DE3631038A1 - Verfahren und vorrichtung zur messung des rotationsspektrums dielektrischer objekte - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, um das Rotationsverhalten dielektrischer Körper im rotierenden Hochfrequenzfeld (im folgenden als ELEKTROROTATION bezeichnet) schnell und EDV-gerecht zu messen. Dabei handelt es sich um die Analyse von technischen und biologischen Objekten (makroskopische Körper sowie Suspensionen von Partikeln und biologischen Strukturen). Die Elektrorotation ist eine zerstörungsfreie Methode, die Aussagen über die Natur und Beschaffenheit der untersuchten Körper und ihre Oberfläche erlaubt.

Die Methode der Elektrorotation läßt sich zur Charakterisierung dielektrischer Eigenschaften technischer und biologischer Objekte einsetzen. Erste Darstellungen der Methode datieren bereits in die 20-ger Jahre (Lertes, ZS für Physik 4 (1921) 315 und 6 (1921) 56). Der technische Einsatz der Elektrorotation ist bereits in Patenten fixiert (Arnold u. Zimmermann DE 33 25 843 A1, DE 33 25 860 A1, Fuhr und Glaser WPG 01N/ 2 55 322.5, Mathies et al. WPG 01N/2 76 901.4). Durch Publikationen ist der Einsatz dieser Methode vor allem auf biologischem Gebiet nachgewiesen (ARNOLD, W. M., WENDT, B., ZIMMERMANN, U., KORENSTEIN, R., BBA 831 (1985) 117; ARNOLD, W. M., ZIMMERMANN, U., Z. Naturforsch. 37c (1982) 908; FUHR, G., (1985) Dissertation, Humboldt-Universität, Berlin; GLASER, R., FUHR, G., in: BLANK, M. (Ed.) Electric Double Layers in Biology, Plenum Press New York, 1985; GLASER, R., FUHR, G., GIMSA, J., studia biophysica 102 (1985) 11; LOVELACE, R. V. E., STOUT, D G., STEPONKUS, P. L., J. Membrane Biol. 82 (1984) 175; MISCHEL, M., POHL, H. A., J. Biol. Physics 11 (1983) 98; POHL, H., Intern. J. Quant. Chem. 10 (1983) 161)

Bei den bisher üblichen Methoden wird die Winkelgeschwindigkeit der Zellen, bzw. die Rotation R (Winkelgeschwindigkeit/Quadrat der Feldstärke) als Funktion der applizierten Frequenz des rotierenden Feldes durch mikroskopische Beobachtung mit Hilfe einer Stoppuhr gemessen. Im Patent Arnold u. Zimmermann (DE 33 25 843 A1) wird bereits eine Kompensationsmethode beschrieben, die eine schnellere Messung erlaubt. In diesem Patent wird vorgeschlagen, die Resonanzfrequenz (f) eines Objektes, d. h. die Frequenz maximaler Rotation, durch Applikation zweier rotierender Felder entgegengesetzten Drehsinnes mit den beiden Frequenzen (f · n) und (f/n) durch schnelles Umtasten dieser Felder im Verhältnis 1 : 1 zu bestimmen. Auf diese Weise könnte schnell und bequem die Resonanzfrequenz für Objekte bestimmt werden, die sich wie einschalige Kugeln verhalten.

In dem Patent von Arnold u. Zimmermann wird ferner vorgeschlagen, Objekte verschiedener dielektrischer Eigenschaften dadurch zu unterscheiden, daß bei Anlegen des umtastbaren Feldes bei einer bestimmten Frequenz (f), Objekte der einen Art zum Stillstand gebracht werden können, während die anderen noch rotieren. Das soll die Unterscheidung lebender von toten Zellen ermöglichen bzw. erlauben, den Anteil abgetöteter Zellen zu bestimmen. Eigene Untersuchungen an komplexen Objekten, vor allem an mehrschichtigen biologischen Zellen haben jedoch gezeigt, daß für eine genaue Bestimmung der gesuchten Objektparameter eine einfache Registrierung der Frequenz maximaler Rotation nicht ausreicht. Es muß für eine gezielte Untersuchung insbesondere biologischer Objekte vielmehr der gesamte Kurvenverlauf der Rotation als Funktion der Frequenz des applizierten elektrischen Feldes gemessen werden. Die von Arnold und Zimmermann vorgeschlagene Messung der Resonanzfrequenz (f1) ist bei komplizierter strukturierten Objekten nur als grober Näherung sinnvoll.

