DE3780997T2 - Zusammensetzungen von retrovirusfreien immunoglobulinen. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft allgemein die Inaktivierung von Retroviren in Immunoserumglobulin (ISG) und insbesondere die Inaktivierung solcher Retroviren wie des LAV-Stammes eines AIDS-Virus in ISG zur beabsichtigten intravenösen (IV) Verabreichung.
• Therapeutische und prophylaktische IsG-Zubereitungen sind gut bekannt und seit vielen Jahren erhältlich. ISG wird gegenwärtig in kommerziellen Mengen erhalten, indem man Variationen einer Blutplasma-Fraktionierungstechnik, die von Cohn et al in den 1940er Jahren entwickelt wurde, verwendet. Obwohl ISG intramuskulär (IM) und neuerdings intravenös (IV) verabreicht wurde, besitzt der letztere Verabreichungsweg eine Vielzahl von Vorteilen und wurde als der bevorzugte Weg der Verabreichung anerkannt.
• Anfängliche Versuche, ein ISG für die IV-Verabreichung (IVIG) sicher und wirksam zu machen, konzentrierten sich auf die Eliminierung seiner Antikomplement-Aktivität. Ein Versuch dazu umfaßt z. B. die chemische Modifizierung des ISG (vgl. U.S. 3,903,262, Pappenhagen et al). In jüngster Zeit wurde das ISG für eine IV-Verabreichung durch eine sorgfältige pH- und Ionenstärke-Kontrolle geeignet gemacht (vgl. U.S. 4,396,608 und U.S. 4,499,073, Tenold). Es ist außerdem bekannt, daß IVIG-Präparate mit Kohlehydraten, wie z. B. Maltose stabilisiert werden können (vgl. U.S. 4,186,192, Fernades et al). ISG-Zubereitungen können außerdem unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden gereinigt werden (vgl. z.B. U.S. 4,272,521, Zuffi). Verschiedene ISG-Zubereitungen mit einem relativ hohen Titer gegenüber einem bestimmten Antigen sind ebenfalls gut bekannt (z. B. Tetanus, Hepatitis, Rho-Faktor, usw.).
• Obgleich ISG-Produkte (sowohl IMIG und IVIG) im allgemeinen als sicher betrachtet wurden, bestand eine wachsende Notwendigkeit, Patienten davor zu sichern, daß ISG-Produkte keine aktiven Viren übertragen, wie z. B. solche, die mit Hepatitis assoziiert sind, oder, in neuerer Zeit, Retroviren, wie z. B. solche, die mit dem Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) assoziiert sind. Die vorliegende Offenbarung basiert auf Arbeiten, die im Hinblick auf eine solche Notwendigkeit durchgeführt wurden.
• Antikörper für Retroviren, die mit AIDS assoziiert sind, wurden in menschlichem Hepatitis B-Immunoglobulin (HBIG) festgestellt (vgl. R. S. Tedder et al, Safety of immunoglobulin preparation containing anti-HTLV-III, Lancet 1985;1:815), sowie ebenfalls in anderen kommerziellen Immunoglobulinen (vgl. D. J. Gocke et al, HTLV-III antibody in commercial immunoglobulin, Lancet 1986;1:37 - 8). Diese Beobachtungen ergaben die Möglichkeit, daß Immunoglobulin-Produkte infektiöse Viren übertragen. Dies wurde durch neuere Berichte von nicht A, nicht B (NANB) Hepatitis in immunodefizienten Patienten verstärkt, die Infusionen intravenöser Immunoglobuline erhalten hatten, hergestellt aus Cohn-Fraktion II (vgl. A. D. B. Webster et al, Non-A, non-B hepatitis after intravenous gammaglobulin, Lancet 1986; 1:322, und H. D. Ochs et al, Non-A, non-B hepatitis after intravenous gammaglobulin, Lancet 1986;1:322 - 23).
• Auf der Grundlage der obigen Feststellungen wurde beschlossen, die Fähigkeit von Retroviren zu bestimmen, verschiedenen Verfahren, die in Immunoglobulin-Zubereitungen verwendet werden, sowie anderen Verfahren zu widerstehen. Für diese Experimente wurden zwei Prototyp-Retroviren verwendet: das Maus-xenotropische Typ-C-Retrovirus und der LAV-Stamm von AIDS-Retrovirus. Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Modell-Retroviren in ISG, das durch eine bekannte Fraktionierungs-Technik hergestellt wurde, inaktiviert werden konnten, wenn dieser Technik eine Lagerung bei kontrollierten Bedingungen des pH-Wertes, der Temperatur und der Zeit folgt. Einzelheiten dieser Methode werden nachfolgend beschrieben.
