DE3831557A1

DE3831557A1 - Kolonne fuer die fluessigchromatografie

Info

Publication number: DE3831557A1
Application number: DE19883831557
Authority: DE
Inventors: Katsumi Kawamura
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1987-09-17
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1989-04-06
Anticipated expiration: 2008-09-17
Also published as: DE3831557C2; SE8803287D0; SE8803287L

Description

Die Erfindung betrifft eine Kolonne für die Flüssigchromatografie, die mit Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung gepackt ist.

Verbindungen auf Basis von Calciumphosphat, insbesondere Hydroxyapatit, weisen eine ausgezeichnete Biokompatibilität auf und werden in zunehmendem Masse als Implantationsmaterialien, einschliesslich künstliche Zähne und Knochen, verwendet. Um die hohe Biokompatibilität von Calciumphosphat-Verbindungen in stärkerem Masse auszunutzen, hat man versucht, sie auch als Packungen für die Flüssigchromatografie zum Trennen von Proteinen, Enzymen und dergleichen einzusetzen.

Teilchen aus aus Calciumphosphat basierenden Verbindungen, die als Packungen bei der Flüssigchromatografie Verwendung finden, kann man herstellen, indem man eine Aufschlämmung aus Calciumphosphat nach einer Nassmethode herstellt, die Aufschlämmung unter Ausbildung von Teilchen sprühtrocknet, und die Teilchen dann bei einer bestimmten Temperatur brennt. Je niedriger die Brenntemperatur ist, umso grösser ist die Fähigkeit der Teilchen, Proteine und andere gelöste Stoffe zu adsorbieren, und umso niedriger ist auch die Festigkeit der Teilchen. Wenn man andererseits die Brenntemperatur erhöht, dann nimmt die Adsorptionskapazität ab, aber die Festigkeit der Teilchen zu.

Ein Hauptproblem bei Kolonnen für die Flüssigchromatografie, die mit Verbindungen auf Basis von Calciumphosphat gepackt sind, besteht darin, dass dann, wenn man sie wiederholt einsetzt und die Fliessrate der zugeführten Lösung steigert, ein grosses Hohlraumvolumen am Einlassteil der Säulen gebildet wird, während der Lösungsmittelstrom eingeführt wird, und dadurch wird die Wirkung der Kolonne gestört. Es gibt zwei mögliche Gründe für dieses Phänomen, nämlich (1) eine Auflösung von Calciumionen in dem Lösungsmittel und (2) einen mechanischen Impakt, der durch die Zufuhr der zugeführten Lösung erfolgt. Aus diesen Gründen weist eine Kolonne, die mit Teilchen aus auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen, die bei niedrigen Temperaturen gebrannt worden sind, gepackt ist, trotz der hohen Kapazität Proteine und andere gelöste Stoffe zu adsorbieren, eine nur geringe Dauerhaftigkeit auf. Wenn man andererseits eine Kolonne aus Teilchen aus auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen, die bei einer hohen Temperatur gebrannt sind, packt, dann wird zwar die Dauerhaftigkeit vergrössert, aber die Adsorptionskapazität vermindert.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Kolonne für die Flüssigchromatografie zur Verfügung zu stellen, die mit teilchenförmigen, auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen gepackt ist und die sowohl eine hohe Dauerhaftigkeit als auch eine gute Adsorptionsfähigkeit für gelöste Stoffe, wie Proteine, aufweist.

Weitere Ziele und Wirkungen der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.

Es wurden Versuche durchgeführt, um die vorgenannte Aufgabe zu lösen und dabei wurde festgestellt, dass die Wirkung des Lösungsmittels, die Packung aufzulösen und der mechanische Impakt des Lösungsmittels am meisten an der Stelle eintreten, an welcher das Lösungsmittel in die Säule eingeführt wird. Gründliche Untersuchungen haben dann ergeben, dass die Dauerhaftigkeit der Säule merklich verbessert werden kann, ohne dass man die Adsorptionskapazität opfert, indem man sie mit dauerhaften Teilchen in dem Teil packt, in welchem das Lösungsmittel eingeführt wird, während man Teilchen mit einer hohen Adsorptionskapazität in den restlichen Teilen der Säule einbringt. Darauf beruht die vorliegende Erfindung.

