Der Erfindung zugrundeliegender allgemeiner Stand der Technik
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Diese Erfindung betrifft Sandwich-Immunoassays, die eine
Immunreaktion verwenden zur Messung einer extrem kleinen
Menge eines im Blut oder in anderen organischen Proben
enthaltenen Bestandteils, und insbesondere ein verbessertes
Kit zur Verwendung in solchen Sandwich-Immunoassays, um die
Genauigkeit der Messung des Bestandteils zu erhöhen.
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Immunoassays werden weit verbreitet verwendet, um eine extrem
kleine Menge eines im Blut oder in anderen organischen Proben
enthaltenen Bestandteils unter Verwendung der Immunreaktion
oder der Antigen-Antikörper-Reaktion zu messen. Solche
Immunoassays sind im allgemeinen in zwei Arten unterteilt;
das "kompetitive Immunoassay" und das "nichtkompetitive
Immunoassay". Das kompetitive Immunoassay verwendet eine
vorbestimmte Menge eines markierten Antigens, das sich an
eine vorbestimmte Menge Antikörper in Kompetition mit dem
zu bestimmenden Antigen bindet. Die Menge des zu
bestimmenden Antigens wird aus der Menge des markierten Antigens
bestimmt, das sich an den Antikörper bindet, oder aus der
Menge des markierten Antigens, das sich nicht an den
Antikörper bindet. Beim kompetitiven Immunoassay muß das
markierte Antigen jedoch eine hohe Konzentration haben für
seine Reaktion mit dem Antikörper. Außerdem weist das
kompetitive Immunoassay eine schlechte Meßempfindlichkeit auf,
die so gering wie etwa ein Zwanzigstel der Menge des
markierten Antigens ist.
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Das nicht-kompetitive Immunoassay wird durch ein Sandwich-
Immunoassay repräsentiert, das eine feste Phase verwendet,
die auf ihrer Oberfläche mit einer überschüssigen Menge
eines unlöslich gemachten Antikörpers bedeckt ist, um das zu bestimmende
Antigen einzufangen. Die feste Phase wird gewaschen und dann
mit einer überschüssigen Menge des markierten Antikörpers
inkubiert, so daß der markierte Antikörper mit dem
eingefangenen zu bestimmenden Antigen reagieren kann. Der
überschüssige markierte Antikörper wird von der festen Phase
weggewaschen. Die Menge des zu bestimmenden Antigens wird aus
der Menge der Markierung bestimmt, die auf dem markierten
Antikörper vorhanden ist, der sich an das Antigen bindet.
Obwohl das Sandwich-Immunoassay eine hohe
Meßempfindlichkeit ergeben kann, besteht eine Neigung zur
nicht-spezifischen Bindung des markierten Antikörpers an die feste
Phase, was eine beträchtliche Erniedrigung der
Empfindlichkeit und des meßbaren Bereichs des Sandwich-Immunoassays
zur Folge hat.
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Ein Sandwich-Immunoassay unter Verwendung von Festphasen und
markierten Antikörpern, die von Meerschweinchen stammen,
wird in J. Immunol. Methods 83/2, 1985, 327-336 offenbart.
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Die EP-A-0125893 beschreibt ein Verfahren für die
quantitative Antigenanalyse durch ein Enzym-Antikörper-Brücken-
Verfahren. In einer Stufe des mehrstufigen Verfahrens wird
ein zweiter Antikörper in einer Lösung, die normales
Tierserum enthalten kann, entweder zu einem unlöslichen Träger
gegeben, der an einem ersten Antikörper und an ein Antigen
gebunden ist, oder gleichzeitig mit dem Antigen zu dem
unlöslichen Träger gegeben, der an den ersten Antikörper
gebunden ist.
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Die US-A-4414324 betrifft ein Immunoassayverfahren zur
Bestimmung von Proben, bei dem eine der Komponenten einer
Antigen-Antikörper-Reaktion auf den Wänden eines Gefäßes
unlöslich gemacht wird, die andere Komponente markiert
wird und die zu bestimmende Probe zusammen mit der
markierten Komponente in das Gefäß gegeben wird. Die
markierte Komponente bindet sich in kompetitiver Weise mit
der Probe an die unlöslich gemachte Komponente. Um die
nicht-spezifischen Wechselwirkungen auf ein Minimum zu
bringen, wird ein Bindungsstellen-deaktivierendes Medium,
z. B. ein von einem Tier stammendes Serum, kovalent an den
Gefäßwänden gebunden und dann wird die unlöslich gemachte
Komponente kovalent an das Medium gebunden.
Zusammenfassung der Erfindung
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Hauptsächliche Aufgabe der Erfindung ist es, ein
verbessertes Kit zur Verwendung in einem Sandwich-Immunoassay zu
schaffen, um den Grad der nicht-spezifischen Bindung des
markierten Antikörpers an der festen Phase zu einem
beträchtlichen Maß zu verringern.
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Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein
verbessertes Kit zur Verwendung in einem Sandwich-Immunoassay
zu schaffen, um die Empfindlichkeit und den empfindlichen
Bereich des Sandwich-Immunoassays zu erhöhen.
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Ferner ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein
verbessertes Kit zur Verwendung in einem Sandwich-Immunoassay
zu schaffen, um den Grad der Abweichung des
Sandwich-Immunoassays zu verringern.
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Erfindungsgemäß wird ein Kit zur Verwendung in einem
Sandwich-Immunoassay geschaffen, das markierte und
Festphasen-Antikörper verwendet, die mit einem Antigen in
Gegenwart einer Reaktionslösung reaktiv sind, um das Antigen
zwischen dem markierten Antikörper und dem
Festphasen-Antikörper zu binden, wobei das Kit einen Festphasen-Antikörper,
bei dem der Antikörper an eine feste Phase gebunden ist,
einen markierten Antikörper, bei dem ein Markierungsenzym
an den Antikörper gebunden ist, wobei wenigstens einer des
markierten Antikörpers und des Festphasen-Antikörpers von
einem Meerschweinchen stammt, und eine Reaktionslösung
enthält, die normales Meerschweinchenserum enthält, um den
Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten
Antikörpers an die feste Phase zu erniedrigen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Diese Erfindung wird eingehender an Hand der folgenden
Beschreibung in Verbindung mit den anliegenden Zeichnungen
erläutert, in denen:
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Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die die Beziehung
zwischen der Intensität der Chemilumineszenz und
der hCG Menge zeigt;
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Fig. 2 eine graphische Darstellung ist' die die Beziehung
zwischen der Intensität der Chemilumineszenz und
der AFP Menge zeigt;
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Fig. 3 ein schematisches Diagramm ist, die die IgG Struktur
zeigt;
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Fig. 4 eine graphische Darstellung ist, in der der
Prozentsatz des nicht-spezifischen Bindens für
gegebene Verhältnisse von normalem Meerschweinchenserum
zur Reaktionslösung A aufgetragen ist;
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Fig. 5 eine graphische Darstellung ist, die die Beziehung
zwischen der Intensität der Chemilumineszenz und
der hCG Menge zeigt;
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Fig. 6 eine graphische Darstellung ist, in der der
Prozentsatz des nicht-spezifischen Bindens für gegebene
Beispiele aufgetragen ist; und
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Fig. 7 eine graphische Darstellung ist, die die Beziehung
zwischen der Intensität der Chemilumineszenz und
der hCG Menge zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Eine Ausführungsform der Erfindung wird beschrieben werden.
