DE3522610C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung für die Behandlung von Zellen im elektrischen Feld mit zwei Elektroden, die im Bereich einer Zone des für die die Zellen enthaltende Suspen­ sion von außen zugänglichen Raumes gleichblei­ bende Abstände zueinander aufweisen.

Eine Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art ist aus der DE-OS 33 17 415 bekannt. Bei dieser bekannten Vorrichtung wird der zur Aufnahme der Zellsuspension vorgesehene Raum durch einen zy­ linderförmigen Innenkörper und einen diesen um­ gebenden Außenkörper gebildet. Die beiden Elek­ troden umgeben den Innenkörper in Form einer mehrgängigen Schraube, so daß die Zone, innerhalb der die Zellen dem elektrischen Feld ausgesetzt werden, als den Innenkörper in Form einer mehr­ gängigen Schraube umgebenden Teilbereich ausge­ bildet ist. Diese Ausführungsform der Vorrich­ tung bietet zwar die Möglichkeit, eine sehr gros­ se Zahl von Zellen zugleich einer elektrischen Behandlung zu unterziehen. Ein gewisser Nachteil besteht dabei jedoch darin, daß konstruktions­ bedingt nicht alle in der Zone befindlichen Zel­ len der gleichen elektrischen Feldstärke ausge­ setzt werden. Dies erhöht die ohnehin durch die natürliche Streuung der Eigenschaften einer Zell­ population bedingte Schwankungsbreite im Hinblick auf das gewünschte Produkt. Darüberhinaus ist diese bekannte Vorrichtung aufwendig in der Herstellung und daher kostspielig.

Eine Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art ist ferner aus der DE-OS 33 21 239 bekannt. Diese besteht aus einer Grundplatte mit einem den Raum für die Zellsuspension bildenden wei­ teren Teil, wobei in den Raum zwei drahtförmige Elektroden hineinragen. Zwar ist diese Ausfüh­ rungsform der Vorrichtung leicht und preiswert herstellbar. Bei der zwischen den Elektroden liegenden Zone treten jedoch die gleichen Nach­ teile wie bei dar vorgenannten Vorrichtung auf.

Vorrichtungen der beschriebenen Art sind generell einsetzbar für die Behandlung von Zellen im elek­ trischen Feld, insbesondere auch zur Fusion von Zellen.

Ein Verfahren zur Fusion von Zellen ist aus Bio­ chemica et Biophysica Acta, 694 (1982), 227-277 (Electric Field-Mediated Fusion and Belated Electrical Phenomena, U. Zimmermann) bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren - dessen Ablauf unter dem Mikroskop beobachtet werden kann - wird der Membrankontakt zwischen wenigstens zwei Zellen durch Anlegen eines alternierenden, schwach homo­ genen Feldes erzeugt. Durch das elektrische Feld werden, bedingt durch Polarisationsprozesse in der Zelle, Dipole erzeugt, die sich gegenseitig anziehen, wenn sich die Zellen während ihrer Wan­ derung im elektrischen Feld einander nähern (sog. Dielektrophorese). Nach der Bildung der Zellen­ reihe werden die Störungen in der Membranstruktur zwischen benachbarten Zellen durch einen elek­ trischen Durchbruchpuls ausgelöst (J. Membrane Biol. 67, 165-182 (1982), Electric Field-Induced Cell-to-Cell Fusion, U. Zimmermann and J. Vien­ ken). Dabei werden - nach den bisherigen Modell­ vorstellungen - Löcher in der Membrankontaktzone benachbarter Zellen erzeugt, die zu einem zyto­ plastischen Kontinuum zwischen den beiden Zellen und zur Brückenbildung von Lipiden zwischen den Membranen der benachbarten Zellen führen. Die Li­ pidomoleküle ordnen sich nicht mehr in ihre ur­ sprüngliche Membran ein. Sobald sich eine Brücke gebildet hat, kommt es aus energetischen Gründen zur Abrundung des entstandenen Gebildes, das aus den über die Lipidbrücken miteinander verbundenen Zellen besteht.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zu schaffen, die einfach herzustellen und leicht handhabbar ist und bei der der oben erwähnte Nach­ teil der bekannten Vorrichtungen vermieden ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vor­ richtung der eingangs bezeichneten Art gelöst, bei der die beiden Elektroden im Bereich der Zone als Innen- bzw. Außenelektrode ausgebildet sind, wo­ bei die Außenelektrode die Innenelektrode derart umschließt, daß die einander im gleichen Abstand gegenüberliegenden Flächen der Elektroden die Wände der Zone bilden und daß die Innenelektrode durch ein sich an die Außenelektrode anschlies­ sendes, beide Elektroden voneinander trennendes Isolierteil geführt ist, über das hinaus sie sich in ein von außen zugängliches Teil erstreckt. Die Zone ist damit durch die Elek­ troden räumlich abgegrenzt. In jedem Bereich der Zone ist, da sie ja durch äquidistante Oberflächen der Elektroden umfaßt wird, die elektrische Feld­ stärke gleich, so daß für alle in der Zone befind­ lichen Zellen die gleichen elektrischen Bedingun­ gen gegeben sind. Im Bereich der Zone ist damit zugleich auch der zur Aufnahme der Zellsuspension vorgesehene Raum mit der Zone identisch.