Ziel der Erfindung ist die schnelle und sichere Vermessung des gesamten Rotationsspektrums als Funktion der Frequenz zur gezielten Untersuchung dielektrischer, insbesondere biologischer Objekte. Dabei soll die Auswertung vereinfacht und ein EDV- gerechter Parameter ermittelt werden.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Messung des Rotationsspektrums dielektrischer Objekte im rotierenden Hochfrequenzfeld durch Vermessung des gesamten Kurvenverlaufs der Rotation als Funktion der Frequenz des applizierten elektrischen Feldes mittels einer Kompensationsmethode. Dies ist insbesondere bei mehrschaligen Objekten, wie Protoplasten und vielen tierischen Zellen, notwendig.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß bei jeder zu messenden Frequenz das Objekt durch Kompensation in eine bestimmte Winkelgeschwindigkeit versetzt wird und zur Ermittlung der gesamten Funktion R(f) Parameter ausgewertet werden, durch deren Variation diese Winkelgeschwindigkeit erzielt wurde.

Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Meßprinzips kann z. B. jeder Frequenz als Parameter, das Verhältnis der Einschaltzeiten von zwei Kompensationsfeldern, oder bei vorgegebenem Einschaltzeitverhältnis der beiden Frequenzen der Abstand zur zweiten Frequenz zugeordnet werden, der notwendig ist, um das Messobjekt mit einer bestimmten Winkelgeschwindigkeit zu versehen. Aus diesen Parametern kann dann leicht die Funktion R(f) bestimmt werden. Die somit erhaltenen Parameter können auch mit Hilfe eines Mikrorechners ausgewertet werden. Erfindungsgemäß wird die Winkelgeschwindigkeit des untersuchten Objekts durch eine Kompensationsschaltung auf einen vorgegebenen Wert, bzw. auf ein Vielfaches dieses vorgegebenen Wertes, oder auf den Wert 0 gebracht.

Zur Auswertung der Rotation werden die meßtechnisch leicht erfaßbaren Parameter der Kompensationsanordnung, die zur Erfüllung der oben genannten Bedingungen führen, herangezogen. Voraussetzung für die Messungen sind:
1. Eine Meßkammer bestehend aus mindestens 3 Elektroden.
2. Mindestens ein Generator variabler Frequenz bzw. mehrere Generatoren fester Frequenz, oder beides.
3. Eine Schaltungsanordnung, die in der Lage ist, in der Meßkammer aus den durch den oder die Generatoren bereitgestellten Spannungen rotierende Felder mit den zu untersuchenden Frequenzen und erforderlichen Drehrichtungen zu erzeugen.
4. Die Schaltung muß das Schalten von einer bzw. das Umschalten zwischen zwei oder mehreren Frequenzen erlauben. Bei Verwendung von 6 oder mehr Elektroden kann eine Kompensation auch durch das gleichzeitige Erzeugen der Kompensationsfelder über zwei oder mehr Elektrodensätze und direkte Überlagerung in der Meßkammer erreicht werden.

Im folgenden sollen die Merkmale der Erfindung am Beispiel der Variation der Schaltzeiten bei fixierten Amplitudenwerten (d. h. Feldstärken) der Felder erläutert werden.