• Es wurde gefunden, daß ISG-Zubereitungen im wesentlichen frei von Retrovirus, wie z. B. einem mit AIDS assoziierten LAV-Stamm, hergestellt werden können, indem man das ISG aus einem gesammelten Plasma unter Verwendung einer bekannten Aufarbeitungsmethode herstellt (das ist das Cohn-Oncley-Verfahren mit kaltem Ethanol, unter Verwendung von mindestens ca. 18 % Ethanol V/V bei pH = 5,4), mit einer nachfolgenden Lagerung des ISG bei einem pH-Wert von weniger als 5,4, einer Temperatur von mindestens ca. 27ºC, oder bei einem pH-Wert von 6,8 bei einer Temperatur von mindestens ca. 45ºC, während einer Zeitdauer, die ausreicht, um die Retrovirus-Inaktivierung sicherzustellen. In bevorzugten Ausführungsformen wird unsere ISG-Zubereitung mit einem Kohlenhydrat (z. B. Maltose) und in einer 5 %igen (Gewicht/Volumen) flüssigen (wäßrigen) Form stabilisiert. Es ist für eine IV-Verwendung vorgesehen und im wesentlichen frei (weniger als 10 infektiöse Virusteilchen) vom LAV-Stamm des mit AIDS assoziierten Retrovirus, indem man gesammeltes menschliches Plasma unter Verwendung der Cohn-Oncley-Methode mit kaltem Ethanol (ca. 18 %iges Ethanol, pH ≥ 5,4) aufarbeitet, um ISG zu erhalten, gefolgt von einer Lagerung des ISG bei einem pH-Wert von ca. 4,25 während mindestens ca. 21 Tagen bei einer Temperatur von ca. 27ºC. In einer anderen Ausführungsform kann das ISG bei einem pH-Wert von 6,8 bei 45ºC wahrend mindestens 8 Stunden gelagert werden, um die Retrovirus-Inaktivierung sicherzustellen.
• Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Herstellung einer Immunoserumglobulin(ISG)-Zusammensetzung, die im wesentlichen frei ist von Retroviren, und das die Stufen umfaßt: Herstellung von ISG aus einer Quelle von menschlichem Plasma unter Verwendung einer Fraktionierungsmethode mit kaltem Ethanol bei einem pH-Wert, der gleich oder kleiner als ca. 5,4 ist, und Lagerung des ISG bei einem pH-Wert, einer Temperatur und einer Zeit, die ausreicht, um sicherzustellen, daß das ISG im wesentlichen frei ist von infektiösem Retrovirus.
• Die Figur veranschaulicht ein Fließschema der in unserer Cohn-Oncley-Fraktionierung von menschlichem Plasma mit kaltem Ethanol verwendeten Stufen, einschließlich der hierin beschriebenen neuen Lagerungsbedingungen.
• Das aus der Niere einer New Zealand Black Maus erhaltene xenotropische Typ C-Maus-Retrovirus wurde in Mink-Lungenzellen auf einen hohen Titer gezüchtet (O. E. Varnier et al, Murine xenotropic type C viruses, V. Biological and structural differences among three cloned retroviruses isolated from kidney cells from one NZB mouse, Virology 1984;132:79 - 94). Die Bestimmung basierte auf einem fokussierenden Versuch in Mink-S+L-Zellen, in denen jedes infektiöse Teilchen als Fläche einer Zelltransformation auftritt (P. T. Peeples, An in vitro focus induction assay for xenotropic murine leukemia virus, feline leukemia virus C, and the feline Primate viruses RI-114/CCC/M-7, Virology 1975;67:288 - 91). Der Virustiter wurde auch durch die Induktion in Zellen des viralen Kernstrukturproteins (Seite 30) durch Immunofluoreszenz gemessen (vgl. J. A. Levy, Xenotropic type C viruses, Current Topics Microbiol. Immunol. 1978;79:111 - 212). Die Verwendung dieser Versuche zur Bestimmung von Mäuse C-Virus in Experimenten mit Plasmafraktionen wurde von uns bereits beschrieben (vgl. J. A. Levy et al, Recovery and inactivation of infectious retroviruses added to factor VIII concentrates, Lancet 1984;ii:722 - 723, und J. A. Levy et al, Inactivation by wet and dry heat of AIDS-associated retroviruses during factor VIII purification from plasma, Lancet 1985;i:1456 - 1457).