Ein zu bestimmendes Antigen wird untersucht durch eine
Sandwich-Enzymimmunoassay-Technik, die einen ersten und
zweiten Antikörper verwendet, die in einer spezifischen
Weise mit dem zu bestimmenden Antigen in Anwesenheit einer
Reaktionslösung reaktiv sind, um das zu bestimmende Antigen
zwischen dem ersten und zweiten Antikörper einzufangen. Die
Antikörper werden aus Serum erhalten, das von einem
ausgewählten Tier entnommen wird, in das das zu bestimmende
Antigen injiziert wurde. Der erste Antikörper wird als ein
Festphasen-Antikörper bezeichnet, der auf eine feste Phase,
wie z. B. Polystyrolkugel, aufgebracht ist. Der zweite
Antikörper wird als ein markierter Antikörper bezeichnet, an
den ein Markierungsenzym gebunden ist. Das Markierungsenzym
kann Glucoseoxidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase,
β-D-Galactosidase oder ähnliches sein. Eine
Chemilumineszenztechnik wird verwendet, um die Menge des Markierungsenzyms
zu messen, die der Menge des zu bestimmenden Antigens
entspricht. Diese Verfahren werden genauer beschrieben werden
mit der Annahme, daß das zu bestimmende Antigen menschliches
Chorion-Gonadotropin (hCG) ist, das ausgewählte Tier
Meerschweinchen ist, das Markierungsenzym Glucoseoxidase (GOD)
ist. Die verwendete Reaktionslösung ist 0,056 mol/l
Natriumphosphatpuffer (pH 6,3), der 0,1% Natriumazid, 0,2%
Rinderserumalbumin (BSA) und 0,337% NaCl enthält. Diese
Reaktionslösung wird als Reaktionslösung A bezeichnet.
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Zuallererst werden 3000 IU (Internationale Einheit) des
hCG (Antigen) sechsmal unter die Rückenhaut eines
Meerschweinchens in Intervallen von einer Woche injiziert. In
der siebten Woche werden 1000 IU Verstärkung in das
Meerschweinchen injiziert. Nach fünf Tagen wird eine
geeignete Blutmenge dem Meerschweinchen entnommen.
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Das Meerschweinchen-anti-hCG-Immunglobulin G (IgG) wird
aus dem entnommenen Serum folgendermaßen gereinigt.
Zuallererst werden 2 ml gesättigtes Ammoniumsulfat in 2 ml Serum
getropft. Die erhaltene Lösung wird langsam bei einer
Temperatur von 4ºC zwei oder drei Stunden lang gerührt. Die
resultierende trübe Lösung wird dann in ein Zentrifugenrohr
gestellt. Das Zentrifugieren wird bei einer Temperatur von
4ºC mit einer Zentrifuge, die mit einer Geschwindigkeit von
3000 Upmin dreht, 15 Minuten lang durchgeführt. Der
Überstand wird aus dem Zentrifugenrohr entfernt, während der
Niederschlag mit 2 ml eines 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffers
(pH 6,0) gelöst wird, der 5 mmol/l
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält. Die resultierende Lösung wird mit
einer Fließrate von 6 ml/h auf einer Sephacryl S-300 Säule
(1 · 90 cm) (ein Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals,
Schweden) eluiert, die mit 0,1 mol/l Natriumphoshatpuffer
(pH 6,0), der 5 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
enthält, equilibriert ist. Die eluierte Lösung wird in 1 ml
Proben aufgeteilt. Die Meerschweinchen-anti-hCG-IgG
Fraktionen, die Licht bei 280 nm absorbieren, werden aus den
entsprechenden Proben gesammelt.
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Das resultierende Meerschweinchen-anti-hCG-IgG wird durch
physikalische Absorption auf eine feste Phase aufgebracht,
indem eine Polystyrolkugel (6,5 mm im Durchmesser),
erhältlich von Ichiko Co., Japan, bei einer Temperatur von
4ºC in 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), der 0,1 mg/ml
Meerschweinchen-anti-hCG-IgG enthält, eine ganze Nacht lang
eingetaucht wird. Die mit anti-hCG-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wird dreimal in 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer
(pH 7,5) gewaschen und dann dreimal mit 0,01 mol/l
Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 mol/l NaCl, 0,1%
Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% NaN&sub3; enthält, gewaschen. Die
gewaschene Polystyrolkugel wird bei einer Temperatur von 4ºC
in 0,01 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 mol/l
NaCl, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% NaN&sub3; enthält,
gelagert.
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Der markierte Antikörper, Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD
wird durch die folgenden drei Schritte hergestellt:
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(1) Maleinimid-Glucoseoxidase (Maleinimid GOD) wird, wie
folgt, hergestellt. Succinimidyl-4-maleinimidobutyrat
(GMBS) wird zu etwa 3 mg Glucoseoxidase (GOD) gegeben,
die in jeweils vier Testrohrchen gefüllt sind, die
0,3 ml eines 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffers (pH 7,0)
enthalten, um eine Lösung mit einem GOD/GMBS Verhaltnis
von 1/50 zu ergeben. Diese Lösung wird bei einer
Temperatur von 30ºC eine Stunde lang inkubiert. Die
resultierende Lösung wird bei einer Fließrate von 12 ml/l
auf einer Sephadex G-25 Säule (1 · 30 cm) (ein
Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden)
entsalzt, die mit 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 6,0)
equilibriert ist. Die entsalzte Lösung wird in 1 ml
Maleinimid GOD Proben aufgeteilt.
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(2) Das sulfhydratisierte
Meerschweinchen-anti-hCG-Immunglobulin G (SH-IgG) wird, wie folgt, hergestellt.
Zuallererst werden 2 ml IgG-Lösung hergestellt, die
10 mg Meerschweinchen-anti-hCG-IgG, 0,1 mol/l
Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) und 5 mmol/l
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält. Die IgG-Lösung wird zu
einer Lösung gegeben, die
S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (ASMSa) gelöst in N,N-Dimethylformamid (DMF)
enthält, unter Bildung einer Lösung mit einem IgG/ASMSa
Verhältnis, als Molkonzentration, von 1/300. Die
erhaltene Lösung wird bei einer Temperatur von 30ºC 30 Minuten
lang gerührt. Nacheinander wird diese Lösung mit 0,1 ml
eines 0,1 mol/l Tris-HCl-Puffers (pH 7,0), 0,02 ml einer
0,1 mol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 7,0)
und 0,1 ml eines 1 mol/l Hydroxylaminhydrochlorids
(pH 7,0) versetzt. Die erhaltene Lösung wird bei einer
Temperatur von 30ºC vier Minuten lang inkubiert, und
dann wird die erhaltene Lösung mit einer Fließrate von
12 ml/h auf einer Sephadex G-25 Säule (1·30 cm) (ein
Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden)
entsalzt, die mit 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer
(pH 6,0), der 5 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) enthält, equilibriert ist. Die entsalzte Lösung
wird in 1 ml SH-IgG Proben aufgeteilt. Diese SH-IgG
Proben werden in einem eisgekühlten Kollodiumbeutel
konzentriert.
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(3) Der markierte Antikörper wurde, wie folgt, hergestellt.
Das Maleinimid GOD wird zu der SH-IgG-Lösung mit
derselben Molkonzentration wie das Maleinimid GOD gegeben.
Nachdem die erhaltene Lösung eine Stunde lang bei einer
Temperatur von 30ºC gehalten wurde und dann bei einer
Temperatur von 4ºC gleichbleibend die ganze Nacht über
gehalten wurde, wird sie bei einer Fließrate von 6 ml/h
auf einer Sephacryl S-300 Säule (1·90 cm) (ein
Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) eluiert,
die mit 0,1 mol/l Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,5),
die 5 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
enthält, equilibriert ist. Die eluierte Lösung wird in 1 ml
Proben aufgeteilt. Das Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD
(markierter Antikörper) wird von den entsprechenden
Proben gesammelt und bei einer Temperatur von 4ºC in
einer Lösung gelagert, die 0,1% NaN&sub3; und 0,1%
Rinderserumalbumin (BSA) enthält.