Die Erfindung betrifft somit eine Säule für die Flüssigchromatografie, die mit Teilchen aus auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen gepackt ist, und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die in dem Teil der Kolonne gepackt sind, in welchem das Lösungsmittel eingeführt wird, eine höhere Dauerhaftigkeit haben als Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die im restlichen Teil der Kolonne gepackt sind.

Fig. 1 ist ein Querschnitt einer Kolonne für Flüssigchromatografie gemäss einer Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 2 ist eine grafische Darstellung und zeigt die Beziehung zwischen der Fliessrate und den Druckprofilen, wenn man destilliertes Wasser durch die Flüssigchromatografiesäule, aufgebaut gemäss Beispielen 1 und 2 und Vergleichsversuch 1, leitet;

Fig. 3 ist ein Chromatogramm, erhalten gemäss Beispiel 3; und

Fig. 4 ist ein Chromatogramm, erhalten gemäss Vergleichsversuch 2.

Bei der erfindungsgemässen Kolonne dienen Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die bei einer hohen Temperatur gebrannt sind und die in dem Teil gepackt sind, in welchem das Lösungsmittel eingeführt wird, als ein Puffer nicht nur gegen die Auflösungswirkung, sondern auch hinsichtlich des mechanischen Impaktes des Lösungsmittels, und erhöhen dadurch die Dauerhaftigkeit der Packung in der Säule. Andererseits wird die Kapazität der Säule, gelöste Stoffe, wie Proteine, zu adsorbieren, auf einem hohen Niveau beibehalten, weil der Teil in der Säule, bei dem das Lösungsmittel nicht eingespritzt wird, mit solchen Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung gefüllt ist, die bei einer niedrigen Temperatur gebrannt wurden.

Beispiele für auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen sind Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat und Fluorapatit. Davon wird Hydroxyapatit vorzugsweise als Hauptkomponente verwendet, weil er eine besonders hohe Kapazität zum Ad sorbieren von Proteinen und anderen gelösten Stoffen hat. Die auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen können in bekannter Weise durch Nass- und Trockenverfahren synthetisiert werden.

Ein Nassverfahren wird beispielsweise beschrieben von Wallaeys, R., Ann. Chim. (Paris), Bd. 7, 808 und 823 (1952); Moreno, E.C., Gregory, T.M., Brown, W.E., J. Res. Nat. Bur. Stand., Bd. 72A, 773 (1968); und L.C. Bell, H. Mika, B.J. Kruger, Archs. Oral. Biol., Bd. 23, 329 bis 336 (1978). Das Trockenverfahren wird beispielsweise beschrieben von Quinaux, N., Arch. Intern. Physiol. Biochim., Bd. 72, 337 (1964) und Chem. Abstr., Bd. 60, 15418a (1964); und Liteanu, C., Macarouci, D., Studii Cercetari Chim., Bd. 13, 157 (1962).

Die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung können durch Sprühtrocknen einer Aufschlämmung aus Calciumphosphat-Verbindungen und anschliessendem Brennen der erhaltenen Körner hergestellt werden. Diese ist selbstverständlich nicht die einzigste Granuliermethode, die man anwenden kann. Das heisst mit anderen Worten, dass man auch andere Methoden zur Herstellung der Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung verwenden kann. Vorzugsweise wird die Teilchengrösse der auf Calciumphosphat basierenden Verbindung in einem bestimmten Bereich eingestellt, z.B. durch Sieben. Obwohl es eine nur grobe Klassifizierung ist, kann man sagen, dass Teilchen mit einer Teilchengrösse von 10 bis 50 µm für die Trennung und Teilchen mit einer Teilchengrösse von 1 bis 10 µm für die Analyse verwendet werden.

Bei der vorliegenden Erfindung ist es wesentlich, dass man wenigstens zwei Arten von Teilchen von Calciumphosphat-Verbindungen, die bei unterschiedlichen Temperaturen gebrannt wurden, verwendet, d.h., dass man an der Lösungsmittel-Einlassstelle der Kolonne Teilchen packt, die bei der höheren Temperatur gebrannt sind, und dem restlichen Teil der Kolonne Teilchen packt, die bei einer niedrigeren Temperatur gebrannt sind.

