ml Medium in 1000-ml-Erlenmeyerkolben werden mit 10 ml der ersten Vorstufe beimpft. Die Inkubation erfolgt bei 37°C und 200 UpM für 15 Stunden.

Hauptstufe: Man verwendet das gleiche Medium wie in Vorstufe 2, das jedoch mit 17,95 M NH₄OH auf pH 7,0 gestellt wird. 50% Glucose wird bis zu einer Endkonzentration von 4 g/l zugesetzt. Die Inkubation erfolgt bei 37°C und 1000 UpM bis zu einem Endpunkt von OD₅₇₀=10.

Die Isolierung der beiden neuen Komponenten, nämlich der um Alanin verkürzten bzw. der um Methionin verlängerten Komponente, kann unter Verwendung von Hydroxylapatit als stationäre Phase mittels einer analytischen HPLC-Methode durchgeführt werden, die eine Basislinientrennung aller drei Komponenten erlaubt.

Das Trennungsverfahren wird mit einem sehr flachen Gradienten durchgeführt. Die genauen Trennungsbedingungen sind folgende:
Eluierungsmittel A: 10 mM Natriumphosphat (pH 7,3)
Eluierungsmittel B: 300 mM Natriumphosphat (pH 7,0)
Gradient: 0% B für 10 Minuten; 0 bis 5% B in 10 Minuten
Flußgeschwindigkeit: 0,8 ml/Minute
Säule: Pentax SH-0710M, 7,5 × 100 mm; Vorsäule: 7,5 × 10 mm
Säulenfüllung: Pentax Hydroxylapatit, 10 µm
Nachweis: 220 nm

Die zu trennenden Proben wurden mit einer Lösung von 18 mM Natriumphosphat und 2 mM Zitronensäure (pH 7,2) verdünnt. Die Ergebnisse der Auftrennung sind in Abb. 1 wiedergegeben.

Als weitere Trennungsmethode kann ein HPLC-Verfahren auf eine RP-Säule mit folgenden Bedingungen eingesetzt werden:
Eluierungsmittel A: 20 mM Ammoniumcitrat (pH 8,6)
Eluierungsmittel B: Acetontril
Gradient: 40-55% B in 30 Minuten
Flußgeschwindigkeit: 1 ml/Minute
Säule: C4 (Vydac) 4,6 × 150 mm; Sättigungssäule aus Silicagel für Eluierungsmittel A
Nachweis: 280 nm.

Die zu untersuchenden Proben werden direkt auf die Säule aufgebracht. Die Zusammensetzung der einzelnen Pools wird durch Gasphasensequenzanalyse ermittelt und ist in Abb. 2 angegeben. Als Eluierungsmittel A kann beispielsweise auch Ammoniumacetat-, Ammoniumphosphat-, Ammoniumtrifluoracetat- oder Ammoniumcarbonat-Puffer (pH 8,0 bis 8,6) verwendet werden.

Die auf diese Weise erhaltenen neuen GM-CSF-Komponenten wurden im CML-Test und im Rezeptorbindungstest auf ihre biologische Aktivität in vitro sowie in vivo im Cynomolgusaffen untersucht. Aus den CML-Tests ergaben sich für die zwei neuen Komponenten folgende Ergebnisse (im Vergleich zum natürlichen humanen GM-CSF):
Pro-Komponente: 1,3 × 10⁸ U/mg
Met-Komponente: 3,6 bis 4,7 × 10⁸ U/mg
humanes GM-CSF: 1,1 bis 1,6 × 10⁸ U/mg

Im Rezeptorbindungstest verhalten sich alle drei Komponenten identisch. Die in vivo Untersuchung wurde an zwei Cynomolgusaffen mit allen drei Komponenten parallel in einer Dosierung von 3 × 10⁶ U/kg/Tag, verteilt auf 1 × 10⁶ U Dosen durchgeführt. Alle drei Komponenten zeigten sich aktiv, Nebenreaktionen sind keine aufgetreten. Aus diesen Versuchen ergibt sich, daß die biologische Aktivität der drei Komponenten identisch ist.

Claims

1. Colony stimulating factor (=CSF) mit einer dem bekannten humanen GM-CSF identischer AS-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz um eine Aminosäure kürzer ist:

2. Colony stimulating factor (=CSF) mit einer bekannten humanen GM-CSF identischer AS-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz um eine Aminosäure länger ist:

3. Verfahren zur Isolierung von GM-CSF wie in Anspruch 1 definiert, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Verwendung von Hydroxylapatit als stationäre Phase mittels einer analytischen HPLC-Methode das Fermentationsgemisch chromatographisch auftrennt.

4. Verfahren zur Isolierung von GM-CSF wie in Anspruch 2 definiert, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Verwendung von Hydroxylapatit als stationäre Phase mittels einer analytischen HPLC-Methode das Fermentationsgemisch chromatographisch auftrennt.