DE3783237T2 - Satz und methode zur bestimmung der wucherungsaktivitaet von menschlichen tumoren. - Google Patents
Satz und methode zur bestimmung der wucherungsaktivitaet von menschlichen tumoren.Info
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Description
- Das vorliegende Patent betrifft ein Kit für den Gebrauch in der Bestimmung der Proliferationsfähigkeit in Tumore bei Menschen. Dieses Kit bietet Einfachheit und operative Reproduzivität an.
- In der onkologieschen Pathologie, wie auch in jeder anderen Pathologie, ist die Verbesserung der therapeutischen Ergebnisse und, wenn möglich, die Heilung des Patienten das Hauptziel: dabei muß man selbstverständlich über geeignete therapeutische Mittel verfügen.
- Leider, abgesehen von der lokalen Chirurgie und der Radiotherapie, sind zur Zeit keine selektiven Behandlungen vorhanden, die, in den Fällen wo die Zellen in dem Organismus verbreitet sind, als einzige Therapie oder als adjuvante Therapie in jenen Fällen benutzt werden können, wo die lokale Behandlung nicht radikal war oder wo eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, daß klinisch nicht nachweisbare Tumorzellen an anderen Organen oder Geweben verbreitet sind.
- Der Mangel an Trennschärfe gegenüber den Krebszellen der zur Zeit verfügbaren Medikamente ergibt sich in mehr oder weniger schweren Nebenwirkungen auf normale Organe und Gewebe: daher die Notwendigkeit, die Therapie vorsichtig zu benutzen indem man die Intensität der Therapie an die biologische Aggressivität des Tumors anpaßt. In anderen Worten: der aktuelle Mangel an selektiven therapeutischen Mitteln beweist die höchste Wichtigkeit diese rationell zu benutzen durch eine Anpassung der Therapie an die Schwere der Krankheit.
- Leider zeigt die Erfahrung, daß Tumore die sich im Grunde der klinischen Eigenschaften ähneln, eine große Wandelbarkeit in ihrem Krankenheitsverlauf aufweisen können. Auch die mikroskopische Überprüfung der morfologischen Eigenschaften des Tumors durch den Pathologen, gibt exakte diagnostische Auskünfte, aber oft nur zu grobe und ungenaue prognostische Indikationen.
- Es ist deshalb wichtig, Studien zur Beschaffung von biologischen Faktoren und Marker für eine ständig sorgfältigere Vorhersage der Weiterentwicklung und Progression der Krankheit zu planen.
- Der große Eifer der Forscher in den letzten Jahrzehnten in diesem Feld der Onkologie kann wie folgt zusammengefaßt werden:
- 1. Suche nach bestimmten Eigenschaften der verschiedenen Krebstypen im Verhältnis zu den Eigenschaften des Organs oder Gewebes, wo der Tumor entsteht.
- 2. Suche nach Eigenschaften die allen Krebstypen gemeinsam sind unabhängig von dem Ursprungsorgan oder Gewebe.
- Die verschiedenen Aspekte der ersten Forschungsrichtlinie umfassen ein weitgehendes Spektrum von Faktoren, die in Tumorgeweben oder in biologischen Flüßigkeiten (Blut, Harn) der Krebspatienten enthalten sind. Dagegen ist der gemeinsame Nenner in der zweiten Forschungsrichtung die bemerkenswerte Proliferationsfähigkeit der Krebszellen.
- Obwohl die Zellreplikation nicht eine exklusive Eigenschaft des Tumorgewebes ist, ist anzunehmen daß das wirkliche Wachstum der tumoralen Masse irgendwie mit der Zahl der Zellen und mit der Zellproliferationsgeschwindigkeit im Verhältnis steht.
- In Verfolgung dieser Hypothese wurden schon seit 1970 Studien über die Charakterisierung der Proliferationsfähigkeit der Tumore gemacht und infolge der bedeutenden biologischen Unterschiede zwischen bei Tieren induzierten Tumoren und humanen Tumoren, wurden diese Studien direkt auf Tumore bei Menschen gerichtet.
- Die am Anfang der Studien benutzten Methoden hatten bedeutende ethische Beschränkungen zur Folge und zwar mit der Verabreichung von radioaktiven Substanzen an den Patienten und mit der Notwendigkeit mehrmals Tumorproben vom Patienten zu entnehmen. Deshalb war es unmöglich, aufeinanderfolgende Patientenserien zu untersuchen.
