DE3687542T2 - MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN PROTEIN C. - Google Patents
MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN PROTEIN C.Info
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Description
Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper gegen menschliches Protein C, ein Hybridom, das den monoklonalen Antikörper erzeugt, ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers aus dem Hybridom und ein Verfahren zur Bestimmung oder Abtrennung von menschlichem Protein C durch Verwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem monoklonalen Antikörper und Protein C.The invention relates to a monoclonal antibody against human protein C, a hybridoma producing the monoclonal antibody, a method for producing the monoclonal antibody from the hybridoma and a method for determining or separating human protein C by using an antigen-antibody reaction between the monoclonal antibody and protein C.
Protein C, das jüngst Interesse als Kontrollfaktor bei den Gerinnungs- und fibrinolytischen Systemen erregte, ist ein Vitamin-K-abhängiges Plasmaprotein eines der γ-carboxyglutaminsäure (Gla)-haltigen Proteine und zeigt bekanntlich eine starke antikoagulierende Wirkung und eine die Fibrinolyse fördernde Wirkung [siehe Kisiel, et al., Biochemistry, 16, 5824-5831 (1977); und P.C. Comp & C.T. Esmon; J. Clin. Invest., 68, 1221-1228 (L977)].Protein C, which has recently attracted interest as a control factor in the coagulation and fibrinolytic systems, is a vitamin K-dependent plasma protein of one of the γ-carboxyglutamic acid (Gla)-containing proteins and is known to exhibit potent anticoagulant activity and fibrinolysis-promoting activity [see Kisiel, et al., Biochemistry, 16, 5824-5831 (1977); and P.C. Comp & C.T. Esmon; J. Clin. Invest., 68, 1221-1228 (L977)].
Menschliches Protein C wird in der Leber erzeugt. Es ist das Produkt der γ-Carboxylierung von Glutaminsäure (Glu), die in der Nachbarschaft des aminoterminalen Endes eines Vorläufers von menschlichem Protein C, der in der Leber gebildet wird, zu Gla (γ-Carboxyglutaminsäure) in Gegenwart von Vitamin K. Das entstandene menschliche Protein C wird danach in das Blut sezerniert. Im Blut liegt der Hauptteil davon als eine zweikettige Struktur, bestehend aus einer L-Kette mit einem Molekulargewicht von 21.000 und einer H-Kette mit einem Molekulargewicht von 41.000 vor und besitzt eine Gla-Domäne, die 9 Gla-Reste am aminoterminalen Ende der L-Kette besitzt.Human protein C is produced in the liver. It is the product of the γ-carboxylation of glutamic acid (Glu) in the vicinity of the amino-terminal end of a precursor of human protein C produced in the liver to Gla (γ-carboxyglutamic acid) in the presence of vitamin K. The resulting human protein C is then secreted into the blood. In the blood, the majority of it exists as a two-chain structure consisting of an L chain with a molecular weight of 21,000 and an H chain with a molecular weight of 41,000 and has a Gla domain containing 9 Gla residues at the amino-terminal end of the L chain.
Es ist bekannt, daß die Gla-Domäne eine calciumbindende Stelle besitzt, und wenn ein Calciumion (Ca&spplus;&spplus;) an diese Stelle bindet, verändert das Protein C seine Konformation, und diese Veränderung ist wichtig zur in vivo Manifestierung einer Wirkung (siehe N.L. Esmon et al.: J. Bil. Chem., 258, 5548-5553 (1983)].It is known that the Gla domain has a calcium-binding site, and when a calcium ion (Ca+) binds to this site, protein C changes its conformation, and this change is important for the in vivo manifestation of an effect (see N.L. Esmon et al.: J. Bil. Chem., 258, 5548-5553 (1983)].
Wenn Vitamin K im Mangel vorhanden ist oder ein Vitamin K-Antagonist (Warfarin, Dicumarol, etc.) verabreicht wird, findet die γ-Carboxylierung des Vorläufers des menschlichen Proteins C nicht statt. In diesem Fall wird das Glu in der Nachbarschaft des aminoterminalen Endes des Vorläufers des menschlichen Proteins C nicht zu Gla umgewandelt, sondern in das Blut sezerniert. Ein solches in das Blut sezerniertes Protein, das die gleiche Struktur wie der Vorläufer des menschlichen Proteins C besitzt, wird als PIVKA-PC abgekürzt, was Protein C als Protein, induziert durch die Abwesenheit von Vitamin H oder Vitamin K-Antagonisten bedeutet. Da PIVKA-PC keine vollständige Gla-Domäne wie in Protein C besitzt, kommt es nicht vollständig zur Gla-abhängigen Veränderung in der sterischen Struktur selbst in Anwesenheit eines Calciumions (Ca&spplus;&spplus;), und dieses Molekül ist nicht biologisch aktiv. Aus diesem Grund wird PIVKA-PC als abnormales Protein in einem lebenden Organismus behandelt. Es war bisher kein Verfahren zur unterscheidenden Messung oder Bestimmung von PIVKA-PC und Protein C mit einer Gla-Domäne unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers verfügbar.When vitamin K is deficient or a vitamin K antagonist (warfarin, dicumarol, etc.) is administered, γ-carboxylation of the human protein C precursor does not occur. In this case, the Glu in the vicinity of the amino-terminal end of the human protein C precursor is not converted to Gla, but is secreted into the blood. Such a protein secreted into the blood, which has the same structure as the human protein C precursor, is abbreviated as PIVKA-PC, which means protein C as protein, induced by the absence of vitamin H or vitamin K antagonists. Since PIVKA-PC does not possess a complete Gla domain as in protein C, the Gla-dependent change in steric structure does not fully occur even in the presence of a calcium ion (Ca⁺⁺), and this molecule is not biologically active. For this reason, PIVKA-PC is treated as an abnormal protein in a living organism. No method has been available to discriminately measure or determine PIVKA-PC and protein C with a Gla domain using a monoclonal antibody.
Da menschliches Protein C eine kurze Halbwertszeit in einem lebenden Organismus besitzt, neigen die Wirkungen des Fehlens von Vitamin H und die Verabreichung eines Vitamin K-Antagonisten dazu, sich früh zu zeigen. Ferner besitzt Protein C im Gegensatz zu anderen Gla-haltigen Koagulationsfaktoren (Prothrombin, FVIII, FIV und FX), die auf das Ablaufen der Gerinnung einwirken, die Wirkung, die Gerinnung zu inhibieren. Daher wird die unterscheidende Bestimmung von PIVKA-PC und normalem Protein C ein sehr nützlicher Parameter zur Bestimmung des Zustands, in dem Vitamin H abwesend oder defekt ist oder der Wirkungen der Verabreichung eines Vitamin H-Antagonisten (wie Warfarin und Dicumarol).Since human protein C has a short half-life in a living organism, the effects of vitamin H deficiency and the administration of a vitamin K antagonist tend to manifest early. Furthermore, unlike other Gla-containing coagulation factors (prothrombin, FVIII, FIV and FX) that act on the course of coagulation, protein C has the effect of inhibiting coagulation. Therefore, the discriminatory determination of PIVKA-PC and normal protein C becomes a very useful parameter for determining the state in which vitamin H is absent or defective or the effects of the administration of a vitamin H antagonist (such as warfarin and dicumarol).