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Der markierte Antikörper (Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD)
wird durch das Antigen (hCG) auf dem Festphasen-Antikörper
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Meerschweinchen-anti-hCG-IgG) in Anwesenheit der
Reaktionslösung A (0,056 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 6,3)
mit 0,1% Natriumazid, 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) und
0,337% NaCl) auf folgende Weise gebunden. Die mit anti-hCG-
IgG beschichtete Polystyrolkugel wird bei Raumtemperatur
mit hCG (Antigen), das mit der Reaktionslösung A verdünnt
ist, inkubiert. Die Polystyrolkugel wird dann dreimal mit
destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschene
Polystyrolkugel wird bei Raumtemperatur mit anti-hCG-IgG-GOD
(markierter Antikörper) in der Reaktionslösung A inkubiert. Die
Polystyrolkugel wird dann wieder mit destilliertem Wasser
gewaschen und in ein anderes sauber es Probenrohr
überführt.
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Eine Chemilumineszenztechnik wird verwendet, um die Menge
des Markierungsenzyms zu bestimmen, das ist die Menge des
Antigens. Zuallererst wird in das Probenrohr 0,3 ml eines
0,01 mol/l Acetatpuffers (pH 5,1), der 0,5 mol/l Glucose
enthält, gegeben. Das Probenrohr wird gleichbleibend bei
einer Temperatur von 37ºC zwei Stunden lang gehalten. Die
resultierende Lösung wird genommen, um eine 0,1 ml Probe
herzustellen. Die Probe wird mit 0,5 ml eines 0,2 mol/l
Carbonatpuffers (pH 9,8), der 2·10&supmin;&sup7; mol/l Luminol
enthält, und dann mit 0,5 ml eines 6·10- mol/l
Kaliumferricyanids versetzt. Die Konzentration des resultierenden
Wasserstoffperoxids wird aus dem Licht, das bei der
Chemilumineszenzreaktion des Luminols und Kaliumferricyanids und
Wasserstoffperoxids emittiert wird, mit einem Luminometer
UPD-8000 (ein Warenzeichen von Meidensha Electric Mfg.,
Co., Japan) gemessen, das 15 Sekunden, nachdem das Luminol
und Kaliumferricyanid in das Probenrohr gegeben wurden, zu
arbeiten beginnt und das emittierte Licht 30 Sekunden lang
zählt.
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Obwohl das Antigen in Verbindung mit menschlichem Chorion-
Gonadotropin (hCG) beschrieben wurde, ist zu bemerken, daß
es auch menschliches Chorion-Gonadotropin β (hCGβ),
α-Fetoprotein (AFP), anti-Karzino-embryonales Antigen (CEA) oder
ähnliches sein kann. Anti-AFP-IgG wird aus Serum gereinigt,
das einem ausgewählten Tier von Tieren, einschließlich
Meerschweinchen, Kaninchen, Ziege und ähnlichen entnommen
wurde, dem AFP sechsmal in Intervallen von einer Woche und
eine Verstärkung in der siebten Woche injiziert worden war.
Anti-CEA-IgG wird aus Serum gereinigt, das einem
ausgewählten Tier von Tieren, einschließlich Meerschweinchen,
Kaninchen, Ziege und ähnlichem entnommen wurde, dem CEA
sechsmal in Intervallen von einer Woche und eine Verstärkung
in der siebten Woche injiziert worden war.
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Ein ernstes Problem, das solchem Sandwich-Enzymimmunoassay
(EIA) anhaftet, ist die Neigung zur nicht-spezifischen
Bindung einer relativ großen Menge des markierten
Antikörpers an der festen Phase, was die Genauigkeit des Sandwich-
Enzymimmunoassays verringert. Die Erfinder stellten fest,
daß der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten
Antikörpers an der festen Phase verringert wurde, wenn
wenigstens einer des Festphasen-Antikörpers und des
markierten Antikörpers aus Blutserum hergestellt wurde, das vom
Meerschweinchen stammt. Eine große Zahl von Versuchen wurde
durchgeführt, die wirksamen Kombinationen von Festphasen-
und markierten Antikörpern zu prüfen.
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Der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten
Antikörpers an der festen Phase wurde bestimmt. Zu diesem
Zweck wurde eine mit IgG beschichtete Polystyrolkugel bei
Raumtemperatur mit IgG-GOD, hundertfach verdünnt mit 0,3 ml
der Reaktionslösung A, in einem Versuchsrohr die ganze
Nacht über inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde dreimal
mit der Reaktionslösung A gewaschen und dann in ein anderes
sauberes Versuchsrohr überführt. Danach wurde 0,3 ml eines
0,01 mol/l Acetatpuffers (pH 5,1), der 0,5 mol/l Glucose
enthielt, in das Versuchsrohr gegeben. Das Versuchsrohr
wurde gleichbleibend bei einer Temperatur von 37ºC zwei
Stunden lang gehalten. Aus der erhaltenen Lösung nahm man
eine 0,1 ml Probe. Die Probe wurde mit 0,5 ml eines
0,2 mol/l Carbonatpuffers (pH 9,8), der 2·10&supmin;&sup7; mol/l
Luminol enthielt, versetzt und dann mit 0,5 ml eines
6·10&supmin;³ mol/l Kaliumferricyanids. Das durch die
Chemilumineszenzreaktion des Luminols und Kaliumferricyanids
und des resultierenden Wasserstoffperoxidsemittierte
Licht wurde mit einem Luminometer UPD-8000 gemessen, das
15 Sekunden, nachdem das Luminol und das Kaliumferricyanid
in das Probenrohr gegeben worden waren, zu arbeiten
begann und das emittierte Licht 30 Sekunden lang zählte.
Der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten
Antikörpers an der festen Phase wurde dargestellt durch
das Verhältnis des nicht-spezifischen Bindens, angegeben
als C1/C2·100 (%), worin C1 die Zahl der für den
markierten Antikörper, der an der Polystyrolkugel bindet,
gemessenen Zählimpulse ist, und C2 die Zahl der
Zählimpulse ist, die der gesamten Menge des in dem
Versuchsrohr verwendeten markierten Antikörpers entspricht.
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In einer Reihe dieser Versuche stammte der verwendete
Festphasen-Antikörper vom Meerschweinchen, und der
verwendete markierte Antikörper stammte vom Meerschweinchen.
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Beispiel 1: Der verwendete markierte Antikörper war
normales Meerschweinchen-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war normales Meerschweinchen-IgG. Das
normale Meerschweinchen-IgG war Miles Co., Lot No. 29.
Eine mit normalem Meerschweinchen-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wurde mit normalem Meerschweinchen-IgG-GOD
in Gegenwart der mit Meerschweinchenserum gemischten
Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 2: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG.
Eine mit Meerschweinchen-anti-hCG-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wurde mit Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD
in Gegenwart von der mit Meerschweinchenserum gemischten
Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 3: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG. Eine
mit Meerschweinchen-anti-AFP-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wurde mit dem Meerschweinchen-anti-AFP-IgG-GOD in
Anwesenheit einer Reaktionslösung inkubiert.
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Beispiel 4: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-CEA-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-CEA-IgG. Eine
mit Meerschweinchen-anti-CEA-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wurde mit dem Meerschweinchen-anti-CEA-IgG-GOD in
Anwesenheit der mit Meerschweinchenserum gemischten
Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 5: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-Insulin-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-Insulin-IgG.