- Die Überzeugung, daß das Studium der Zellproliferationsfähigkeit Informationen abgibt, die vom wissenschaftlichen Standpunkt für eine bessere Erklärung der Biologie und Entwicklung der Tumore nützlich, sowie vom klinische Standpunkt für eine rationelle Planung der Therapie wichtig sind, führte zur Suche nach einfacheren und leichter darstelbaren Methodologien.
- Die zellkinetische Bestimmung wurde deshalb von dem in vivo System, d.h. von dem Patienten, zum Probeglas versetzt, wodurch die potentielle Radioaktivitätsgefahr für den Patient entfernt wurde und der Patient nicht mehr mit der schweren Prozedur der Entnahme von Biopsien belastet wurde.
- Die Methodologie, die jetzt einstimmend bei den Forschern in diesem Feld benutzt wird kann wie folgt schematisiert werden:
- -Die durch Biopsie oder Chirurgie erhaltene Tumorprobe wird in 1 mm-große Stücke zerkleinert und unter ständigem Rühren eine Stunde lang bei 37ºC in einem Probeglas mit Kulturmedium, passenden Nahrungsfaktoren und einer radioaktiven Substanz wie z. B. Thymidin, das normalerweise in den Zellen vorhanden ist und selektiv von den proliferierenden Zellen angenommen wird, inkubiert.
- -Nach einer Stunde Inkubation der Zellen mit dem radioaktiven metabolischen Prekursor wird das Kulturmedium entfernt und die Gewebestücke werden mit einem Fixiermittel behandelt, um die morphologische Aufbewahrung des Gewebes zu ermöglichen.
- -wie bei den gewöhnlichen histologischen Prozeduren werden die Tumorstücke mit steigenden Konzentrationen von Ethylalkohol behandelt um sie durchsichtig zu machen und danach werden sie in Paraffin eingekörpert.
- -Das Gewebe wird mit einem Mikrotom in 4 um dicke Sektionen geschnitten und in eine photographische Emulsion eingetaucht (Autoradiographische Methode). Diese Operation wird in der Dunkelheit ausgeführt, 8 bis 10 Tage lang, damit die Strahlungen aus dem biologischen Muster ein photographisches Bild gewünschter Intensität bilden können.
- - Die so erhaltenen photographischen latenten Bilder werden mit den gewöhnlichen Prozeduren entwickelt.
- -Die Präparate werden mit den konventionellen Prozeduren mit Hematoxyllin und Eosin gefärbt.
- -die unfänglich im Tumor vorhandenen proliferierenden Zellen enthalten den markierten Prekursor und sind deswegen fähig, autoradiographische Bilder zu liefern, die am Mikroskop sichtbar sind.
- Das Verhältnis zwischen der Zahl der markierten Zellen und der Gesamtanzahl von Zellen:
- LI = Zahl der markierten Zellen/Gesamtanzahl von Zellen
- wird ³H-thymidin Markierungsindex oder Labelingsindex genannt.
- Dieses Verhältnis, das als Ausdruck der Proliferationsfähigkeit des Tumors angesehen wird, ist ein echter prognostischer Faktor in vielen Typen von humanen Tumoren wie zum Beispiel bei Mammakarzinomen, Tumoren der Mundhöhle, Melanomen, Lymphomen und Mielomen.
- Die zuvor beschriebene Methode hat folgende Vorteile:
- -Benutzung von geringen Mengen Tumormaterials; deswegen kein chirurgischer Eingriff, denn es genügt eine Biopsie.
- -man braucht nur eine einzige Tumorentnahme
- -ist relativ einfach vom methodologischen Standpunkt ausgesehent
- -kann leicht standardisiert werden und erlaubt deswegen einen gültigen Vergleich zwischen den bei verschiedenen Forschungsgruppen erhaltenen Ergebnisssen.
- -die Ausführung dieser Methode ist zeitlich an den klinischen Bedarf angepaßt; die Methode wird deshalb schon zur Bestimmung der Proliferationsfähigkeit angewandt, sowohl in der Forschung als auch für klinische Ziele.