• LAV wurde von den Centers for Disease Control (CDC) in Atlanta, Georgia kultiviert und erhalten. Seine Bestimmung basierte auf einem früher beschriebenen Sandwich-Enzym gebundenen Immunoassay (ELISA) (vgl. J. S. McDougal et al, Immunoassay for the detection and quantitation of infectious human retrovirus, lymphadenopathy-associated virus [LAV], J. Immunol. Methods 1985;76:171 - 183).
• Proben menschlichen Plasmas wurden mit retroviralen Zusammensetzungen beimpft (spiked) und gemäß der klassischen Cohn-Oncley-Verfahren mit kaltem Ethanol fraktioniert (vgl. E. J. Cohn et al, Preparation and properties of serum and plasma proteins, IV. A system for the separation into fractions of protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids, J. Am. Chem. Soc. 1946;68:459 - 75, und J. L. Oncley et al, The separation of the antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen, and beta-l-lipoprotein into subfractions of human plasma, J. Am. Chem. Soc. 1949;71-541 - 50). Die Fraktionierung wurde durch selektive Fällungen in der Kälte bei verschiedenen Ethanolkonzentrationen und pH-Werten durchgeführt: Fraktion I bei 8 % Ethanol, -2ºC, pH = 7,4; Fraktion II+III bei 21 % Ethanol, -5ºC, pH = 6,7; Fraktion II+IIIw bei 20 % Ethanol, -5ºC, pH = 6,5; Fraktion III bei 18 % Ethanol, -6ºC, pH = 5,4, und Fraktion II wurde bei 25 % Ethanol, -10ºC, pH = 7,2 gesammelt. Die verbleibenden retroviralen Konzentrationen wurden quer durch die Fraktionierungsstufen bestimmt. Die Wirkungen des pH-Wertes (Bereich 5,4 bis 4,0) und der Temperatur (Bereich von -5ºC bis 22ºC) auf die Virusinfektivität in Gegenwart von Ethanol (ca 18 %) wurde mit dem Filtrat III bestimmt. Flüssige Immunoglobulin-Zusammensetzungen im Endbehälter wurden in Abwesenheit von Ethanol mit Retrovirus-Konzentraten bei 27ºC und 45ºC inkubiert; die Virus-Infektivität wurde bei verschiedenen Zeitperioden bestimmt.
• Die Infektivität von Maus C und AIDS-Retrovirus wurde durch die Zugabe dieser Viren zu menschlichem Plasma bei ≤ 5ºC nicht beeinflußt. Vergleiche Tabelle 1. Tabelle 1: Wirkung von Immunoglobulin-Fraktionierungsverfahren auf dem Plasma zugegebenes infektiöses Retrovirus Lagerung Maus Typ C (Gesamt IP) AIDS-Virus LAV (Gesamt ID&sub5;&sub0;) Virus allein Virus + Plasma Filtrat III Fraktion II nicht bestimmbar
• Für die beschriebenen Fraktionierungsuntersuchungen wurden 20 ml des Viruskonzentrates zu 200 ml Plasma zugegeben. Die Fraktionierungsmethoden und viralen Untersuchungen werden im Text beschrieben. Gesamt-IP = Gesamtzahl infektiöser Teilchen. Gesamt ID&sub5;&sub0; = ID&sub5;&sub0; (Reziprokwert der Verdünnung, bei der 50 % der Kulturen positiv sind) x Volumen.
• Vom Plasma zur Fraktion II+IIIw wurde nicht mehr als die zehnfache Verringerung des Virustiters beobachtet. Die Zusammensetzung des Filtrats III aus der Fraktion II+IIIw ergab eine ungefähr 10000-fache Verringerung des Maus Typ C-Retrovirus und eine zehnfache Verringerung von LAV. Aufgrund der Verdünnung verringerte sich die Ethanolkonzentration im Laufe dieser Fraktionierungsstufe von 20 % V/V auf 18 % V/V, und der pH-Wert wurde von 6,50 auf 5,40 verringert. Der Niederschlag der Fraktion II aus dem Filtrat III ergab eine > 1000-fache Verringerung im Titer der infektiösen Maus- und menschlichen Retroviren. Während dieser Fraktionierungsstufe wurde der pH-Wert auf 7,25 erhöht, und die Ethanolkonzentration stieg auf 25 %. Die 1.000-fache Verringerung der Virus-Infektivität resultiert in erster Linie aus der Virus-Inaktivierung (nicht Fraktionierung), da nach extensiver Dialyse in dem der Fraktion II entsprechenden Überstand kein infektiöser Virus meßbar war (die Daten sind nicht gezeigt).