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Das Meerschweinchen-anti-Insulin-IgG war Miles Co., Lot
No. 23. Eine mit Meerschweinchen-anti-Insulin-IgG
beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Meerschweinchenanti-Insulin-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Zum Vergleich der erfindungsgemäß erreichbaren
Herabsetzungswirkung des nicht-spezifischen Bindens wurden Versuche für
die folgenden Vergleichsbeispiele durchgeführt, in denen
weder der Festphasen-Antikörper noch der markierte
Antikörper vom Meerschweinchen stammten.
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Vergleichsbeispiel 1: Der verwendete markierte Antikörper
war normales Kaninchen-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war normales Kaninchen-IgG. Das normale
Kaninchen-IgG war Miles Co., Lot No. 0019. Eine mit
normalem Kaninchen-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit
dem normalen Kaninchen-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Vergleichsbeispiel 2: Der verwendete markierte Antikörper
war Kaninchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-hCG-IgG. Das
Kaninchen-anti-hCG-IgG war EY Co., Lot No. 021304. Eine mit
Kaninchen-anti-hCG-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit Kaninchen-anti-hCG-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Vergleichsbeispiel 3: Der verwendete markierte Antikörper
war Kaninchen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-AFP-IgG. Das
Kaninchenanti-AFP-IgG war Nordic Co., Lot No. 16-184. Eine mit
Kaninchen-anti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Kaninchen-anti-AFP-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Vergleichsbeispiel 4: Der verwendete markierte Antikörper
war Kaninchen-anti-CEA-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-CEA-IgG. Das
Kaninchenanti-CEA-IgG war Zymed Co., Lot No. 40925. Eine mit
Kaninchen-anti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Kaninchen-anti-CEA-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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In einer anderen Reihe dieser Versuche stammte der
verwendete Festphasen-Antikörper vom Meerschweinchen, und der
verwendete markierte Antikörper stammte vom Kaninchen oder
der Ziege.
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Beispiel 6: Der verwendete markierte Antikörper war
Kaninchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG. Das
Kaninchen-antihCG-IgG war EY Co., Lot No. 021304. Eine mit
Meerschweinchenanti-hCG-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Kaninchen-anti-hCG-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 7: Der verwendete markierte Antikörper war
Kaninchen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG. Das
Kaninchenanti-AFP-IgG war Nordic Co., Lot No. 16-184. Eine mit
Meerschweinchen-anti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Kaninchen-anti-AFP-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 8: Der verwendete markierte Antikörper war
Ziegenanti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-Antikörper
war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG. Das Ziegen-anti-AFP-IgG
war Cappel Co., Lot No. 20176. Eine mit
Meerschweinchenanti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Ziegen-anti-AFP-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 9: Der verwendete markierte Antikörper war
Ziegenanti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-Antikörper
war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG. Eine mit
Meerschweinchenanti-hCG-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Ziegen-anti-hCG-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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In einer noch anderen Serie von Versuchen stammte der
verwendete Festphasen-Antikörper vom Kaninchen oder der Ziege,
und der verwendete markierte Antikörper stammte vom
Meerschweinchen.
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Beispiel 10: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Kaninchen-anti-hCG-IgG. Das
Kaninchen-antihCG-IgG war EY Co., Lot No. 021304. Eine mit
Kaninchenanti-hCG-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 11: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Kaninchen-anti-AFP-IgG. Das Kaninchen-anti-
AFP-IgG war Nordic Co., Lot No. 16-184. Eine mit
Kaninchenanti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Meerschweinchen-anti-AFP-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Beispiel 12: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Ziegen-anti-AFP-ZgG. Das Ziegen-anti-AFP-IgG
war Cappel Co., Lot No. 20176. Eine mit Ziegen-anti-AFP-IgG
beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Meerschweinchenanti-AFP-IgG-GOD in Anwesenheit der mit Meerschweinchenserum
gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Zum Vergleich der erfindungsgemäß erreichbaren
Herabsetzungswirkung des nicht-spezifischen Bindens wurden für die
folgenden Vergleichsbeispiele Versuche durchgeführt, in denen
weder der Festphasen-Antikörper noch der markierte Antikörper
vom Meerschweinchen stammten.
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Vergleichsbeispiel 5: Der verwendete markierte Antikörper
war Kaninchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-hCG-IgG. Eine mit
Kaninchen-anti-hCG-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Kaninchen-anti-hCG-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
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Vergleichsbeispiel 6: Der verwendete markierte Antikörper
war Kaninchen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-AFP-IgG. Eine mit
Kaninchen-anti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Kaninchen-anti-AFP-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Vergleichsbeispiel 7: Der verwendete markierte Antikörper
war Ziegen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Ziegen-anti-AFP-IgG. Eine mit Ziegen-anti-
AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Ziegenanti-AFP-IgG-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Die Ergebnisse der nicht-spezifischen Bindungsversuche sind
in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabelle 1
Beispiel Nr. Durchschnittlicher Prozentsatz (%) des nicht-spezifischen Bindens Vergleichsbeispiel Nr.
-
Der Prozentsatz des nicht-spezifischen Bindens variiert von
0,078% bis 0,190% für Kombinationen, in denen weder der
Festphasen-Antikörper noch der markierte Antikörper vom
Meerschweinchen stammt. Der Prozentsatz des nicht-spezifischen
Bindens variiert von 0,0089% bis 0,023% für Kombinationen,
in denen wenigstens einer von dem Festphasen-Antikörper und
dem markierten Antikörper vom Meerschweinchen stammte. Es
kann aus den Versuchsergebnissen ersehen werden, daß der Grad
des nicht-spezifischen Bindens des markierten Antikörpers an
die feste Phase zu einem beträchtlichen Ausmaß erniedrigt
werden kann, wenn wenigstens einer von dem Festphasen-Antikörper
und dem markierten Antikörper vom Meerschweinchen stammt.
-
Die Empfindlichkeit und der meßbare Bereich eines solchen
Sandwich-Enzymimmunoassays wurde bestimmt. Für diesen Zweck
wurde eine anti-hCG-IgG beschichtete Polystyrolkugel bei
Raumtemperatur mit 0,1 ml einer hCG-Standardlösung, die mit
0,2 ml der Reaktionslösung A verdünnt war, in einem
Versuchsrohr 6 Stunden lang inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde 3 mal
mit der Reaktionslösung A gewaschen. Die gewaschene
Polystyrolkugel wurde mit 0,1 ml des anti-hCG-IgG-GOD markierten
Antikörpers, der in einem geeigneten Verhältnis mit der
Reaktionslösung A verdünnt war, inkubiert. Das Versuchsrohr
wurde gleichbleibend bei Raumtemperatur die ganze Nacht
über gehalten. Die Polystyrolkugel wurde dann 3 mal mit der
Reaktionslösung A gewaschen und in ein anderes sauberes
Versuchsrohr überführt. Danach wurden 0,3 ml eines 0,01 mol/l
Acetatpuffers (pH 5,1), der 0,5 mol/l Glucose enthielt, in
das Versuchsrohr gegeben. Das Versuchsrohr wurde
gleichbleibend bei einer Temperatur von 37ºC 2 Stunden lang
gehalten. 0,1 ml der Reaktionslösung wurden in ein anderes
Versuchsrohr pipettiert. Das Versuchsrohr wurde dann mit
0,5 ml eines 0,2 mol/l Carbonatpuffers (pH 9,8), der 2·10&supmin;&sup7;
mol/l Luminol enthielt, und dann mit 0,5 ml eines 6·10&supmin;³
mol/l Kaliumferricyanids versetzt. Das durch die
Chemilumineszenzreaktion des Luminols und des resultierenden
Wasserstoffperoxids emittierte Licht wurde mit einem
Luminometer UPD-800 gemessen, das 15 Sekunden, nachdem
das Luminol und das Kaliumferricyanid in das Versuchsrohr
gegeben worden waren, zu arbeiten begann und das emittierte
Licht 30 Sekunden lang zahlte. Ähnliche Verfahren wurden
für anti-AFP-IgG-Antikörper und anti-CEA-IgG-Antikörper
wiederholt.