Die Messungen werden in einer 4-Elektroden-Kammer durchgeführt. Durch eine elektronische Schaltung ist es möglich, in der Meßkammer abwechselnd zwei rotierende Felder gleicher Feldstärke zu erzeugen, die auf das Objekt ein entgegengesetztes Drehmoment ausüben. Die Frequenzen der Felder und das Verhältnis der Einschaltzeiten lassen sich variieren (siehe auch Fig. 1). Das Ziel ist es, die gesamte Funktion R(f) mit einer Kompensationsmethode zu erfassen.

Dabei kann folgendes Meßprinzip angewandt werden: Zunächst wird eine Bezugsfrequenz gewählt, die mit möglichst großem Drehmoment das zu messende Objekt in Bewegung setzt. Dies könnte z. B. die Frequenz maximaler Rotation (fc) sein. Im folgenden wird diese Bezugsfrequenz wechselweise mit einer variablen Frequenz (Meßfrequenz) appliziert, derart, daß dadurch der Drehsinn des Meßobjektes in schneller Folge wechselt. Die Einschaltzeiten (t1, t2) beider Frequenzen sind so bemessen, daß entsprechend der mechanischen Trägheit des Objektes optisch lediglich die Resultierende aus beiden Drehmomenten auf das Objekt sichtbar wird. Durch manuelle Regulation oder durch den Steuerbefehl eines automatischen Bildauswerte-Gerätes wird die Relation der Einschaltzeiten beider Frequenzen zueinander so lange variiert bis die resultierende Rotation gleich Null wird, d. h., das untersuchte Objekt nicht mehr rotiert. Dies bedeutet, daß die Wirkung beider Felder, d. h., das Produkt aus Rotations-Energie und Einschaltzeit gleich ist. Dieser Zustand vollständiger gegenseitiger Kompensation der Rotationswirkung durch die Felder kann ausgewertet werden: Ein völliger Stillstand des Objektes wird erreicht, wenn gilt:

t1 · R1 = t2 · R2

(wobei gelten soll:
R1 = Rotation des Objektes bei der Bezugsfrequenz,
R2 = Rotation des Objektes bei der Meßfrequenz.)

Ist R1, sowie das Verhältnis t1/t2 bekannt, so ergibt sich:

R2 = R1 · t1 : t2

In Fig. 1 ist das Blockschaltbild dieses Gerätes dargestellt. Die Frequenzen (f) der Generatoren (1) und (2) sind durchstimmbar. Mit dem Schalter S 1 kann wahlweise die Frequenz von Generator (1) oder (2) zur Phasenaufspaltung Baugruppe (3) für die 4 Elektroden der Meßkammer (5) weitergeleitet werden. Der Schalter S 2 bewirkt eine Umkehr des Drehsinns des elektrischen Feldes in der Kammer. Für die Ermittlung der Funktion R(f) wird der Generator für die Bezugsfrequenz (1) auf eine Frequenz eingestellt, bei der das zu untersuchende Objekt verhältnismäßig schnell rotiert (Bezugsfrequenz). Jetzt kann der andere Generator (2) auf die gewünschte Meßfrequenz eingestellt werden. Es ist zu beachten, ob bei dieser Frequenz der Drehsinn des Objektes dem der zuvor festgelegten Bezugsfrequenz entspricht. Trifft dies zu, so muß bei der nachfolgenden Messung der Schalter S 2 gleichzeitig mit S 1 umgeschaltet werden. Das Tastverhältnis wird entweder automatisch oder mit Hand über die Steuerung (4) festgelegt. Für die Ermittlung der Funktion R(f) ist das Tastverhältnis von S 1 bei einjustiertem Stillstand des Objektes zu registrieren.