• Zur genaueren Untersuchung der Wirkung des pH-Wertes und der Temperatur auf die Retroviren-Inaktivierung mit 18 % Ethanol wurde eine Menge des Mäuse-Retrovirus mit dem Filtrat III gemischt. Siehe Tabelle II. Tabelle 2: Wirkung des pH-Wertes und der Temperatur auf zum Filtrat III zugegebenen Maus Typ C Retrovirus (18 % Ethanol) Temperatur Probe (GesamtIP) Virus allein Virus + Filtrat III nicht bestimmbar Die Gesamtzahl der infektiösen Teilchen wurde wie unter Materialen und Methoden beschrieben bestimmt. Die Bestimmungsgrenze betrug ca. 10-0,2 IP/m. 2 ml Maus Typ C-Viruskonzentrat wurden für (a), (b) und (c) zu 20 ml des Effluens III zugegeben. 10 ml und 5 ml Maus Typ C-Virus wurden für (d) bzw. (e) zu 100 ml und 50 ml des Effluens III zugegeben.
• Im pH-Bereich von 5,4 bis 4,0 wurde bis zu 6 h (2a, b, c) bei -5ºC keine signifikante viruzide Wirkung beobachtet. Bei 22ºC (Umgebungstemperatur) wurden jedoch bei pH = 4,0 > 100.000 infektiöse Maus-Retrovirusteilchen nach 3 h (2e) inaktiviert. Im Gegensatz dazu wurde bei pH = 5,4 unter ähnlichen Bedingungen keine signifikante viruzide Wirkung beobachtet (2d). Auf ähnliche Weise wurden 1,7 x 10³ Gesamt-ID&sub5;&sub0; von LAV, die in einer Filtrat III-Lösung bei pH = 4,0 vorhanden war, die bei +5ºC 18 h lang gehalten wurde, im Titer auf einen nicht bestimmbaren Gehalt (die Daten sind nicht angegeben) verringert. Es scheint deshalb, daß die Gegenwart von 18 % Ethanol in Plasmafraktionen bei pH = 5,4 für diese Viren im Temperaturbereich von -5ºC bis 22ºC nicht merkbar viruzid ist. Nur wenn der pH-Wert gleichzeitig mit einer Erhöhung der Temperatur (≥5ºC) verringert wird (pH = 4,0), wird eine signifikante Virus-Inaktivierung beobachtet. Für LAV waren die folgenden Bedingungen für eine 1000-fache Verringerung im infektiösen Virus ausreichend: Ethanol 18 %, pH = 4,0, Temperatur +5ºC, Zeit 18 h (die Daten sind nicht angegeben). Für den Maus Typ C-Retrovirus wurde unter ähnlichen Behandlungsbedingungen eine > 10000-fache Verringerung gemessen. Um die Wirkung des pH-Wertes und der Temperatur auf das Endprodukt an AIDS-Virus zu bestimmen, wurden die flüssigen Immunoglobulin-Zusammensetzungen des Endbehälters (Proteinkonzentration 5 % Gew./Vol.) mit LAV inkubiert (Tabelle 3). Bei 27ºC wurden für die Immunoglobulin-Zusammensetzungen sowohl ,bei pH = 6,8 als auch bei pH = 4,25 während 3 Tagen zwischen 10³ -10&sup4; der Gesamt-ID&sub5;&sub0; inaktiviert. Bei 45ºC wurden innerhalb von 8 h bei einem pH-Wert von 6,8 der Immunoglobulin-Zusammensetzung > 10.000 infektiöse Teilchen inaktiviert. Die Immunoglobulin-Zusammensetzung bei pH =4,25 wurde bei 45ºC nicht getestet.
• Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Wirkung der verwendeten Verfahren der Immunoglobulin-Fraktionierung auf infektiöse Retroviren zu bestimmen. Die Werte sind wichtig für die Bewertung des möglichen Risikos einer AIDS-Virus-Kontaminierung einiger Ig-Zusammensetzungen. Es wurden sowohl das Maus Typ C-Retrovirus als auch der LAV-Stamm von AIDS-Virus verwendet, weil das erstere auf einen sehr hohen Titer gezüchtet werden kann und deshalb die Wirkung verschiedener Verfahren besser bewertet werden können. Darüber hinaus erlaubt eine fokussierende Untersuchung des Mäuse-Virus eine genauere Quantifizierung.
• Im Gegensatz zu der Komplement-vermittelten Lyse vieler Retroviren im menschlichen Serum bei 37ºC (vgl. R. M. Welsh et al, Human serum lysis RNA tumor viruses, Nature 1975;257:612 - 14) wird das AIDS-Virus in der Kälte (0 - 5ºC) durch diesen Mechanismus nicht beeinflußt (vgl. B. Banapour et al, The AIDS-associated retrovirus is not sensitive to lysis or inactivation by human serum, Virology [in press] 1986). Die angegebenen viruziden Wirkungen von Ethanol auf LAV bezogen sich auf Raumtemperatur (vgl. B. Spire et al, Inactivation of lymphadenopathy associated virus by chemical disinfectants, Lancet 1984;ii:899 - 901, und L. S. Martin et al, Disinfection and inactivation of human T lymphotropic virus type III/lymphadenopathy associated virus, J. Infec. Dis. 1985;152:400-403), während die hier angegebenen Werte zeigen, daß diese Virus-inaktivierenden Wirkungen in Gegenwart von Plasma bei niederen Temperaturen (< 5ºC) verringert werden. Es wird eine erhöhte Inaktivierung bei niedrigem pH-Wert gezeigt, die wieder stark von der Temperatur abhängig ist. Diese Beobachtung stimmt mit einem früheren Bericht überein (vgl. L. S. Martin et al, Disinfection and inactivation of human T lymphotropic virus type III/lymphadenopathy associated virus, J. Infec. Dis. 1985;152:400-403), was eine erhöhte Inaktivierung von LAV-Impfstoff (inoculum) bei extremen pH-Werten anzeigt.
• Das Filtrat III mit 18 % Ethanol bei einem pH-Wert von 5,4 und einer Temperatur von -5ºC war für Retroviren während eines verlängerten Zeitraums nicht signifikant viruzid. Die 100000-fache Verringerung des Maus Typ C-Virus und eine 100-fache Verringerung von LAV vom Plasma zum Filtrat III ist deshalb wahrscheinlich in erster Linie von der Fraktionierung unter den Verfahrensbedingungen (Ethanolbereich 0 bis 20 % V/V, pH-Bereich 7,4 - 5,4), durchgeführt bei -5ºC, abhängig. Die Differenz in der Verringerung zwischen dem Maus- und dem menschlichen Virus reflektiert entweder eine größere Widerstandsfähigkeit des AIDS-Virus gegenüber den Verfahrensbedingungen oder eine geringere quantitative Untersuchung dieses Virus. Wie vorstehend angegeben, kann das Mäuse-Virus bis zu hohen Titern gezüchtet werden, und seine Untersuchung ist sehr reproduzierbar. Seine Brauchbarkeit für Fraktionierungs/Inaktivierungs-Untersuchungen wurde von uns bereits früher berichtet (vgl. J. A. Levy et al, Recovery and inactivation of infectious retroviruses added to factor VIII concentrates, Lancet 1984;ii:722 - 723 and J. A. Levy et al, Inactivation by wet and dry heat of AIDS-associated retroviruses during factor VIII purification from plasma, Lancet 1985;i:1456 - 1457).