Andererseits gewannen jüngst monoklonale Antikörper weite Akzeptanz bei der Analyse der Funktion und Struktur eines antigenen Proteins oder in einem Immunoassay, wie einem Enzymimmunoassay (E.I.A.) oder Radioimmunoassay (RIA), weil sie den Vorteil besitzen, für eine einzige antigene Determinante spezifisch zu sein, und Antikörper mit der gleichen Spezifität können stabil erzeugt werden. Für die funktionelle Analyse und die molekulare Analyse eines antigenen Proteins wird es ein effektives Mittel sein, einen Antikörper herauszufinden, der eine an der Funktion des antigenen Proteins beteiligte Stelle oder eine spezielle Strukturstelle erkennt.On the other hand, monoclonal antibodies have recently gained wide acceptance in the analysis of the function and structure of an antigenic protein or in an immunoassay such as enzyme immunoassay (EIA) or radioimmunoassay (RIA) because they have the advantage of being specific to a single antigenic determinant and antibodies with the same specificity can be stably generated. For the functional analysis and molecular analysis of an antigenic protein, it will be an effective means to find out an antibody that recognizes a site involved in the function of the antigenic protein or a specific structural site.
Monoklonale Antikörper gegen menschliches Protein C als antigenes Protein wurden bereits vorgeschlagen (Blood & Vessel, 1984, Bd. 15, Nr. 2, S. 171-174; J. Biochem., Bd. 97, Nr. 1, 1985, S. 127-138; und offengelegte japanische Patentpublikation Nr. 120.825/1985). Diese Druckschriften beschreiben insgesamt 13 monoklonale Antikörper gegen menschliches Protein C. Sechs davon binden an die L-Kette von Protein C, fünf an die H-Kette von Protein C und zwei erkennen eine Region zwischen der L- Kette und der H-Kette von Proten C. J. Biochem, Bd. 97, Nr. 1, 1985, S. 127-138 stellt am Ende fest: "Von den erzeugten, vorliegenden Antikörpern konnten einige konformationsspezifische Antikörper gegen die metallionenabhängige Struktur des Proteins sein." Dies ist jedoch eine Spekulation, und diese Druckschrift beschreibt nicht die Tatsache, daß solche konformationsspezifischen Antikörper tatsächlich erhalten wurden. Eine derartige Tatsache wurde anschließend auch nie beschrieben.Monoclonal antibodies against human protein C as an antigenic protein have been proposed (Blood & Vessel, 1984, Vol. 15, No. 2, pp. 171-174; J. Biochem., Vol. 97, No. 1, 1985, pp. 127-138; and Japanese Patent Laid-Open Publication No. 120,825/1985). These references describe a total of 13 monoclonal antibodies against human protein C. Six of them bind to the L chain of protein C, five to the H chain of protein C, and two recognize a region between the L chain and the H chain of protein C. J. Biochem, Vol. 97, No. 1, 1985, pp. 127-138 concludes: "Of the antibodies generated, the present could be some conformation-specific antibodies against the metal ion-dependent structure of the protein." However, this is speculation, and this paper does not report the fact that such conformation-specific antibodies were actually obtained. Such a fact was never subsequently reported.
Zusätzlich sind die Bindungsstellen der obigen 13 monoklonalen Antikörper gegen menschliches Protein C Stellen, die Protein C und PIVKA- PC gemeinsam sind. Folglich können mit diesen monoklonalen Antikörpern Protein C und PIVKA-PC nicht unterscheidend gemessen oder bestimmt werden.In addition, the binding sites of the above 13 monoclonal antibodies against human protein C are sites common to protein C and PIVKA-PC. Consequently, these monoclonal antibodies cannot discriminately measure or determine protein C and PIVKA-PC.
Die WO-A-8 501 941 betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Proteins aus einem Gemisch, das das Protein enthält, wobei bei diesem Verfahren ein auf einem festen Träger immobilisierter Antikörper bereitgestellt wird, der mit dem Protein, das mit einem Liganden komplexiert ist, reaktiv ist und im wesentlichen unreaktiv gegenüber dem mit dem Liganden nicht komplexierten Protein ist und gegen den immobilisierten Antikörper gerichtet ist, mit dem er einen Immunkomplex bildet, und der Immunkomplex mit einer Verbindung in Kontakt gebracht wird, die eine Bindungsaffinität für den Liganden besitzt, die größer als die Bindungsaffinität des Proteins für den Liganden ist, um das Protein aus dem immobilisierten Antikörper freizusetzen.WO-A-8 501 941 relates to a process for isolating a protein from a mixture containing the protein, which process comprises providing an antibody immobilized on a solid support which is reactive with the protein complexed with a ligand and substantially unreactive with the protein not complexed with the ligand and directed against the immobilized antibody with which it forms an immune complex, and contacting the immune complex with a compound having a binding affinity for the ligand greater than the binding affinity of the protein for the ligand to release the protein from the immobilized antibody.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen monoklonalen Antikörper gegen menschliches Protein C bereitzustellen.It is therefore an object of the present invention to provide a novel monoclonal antibody against human protein C.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen menschliches Protein C, der spezifisch menschliches Protein C in der Gla-Domäne erkennt.Another object of this invention is to provide a monoclonal antibody against human protein C that specifically recognizes human protein C in the Gla domain.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen menschliches Protein C, der spezifisch menschliches Protein C in der Gla-Domäne erkennt, die eine Konformationsänderung durch ein Calciumion vollzogen hat.Another object of this invention is to provide a monoclonal antibody against human protein C that specifically recognizes human protein C in the Gla domain that has undergone a conformational change by a calcium ion.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen menschliches Protein C, der unterscheidbar Protein C und PIVKA-PC ohne vollständige Gla-Domäne wie in Protein C erkennen kann.Another object of this invention is to provide a monoclonal antibody against human protein C that can distinguishably recognize protein C and PIVKA-PC without the complete Gla domain as in protein C.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Hybridoms, das den zuvor erwähnten, erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erzeugt.Another object of this invention is to provide a hybridoma that produces the aforementioned monoclonal antibody of the invention.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Abtrennung und Gewinnung des monoklonalen Antikörpers aus dem Produkt des vorstehend erwähnten Hybridoms.Another object of this invention is to provide a process for separating and recovering the monoclonal antibody from the product of the above-mentioned hybridoma.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von menschlichem Protein C, bei dem man den Gehalt an menschlichem Protein C in einem Gemisch mit menschlichem Protein C über eine Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers bestimmt.Another object of this invention is to provide a method for determining human protein C, in which the content of human protein C in a mixture containing human protein C is determined via an antigen-antibody reaction using the monoclonal antibody according to the invention.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Einfangen von menschlichem Protein C dadurch, daß man ein Gemisch, das das menschliche Protein C enthält, mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in Bindung an einen unlöslichen Träger unter Verwendung der Eigenschaft des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers spezifisch menschliches Protein C, das das Calciumion bindet, zu erkennen, in Kontakt bringt.Another object of this invention is to provide a method for capturing human protein C by contacting a mixture containing the human protein C with the monoclonal antibody of the invention bound to an insoluble carrier using the property of the monoclonal antibody of the invention to specifically recognize human protein C which binds the calcium ion.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.Further objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description.