Ausführungsbeispiele:

Zur Illustration des Funktionsprinzips des Gerätes sei das Elektrorotationsspektrum eines mehrschichtigen Objektes mit einem Aufbau entsprechend Fig. 2 demonstriert. Es handelt sich demzufolge um eine Elektrolytphase (1), die von einer kugelförmigen Schale andersartiger dielektrischer Eigenschaften (2) umgeben ist. Diese wiederum befinde sich konzentrisch in einem weiteren Elektrolytraum (3), der seinerseits durch die Phase (4) kugelförmig begrenzt ist. Das zu untersuchende Objekt befindet sich in einer Meßlösung, deren dielektrische Parameter durch den Index e gekennzeichnet sind.

Die dielektrischen Eigenschaften eines solchen Modells werden durch die Dielektrizitätskonstanten (DK), Leitfähigkeiten (G) und Radien (R) bzw. Schichtdicken (d) festgelegt.

Überträgt man das Modell auf einen pflanzlichen Protoplasten mit zentraler Vacuole, so lassen sich diese physikalischen Größen folgendermaßen zuordnen:

Fig. 3 demonstriert den theoretisch berechneten Verlauf eines Elektrorotationsspektrums eines solchen Objektes bei unterschiedlichen Werten der äußeren Leitfähigkeit. Es ist ersichtlich, daß eine Variation der äußeren Leitfähigkeit nicht nur die Position der Kurve sondern darüber hinaus auch deren Form verändert.

Es wurden folgende Werte als fest angenommen:

Variiert wurde die Leitfähigkeit des äußeren Mediums (Ge): ---- = 3 mS/m, - - - - = 10 mS/m.

In Fig. 4 sind Meßpunkte dargestellt, die an einem Brassica oleracea Protoplasten im niederfrequenten Bereich des Rotationsspektrums gewonnen wurden. Der Durchmesser der Zelle betrug 22 um, die Leitfähigkeit des äußeren Mediums 8.6 mS/m und die Feldstärke 3240 V/m.

Bei der Frequenz f1 (Bezugsfrequenz) tritt die Rotation R1 und bei der Frequenz f2 die Rotation R2 auf. Das erfindungsgemäße Meßprinzip erlaubt es nun, die Funktion R(f) wie folgt zu bestimmen. Es wird zunächst die Bezugsfrequenz f1 in der Nähe des Rotationsmaximums festgelegt (100 KHz). Die Meßfrequenz soll z. B. 10 KHz betragen. Der Drehsinn des Objektes ist bei beiden Frequenzen gleich. Der Drehsinn des applizierten Feldes muß also zusammen mit den Frequenzen geschaltet werden (siehe Fig. 1). Bei Verwendung des Prinzips der Variation der Schaltzeit bei konstanter Feldstärke ergibt sich die Rotation des Objektes bei der Meßfrequenz nach der oben angegebenen Formel. Auf diese Weise kann Punkt für Punkt der Kurve durch Beibehaltung der Bezugsfrequenz und Variation der Meßfrequenz bestimmt werden.

Zur einfachen Unterscheidung von Objekten mit einem Rotationsspektrum, das einer einschaligen Kugel entspricht von solchen mit komplizierterem Verlauf, sowie für die Analyse eines solchen Objektes kann auch folgendes, bereits erwähnte Verfahren angewendet werden: In diesem Falle ist das Verhältnis der Einschaltzeiten der beiden Felder fixiert (z. B. gleich). Beide Felder sind so geschaltet, daß sie auf das Objekt ein gegensinnig wirkendes Drehmoment ausüben. Die Kompensation erfolgt jetzt durch Variation der Frequenzen. Sind die Kompensationsbedingungen erfüllt, d. h. zeigt das Objekt keine Rotation mehr, dann kann eine mittlere Frequenz (logarithmischer Mittelwert) bestimmt werden. Der Abstand beider Frequenzen zueinander wird nun verändert und das Verfahren wiederholt. Bei einem Rotationsspektrum einer einschaligen Kugel sind die Mittelfrequenzen jeweils gleich. Eine Veränderung der Mittelfrequenzen bei Variation des Frequenzabstandes zeugt von einem komplizierteren Rotationsspektrum.