• Für die Fraktion II-Fällung wird die Ethanolkonzentration auf 25 % V/V bei pH = 7,20 erhöht, was zu einer mehr als 1000-fach Inaktivierung des Maus Typ C-Virus und von LAV führt. Da das entsprechende Effluens frei war von infektiösem Virus, handelt es sich bei der 25 % Ethanol-Konzentration sehr wahrscheinlich um eine echte Inaktivierung. Ein Bericht aus neuerer Zeit (vgl. D. Piszkiewicz et al, Inactivation of HTLV-III/LAV during Plasma fractionation, Lancet 1985;ii:1188 - 89) zeigte während der Fällung von I+II+III (Ethanol 20 % V/V, pH = 6,9, Temperatur -5ºC) unter den Bedingungen, bei denen die Fraktion II+III zusammen mit der Fraktion I ausgefällt wird, eine Inaktivierung von 104,5 ID&sub5;&sub0; des AIDS-Retrovirus. Unsere Ergebnisse, die diese Fraktionen getrennt isolieren, zeigen keine solche vollständige LAV-Inaktivierung unter ähnlichen Bedingungen (Tabelle 1). In unserer Untersuchung wurden die Proben in PBS vor der ID&sub5;&sub0;-Untersuchung extensiv dialysiert. In dem anderen Bericht wurde in der Untersuchung eine 1:10-Verdünnung auf eine resultierende restliche Ethanolkonzentration von 2 % V/V verwendet. Außerdem ist es aus dem anderen Bericht nicht möglich, zu unterscheiden, ob der Virustiter in der Ausfällung oder in dem der I+II+III-Fällung folgenden Überstand bestimmt wurde; ein aussagekräftiger Vergleich zwischen den zwei Untersuchungen ist deshalb schwierig durchzuführen.
• Nach seiner Inkubation mit gereinigten flüssigen Immunoglobulin-Zusammensetzungen bei 27ºC wahrend 3 Tagen ergab sich eine mehr als 1000-fache Verringerung in der AIDS-Virusinfektivität; der pH-Wert der gereinigten Immunoglobulin-Zusammensetzungen schien keine merkliche Wirkung zu besitzen. Eine höhere Inkubationstemperatur (45ºC) zeigte eine vergleichbare Titerverringerung innerhalb von 8 h. Eine "schlechter Fall" ("worse case")-Einschatzung von 2000 ID/ml an AIDS-Virus in einem großem Plasmapool wurde berichtet (vgl. J. C. Petricciani et al, Case for concluding that heat-treated, licensed antihaemophilic factor is free from HTLV-III, Lancet 1985;ii:890 - 891). Die Ausbeute an IgG könnte so gering sein wie 50 % der im Plasma vorhandenen Menge zusammen mit dem IgG-Konzentrationsanstieg von ca 1 g/100 ml im Plasma auf 5 g/100 ml in einem gereinigten Produkt. Wenn das AIDS-Virus ohne Verringerung der Infektivität zusammen mit der IgG-Reinigung konzentriert würde, würde das gereinigte IgG 2000 ID/ml x 10 (2 x 10&sup4; ID/ml) enthalten. Immunoglobulin- Reinigungsverfahren müssen deshalb dazu fähig sein, 2 x 10&sup4; ID-ml AIDS-Virus zu fraktionieren/inaktivieren. Keine einzige Stufe im Cohn-Verfahren mit kaltem Ethanol kann Retroviren vollständig inaktivieren. Die Wirkungen der Fraktionierung und Inaktivierung während der Fraktionierungskaskade können zusammengenommen ziemlich groß sein. Die LAV-Rückgewinnung vom Plasma zur Fraktion II wird um mindestens das 100000-fache verringert; eine pH-Einstellung auf 4,0 beim Filtrat III (bei +5ºC) ist für die virale Inaktivierung genauso wirksam wie die Ausfällung von Fraktion II in Gegenwart von 25 % Ethanol. Ein zusätzlicher Sicherheitsfaktor wird bereitgestellt, wenn die Endzusammensetzung in flüssiger Form bei 27ºC inkubiert wird, weil diese Experimente zeigten, daß in flüssigen Immunoglobulin-Zusammensetzungen innerhalb von 3 Tagen unter diesen Bedingungen eine 1000- bis 10000-fache Verringerung von LAV auftrat. Prince et al, Effect of Cohn fractionation conditions on infectivity of the AIDS virus, N. Eng.J. Med 1986;314:386 - 87, haben vorgeschlagen, daß die lange Lagerung von flüssigen Immunoserumglobulin-Zusammensetzungen zu ihrer Sicherheit beitragen könnte. Die hier dargestellten Untersuchungen bestätigen experimentell, daß AIDS-Viren tatsächlich während einer flüssigen Lagerung inaktiviert werden (vgl. Tabelle 3). Tabelle 3: Wirkung des pH-Wertes und der Temperatur auf zu flüssigen Immunoglobulin-Zusammensetzungen im Endbehälter zugefügtem LAV Temperatur Probe (Gesamt ID&sub5;&sub0;) Virus + IgG Tage nicht bestimmbar ID&sub5;&sub0; von LAV entspricht der in Tabelle 1 angegebenen Definition. ID&sub5;&sub0;-Bestimmungsgrenze 101,0. Für jeden der zwei Teile des Experimentes wurden 1,5 ml einer LAV-Zusammensetzung zu 15 ml IgG-Lösung zugegeben.