-
Die Ergebnisse der Empfindlichkeit des meßbaren Bereichs
des Sandwich-Enzymimmunoassays sind in den Fig. 1 und 2
gezeigt. Fig. 1 betrifft die Beispiele 2, 6, 9 und 10
und die Vergleichsbeispiele 2 und 5, in denen das
verwendete Antigen hCG war. Fig. 2 betrifft die Beispiele
3, 7, 8, 11 und 12 und die Vergleichsbeispiele 3, 6 und 7,
in denen das verwendete Antigen AFP war. Es kann aus
diesen Versuchsergebnissen ersehen werden, daß die
Empfindlichkeit und der meßbare Bereich des
Sandwich-Enzymimmunoassays besser waren, wenn wenigstens einer von dem
Festphasen-Antikörper und dem markierten Antikörper vom
Meerschweinchen stammte, als die, die erhalten wurden, wenn
weder der Festphasen-Antikörper noch der markierten
Antikörper vom Meerschweinchen stammte.
-
Das Sandwich-Enzymimmunoassay wurde 10 mal innerhalb eines
Tages (within assay) unter Verwendung der Antikörper in
den Beispielen 2, 6, 9 und 10 und den Vergleichsbeispielen
2 und 5 wiederholt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2
und 3 gezeigt. Ähnlich wurde das Sandwich-Enzymimmunoassay
6 mal an 6 verschiedenen Tagen (between assay) unter
Verwendung der Antikörper in den Beispielen 2, 6, 9 und 10
und den Vergleichsbeispielen 2 und 5 wiederholt. Die
Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt.
Tabelle 2
Beispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert
Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 2 Fortsetzung
Beispiel Nr. Zahl der
Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 3
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 4
Beispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 5
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
-
Es kann aus diesen Ergebnissen ersehen werden, daß kleinere
Schwankungen in den Ergebnissen des Sandwich-Enzymimmunoassays
erhalten werden können, wenn wenigstens einer von dem
Festphasen-Antikörper und dem markierten Antikörper vom
Meerschweinchen stammt, als wenn weder der Festphasen-Antikörper
noch der markierte Antikörper vom Meerschweinchen stammt.
-
In Fig. 3 wird inschematischer Weise die Struktur von
Immunglobulin G (IgG) gezeigt. Die IgG Struktur kann
geteilt werden in ein antigenbindendes F(ab')&sub2; Fragment
und ein kristallisierbares (Fc) Fragment, wenn es bei einer
Temperatur von 37ºC 18 Stunden lang in Anwesenheit von
Pepsin gehalten wird. Das Fc Fragment hat einen Teil P4 für
die Adsorption an eine Zelle. Das Fc Fragment hat keine
Fähigkeit, an ein Antigen zu binden, und es kristallisiert
bei niedriger Temperatur. Das F(ab')&sub2; Fragment kann durch
ein Reduktionsverfahren, z. B. in Anwesenheit von
Mercaptoethylamin, in zwei Fab' Fragmente geteilt werden, die einen
zum Binden an ein Antigen fähigen Teil P1 haben. Die
Erfinder stellten fest, daß das Ausmaß des nicht-spezifischen
Bindens des markierten Antikörpers an die feste Phase
abhängig ist von der Anwesenheit des Fc Fragments und
verringert werden kann durch den Ersatz des IgG-GOD durch
Fab'-GOD, wenn wenigstens einer von dem
Festphasen-Antikörper und dem markierten Antikörper vom Meerschweinchen
stammt. Das Fab' Fragment wird als Ergebnis der Trennung
des Fc Fragment vom IgG in der folgenden Weise hergestellt:
-
Zuallererst werden 2 ml gesättigtes Ammoniumsulfat in 2 ml
Serum getröpfelt, das einem ausgewählten Tier, wie oben
beschrieben, entnommen war. Die resultierende Lösung wird
langsam bei einer Temperatur von 4ºC 2 oder 3 Stunden lang
gerührt. Die entstandene trübe Lösung wird dann in ein
Zentrifugenrohr gegeben. Das Zentrifugieren wird bei einer
Temperatur von 4ºC mit einer Zentrifuge durchgeführt, die
mit einer Geschwindigkeit von 3000 Upm 15 Minuten lang
rotiert. Der Überstand wird aus dem Zentrifugenrohr
entfernt, während der Niederschlag mit 2 ml eines 0,1 mol/l
Natriumphosphatpuffers (pH 6,0), der 5 mmol/l
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, gelöst wird. Die
resultierende Lösung wird mit einer Fließrate von 6 ml/h
auf einer Sephacryl S-300 Säule (1·90 cm) (ein
Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) eluiert,
die mit 0,1 mol/l Acetatpuffer (pH 4,5), der 0,1 mmol/l
NaCl enthält, äquilibriert ist. Die eluierte Lösung wird
in 1 ml Proben geteilt. Die IgG Fraktionen, die Licht
bei 280 nm absorbieren, werden aus den entsprechenden
Proben gesammelt. Danach werden 0,1 ml einer 3 mg/ml
Pepsinlösung zu dem gesammelten IgG gegeben. Die
resultierende Lösung wird bei einer Temperatur von 37ºC 18
Stunden lang inkubiert. Die resultierende Lösung wird
mit einer Fließrate von 6 ml/h auf einer Sephacryl S-200
Säule (1·90 cm) (ein Warenzeichen der Pharmacia Fine
Chemicals, Schweden) eluiert, die mit 0,1 mol/l
Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) äquilibriert ist. Die eluierte
Lösung wird in 1 ml Proben getrennt. Die F(ab')&sub2;
Fraktionen, die Licht bei 280 nm absorbieren, werden aus
den entsprechenden Proben gesammelt. Das gesammelte
F(ab')&sub2; wird mit 0,05 ml eines 0,1 mol/l
Mercaptoethylamins versetzt und bei einer Temperatur von 37ºC 90
Minuten lang inkubiert. Die entstandene Lösung wird bei
einer Fließrate von 6 ml/h auf einer Sephadex G-25 Säule
(1·30 cm) (ein Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals,
Schweden) entsalzt, die mit 0,1 mol/l
Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert ist. Die entsalzte Lösung
wird in 1 ml Fab' Proben geteilt.
-
Eine große Zahl von Versuchen wurde im wesentlichen auf
dieselbe Weise, wie oben beschrieben, durchgeführt, um die
vorteilhaften Wirkungen auf das nicht-spezifische Binden
der Fab'-GOD markierten Antikörper an die feste Phase zu
prüfen.
-
Beispiel 13: Der verwendete markierten Antikörper war
Meerschweinchen-anti-AFP-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG. Eine
mit Meerschweinchen-anti-AFP-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wurde mit dem Meerschweinchen-anti-AFP-Fab'-GOD in
Anwesenheit der mit Meerschweinchenserum gemischten
Reaktionslösung A inkubiert.
-
Beispiel 14: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-AFP-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-AFP-IgG. Eine mit
Kaninchen-anti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Meerschweinchen-anti-AFP-Fab'-GOD in Anwesenheit
der mit Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A
inkubiert.