Aus den gemessenen Mittelfrequenzen kann mit Hilfe eines Rechners die dielektrische Eigenschaft des untersuchten Objektes ermittelt werden. (Das Blockschaltbild einer solchen Anordnung entspricht der von Fig. 1, wobei die Baugruppe (2) z. B. ein durch die Steuerung programmierbarer Teiler für die durch den Generator (1) erzeugte Frequenz sein könnte.)

Beide hier dargestellten Meßmethoden lassen sich kombinieren.

Claims (9)

1. Verfahren zur Messung des Rotationsspektrums von dielektrischen Körpern, insbesondere biologischer Objekte wie einzelne Zellen beziehungsweise Zell- oder Partikelaggregate in einem rotierenden elektrischen Feld durch Messung des gesamten Kurvenverlaufs der Rotation als Funktion der Frequenz des applizierten elektrischen Feldes mit Hilfe einer Kompensationsmethode, dadurch gekennzeichnet, daß bei jeder zu messenden Frequenz das Objekt durch Kompensation in eine bestimmte Winkelgeschwindigkeit oder den Stillstand versetzt wird und zur Ermittlung des gesamten Rotationsspektrums Parameter ausgewertet werden, durch deren Variation diese Winkelgeschwindigkeit erzielt wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kriterium für die Festlegung der Parameter zur Ermittlung des Rotationsspektrums der dielektrischen Körper entweder der Stillstand des Körpers im rotierenden Feld oder eine festgelegte Konstante Winkelgeschwindigkeit oder ein Vielfaches oder ein Bruchteil der selben oder die Umkehrung des Drehsinnes oder einer Kombination der genannten Kriterien dient.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anwendung eines rotierenden Feldes dieses periodisch zugeschaltet wird, daß bei Anwendung von zwei oder mehreren Feldern diese gleichzeitig, nacheinander oder periodisch zugeschaltet werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die dielektrischen Körper und ihre Winkelgeschwindigkeit und die Kreisfrequenz des / der rotierenden Felder, oder / und deren Amplitudenänderungen, Anschaltzeiten, Impulsformen, aus denen sich die Felder zusammensetzen, gemessen werden können und so Parameter bestimmt werden, deren Auswertung das Rotationsspektrum der dielektrischen Körper ergibt.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß in kontinuierlich oder / und diskontinuierlich rotierenden Feldern gearbeitet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kompensation durch Variation der Impulslänge und oder der Form der Einzelspannungsverläufe, aus denen sich das oder die rotierenden Felder zusammensetzen oder / und Variation der Amplitude dieser Spannungen oder / und bei periodischer Zuschaltung des / der rotierenden Felder durch Variation der Dauer der Feldeinwirkungszeit zwei oder mehreren Feldern erreicht wird und die Messung der variierten Parameter zur Ermittlung des Rotationsspektrums führt.

7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß gleiche oder verschiedene Impulse oder periodische Spannungen wie Sinus-, Dreieck-, Rechteck- oder andere Spannungsverläufe zur Erzeugung der Felder verwendet werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung der Meßgröße oder Meßgrößen über ein Videosystem erfolgt und die Meßwertbehandlung rechner- oder mikroprozessorgesteuert erfolgt und zur Darstellung beziehungsweise sofortigen Auswertung des Rotationsspektrums führt.

9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Generator, der in der Frequenz variabel ist oder eine genügend große Anzahl von Generatoren beziehungsweise Teilern Spannungen verschiedener Frequenzen bereitstellen, die über eine durch eine Steuerteil gesteuerte Umschaltlogik an eine Baugruppe zur Phasenaufspaltung angeschlossen sind, die zur Erzeugung eines rotierenden Feldes in einer Meßkammer aus mindestens drei Elektroden die entsprechende Phasenverschiebung erzeugt, wobei an dieser Baugruppe durch die Steuerung der Richtungssinn des rotierenden Feldes umgekehrt werden kann.