Vorzugsweise wird die Lösungsmittel-Einlasseite der Kolonne mit Teilchen gepackt, die bei etwa 850°C oder höher, und vorzugsweise 900 bis 1200°C gebrannt sind und der restliche Teil der Kolonne wird mit Teilchen gepackt, die lediglich getrocknet wurden oder die bei etwa 800°C oder weniger und vorzugsweise 700°C oder weniger gebrannt wurden. Die Festigkeit der Teilchen und deren Fähigkeit, gelöste Stoffe, wie Proteine, zu adsorbieren, verändert sich erheblich mit den Brenntemperaturen in der Nachbarschaft von 800 bis 850°C und man kann die Wirkung der vorliegenden Erfindung besonders gut erzielen, indem man zwei Arten von Teilchen kombiniert, die in den vorerwähnten Temperaturbereichen gebrannt worden sind.

Die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die in der Kolonne gepackt sind, können in der gesamten Kolonne aus dem gleichen Material bestehen oder sie können auch aus unterschiedlichen Materialien zusammengesetzt sein. Beispielsweise kann die Packung vollständig aus Hydroxyapatit, der bei zwei unterschiedlichen Temperaturen gebrannt wurde, bestehen. Alternativ kann die Stelle in der Kolonne, in welcher das Lösungsmittel eingeführt wird, mit Fluorapatit-Teilchen, die bei einer höheren Temperatur gebrannt wurden, gepackt sein, während der restliche Teil der Kolonne mit Hydroxyapatit- Teilchen, die bei einer niedrigeren Temperatur gebrannt wurden, gepackt ist. Fluorapatit ist gegenüber Auflösung äusserst beständig und daher kann man die Dauerhaftigkeit der Kolonne noch weiter dadurch verbessern, dass man Fluorapatit-Teilchen in den Teil packt, in welchen das Lösungsmittel eingeführt wird.

Die bei einer höheren Temperatur gebrannten Teilchen werden vorzugsweise in den Teil der Kolonne eingebracht, der sich von dem Ende der Lösungsmittel-Eingabestelle bis nicht mehr als zur Hälfte und vorzugsweise nicht mehr als ein Zehntel der Kolonnenlänge erstreckt. Selbst wenn eine grössere Fläche der Kolonne mit diesen Teilchen gepackt ist, wird keine wesentliche Verbesserung der Dauerhaftigkeit der Kolonne erzielt, im Gegenteil, die Adsorptionskapazität der Kolonne nimmt dann erheblich ab.

Die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen, die zum Packen der erfindungsgemässen Kolonne verwendet werden, können je nach der speziellen Anwendung der Kolonne verschiedene Grössen haben. Teilchen mit einer Teilchengrösse von 1 bis 5 µm neigen dazu, den Rückdruck beim Fliessen eines Lösungsmittels zu erhöhen und werden bei der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Auch die Form der Teilchen ist praktisch unbegrenzt und kann kugelförmig, amorph sein oder irgendeine andere Form haben. Die Teilchen können auch porös sein.

Fig. 1 zeigt schematisch eine Flüssigchromatografie-Kolonne gemäss einer Ausführungsform der Erfindung. Eine zylindrische Kolonne (11) ist am unteren Ende mit einem Filter (12) ausgerüstet. Das Ende des Filters (12) ist mit einer Abdeckung (13) verschlossen, welche mit einer Lösungsmittel-Abführleitung (14) ausgerüstet ist. Der untere Teil der Kolonne (11) ist über die Länge (b) mit Teilchen (15) aus einer aus auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die bei einer niedrigen Temperatur gebrannt wurden, gepackt, und der obere Teil der Kolonne ist über die Länge (a) mit Teilchen (16) aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die bei einer höheren Temperatur gebrannt ist, gepackt. Das obere Ende der Kolonne (11) ist mit einem Filter (19) versehen und das äussere Ende des Filters ist mit einer Abdeckung (17) verschlossen, die mit einer Lösungsmittel-Zuführleitung (18) verbunden ist.