Erfindungsgemäß werden die obigen Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung erstens durch einen monoklonalen Antikörper gegen menschliches Protein C, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er a) menschliches Protein C, das kein Calciumion an der Gla-Domäne bindet, nicht erkennt, und b) menschliches Protein C, das ein Calciumion an der Gla-Domäne bindet, erkennt, erreicht.According to the invention, the above objects and advantages of this invention are achieved, first, by a monoclonal antibody against human protein C, characterized in that it a) does not recognize human protein C that does not bind a calcium ion to the Gla domain, and b) recognizes human protein C that binds a calcium ion to the Gla domain.
Erfindungsgemäß kann der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper gegen menschliches Protein C durch Abtrennen und Gewinnen eines monoklonalen Antikörpers gegen menschliches Protein C aus dem Produkt eines Hybridoms, das einen monoklonalen Antikörper gegen menschliches Protein C, der a) menschliches Protein C, das kein Calciumion an der Gla-Domäne bindet, nicht erkennt, und b) menschliches Protein C, das ein Calciumion an der Gla-Domäne bindet, erkennt, erzeugen kann, gebildet werden.According to the invention, the monoclonal antibody against human protein C of the invention can be produced by separating and recovering a monoclonal antibody against human protein C from the product of a hybridoma capable of producing a monoclonal antibody against human protein C which a) does not recognize human protein C which does not bind a calcium ion to the Gla domain and b) recognizes human protein C which binds a calcium ion to the Gla domain.
Erfindungsgemäß wird auch das vorstehend erwähnte Hybridom und ein Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung des Hybridoms bereitgestellt.According to the invention, there are also provided the above-mentioned hybridoma and a method for producing a monoclonal antibody using the hybridoma.
Die Hybridomazellen, die den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erzeugen können, können nach einem Verfahren, das als das Kohler- Milstein-Verfahren bekannt ist [Kohler & Milstein: Nature, 256, 495-497 (1975)] erzeugt werden. Genauer, Mäuse werden mit menschlichem Protein C immunisiert, und die Milzzellen werden den immunisierten Mäusen entnommen. Die Milzzellen werden dann mit Mausmyelomazellen fusioniert. Die entstandenen Hybridomazellen werden systematisch untersucht und gegen eine Antikörperreaktion mit menschlichem Protein C, fixiert an Mikrotiterplatten, abgesucht. Die Untersuchung wird sowohl in Anwesenheit eines Calciumions (Ca&spplus;&spplus;), als auch in Abwesenheit eines Calciumions durchgeführt. Durch Auswählen dieser Hybridomazellen, die sich als positiv nur in der zuerst genannten Reaktion in Anwesenheit eines Calciumions erwiesen, werden ausgewählt und isoliert. Diese Hybridomazellen synthetisieren und sezernieren den gewünschten Antikörper.The hybridoma cells capable of producing the monoclonal antibody of the present invention can be produced by a method known as the Kohler-Milstein method [Kohler & Milstein: Nature, 256, 495-497 (1975)]. More specifically, mice are infected with human protein C immunized and the spleen cells are removed from the immunized mice. The spleen cells are then fused with mouse myeloma cells. The resulting hybridoma cells are systematically examined and screened against an antibody reaction with human protein C fixed to microtiter plates. The examination is carried out both in the presence of a calcium ion (Ca⁺⁺) and in the absence of a calcium ion. By selecting those hybridoma cells which are found to be positive only in the former reaction in the presence of a calcium ion are selected and isolated. These hybridoma cells synthesize and secrete the desired antibody.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper wird aus einem Produkt, das von diesen neuen Hybridomazellen gebildet wird, erzeugt und wirkt monospezifisch auf eine spezifische antigene Determinante auf dem menschlichen Protein C-Molekül in Anwesenheit eines Calciumions.The monoclonal antibody of the invention is generated from a product formed by these new hybridoma cells and acts monospecifically on a specific antigenic determinant on the human protein C molecule in the presence of a calcium ion.
Ein spezifisches Verfahren zur Erzeugung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers wird nun näher erläutert.A specific method for producing the monoclonal antibody of the invention will now be explained in more detail.
Menschliches Protein C, das als Antigen verwendet wird, wird aus menschlichem Plasma isoliert und nach dem Verfahren von Suzuki et al., [J. Biol. Chem., 258, 1914-1920 (1983)] gereinigt.Human protein C, used as an antigen, is isolated from human plasma and purified according to the method of Suzuki et al., [J. Biol. Chem., 258, 1914-1920 (1983)].
Weibliche Balb/C-Mäuse können verwendet werden, aber Mäuse von anderen Stämmen können auch verwendet werden. Das Immunisierungsschema und die Konzentration an menschlichem Protein C sollten so ausgewählt werden, daß sich eine ausreichende Menge antigen-stimulierter Lymphocyten bildet. Beispielsweise wird eine Maus intraperitoneal mit 50 ug menschlichem Protein C dreimal in 2-wöchigen Intervallen immunisiert, und schließlich werden 30 ug menschliches Protein C intravenös verabreicht. Mehrere Tage nach der abschließenden Immunisierung werden die Milzzellen aus dem Tier zur Fusion extrahiert.Female Balb/C mice can be used, but mice from other strains can also be used. The immunization schedule and the concentration of human protein C should be selected to produce a sufficient amount of antigen-stimulated lymphocytes. For example, a mouse is immunized intraperitoneally with 50 µg of human protein C three times at 2-week intervals, and finally 30 µg of human protein C is administered intravenously. Several days after the final immunization, spleen cells are extracted from the animal for fusion.
Die Milz wurde aseptisch der immunisierten Maus entnommen, und eine Suspension der Milzzellen wurde hergestellt. Die Milzzellen werden mit Mausmyelomazellen aus einer geeigneten Zellinie in Anwesenheit eines geeigneten Fusionspromotors fusioniert. Das bevorzugte Verhältnis der Milzzellen zu den Myelomazellen beträgt von etwa 20:1 bis etwa 2:1, und ein Fusionsmedium wird geeigneterweise in einer Menge von 0,5 bis 1,5 ml pro etwa 108 Milzzellen verwendet.The spleen was aseptically removed from the immunized mouse and a suspension of the spleen cells was prepared. The spleen cells are fused with mouse myeloma cells from an appropriate cell line in the presence of an appropriate fusion promoter. The preferred ratio of spleen cells to myeloma cells is from about 20:1 to about 2:1 and fusion medium is suitably used in an amount of 0.5 to 1.5 ml per about 108 spleen cells.
Die Mausmyelomazellen, die für die Zellfusion verwendet werden, sind gut bekannt. Bei der vorliegenden Erfindung werden P3-X63-Ag 8-U1- Zellen (P3-U1) [siehe D.E. Yelton et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (L978)] verwendet.The mouse myeloma cells used for cell fusion are well known. The present invention uses P3-X63-Ag 8-U1 cells (P3-U1) [see D.E. Yelton et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (L978)].