• Die Chance für einen infektiösen Retrovirus, diese Fraktionierung sowie die Lagerung der flüssigen Endzusammensetzung zu überleben ist deshalb, wenn überhaupt, extrem gering.
• Die hier berichteten Ergebnisse der Fraktionierung/Inaktivierung und Inkubierung des Endbehälters stützt die verfügbare klinische und epidemiologische Aussage, daß therapeutische Immunoglobuline, die nach dem Cohn-Oncley-Verfahren mit kaltem Ethanol (&ge; 18 % V/V Ethanol, pH &le; 5,4 beim Filtrat III) keine AIDS-Viren übertragen, insbesondere nach einer Lagerung bei einem pH-Wert von 4,25 bei einer Temperatur von 27ºC während ca. 3 Tagen oder bei einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 45ºC während mindestens 8 Stunden. Die Bedingungen des Cohn-Oncley- Verfahrens, d. h. die Alkoholkonzentration, der pH-Wert, die Temperatur, inaktivieren eigenständig AIDS-Viren nicht, wie dies kürzlich von Prince et al, Effect of Cohn fractionation conditions on infectivity of the AIDS virus, N. Eng. J. Med. 1986;314:386 - 87, berichtet wurde. Wie beschrieben, war ihre Untersuchung in erster Linie auf die Bestimmung der Inaktivierung gerichtet, und es wurde keine nachfolgende Fraktionierung mit Viren durchgeführt. Im Gegensatz dazu ahmt die vorliegende Untersuchung ein echtes Fraktionierungsverfahren nach und stellt deshalb eine realistische Einschätzung der Virusübertragung dar, die die Gesamtsumme von Fraktionierung und Inaktivierung umfaßt.
• Wichtig ist es, hervorzuheben, daß Veränderungen der klassischen Cohn-Methode im Hinblick auf ihr viruzides und Virus-Verteilungs-Potential bestätigt werden müssen, da die Fraktionierung, die Ethanolkonzentration, der pH-Wert, und die Temperatur alle eine wichtige Rolle bei der Virus-Rückgewinnung spielen. Es ist möglich, daß die gesamte Verringerung verschiedener Viren verschieden sein könnte und es deshalb schwierig sein würde, die Ergebnisse dieser Virus-Rückgewinnung für andere Viren zu verallgemeinern.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung eines Immunoserumglobulins, das im wesentlichen frei ist von infektiösen Retroviren, umfassend die Stufen von

(1) Herstellung eines Immunoserumglobulins aus einer menschlichen Plasmaquelle unter Verwendung eines Verfahrens mit kaltem Ethanol mit einem pH-Wert von gleich oder weniger als ca. 5,4, und dann

(2) Lagerung des Globulins bei einem pH von gleich oder weniger als ca. 4,25 bei einer Temperatur von ca. 27ºC während mindestens ca. 3 Tagen.

2. Verfahren zur Herstellung eines Immunoserumglobulins, das im wesentlichen frei ist von infektiösen Retroviren, umfassend die Stufen von

(1) Herstellung eines Immunoserumglobulins aus einer menschlichen Plasmaquelle unter Verwendung eines Verfahrens mit kaltem Ethanol bei einem pH-Wert von gleich oder weniger als ca. 5,4, und dann

(2) Lagerung des Globulins bei einem pH-Wert von gleich oder kleiner als ca. 6,8 und einer Temperatur von ca. 45ºC während mindestens ca. 8 Stunden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Retrovirus der mit Acquired Immune Deficiency Syndrome assoziierte LAV-Stamm ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ethanolkonzentration mindestens ca. 18 % V/V beträgt.

5. ISG-Zusammensetzung, die im wesentlichen frei ist von infektiösen Retroviren, hergestellt gemäß dem Verfahren der Ansprüche 1 und 2.

6. ISG-Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine intravenöse Verabreichung geeignet ist.

7. ISG-Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Kohlehydrat-Stabilisator enthält.

8. ISG-Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Kohlehydrat Maltose ist.

9. ISG-Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Maltosemenge ca. 10 % (Gewicht/Volumen) beträgt.