-
Beispiel 15: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-AFP-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Ziegen-anti-AFP-IgG. Eine mit
Ziegenanti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Meerschweinchen-anti-AFP-Fab'-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Beispiel 16: Der verwendete markierte Antikörper war
Kaninchen-anti-AFP-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG. Eine
mit Meerschweinchen-anti-AFP-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wurde mit dem Kaninchen-anti-AFP-Fab'-GOD in
Anwesenheit der mit Meerschweinchenserum gemischten
Reaktionslösung A inkubiert.
-
Beispiel 17: Der verwendete markierte Antikörper war
Ziegenanti-AFP-Fab'-GOD, und der verwendete Festphasen-Antikörper
war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG. Eine mit
Meerschweinchenanti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Ziegen-anti-AFP-Fab'-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Beispiel 18: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-CEA-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-CEA-IgG. Eine mit
Meerschweinchen-anti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel
wurde mit dem Meerschweinchen-anti-CEA-Fab'-GOD in
Anwesenheit der mit Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A
inkubiert.
-
Beispiel 19: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-CEA-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-CEA-IgG. Eine mit
Kaninchen-anti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Meerschweinchen-anti-CEA-Fab'-GOD in Anwesenheit
der mit Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A
inkubiert.
-
Beispiel 20: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-CEA-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Ziegen-anti-CEA-IgG. Eine mit
Ziegenanti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Meerschweinchen-anti-CEA-Fab'-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Beispiel 21: Der verwendete markierte Antikörper war
Kaninchen-anti-CEA-Pab'-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Meerschweinchen-anti-CEA-IgG. Eine mit
Meerschweinchen-anti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Kaninchen-anti-CEA-Pab'-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Beispiel 22: Der verwendete markierte Antikörper war
Ziegenanti-CEA-Fab'-GOD, und der verwendete Festphasen-Antikörper
war Meerschweinchen-anti-CEA-IgG. Eine mit
Meerschweinchenanti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Ziegen-anti-CEA-Fab'-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Zum Vergleich der durch die Erfindung erreichbaren Wirkung
der Erniedrigung des nicht-spezifischen Bindens wurden
Versuche für die folgenden Vergleichsbeispiele durchgeführt:
-
Vergleichsbeispiel 8: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-AFP-IgG.
Eine mit Meerschweinchen-anti-AFP-IgG beschichtete
Polystyrolkugel wurde mit dem Meerschweinchen-anti-AFP-IgG-GOD
in Anwesenheit der mit Meerschweinchenserum gemischten
Reaktionslösung A inkubiert.
-
Vergleichsbeispiel 9: Der verwendete markierte Antikörper
war Kaninchen-anti-AFP-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-AFP-IgG. Eine mit
Kaninchen-anti-AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
mit dem Kaninchen-anti-AFP-Fab'-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Vergleichsbeispiel 10: Der verwendete markierte Antikörper
war Ziegen-anti-AFP-Fab'-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Ziegen-anti-AFP-IgG. Eine mit Ziegen-anti-
AFP-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Ziegenanti-AFP-Fab'-GOD in Anwesenheit einer Reaktionslösung
inkubiert.
-
Vergleichsbeispiel 11: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-CEA-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-CEA-IgG. Eine
mit Meerschweinchen-anti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel
wurde mit dem Meerschweinchen-anti-CEA-IgG-GOD in Anwesenheit
der mit Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A
inkubiert.
-
Vergleichsbeispiel 12: Der verwendete markierte Antikörper
war Kaninchen-anti-CEA-Fab'-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Kaninchen-anti-CEA-IgG. Eine mit
Kaninchen-anti-CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde
in Anwesenheit der mit Meerschweinchenserum gemischten
Reaktionslösung A inkubiert.
-
Vergleichsbeispiel 13: Der verwendete markierte Antikörper
war Ziegen-anti-CEA-Fab'-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Ziegen-anti-CEA-IgG. Eine mit Ziegen-anti-
CEA-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde mit dem
Ziegenanti-CEA-Fab'-GOD in Anwesenheit der mit
Meerschweinchenserum gemischten Reaktionslösung A inkubiert.
-
Die Ergebnisse der nicht-spezifischen Bindungsversuche sind
in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6
Beispiel Nr. Durchschnittlicher Prozentsatz (%) des nicht-spezifischen Bindens Vergleichsbeispiel Nr.
Tabelle 6
Beispiel Nr. Durchschnittlicher Prozentsatz (%) des nicht-spezifischen Bindens Vergleichsbeispiel Nr.
-
Die Prozentsätze des nicht-spezifischen Bindens der
Vergleichsbeispiele 9, 10, 12 und 13, in denen der markierte Antikörper
Fab¹-GOD war, sind im wesentlichen dieselben wie die der
Vergleichsbeispiele 8 und 11, in denen sowohl der IgG Festphasen-
Antikörper als auch der IgG-GOD markierte Antikörper vom
Meerschweinchen stammten. Aus den Versuchsergebnissen, die sich
auf die Beispiele 13 bis 22 beziehen, kann gesehen werden, daß
der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten
Antikörpers an die feste Phase zu einem beträchtlichen Maß
herabgesetzt werden kann, wenn wenigstens einer von dem Fab'-GOD
markierten Antikörper und dem IgG Festphasen-Antikörper vom
Meerschweinchen stammt. Der meßbare Bereich und die
Nachweisgrenze des Sandwich-Enzymimmunoassays wurden im wesentlichen
auf dieselbe Weise bestimmt wie oben beschrieben. Die
Ergebnisse des meßbaren Bereichs der Nachweisgrenze des Sandwich-
Enzymimmunoassays sind in den Tabellen 7 bis 10 dargestellt.
Tabelle 7
Beispiel Nr. Meßbarer Bereich Vergleichsbeispiel Nr.
Tabelle 8
Beispiel Nr. Meßbarer Bereich Vergleichsbeispiel Nr.
Tabelle 9
Beispiel Nr. Nachweisgrenze AFP (ng/Rohr) Vergleichsbeispiel Nr.
Tabelle 10
Beispiel Nr. Nachweisgrenze AFP (ng/Rohr) Vergleichsbeispiel Nr.
-
Es kann aus diesen Versuchsergebnissen gesehen werden, daß
der meßbare Bereich und die Nachweisgrenze des Sandwich-
Enzymimmunoassays besser sind, wenn der verwendete markierte
Antikörper Fab'-GOD ist, als die, die erhalten werden, wenn
der verwendete Antikörper IgG-GOD ist. Zusätzlich sind der
meßbare Bereich und die Nachweisgrenze des
Sandwich-Enzymimmunoassays besser, wenn wenigstens einer von dem markierten
Antikörper (Fab'-GOD) und dem Festphasen-Antikörper (IgG) vom
Meerschweinchen stammt, als diejenigen, die erhalten werden,
wenn der markierte Antikörper Fab'-GOD ist und vom Kaninchen
stammt, und der Festphasen-Antikörper (IgG) vom Kaninchen
stammt, oder wenn der markierte Antikörper (Fab'-GOD) von
der Ziege stammt, und der Festphasen-Antikörper (IgG) von
der Ziege stammt.
-
Das Sandwich-Enzymimmunoassay wurde zehnmal innerhalb eines
Tages (within assay) wiederholt unter Verwendung der Antikörper
in den Beispielen 13-22 und den Vergleichsbeispielen 8 bis 13.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 11-14 gezeigt. Ähnlich
wurde das Sandwich-Enzymimmunoassay sechsmal an sechs
verschiedenen Tagen (between assay) wiederholt unter Verwendung
der Antikörper in den Beispielen 13-22 und den
Vergleichsbeispielen 8-13. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 15
bis 18 gezeigt.