Der Fusionspromotor ist bevorzugt Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 bis 4000. Andere auf dem Fachgebiet bekannte Fusionspromotoren können ebenfalls verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt Polyethyienglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1540 verwendet.The fusion promoter is preferably polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 4000. Other fusion promoters known in the art may also be used. In the present invention, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1540 is preferably used.
In einem separaten Behälter (wie beispielsweise einer Mikrotiterplatte) wird ein Gemisch aus den unfusionierten Milzzellen, den unfusionierten Mausmyelomazellen und den fusionierten Hybridomazellen mit einem Selektivmedium, auf dem nicht-fusionierte Mausmyelomazellen nicht wachsen, verdünnt und für eine Zeitspanne, die ausreicht, die nicht-fusionierten Mausmyelomazellen abzutöten (etwa eine Woche), gezüchtet. Ein Kulturmedium mit einer Arzneimittelresistenz (beispielsweise 8-Azaguanin- Resistenz) und das das Wachstum der unfusionierten Mausmyelomazellen nicht fördert, wie beispielsweise ein HAT-Medium, wird verwendet. In dem Selektivmedium sterben die nicht-fusionierten Myelomazellen ab. Da die unfusionierten Milzzellen untransformierte Zellen sind, sterben sie nach einer bestimmten Zeitspanne (eine Woche) ab. Die fusionierten Zellen andererseits können in dem Selektivmedium überleben, da sie sowohl die tumorale Natur der Elternzellen des Myeloms als auch die Natur der elterlichen Milzzellen besitzen.In a separate container (such as a microtiter plate), a mixture of the unfused spleen cells, the unfused mouse myeloma cells and the fused hybridoma cells is diluted with a selective medium on which unfused mouse myeloma cells do not grow and cultured for a period of time sufficient to kill the unfused mouse myeloma cells (about one week). A culture medium having drug resistance (e.g., 8-azaguanine resistance) and which does not promote the growth of the unfused mouse myeloma cells, such as a HAT medium, is used. In the selective medium, the unfused myeloma cells die. Since the unfused spleen cells are untransformed cells, they die after a certain period of time (one week). The fused cells, on the other hand, can survive in the selective medium because they possess both the tumoral nature of the parental myeloma cells and the nature of the parental spleen cells.
Nachdem so die Hybridomazellen detektiert worden sind, werden Proben des Kulturüberstands genommen und auf einen Antikörper gegen menschliches Protein C mittels eines Enzym-linked-immunosorbent-Assay (ELISA) abgesucht. Der Assay wird durch Zugabe von CaCl&sub2; in einer bestimmten Konzentration zu dem Kulturüberstand einer Lösung des enzym-markierten Antikörpers und einer Waschlösung und auch in Abwesenheit von CaCl&sub2; durchgeführt. Durch Selektion werden diejenigen Hybridome, die sich nur in Gegenwart von CaCl&sub2; als positiv erwiesen, ausgewählt. Diese Hybridome erzeugen und sezernieren einen Antikörper, der menschliches Protein C in Abwesenheit eines Calciumions nicht erkennt, aber menschliches Protein C in Anwesenheit eines Calciumions erkennt.After the hybridoma cells have been thus detected, samples of the culture supernatant are taken and screened for an antibody against human protein C by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The assay is carried out by adding CaCl2 at a certain concentration to the culture supernatant of a solution of the enzyme-labeled antibody and a washing solution and also in the absence of CaCl2. By selection, those hybridomas that are found to be positive only in the presence of CaCl2 are selected. These hybridomas produce and secrete an antibody that does not recognize human protein C in the absence of a calcium ion, but recognizes human protein C in the presence of a calcium ion.
Hybridomazellen, die den gewünschten Antikörper erzeugen können, werden nach einem geeigneten Verfahren, wie dem Verfahren der limitierten Verdünnung, kloniert, und der gewünschte Antikörper kann nach den folgenden zwei verschiedenen Verfahren erzeugt werden. Nach einem ersten Verfahren werden die Hybridomazellen in einem geeigneten Medium für eine bestimmte Zeitspanne gezüchtet, und der von den Hybridomazellen erzeugte monoklonale Antikörper kann aus dem Überstand der Kultur isoliert werden. Gemäß einem zweiten Verfahren werden die Hybridomazellen intraperidoneal einer syngenen Maus injiziert. Nach einer bestimmten Zeitspanne kann der von den Hybridomazellen erzeugte monoklonale Antikörper aus dem Blut und der Ascitesflüssigkeit des Wirtstieres isoliert werden.Hybridoma cells capable of producing the desired antibody are cloned by an appropriate method such as the limited dilution method, and the desired antibody can be produced by the following two different methods. According to a first method, the hybridoma cells are cultured in an appropriate medium for a certain period of time, and the monoclonal antibody produced by the hybridoma cells can be isolated from the supernatant of the culture. According to a second method, the hybridoma cells are injected intraperidoneally into a syngeneic mouse. After a certain period of time, the monoclonal antibody produced by the hybridoma cells can be isolated from the blood and ascites fluid of the host animal.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper besitzt, wie oben angegeben, die Eigenschaft, menschliches Protein C in Abwesenheit eines Calciumions (Ca&spplus;&spplus;) nicht zu erkennen, aber spezifisch menschliches Protein C in Anwesenheit eines Calciumions (Ca&spplus;&spplus;) zu erkennen. Unter Verwendung dieser Eigenschaft kann menschliches Protein C leicht aus einem Gemisch, das das menschliche Protein C enthält (beispielsweise menschliches Plasma) abgetrennt werden.As stated above, the monoclonal antibody of the present invention has the property of not recognizing human protein C in the absence of a calcium ion (Ca⁺⁺), but specifically recognizing human protein C in the presence of a calcium ion (Ca⁺⁺). Using this property, human protein C can be easily separated from a mixture containing the human protein C (for example, human plasma).
Zu diesem Zweck wird der monoklonale Antikörper gegen menschliches Protein C zuerst an einen unlöslichen Träger fixiert oder gebunden. Der zu dieser Zeit verwendete unlösliche Träger kann irgendeiner von denen, die üblicherweise als Substrate für Assayreagenzien oder Kits auf der Basis der Verwendung der monoklonalen Antikörper verwendet werden, sein. Beispielsweise kann der unlösliche Träger aus einem Material, wie Sepharose, Polyacrylamid, Cellulose, Dextran, einem Maleinsäurepolymeren oder Gemischen davon, hergestellt sein. Der unlösliche Träger kann in verschiedenen Formen, wie beispielsweise einem Pulver, einem Granulat, Pellets, Kugeln, einem Film oder einer Faser, vorliegen. Im allgemeinen ist es vorteilhaft, Platten mit vielen Vertiefungen (Kavitäten), die für Assays oder zur Abtrennung von Plasma oder dessen fraktionierten Komponenten verwendet werden, zu verwenden.For this purpose, the monoclonal antibody against human protein C is first fixed or bound to an insoluble carrier. The insoluble carrier used at this time may be any of those commonly used as substrates for assay reagents or kits based on the use of the monoclonal antibodies. For example, the insoluble carrier may be made of a material such as Sepharose, polyacrylamide, cellulose, dextran, a maleic acid polymer or mixtures thereof. The insoluble carrier may be in various forms such as a powder, a granule, pellets, beads, a film or a fiber. In general, it is advantageous to use multi-well plates used for assays or for separating plasma or its fractionated components.