Wird eine Lösung einer zu analysierenden Probe in die Kolonne durch die Lösungsmittel-Einführleitung (18) eingebracht, dann werden die Komponenten in der Probe spezifisch auf den Teilchen (16, 15) adsorbiert, und fliessen durch die Kolonne in unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Deshalb kann man die Probe in die jeweiligen Komponenten auftrennen, indem man hintereinander den Abfluss aus der Lösungsmittel-Abflussleitung (14) gewinnt. In der in Fig. 1 gezeigten Kolonne sind die bei einer höheren Temperatur gebrannten Teilchen in dem Teil der Kolonne gepackt, der sich nach unten von der Lösungsmittel-Einführstelle über die Länge (a) erstreckt. Infolgedessen ergeben diese festen Teilchen (16) eine Pufferwirkung gegenüber einer Auflösungswirkung und den mechanischen Impakt des eingegebenen Lösungsmittels. Dadurch wird die Gesamtdauerhaftigkeit der Kolonne erhöht, obwohl die Teilchen (15), die bei einer niedrigeren Temperatur gebrannt sind, in dem abströmigen Teil der Kolonne über eine Länge (b) gepackt sind. Da diese Teilchen (15) eine ausreichende Adsorptionskapazität aufweisen, hat die Kolonne gute Trenncharakteristika.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

BEISPIEL 1

Eine Aufschlämmung aus Hydroxyapatit wird in bekannter Weise durch ein Nassverfahren hergestellt. Die Aufschlämmung wird bei 120°C unter Ausbildung eines Pulvers aus Teilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengrösse von 10 µm sprühgetrocknet. Dieses Pulver wird als Pulver (A) bezeichnet. Ein Teil des Pulvers wurde bei 1200°C gebrannt und wird als Pulver (B) bezeichnet.

Eine Kolonne aus rostfreiem Stahl (7,5 mm Durchmesser und 100 mm Länge) wurde mit dem Pulver (A) nach einer Nassmethode so gepackt, dass der untere Teil der Kolonne über eine Länge von 7 cm gefüllt war. Anschliessend wurde der Kopfraum über der Lösungsmittel-Eingabestelle der Kolonne mit dem Pulver (B) nach einer Nassmethode gepackt, so dass diese Fläche über eine Länge von 3 cm bedeckt war.

Die so aufgebaute Kolonne für die Flüssigchromatografie wurde mit destilliertem Wasser beschickt und die Beziehung zwischen der Fliessrate und dem Druckprofil der Kolonne wurde bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt.

BEISPIEL 2

In bekannter Weise wurde eine Aufschlämmung aus Fluorapatit hergestellt. Diese Aufschlämmung wurde ver arbeitet und bei 1200°C wie bei der Herstellung des Pulvers (B) in Beispiel 1 gebrannt. Das erhaltene Pulver wurde als Pulver (C) bezeichnet. Eine Kolonne aus rostfreiem Stahl mit den gleichen Dimensionen wie in Beispiel 1, wurde mit dem Pulver (A) gemäss Beispiel 1 so gepackt, dass der untere Teil der Kolonne über eine Länge von 9 cm geführt war. Anschliessend wurde der Kopfraum auf der Lösungsmittel-Eingabeseite der Kolonne mit dem Pulver (C) gefüllt, so dass die Fläche über eine Länge von 1 cm bedeckt war.

In die so aufgebaute Kolonne für die Flüssigchromatografie wurde destilliertes Wasser an der Lösungsmittel-Eingabeseite eingebracht und die Beziehung zwischen der Fliessrate und dem Druckprofil in dieser Kolonne wurde bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt.

VERGLEICHSVERSUCH 1

Ein gemäss Beispiel 1 hergestelltes Pulver (A) wurde über den gesamten Teil einer Kolonne aus rostfreiem Stahl mit den gleichen Dimensionen wie in Beispiel 1 gefüllt. In diese Kolonne für die Flüssigchromatografie wurde destilliertes Wasser von der Lösungsmittel-Eingabeseite eingegeben und die Beziehung zwischen der Fliessrate und dem Druckprofil in dieser Kolonne wurde bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt.

Wenn die Packung in der Kolonne ihre eigene Form beibehält, nimmt der Druck in der Kolonne im Verhältnis zur Fliessrate der zugeführten Lösung zu. Deshalb stellt der lineare Anteil in jeder der drei in Fig. 2 gezeigten Kurven das geringe Auftreten einer Destruktion oder Auflösung der Packung dar. Andererseits zeigen die Teile, in denen der Druck exponentiell ansteigt, dass die Wirksamkeit der Kolonne verschlechtert wird aufgrund einer zu starken Destruktion oder Auflösung der Packung.