- Trotzdem gibt es eine gewisse Einschränkung, die es noch nicht ermöglicht, diese Methode in allen klinischen Anstalten anzuwenden. Diese Einschränkung ist dadurch bedingt, daß die Einfügung des radioaktiven Prekursors in die Tumorzellen ein aktives Phänomen darstellt und deshalb an den noch vitalen Zellen innerhalb kurzer Zeit (ca. 60 Minuten) nach der Entnahme ausgeführt werden muß. Diese Methode kann deshalb nur in Kliniken ausgeführt werden, die über die nötigen Einrichtungen verfügen und ein schnelles Vergehen garantieren können. Die Auswirkung dieser Einschränkung ist verständlich, wenn man bedenkt, daß die Proliferationsfähigkeit nicht nur ein charakteristicher Aspekt der Tumorbiologie ist, sondern auch bei der gegenwärtigen Therapieplanung potentiell eine wichtigere Rolle hat als andere Faktoren.
- Diese Beschränkung kann teilweise bei in denjenigen klinischen Anstalten überwunden werden die sich nicht in allzu weit vom Stützlabor befinden; sie bleibt jedoch unüberwindlich bei großen Entfernungen. Dieses Problem stellt sich sowohl in Italien als auch im Ausland, insbesondere in den Vereinigten Staaten, wo die Entfernungen enorm sind und wo man beginnt sich alternativen Lösungen zuzuwenden, für die man aber höhere Kosten sowie geringere Sorgfalt bei der Information voraussieht.
- Vor kurzem wurde ein Kit erfunden, das die Bestimmung der Proliferationsfähigkeit von humanen Tumoren nicht nur für Patienten einiger previligierter Anstalten ermöglicht, sondern auch bei allen klinischen Zentren, die über keine angemessenen Laboratorien verfügen.
- In der Tat erlaubt dieses Kit jeder klinischen Anstalt die ersten Stufen der Methode, bei denen man frisches und vitales Material braucht, durchzuführen.
- Das Kit, Objekt der Erfindung, besteht aus:
- -1. Ein Fläschchen (hermetisch verschlossen mit Gummizapfen oder mit einem Schraubdeckel oder ähnliches) welches das liophilisierte Kulturmedium, die Antibiotika, sowie den radioaktiven metabolischen Prekursor enthält, die nach der bisher befolgten Prozedur nur bei Gebrauch zusammengeinischt wurden.
- -2. Eine gewöhnliche Ampulle mit destilliertem Wasser
- -3 Eine Ampulle mit dem Fixiermittel
- -4. Eine Ampulle mit Alkohol (80º)
- -5. Ein Fläschchen zum Sammeln der Abfallflüßigkeiten
- -6. Zwei gewöhnliche Pipetten
- Als Kulturmedien werden in dem Fläschchen Nr.1 Medien die auf dem Markt verfügbar sind, sowie RPMI1640, McCoy's 5a, alpha MEM, Medium 199 benutzt. Als Serum können fetales Kälberserum, Ochsenserum, Kälberserum oder Pferdserum benutzt werden. Als radioaktiver Prekursor der DNS wurde ³H-thymidin benutzt. Zum Beispiel, ist die Zusammensetzung des Fläschchen Nr. 1 folgende: 1.9ml McCoys 5a, 0.38 ml fetal Kälberserum, 190 U Penizillin, 190 ug Streptomycin, 0.1 ml einer Saltzlösung ³H-thymidin (12 uCi, 5 Ci/umole). Als pH Wert Regulator wird Glutamin verwendet. Als Fixiermittel wird Formalin in Pufferlösung verwendet.
- Bei der praktischen Anwendung wird die Tumorprobe (ein einzelnes Stück bei Biopsien oder mehrere Stücke bei chirurgischer Entnahme) in das Gefäß Nr.1 getan und das destillierte Wasser aus der Ampulle Nr.2 zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation beim 37ºC wird die Flüßigkeit aus Fläschchen Nr.1 mit Pipetten aufgesaugt und als Abfall in das Fläschchen Nr.5 umgegoßen. Das histologische Fixiermittel aus Ampulle Nr.3 wird dem Fläschchen Nr.1 zugegeben. Nach einer Stunde wird auch das Fixiermittel aufgesaugt und ins Fläschchen Nr.5 gegoßen, sowie der Akohol aus Ampulle Nr.4 zugegeben.
- Die tatsächliche Neuheit in der in diesem Kit enthaltenen Erfindung, ist der Inhalt des Fläschen Nr.1.