Wenn der fixierte monoklonale Antikörper in Kontakt mit einem Gemisch, das menschliches Protein C in Gegenwart eines Calciumions (Ca&spplus;&spplus;) enthält, gebracht wird, wird menschliches Protein C an den fixierten monoklonalen Antikörper gebunden und somit eingefangen.When the fixed monoclonal antibody is in contact with a mixture containing human protein C in the presence of a calcium ion (Ca⁺⁺) containing, human protein C is bound to the fixed monoclonal antibody and thus captured.
Sofern erforderlich, wird das menschliche Protein C, das von dem fixierten monoklonalen Antikörper eingefangen ist, durch Waschen mit einer wäßrigen Lösung, die ein Calciumion zusammen mit dem Träger, an den er fixiert ist, um den Rest des Gemisches zu entfernen, und anschließende Behandlung des fixierten monoklonalen Antikörpers mit einem wäßrigen Medium, das im wesentlichen von Calciumionen frei ist, abgetrennt.If necessary, the human protein C captured by the fixed monoclonal antibody is separated by washing with an aqueous solution containing a calcium ion together with the support to which it is fixed to remove the remainder of the mixture and then treating the fixed monoclonal antibody with an aqueous medium substantially free of calcium ions.
Somit gestattet das erfindungsgemäße Trennverfahren die Entfernung von menschlichem Protein C aus einem Gemisch, das das menschliche Protein C enthält, die Abtrennung von menschlichem Protein aus dem Gemisch und dessen Reinigung und die Bestimmung des Gehalts an menschlichem Protein C in dem Gemisch durch sehr simple Arbeitsschritte. Beispielsweise kann der Gehalt an menschlichem Protein C mit einer Gla-Domäne in einem es enthaltenden Gemisch unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers gegen menschliches Protein C und Induktion einer Antigen- Antikörper-Reaktion zwischen ihnen, bevorzugt in Gegenwart eines Calciumions, bestimmt werden. Ferner kann die Menge an Gla-defizientem Protein C (PIVKA-PC) durch Kombinieren des Gehalts an menschlichem Protein C, bestimmt nach dem obigen Verfahren, mit den Ergebnissen der Messung der Menge des gesamten Proteins C nach einer immunologischen Technik (wie beispielsweise EIA, RIA oder das Laurell-Verfahren) unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der eine Stelle, die keine Beziehung zu der Gla-abhängigen sterischen Strukturveränderung besitzt, eines polyklonalen Antikörpers oder eines Antiserums bestimmt werden.Thus, the separation method according to the invention allows the removal of human protein C from a mixture containing the human protein C, the separation of human protein from the mixture and its purification and the determination of the content of human protein C in the mixture by very simple operations. For example, the content of human protein C having a Gla domain in a mixture containing it can be determined by using the monoclonal antibody against human protein C according to the invention and inducing an antigen-antibody reaction between them, preferably in the presence of a calcium ion. Furthermore, the amount of Gla-deficient protein C (PIVKA-PC) can be determined by combining the content of human protein C determined by the above method with the results of measuring the amount of total protein C by an immunological technique (such as EIA, RIA or the Laurell method) using a monoclonal antibody having a site unrelated to the Gla-dependent steric structure change, a polyclonal antibody or an antiserum.
Die folgenden Beispiele erläutern den Gegenstand der vorliegenden Erfindung genauer. In diesen Beispielen wird Protein C manchmal als PC abgekürzt.The following examples illustrate the subject matter of the present invention in more detail. In these examples, Protein C is sometimes abbreviated as PC.
Zwei weibliche Balb/C-Mäuse (4 Wochen alt) wurden mit gereinigtem, menschlichem PC viermal in 14-tägigen Intervallen immunisiert. Die erste Immunisierung wurde durch intraperitoneale Verabreichung eines Gemisches (Emulsion) aus 50 ug menschlichem PC, aufgelöst in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und einem gleichen Volumen vollständigem Freundschem Adjuvans in einer Menge von 0,5 ml/Kopf an die Mäuse durchgeführt. Die zweiten und dritten Immunisierungen wurden durch intraperitoneale Verabreichung eines Gemisches aus 50 ug menschlichem PC und unvollständigem Freundschem Adjuvans an die Mäuse durchgeführt. Die abschließende Immunisierung wurde durch Verabreichen einer PBS-Lösung aus 30 ug menschlichem PC aus der Schwanzvene der Mäuse durchgeführt. Drei Tage nach der abschließenden Immunisierung wurden die Milzzellen der immunisierten Mäuse zur Zellfusion verwendet.Two female Balb/C mice (4 weeks old) were immunized with purified human PC four times at 14-day intervals. The first immunization was performed by intraperitoneal administration to the mice of a mixture (emulsion) of 50 µg human PC dissolved in phosphate buffered saline (PBS) and an equal volume of complete Freund's adjuvant at a rate of 0.5 ml/head. The second and third immunizations were performed by intraperitoneal administration to the mice of a mixture of 50 µg human PC and incomplete Freund's adjuvant. The final immunization was performed by administering a PBS solution containing 30 µg human PC from the tail vein of mice. Three days after the final immunization, the spleen cells of the immunized mice were used for cell fusion.
Die Milzzellen der immunisierten Mäuse und die Myelomazellen (P3U1) einer Maus des gleichen Stammes wurden in einem Verhältnis von etwa 2:1 bis etwa 15:1 vermischt und in Gegenwart von 50%igem Polyethylenglykol 1540 (ein Produkt von Wako Pure Chemicals, Co., Ltd.) gemäß dem Verfahren nach Kohler und Milstein fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (enthaltend 10% FCS) suspendiert, so daß die Konzentration der Zellen 1·10&sup6; Zellen/ml wurde. Die Suspension wurde in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (Coster) in einer Menge von 100 ul pro Kavität verteilt.The spleen cells of the immunized mice and the myeloma cells (P3U1) of a mouse of the same strain were mixed at a ratio of about 2:1 to about 15:1 and fused in the presence of 50% polyethylene glycol 1540 (a product of Wako Pure Chemicals, Co., Ltd.) according to the method of Kohler and Milstein. The fused cells were suspended in RPMI-1640 medium (containing 10% FCS) so that the concentration of the cells became 1 × 106 cells/ml. The suspension was dispensed into the wells of a 96-well microtiter plate (Coster) in an amount of 100 µl per well.
Die fusionierten Zellen wurden in einem CO&sub2;-Inkubator (5% CO&sub2;, 37ºC) inkubiert. Nach einem Tag wurde ein Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthielt, jeder Kavität zugesetzt, und die Hälfte des Volumens des Mediums in jeder Kavität wurde entfernt, und das HAT-Medium wurde jeder Kavität jeden zweiten oder dritten Tag zugesetzt. Somit wurde auf Hybridomazellen aus den Milzzellen und den Myelomazellen abgesucht.The fused cells were incubated in a CO2 incubator (5% CO2, 37°C). After one day, a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT) was added to each well, and half of the volume of the medium in each well was removed and the HAT medium was added to each well every second or third day. Thus, hybridoma cells from the spleen cells and the myeloma cells were screened.