Die Kurven, welche die Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 zeigen, haben einen linearen Teil, der sich bis zu einem Punkt erstreckt, bei welchem die Fliessrate ziemlich hoch ist. Andererseits neigt sich die Kurve, welche die Ergebnisse im Vergleichsversuch 1 zeigen, zu einer Region, wo der Druck bei einer viel geringeren Fliessrate exponentiell ansteigt.

Wie vorstehend beschrieben wird, ist die erfindungsgemässe Flüssigchromatografie-Kolonne im Lösungsmittel-Eingabeteil mit Teilchen einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die bei einer hohen Temperatur gebrannt wurde, gefüllt, und der restliche Teil der Kolonne ist mit Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die bei einer niedrigen Temperatur gebrannt wurde, gefüllt. Wegen dieser Kombination von wenigstens zwei unterschiedlichen Arten von Teilchen einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung weist die Packung in der Kolonne eine verbesserte Dauerhaftigkeit gegen die Auflösewirkung und den mechanischen Impakt des Lösungsmittels auf und behält trotzdem eine ausreichende Kapazität zum Adsorbieren von gelösten Stoffen, wie Proteinen, bei.

BEISPIEL 3

Eine Aufschlämmung aus Hydroxyapatit wurde nach einem bekannten Nassverfahren hergestellt. Die Aufschlämmung wurde bei 120°C sprühgetrocknet, wobei man ein Pulver aus Teilchen mit einer Teilchengrösse von 10 µm erhielt. Das Pulver wurde bei 800°C wärmebehandelt, und als (C) bezeichnet. Ein Teil des Pulvers (C) wurde bei 950°C wärmebehandelt und bildete das Pulver (D).

Eine Kolonne aus rostfreiem Stahl (7,5 mm Durchmesser und 100 mm Länge) wurde mit Pulver (C) nach einem Nassverfahren zum Bedecken des unteren Teils der Kolonne über eine Länge von 7,5 cm gepackt. Anschliessend wurde der Kopfraum an der Lösungsmittel-Eingabeseite der Kolonne mit dem Pulver (D) nach einer Nassmethode bis zur Bedeckung einer Fläche über eine Länge von 0,5 cm gepackt. Das Chromatogramm der so hergestellten Kolonne, erhalten unter den nachfolgenden Bedingungen, wird in Fig. 3 gezeigt.

VERGLEICHSVERSUCH 2

Das in Beispiel 3 erhaltene Pulver (C) wurde in die gleiche Kolonne, wie sie in Beispiel 3 verwendet wurde, über die gesamte Länge der Kolonne eingefüllt und das Chromatogramm wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 erstellt, das dabei erhaltene Chromatogramm wird in Fig. 4 gezeigt.

Claims

1. Kolonne für die Flüssigchromatografie, die mit Teilchen aus auf Calciumphosphat basierenden Verbindungen gepackt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung in dem Teil der Kolonne, in dem ein Lösungsmittel eingeführt wird, eine höhere Festigkeit haben als die Teilchen einer Calciumphosphat-Verbindung, welche im restlichen Teil der Kolonne gepackt sind.

2. Kolonne für die Flüssigchromatografie gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die in dem Teil der Kolonne gepackt sind, in welchem ein Lösungsmittel eingeführt wird, Teilchen sind, die bei einer höheren Temperatur wärmebehandelt worden sind als die Teilchen einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die im restlichen Teil der Kolonne gepackt sind.

3. Kolonne für die Flüssigchromatografie gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, die in dem Teil der Kolonne gepackt sind, in welchen ein Lösungsmittel eingeführt wird, Teilchen sind, die bei einer Temperatur von 800°C oder mehr gebrannt worden sind.

4. Kolonne für die Flüssigchromatografie gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung aus Hydroxyapatit bestehen.

5. Kolonne für die Flüssigchromatografie gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, welche in dem Teil der Kolonne gepackt sind, in welchem eine Flüssigkeit eingeführt wird, Fluorapatit umfassen, und die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die im restlichen Teil der Kolonne gepackt sind, aus Hydroxyapatit sind.

6. Kolonne für die Flüssigchromatografie gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus einer auf Calciumphosphat basierenden Verbindung, die bei einer hohen Temperatur gebrannt wurden, in dem Teil der Kolonne, der sich vom Ende der Lösungsmitteleinführstelle bis nicht mehr als die Hälfte der Kolonne erstreckt, gepackt sind.