Tabelle 11
Beispiel Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 12
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 13
Beispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen
Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 14
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 15
Beispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 16
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 17
Beispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 18
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
-
Es kann aus diesen Ergebnissen ersehen werden, daß kleinere
Schwankungen in den Ergebnissen des Sandwich-Enzymimmunoassays
erhalten werden können, wenn wenigstens einer von dem markierten
Antikörper (Fab'-GOD) und dem Festphasen-Antikörper (IgG) vom
Meerschweinchen stammt.
-
Die Erfinder haben festgestellt, daß der Grad des
nicht-spezifischen Bindens des markierten Antikörpers und der festen
Phase verringert werden kann durch Zugabe von normalem
Meerschweinchenserum zu der Reaktionslösung A, in deren Gegenwart
der markierte Antikörper an den Festphasen-Antikörper durch
das Antigen bindet. Eine Anzahl von Versuchen wurde
durchgeführt, um die vorteilhafte Wirkung auf den Grad des
nichtspezifischen Bindens des markierten Antikörpers an die feste
Phase zu liefern.
-
Beispiel 23: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG. Die
Reaktionslösung war eine Mischung der Reaktionslösung A und von
normalem Meerschweinchenserum.
-
Der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten
Antikörpers an die feste Phase wurde bestimmt. Für diesen Zweck
wurde eine mit Meerschweinchen-anti-hCG-IgG beschichtete
Polystyrolkugel bei Raumtemperatur in einem Versuchsrohr die
ganze Nacht über mit Meerschweinchen-anti-hCG-IgG inkubiert,
das mit 0,3 ml einer Reaktionslösungsmischung X verdünnt war,
die die Reaktionslösung A (0,056 mol/l Natriumphosphatpuffer
(pH 6,3), enthaltend 0,1% Natriumazid, 0,2% Rinderserumalbumin
(BSA) und 0,337% NaCl) gemischt in einem Volumenverhältnis
mit normalem Meerschweinchenserum enthielt. Die Polystyrolkugel
wurde dreimal mit der Reaktionslösung A gewaschen und wurde
dann in ein anderes sauberes Versuchsrohr überführt. Danach wurden
0,3 ml eines 0,1 mol/l Acetatpuffers (pH 5,1), der 0,5 mol/l
Glucose enthielt, in das Versuchsrohr gegeben. Das
Versuchsrohr wurde gleichbleibend bei einer Temperatur von 37ºC zwei
Stunden lang gehalten. Die erhaltene Lösung wurde verwendet,
um eine 0,1 ml Probe herzustellen. Der Probe wurden 0,5 ml
eines 0,2 mol/l Carbonatpuffers (pH 9,8), der 2·10&supmin;&sup7; mol/l
Luminol enthielt, und dann 0,5 ml eines 6·10&supmin;³ mol/l
Kaliumferricyanids zugesetzt. Das durch die
Chemilumineszenzreaktion des Luminols und des Kaliumferricyanids und des
resultierenden Wasserstoffperoxids emittierte Licht wurde mit
einem Luminometer UPD-8000 (ein Warenzeichen von Meidensha
Electric Mfg., Co., Japan) gemessen, der mit seiner Zählung
15 Sekunden, nachdem das Luminol und das Kaliumferricyanid
in das Versuchsrohr gegeben worden waren, begann und das
emittierte Licht 30 Sekunden lang zählte. Der Grad des
nicht-spezifischen Bindens des markierten Antikörpers an
die feste Phase wurde durch das nicht-spezifische
Bindungsverhältnis dargestellt, ausgedrückt als C1/C2 · 100 (%), in
dem C1 die Zahl der Zählimpulse für den markierten
Antikörper ist, der an die Polystyrolkugel bindet, und C2 die
Zahl der Zählimpulse ist, die der gesamten Menge des in dem
Versuchsrohr verwendeten markierten Antikörpers entspricht.
Diese Verfahren wurden wiederholt, während das
Volumenverhältnis des normalen Meerschweinchenserums zu der
Reaktionslösung A von 1:0 bis 1:20 geändert wurde.
-
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen des
nicht-spezifischen Bindens, die für verschiedene
Volumenverhältnisse durchgeführt wurden. Es kann aus diesen
Versuchsergebnissen gesehen werden, daß der Prozentsatz des
nicht-spezifischen Bindens von 0,005% bis 0,05% ansteigt,
wenn das Volumenverhältnis von dem normalen
Meerschweinchenserum zu der Reaktionslösung A von 1:0 bis 1:20 ansteigt.
-
Zum Vergleich der durch die Erfindung erreichbaren
Erniedrigung des nicht-spezifischen Bindens wurde im wesentlichen
in derselben Weise ein Versuch für das folgende
Vergleichsbeispiel durchgeführt:
-
Vergleichsbeispiel 14: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG.
Die verwendete Reaktionslösung war die Reaktionslösung A
ohne zugemischtes normales Meerschweinchenserum. Für
dieses Vergleichsbeispiel betrug das Verhältnis des
nichtspezifischen Bindens 0,4%.
-
Es ist daher offensichtlich, daß das Ausmaß des
nichtspezifischen Bindens des markierten Antikörpers an die feste
Phase in einem beträchtlichen Ausmaß erniedrigt werden
kann, wenn normales Meerschweinchenserum zu der
Reaktionslösung zugegeben wird, die beim Binden des markierten
Antikörpers an den Festphasen-Antikörper verwendet wird.
-
Die Empfindlichkeit und der meßmare Bereich des Sandwich-
Enzymimmunoassays wurde durch das folgende Beispiel
bestimmt.
-
Beispiel 24: Der verwendete markierte Antikörper war
Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete Festphasen-
Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG. Die verwendete
Reaktionslösung war eine Mischung der Reaktionslösung A und
von normalem Meerschweinchenserum. Das Volumenverhältnis des
normalen Meerscheinchenserums zu der Reaktionslösung A
betrug 1:5.
-
Eine mit anti-hCG-IgG beschichtete Polystyrolkugel wurde bei
Raumtemperatur in einem Versuchsrohr sechs Stunden lang mit
hCG Standardlösung inkubiert, die mit 0,3 ml Reaktionslösung A
verdünnt war. Die Polystyrolkugel wurde dreimal mit der
Reaktionslösung A gewaschen. Die gewaschene Polystyrolkugel wurde
mit 0,1 ml eines mit anti-hCG-IgG-GOD markierten Antikörpers
inkubiert,der in einem geeigneten Verhältnis mit einer Mischung
der Reaktionslösung A mit normalem Meerschweinchenserum
verdünnt war. Das Volumenverhältnis des normalen
Meerschweinchenserums zu der Reaktionslösung A betrug 1:5. Das Versuchsrohr
wurde gleichbleibend bei Raumtemperatur die ganze Nacht durch
gehalten. Die Polystyrolkugel wurde dann dreimal mit der
Reaktionslösung A gewaschen und in ein anderes sauberes
Versuchsrohr überführt. Danach wurden 0,3 ml eines 0,01 mol/l
Acetatpuffers (pH 5,1), der 0,5 mol/l Glucose enthielt, in das
Versuchsrohr gegeben. Das Versuchsrohr wurde gleichbleibend
bei einer Temperatur von 37ºC zwei Stunden lang gehalten.