Der Antikörper in dem Kulturüberstand der Hybridomazellen wurde mittels des ELISA-Verfahrens unter Verwendung einer mit menschlichem PC als Antigen beschichteten Mikrotiterplatte detektiert. Als zweiter Antikörper wurde ein mit alkalischer Phosphatase markierter Kaninchen-Antimaus-IgG-Antikörper verwendet, und um den Unterschied zwischen der Bindung von menschlichem PC an den Antikörper in Gegenwart von Calciumionen und der in Abwesenheit von Calciumionen zu bestimmen, wurde TBS (0,02 M Tris/HCl, 0,14 M NaCl, pH 7,4), enthaltend 5 mM CaCl&sub2;, dem einen Überstand aus einer Kavität zugesetzt, und TBS wurde einem anderen Oberstand aus der gleichen Kavität zugesetzt. Ferner wurde TBS, enthaltend 5 mM CaCl&sub2;, 0,05% Tween 20 /0,02% NaN&sub3; oder TBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN&sub3; als Verdünnungsmittel für den zweiten Antikörper und als Waschpuffer verwendet.The antibody in the culture supernatant of the hybridoma cells was detected by the ELISA method using a microtiter plate coated with human PC as an antigen. As a second antibody, an alkaline phosphatase-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody was used, and to determine the difference between the binding of human PC to the antibody in the presence of calcium ions and that in the absence of calcium ions, TBS (0.02 M Tris/HCl, 0.14 M NaCl, pH 7.4) containing 5 mM CaCl2 was added to one supernatant from one well, and TBS was added to another supernatant from the same well. Further, TBS containing 5 mM CaCl2, 0.05% Tween 20/0.02% NaN3 was added. or TBS/0.05% Tween 20/0.02% NaN3; was used as a diluent for the second antibody and as a wash buffer.
In insgesamt 541 Kavitäten, in denen die fusionierten Zellen ausplattiert waren, wurde die Bildung von Kolonien in 523 Kavitäten beobachtet. Von diesen erwiesen sich 44 Kavitäten als positiv bezüglich der Antikörpererzeugung, wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt ist. 44 Kavitäten zeigten eine Bindung an menschliches PC in Anwesenheit eines Calciumions und 32 Kavitäten zeigten die Bindung an menschliches PL in Abwesenheit eines Calciumions.In a total of 541 wells in which the fused cells were plated, the formation of colonies was observed in 523 wells. Of these, 44 wells were found to be positive for antibody production as shown in Table 1 below. 44 wells showed binding to human PC in the presence of calcium ion and 32 wells showed binding to human PL in the absence of calcium ion.
Diese positiven Kavitäten wurden zweimal nach dem Verfahren der limitierten Verdünnung kloniert. Die entstandenen Klone wurden in 90% FCS-10% DMSO suspendiert und in flüssigem Stickstoff gelagert.These positive wells were cloned twice using the limited dilution method. The resulting clones were suspended in 90% FCS-10% DMSO and stored in liquid nitrogen.
Die von den einzelnen Klonen erzeugten monoklonalen Antikörper wurden in den Bauchhöhlen von Balb/C-Mäusen vermehrt. Menschliches PC wurde aus der Ascitesflüssigkeit der Mäuse isoliert und unter Verwendung einer Protein A-Sepharose 4B-Säule gereinigt.The monoclonal antibodies produced by each clone were propagated in the abdominal cavities of Balb/C mice. Human PC was isolated from the ascites fluid of the mice and purified using a Protein A-Sepharose 4B column.
Anzahl der Kavitäten, in denen die fusionierten Zellen plattiert waren 541Number of wells in which the fused cells were plated 541
Anzahl der Kavitäten, in denen sich Kolonien gebildet hatten 523Number of cavities in which colonies had formed 523
Anzahl der Kavitäten, die Antikörper erzeugten 44Number of wells that produced antibodies 44
Positive Bindung an PC in Anwesenheit von Ca&spplus;&spplus; 44Positive binding to PC in the presence of Ca+&spplus; 44
Positive Bindung an PC in Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus; 32Positive binding to PC in the absence of Ca+&spplus; 32
IgGs der einzelnen aus den Mausascitesflüssigkeiten gereinigten Klone wurden auf Unterklassen, die Wirkung auf die menschliche PC-Aktivität, die Bindungsaktivität an die L-Kette oder H-Kette und die Bindungsaktivität an menschliches PC, dessen Gla-Domäne durch Enzymbehandlung unter Verwendung von α-Chymotrypsin entfernt worden war, untersucht.IgGs of individual clones purified from mouse ascites fluids were examined for subclasses, effect on human PC activity, binding activity to the L chain or H chain, and binding activity to human PC whose Gla domain had been removed by enzyme treatment using α-chymotrypsin.
Die Subklassen wurden nach dem Ouchterlony-Verfahren unter Verwendung von Antimaus-Antisera, die für die einzelnen Klassen spezifisch waren, bestimmt.The subclasses were determined by the Ouchterlony method using antimouse antisera specific for each class.
Die Wirkung auf die menschliche PC-Aktivität wurde durch Vermischen von IgG und menschlichem PC in einem Molverhältnis von 5:1, Inkubieren des Gemisches über Nacht bei 4ºC, Aktivieren von menschlichem PC durch einen Thrombin-Thrombomodulin-Komplex und Messen der menschlichen PC- Aktivität durch Bestimmen der zersetzenden Aktivität eines Synthesesubstrats bestimmt. Als Synthesesubstrat wurde The effect on human PC activity was determined by mixing IgG and human PC in a molar ratio of 5:1, incubating the mixture overnight at 4ºC, activating human PC by a thrombin-thrombomodulin complex and measuring human PC activity by determining the degradative activity of a synthesis substrate. The synthesis substrate used was
(worin Val für optisch aktives D-Valin, Leu für optisch aktives L-Leuzin und Arg für optisch aktives L-Arginin steht; ein Produkt von Kabi Vitrum AB aus Schweden mit der Bezeichnung 5-2266) verwendet.(where Val stands for optically active D-valine, Leu for optically active L-leucine and Arg for optically active L-arginine; a product of Kabi Vitrum AB of Sweden under the designation 5-2266) is used.
Die Bindungsaktivität an die L-Kette oder H-Kette wurde so bestimmt, daß man menschliches PC unter reduzierenden Bedingungen einer Elektrophorese und anschließend einem Immunblotting unter Verwendung einer Nitrocellulosemembran und eines HRP-markierten Ziege-Antimaus-IgGs unterwarf.Binding activity to the L chain or H chain was determined by subjecting human PC to electrophoresis under reducing conditions and then to immunoblotting using a nitrocellulose membrane and HRP-labeled goat anti-mouse IgG.