- In der Tat gibtes für die Möglichkeit, in liophilisiertem Zustand vier Komponenten zusammen zu mischen, keinen Präzedenzfall in dem bisher beschriebenen Bereich von Reagenzen und Kit, die auf dem Markt verfügbar wären. Die Tatsache, daß diese Mischung verwirklicht werden konnte und daß sie zeitlich unbeschränkt ihre Funktionalität beibehaltet, ist eine überaschende Neuerung. Die Zuverlässigkeit dieses Vorschlages stützt sich auf eine Serie von Versuchen, die an verschiedenen menschlichen Tumoren durchgeführt wurden, und zwar in Kurztermin- Kulturen mit verschiedenen Kulturmedien, Serums und zellularen metabolischen Prekursoren. Diese Proben haben bewiesen, daß die Liophilisierung der verschiedenen Reagenzen und ihre Aufnahine im destillierten Wasser die ursprünglichen Eigenschaften der Nahrungskomponenten und markierten Substanzen nicht verändert.
- Normalerweise benutzt man ein Volumen von 2 ml von Medium, Serum, Antibiotika und radioaktiven Prekursor mit 2 ml Aufnahmemittel. Dieses 1:1 Verhältnis kann jedoch bis 3:1 verändert werden.
- Die Vorteile des Kits im Vergleich zu der gewöhnlichen Methode sind folgende:
- a) Ein leicht und lang aufbewahrbares Liophilizat, das die vier Hauptreagenzen enthält (Kulturmedium, Serum, Antibiotika, und radioaktiver metabolischer Prekursor) wird jedem Spital oder isolierten klinischen Praxis zur Verfügung gestellt.
- b) Von diesem Liophilizat wird die Lösung, in die die frische Tumorprobe gegeben wird, auf einfache Weise durch Zugabe von Wasser (im Kit enthalten) vorbereitet.
- c) Die Gewebefragmente können mit den im Kit enthaltenen Reagenzien histologisch fixiert werden, wobei die Verfallgefahr verhindert wird.
- d) Der Benützer wird von allen Prozeduren, die mit der Bestellung des radioaktiven Materials verbunden sind, befreit.
- e) Durch das Kit werden alle Verdünnungsstufen des radioaktiven Materials und der Antibiotika uberflüssig.
- f) Das Tumormaterial, vorbereitet und fixiert mit Hilfe des Kits, kann danach zur Vervollständigung der Analyse ohne Gefahr an die spezialisierten Laboratorien versand werden, .
- Außerdem, erlaubt das Kit eine absolute Standardisierung der Methode innerhalb einem, beziehungsweise zwischen verschiedenen Labors. Darüber hinaus werden menschliche Fehler wie sie bei der heute angewandten Methode möglich sind praktisch eliminiert.
Claims (6)
1. Satz zur Verwendung bei der Bestimmung der proliferativen Aktivität von
menschlichen Tumoren, umfassend einen Behälter, der in
zusammengestellter und lyophilisierter Form die vier Bestandteile -
Kulturmedium, Antibiotikum, Serum und radioaktiven metabolischen
Vorläufer - die zur Fixierung des Tumormaterials benötigt werden,
enthält, wobei der Satz außerdem Gefäße, die jeweils destilliertes
Wasser zur Wiederaufbereitung der lyophilisierten Komponenten,
histologisches Fixiermittel und Alkohol, einen Behälter für die
verbrauchten Flüssigkeiten und Einrichtungen zum Ansaugen und
Übertragen der Flüssigkeiten, umfaßt.
2. Satz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive
metabolische Vorläufer durch eine tritiierte Verbindung gebildet wird.
3. Satz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der tretierte
metabolische Vorläufer tritiiertes Thymidin ist.
4. Satz nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
lyophilisierte Volumen etwa 2 ml ist.
5. Satz nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß das
Volumen des destillierten Wassers für die Wiederaufbereitung des
lyophilisierten Produkts im Bereich von etwa 0,6 bis etwa 2 ml liegt.
6. Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten Probe, die Tumormaterial
enthält, zur Bestimmung der proliferativen Tumoraktivität, umfassend
die Bereitstellung eines Satzes nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, den Zusatz des destillierten Wassers zu den lyophilisierten
Komponenten, den Zusatz des Tumormaterials nach einem geeigneten
Zeitraum, das Entfernen der Flüssigkeit nach einer geeigneten
Inkubationszeit, das Einbringen des Fixiermittels in den Rückstand, das
Entfernen der Flüssigkeit nach einem geeigneten Zeitraum und das
Einbringen von Alkohol in den Rückstand, um die stabilisierte Testprobe
zu erstellen.
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