Die entstandene Lösung wurde verwendet zur Herstellung einer
0,1 ml Probe. Die Probe wurde mit 0,5 ml eines 0,2 mol/l
Carbonatpuffers (pH 9,8), der 2·10&supmin;&sup7; mol/l Luminol enthielt,
und dann mit 0,5 ml eines 6·10&supmin;³ mol/l Kaliumferricyanids
versetzt. Das durch die Chemilumineszenzreaktion des Luminols
und des Kaliumferricyanids und des resultierenden
Wasserstoffperoxids emittierte Licht wurde mit einem Luminometer UPD-8000
gemessen, der 15 Sekunden, nachdem das Luminol und das
Kaliumferricyanid in das Versuchsrohr gegeben worden waren, zu
arbeiten anfing und das emittierte Licht 30 Sekunden lang
zählte.
-
Ähnliche Verfahren wurden für das folgende
Vergleichsbeispiel wiederholt, um die vorteilhaften Wirkungen auf das
Sandwich-Enzymimmunoassay zu prüfen.
-
Vergleichsbeispiel 15: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG. Die
verwendete Reaktionslösung war die Reaktionslösung A ohne
zugemischtes normales Meerschweinchenserum.
-
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse. Der für das Beispiel 24
erhaltene meßbare Bereich und die Empfindlichkeit des Sandwich-
Enzymimmunoassays betrug 2,5 bis 1000 mIU/ml beziehungsweise
2,5 mIU/ml. Andererseits betrugen der für das
Vergleichsbeispiel 15 erhaltene meßbare Bereich und die Empfindlichkeit
des Sandwich-Enzymimmunoassays 50-500 mIU/ml
beziehungsweise 50 mIU/ml. Es ist daher offensichtlich, daß die
Empfindlichkeit und der meßbare Bereich des Sandwich-Enzymimmunoassays
verbessert sind, wenn normales Meerschweinchenserum zu der
Reaktionslösung A zugegeben wird.
-
Das Sandwich-Enzymimmunoassay wurde zehnmal innerhalb eines
Tages (within assay) für Beispiel 24 und Vergleichsbeispiel 15
wiederholt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 19 und 20
gezeigt. Ähnlich wurde das Sandwich-Enzymimmunoassay an
verschiedenen Tagen (between assay) für Beispiel 24 und
Vergleichsbeispiel 15 wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabellen
21 und 22 gezeigt.
Tabelle 19
Beispiel Nr. Zahl der
Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 20
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 21
Beispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 22
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
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Es kann aus diesen Resultaten gesehen werden, daß kleinere
Abweichungen in den Ergebnissen des Sandwich-Enzymimmunoassays
erhalten werden können, wenn normales Meerschweinchenserum
zu der Reaktionslösung zugegeben wird.
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Um das effektive, der Reaktionslösung zuzusetzende Serum zu
finden, wurde eine Anzahl von Versuchen für die folgenden
Vergleichsbeispiele durchgeführt:
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Vergleichsbeispiel 16: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG.
Normales Kaninchenserum wurde zu der Reaktionslösung A
zugegeben. Das Volumenverhältnis des normalen
Kaninchenserums zu der Reaktionslösung A betrug 1:5.
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Vergleichsbeispiel 17: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG.
Normales Ziegenserum wurde zu der Reaktionslösung A
zugegeben. Das Volumenverhältnis des normalen Ziegenserums zu
der Reaktionslösung A betrug 1:5.
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Vergleichsbeispiel 18: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG.
Normales Pferdeserum wurde zu der Reaktionslösung A
zugegeben. Das Volumenverhältnis des normalen Pferdeserums zu
der Reaktionslösung A betrug 1:5.
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Vergleichsbeispiel 19: Der verwendete markierte Antikörper
war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG-GOD, und der verwendete
Festphasen-Antikörper war Meerschweinchen-anti-hCG-IgG.
Es wurde kein Serum zu der Reaktionslösung A zugegeben.
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Die Ergebnisse der Versuche des nicht-spezifischen Bindens,
die im wesentlichen in derselben Weise wie oben beschrieben
durchgeführt wurden, sind in Fig. 6 dargestellt. Der
Prozentsatz des nicht-spezifischen Bindens war für Beispiel 24 so
klein wie 0,022%. Andererseits variierte der Prozentsatz
des nicht-spezifischen Bindens für die Vergleichsbeispiele
16-19 von 0,07% bis 0,3%. Es ist daher offensichtlich,
daß der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten
Antikörpers an die feste Phase zu einem beträchtlichen
Ausmaß durch die Zugabe von normalem Meerschweinchenserum zu
der Reaktionslösung herabgesetzt werden kann.
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Die Ergebnisse der im wesentlichen in derselben Weise wie
oben beschrieben durchgeführten Versuche für die
Empfindlichkeit und den empfindlichen Bereich des
Sandwich-Enzymimmunoassays sind in Fig. 7 dargestellt. Der empfindliche
Bereich und die Empfindlichkeit des Sandwich-Enzymimmunoassays
betrugen für Beispiel 24 1-1000 mIU/ml und 1 mIU/ml
Andererseits betrugen der empfindliche Bereich und die
Empfindlichkeit des Sandwich-Enzymimmunoassays für
Vergleichsbeispiel 19 50-1000 mIU/ml und 50 mIU/ml. Es ist daher
offensichtlich, daß der empfindliche Bereich und die
Empfindlichkeit des Sandwich-Enzymimmunoassays durch die
Zugabe von normalem Meerschweinchenserum zu der
Reaktionslösung verbessert werden können.
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Das Sandwich-Enzymimmunoassay wurde zehnmal innerhalb eines
Tages (within assay) für Beispiel 24 und Vergleichsbeispiel
19 wiederholt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 23 und 24
gezeigt. Ähnlich wurde das Sandwich-Enzymimmunoassay an
verschiedenen Tagen (between assay) für Beispiel 24 und
Vergleichsbeispiel 19 wiederholt. Die Ergebnisse sind in
den Tabellen 25 und 26 gezeigt.
Tabelle 23
Beispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 24
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 25
Beispiel Nr. Zahl der
Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
Tabelle 26
Vergleichsbeispiel Nr. Zahl der Assaywiederholungen Durchschnittswert Standardabweichung Schwankungskoeffizient
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Es kann aus diesen Ergebnissen ersehen werden, daß kleinere
Abweichungen in den Ergebnissen des Sandwich-Enzymimmunoassays
erhalten werden können, wenn normales Meerschweinchenserum zu
der Reaktionslösung zugegeben wird.
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Obwohl für die Reaktionslösung angegeben wurde, daß sie
Natriumphosphatpuffer (pH 6,3) enthält, soll angemerkt werden, daß dieser
die durch Natriumphosphatpuffer (pH 6,0-7,5), Boratpuffer
(pH 8,0-8,5) und ähnliches ersetzt werden kann. Obwohl für
den markierten Antikörper angegeben wurde, daß er Glucoseoxidase
(GOD) als Markierungsenzym enthält, soll vermerkt werden, daß
das Markierungsenzym Peroxidase, alkalische Phosphatase,
β-D-Galactosidase oder ähnliches sein kann. Obwohl die Erfindung
in Verbindung mit Sandwich-Enzymimmunoassay beschrieben wurde,
sei zusätzlich bemerkt, daß die Markierung ein fluoreszierendes
Material (Fluoresceinisothiocyanat,
Tetramethylrhodaminisothiocyanat oder ähnliches), ein chemilumineszierendes
Material (Aminoethylethylisoluminol, Aminobutylethylisoluminol,
Aminopentylethylisoluminol, Aminohexylethylisoluminol und
ähnliches) oder ein radioaktives Isotop (³H, ¹&sup4;C ³²P, ¹²&sup5;I,
¹³¹I, und ähnliches) sein kann.