Das menschliche PC, bei dem die Gla-Domäne entfernt war, wurde durch limitierte Hydrolyse unter Verwendung von α-Chymotrypsin gemäß dem Verfahren nach Esmon et al. [N.L. Esmon et al., J. Bio. Chem., 258, 5548- 5553 (1983)] hergestellt, und durch Immunblotting wurde dessen Bindungsfähigkeit an den Antikörper bestimmt.The human PC with the Gla domain removed was prepared by limited hydrolysis using α-chymotrypsin according to the method of Esmon et al. [N.L. Esmon et al., J. Bio. Chem., 258, 5548-5553 (1983)], and its binding ability to the antibody was determined by immunoblotting.
Die Eigenschaften der Antikörper, die von den sechs Klonen gebildet wurden, sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die calciumionen-abhängigen Antikörper banden alle an die L-Kette, und selbst in Anwesenheit eines Calciumions banden sie nicht an menschliches PC, dessen Gla-Domäne entfernt war. Es wurde gezeigt, daß dieser Antikörper nur dasjenige Human-PC erkannte, das eine Konformationsänderung in Abhängigkeit von der Gla-Domäne durch das an die Gla-Domäne gebundene Calciumion vollzogen hatte. Tabelle 2 Klon Subklasse Epitop auf Protein C (L-Kette oder H-Kette) Ca&spplus;&spplus;-Abhängigkeit Bindung an PC, dessen Gla-Domäne entfernt wurde Wirkung auf die PC-AktivierungThe properties of the antibodies raised by the six clones are summarized in Table 2. The calcium ion-dependent antibodies all bound to the L chain, and even in the presence of a calcium ion they did not bind to human PC whose Gla domain was removed. It was shown that this antibody only recognized human PC that had undergone a conformational change dependent on the Gla domain by the calcium ion bound to the Gla domain. Table 2 Clone Subclass Epitope on protein C (L-chain or H-chain) Ca++ dependence Binding to PC with Gla domain deleted Effect on PC activation
Bestimmung von meschlichem PC in Plasma:Determination of human PC in plasma:
PC wurde nach den folgenden zwei Verfahren des IRMA (Immunoradiometrischer Assay) unter Verwendung von Plasmaproben, die normalen gesunden Personen entnommen worden waren, Plasmaproben, die Patienten mit Protein C-Mangel entnommen worden waren, Plasmaproben, die Patienten mit Lebererkrankung entnommen worden waren und Plasmaproben, die Patienten, die mit Warfarin behandelt wurden, entnommen worden waren, ,bestimmt.PC was determined by the following two IRMA (immunoradiometric assay) methods using plasma samples collected from normal healthy subjects, plasma samples collected from patients with protein C deficiency, plasma samples collected from patients with liver disease, and plasma samples collected from patients treated with warfarin.
Die Plasmaproben und eine Standardplasmaprobe wurden jeweils mit 0,05 M Tris-HCl (pH 7,4)/0,15 M NaCl (TBS), enthaltend 1% BSA, verdünnt und in die Kavitäten einer mit dem Antikörper (6C3), der an die H-Kette von PC binden konnte, beschichteten Mikrotiterplatten, verteilt und mit 1 % BSA blockiert. Die Platte wurde bei 37ºC 3 h lang inkubiert, und die Zellen wurden mit 1% BSA/TBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Ein mit ¹²&sup5;I- markierter calcium-abhängiger PC-Antikörper (7B12), verdünnt mit 1 % BSA/TBS, enthaltend 5 mM CaCl&sub2;, wurde zugesetzt. Die Platte wurde 3 h lang bei 37º C inkubiert, und die Kavitäten wurden mit 1% BSA/TBS/0,05% Tween 20, supplementiert mit 5 mM CaCl&sub2;, gewaschen. Die Kavitäten wurden dann mit einem γ-Zähler ausgemessen.The plasma samples and a standard plasma sample were each diluted with 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4)/0.15 M NaCl (TBS) containing 1% BSA and dispensed into the wells of a microtiter plate coated with the antibody (6C3) capable of binding to the H chain of PC and blocked with 1% BSA. The plate was incubated at 37°C for 3 h and the cells were washed with 1% BSA/TBS/0.05% Tween 20. A 125I-labeled calcium-dependent PC antibody (7B12) diluted with 1% BSA/TBS containing 5 mM CaCl2 was added. The plate was incubated for 3 h at 37ºC and the wells were washed with 1% BSA/TBS/0.05% Tween 20 supplemented with 5 mM CaCl2. The wells were then counted with a γ-counter.
Es wurde wie bei Verfahren A vorgegangen, jedoch mit der Ausnahme, daß der ¹²&sup5;I-markierte Kaninchen-Anti-Human-PC-Antikörper als ¹²&sup5;I- markierter zweiter Antikörper verwendet wurde.The procedure for method A was followed, except that the 125I-labeled rabbit anti-human PC antibody was used as the 125I-labeled second antibody.
Die Meßergebnisse sind in der beigefügten Zeichnung gezeigt. In den normalen gesunden Personen, Patienten mit Protein C-Defizienz und Patienten mit Lebererkrankung entnommenen Plasmaproben entsprachen die nach den Verfahren A und B erhaltenen Meßwerte gut einander, und der Korrelationskoeffizient betrug γ = 0,99. Im Falle der Plasmaproben von den mit Warfarin behandelten Patienten waren die nach dem Verfahren A erhaltenen Meßwerte niedriger als die nach dem Verfahren B erhaltenen. Dies zeigt, daß Gla-defizientes PC (PIVKA-PC), das keine Konformationsveränderung in Abhängigkeit von Gla, selbst in Anwesenheit eines Calciumions, vollzogen hatte, in das Blut sezerniert wurde. Die Menge des Gla-defizienten PCs (PIVKA-PC) kann als Unterschied zwischen den zwei Meßwerten, die nach den Verfahren A und B erhalten wurden, genommen werden.The measurement results are shown in the accompanying drawing. In the plasma samples taken from normal healthy individuals, patients with protein C deficiency and patients with liver disease, the measured values obtained by methods A and B were in good agreement with each other and the correlation coefficient was γ = 0.99. In the case of the plasma samples from the patients treated with warfarin, the measured values obtained by method A were lower than those obtained by method B. This shows that Gla-deficient PC (PIVKA-PC) which had not undergone any conformational change depending on Gla even in the presence of calcium ion was secreted into the blood. The amount of Gla-deficient PC (PIVKA-PC) can be taken as the difference between the two measured values obtained by methods A and B.
In der Zeichnung stehen Kreise für die Meßwerte der Proben von den normalen gesunden Personen, Quadrate für die Meßwerte der Proben von den Patienten mit Lebererkrankung und Dreiecke für die Meßwerte der Proben von Patienten mit Protein C-Defizienz; die schwarzen Kreise stehen für die Meßwerte der Proben von mit Warfarin behandelten Patienten.In the drawing, circles represent the measured values of the samples from normal healthy people, squares represent the measured values of the samples from the patients with liver disease and triangles for the measured values of the samples from patients with protein C deficiency; the black circles represent the measured values of the samples from patients treated with warfarin.
Messung der Menge an PC-Antigen vor und nach Verabreichung von Warfarin:Measurement of the amount of PC antigen before and after administration of warfarin:
Protein C in Plasmaproben, die vor und nach der Verabreichung von Warfarin entnommen worden waren, wurden nach den gleichen zwei Verfahren A und B wie in Beispiel 3 gemessen.Protein C in plasma samples collected before and after administration of warfarin was measured by the same two methods A and B as in Example 3.
Tabelle 3 zeigt die Meßergebnisse in beiden Fällen. In den beiden Fällen lag die Menge an Protein C vor der Verabreichung von Warfarin im normalen Bereich, und die Meßwerte nach den zwei Verfahren A und B entsprachen einander gut. Aber nach der Verabreichung von Warfarin nahm der Protein C-Gehalt deutlich ab. Die Menge an mit dem Verfahren A gemessenen PC nach Verabreichung betrug die Hälfte der nach dem Verfahren B gemessenen oder weniger. Dies zeigt, daß die Verabreichung von Warfarin, die Menge an Protein C, die in das Blut sezerniert wird, erniedrig, und das Gla-defiziente Protein C (PIVKA-PC) wurde sezerniert. Tabelle 3 Menge des PC-Antigens vor und nach Verabreichung von Warfarin Warfarin-Therapie Verfahren A Gla-normales-PC Verfahren B Gesamt-PC Probe 1 vorher nachher Probe 2Table 3 shows the measurement results in both cases. In both cases, the amount of protein C before administration of warfarin was within the normal range, and the measured values by the two methods A and B were in good agreement with each other. But after administration of warfarin, the protein C content decreased significantly. The amount of PC measured by method A after administration was half of that measured by method B or less. This indicates that administration of warfarin decreased the amount of protein C secreted into the blood, and Gla-deficient protein C (PIVKA-PC) was secreted. Table 3 Amount of PC antigen before and after administration of warfarin Warfarin therapy Procedure A Gla-normal PC Procedure B Total PC Sample 1 before after Sample 2
0,5 g eines trockenen Gels aus Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals), welches mit Bromcyan aktiviert worden war, wurde gequollen und mit 100 ml 1 mM HCl auf einem G3-Glasfilter gewaschen und weiter mit einem Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO&sub3;, enthaltend 0,5 M NaCl, pH 8,3) gewaschen. Nach Entfernen des Kopplungspuffers durch Absaugen wurde das Gel unmittelbar mit 2 ml einer Antikörperlösung (6H2) in einem Kopplungspuffer (3 mg/ml) versetzt und suspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei 4ºC sanft geschüttelt. Das Gel wurde dann in 1 M Ethanolamin- HCl (pH 8,0, 2 ml) überführt und 2 h lang bei Raumtemperatur geschüttelt, um die verbleibenden aktiven Stellen zu blockieren. Nach der Blockierung wurde das Antikörper gekoppelte Sepharosegel alternierend mit 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,0), enthaltend 0,5 M NaCl, und 0,1 M Boratpuffer (pH 8,0), enthaltend 0,5 M NaCl, auf einem Glasfilter gewaschen. Wenn die Absorption des Filtrats bei 280 nm weniger als 0,01 erreichte, wurde es mit 5 mM CaCl&sub2; und 0,05 M Tris-HCl (pH 7,4) äquilibriert und in eine Säule gepackt. Eine Affinitätschromatografie wurde unter Verwendung des monoklonalen Anti-Human-PC-Antikörpers (6H2) in Kopplung an die so hergestellte Sepharose 4B-Säule durchgeführt.0.5 g of a dry gel of Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia Fine Chemicals) activated with cyanogen bromide was swollen and washed with 100 ml of 1 mM HCl on a G3 glass filter and further treated with a coupling buffer (0.1 M NaHCO₃ containing 0.5 M NaCl, pH 8.3). After removing the coupling buffer by aspiration, the gel was immediately added with 2 ml of an antibody solution (6H2) in a coupling buffer (3 mg/ml) and suspended. The suspension was gently shaken overnight at 4°C. The gel was then transferred to 1 M ethanolamine-HCl (pH 8.0, 2 ml) and shaken for 2 h at room temperature to block the remaining active sites. After blocking, the antibody-coupled Sepharose gel was washed alternately with 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) containing 0.5 M NaCl and 0.1 M borate buffer (pH 8.0) containing 0.5 M NaCl on a glass filter. When the absorbance of the filtrate at 280 nm became less than 0.01, it was washed with 5 mM CaCl2. and 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) and packed into a column. Affinity chromatography was performed using the monoclonal anti-human PC antibody (6H2) coupled to the as-prepared Sepharose 4B column.
8 ml einer 1 M BaCl&sub2;-Lösung wurden zu 100 ml eines Human-Plasmas gegeben, und das Gemisch wurde 1 h lang bei 4ºC gerührt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen und mit 0,1 M NaCl, enthaltend 5 mM BACl&sub2; und 5 mM Benzamidin, gewaschen und dann in 0,2 M EDTA (pH 7,4), enthaltend 15 ml 5 mM Benzamidin, um eine barium-adsorbierte Fraktion zu erhalten, aufgelöst. Die barium-adsorbierte Fraktion wurde gegen 0,05 M Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1 mM Benzamidin, dialysiert, und eine CaCl&sub2;-Lösung wurde zugesetzt, so daß die Endkonzentration 5 mM erreichte. Das Gemisch wurde auf eine Antikörper (6H2) gekoppelte Säule, die mit 0,05 M Tris-HCl, enthaltend 5 mM CaCl&sub2; und 1 mM Benzamidin, äquilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit 0,05 M Tris-HCl, enthaltend 5 mM CaCl&sub2;, 1 mM Benzamidin und 1 M NaCl, gewaschen und mit 0,05 M Tris-HCl, enthaltend 50 mM EDTA und 1 mM Benzamidin, eluiert. Ein einziger PC-haltiger Peak wurde erhalten. PC in der Fraktion eluierte von dem Antikörper-Sepharose 4B und wurde in einem Ausmaß von dem 52-fachen der in der barium-adsorbierten Fraktion gereinigt, und das Wiedergewinnungsverhältnis von PC betrug etwa 48,2%.8 ml of a 1 M BaCl2 solution was added to 100 ml of a human plasma, and the mixture was stirred at 4°C for 1 hour. The precipitate was recovered by centrifugation and washed with 0.1 M NaCl containing 5 mM BACl2 and 5 mM benzamidine, and then dissolved in 0.2 M EDTA (pH 7.4) containing 15 ml of 5 mM benzamidine to obtain a barium-adsorbed fraction. The barium-adsorbed fraction was dialyzed against 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) containing 1 mM benzamidine, and a CaCl2 solution was added so that the final concentration reached 5 mM. The mixture was loaded onto an antibody (6H2)-coupled column equilibrated with 0.05 M Tris-HCl containing 5 mM CaCl2 and 1 mM benzamidine. The column was washed with 0.05 M Tris-HCl containing 5 mM CaCl2, 1 mM benzamidine and 1 M NaCl and eluted with 0.05 M Tris-HCl containing 50 mM EDTA and 1 mM benzamidine. A single peak containing PC was obtained. PC in the fraction eluted from the antibody-Sepharose 4B was purified to an extent of 52 times that in the barium-adsorbed fraction, and the recovery ratio of PC was about 48.2%.
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