Bei einer ersten besonderen Ausführungsart der Vorrichtung gemäß dar Erfindung ist die Innenelek­ trode im Bereich der Zone mit zylindrischer oder im wesentlichen zylindrischer Oberfläche und die Außenelektrode mit nach innen gerichteter zylin­ drischer oder im wesentlichen zylindrischer Ober­ fläche ausgebildet, so daß die Zone ein zylindri­ scher oder nahezu zylindrischer Ringraum ist. Die geometrische Form des Ringraumes kann dabei inso­ fern von der zylindrischen Form abweichen, als der Querschnitt nicht exakt kreisförmig sein muß, son­ dern beispielsweise auch oval sein kann.

Eine zweckmäßige Ausgestaltung der ersten Ausfüh­ führungsart der Vorrichtung besteht darin, daß die eine Stirnseite des Ringraumes nach außen eine Ausfüllöffnung aufweist und daß sich an der ande­ ren Stirnseite des Ringraumes zumindest eine ra­ diale, in der Innenelektrode verlaufende Querboh­ rung anschließt, die in einen axialen Kanal mün­ det, der im Bereich des Isolierteils in der Innen­ elektrode verläuft und der im von außen zugängli­ chen Teil der Innenelektrode in eine Einfüllöff­ nung mündet.

Zur Vorbereitung der elektrischen Behandlung der Zellen wird die Zellsuspension über den Kanal in die Zone eingedrückt, in der sie - bei üblichen Elektrodenabständen von 20 bis 500 µm - verbleibt, ohne herauszutropfen. Nach der elektrischen Be­ handlung kann die Zellsuspension durch Nachdrücken von Gas (Luft) oder einer zweiten Lösung oder durch Zentrifugieren aus der Zone herausgedrückt werden.

Um beide Elektroden in einfacher Weise an die elektrische Versorgung anschließen zu können, sind - bei der ersten Ausführungsart der Vorrich­ tung - die beiden Elektroden außerhalb des Be­ reichs des Ringraumes durch ein Isolierteil von­ einander getrennt, das bis zur Querbohrung reicht, einen Teil der Innenelektrode im Bereich des axia­ len Kanals umfaßt und die beiden Elektroden bis zur Außenseite der Kammer voneinander trennt, so daß die Außenelektrode im wesentlichen Bereich des Ringraumes und die Innenelektrode im übrigen Teil der Kammer von außen zugänglich sind. Die elektrischen Anschlüsse können bei dieser Aus­ führungsform auf einfache Weise von außen an die Kammer angelegt werden, wobei es sich für die Durchführung der Fusion von Zellen in der Regel um Anschlüsse einer elektrischen Einrichtung zur Erzeugung eines alternierenden elektrischen Feldes und einer elektrischen Einrichtung zur Erzeugung elektrischer Spannungsimpulse handelt.

Eine weitere, sehr vorteilhafte Ausführungsform der ersten Ausführungsart der Vorrichtung besteht darin, daß der axiale Kanal in einen sich nach außen hin erweiternden Innenkonus mündet, dessen Abmessungen so gewählt sind, daß in ihn eine Pi­ pette eingeführt werden kann. Über die Pipette kann auf diese Weise eine an das Volumen der Zone angepaßte Menge an Zellsuspension in die Kammer eingeführt werden. Dies ermöglicht eine sehr einfache Handhabung der Vorrichtung, wobei bei Vorhandensein einer Vielzahl von Vorrich­ tungen auf sehr einfache Weise eine Serie von Behandlungen von Zellen, beispielsweise ganze Untersuchungsreihen an einer oder mehrerer Zell­ suspensionen durchgeführt werden können.

Um die Vorrichtungen in eine elektrische Steck­ verbindung, die den Kontakt mit der elektri­ schen Versorgung herbeiführt, leicht einführen zu können, ist es ferner zweckmäßig, daß die Außenelektrode zur Seite der Ausfüllöffnung des Ringraumes hin sich verjüngend konisch aus­ gebildet ist.

Bei einer zweiten Ausführungsart der Vorrich­ tung gemäß der Erfindung ist die Innenelektrode stabförmig, ragt in eine reagenzglasförmige Außenhülle hinein und ist im Bereich der Zone kugelförmig oder nahezu kugelförmig. Die Außen­ elektrode weist im Bereich der Zone eine der Oberfläche einer Kugel entsprechende oder nahe­ zu entsprechende Innenoberfläche auf, so daß die Zone ein zwischen zwei konzentrischen Ku­ geloberflächen oder nahezu kugeligen Oberflächen liegender Raum ist, wobei der obere Teil der Außenhülle ein lsolierteil ist.

Zur Vorbereitung der elektrischen Behandlung der Zellen wird die Innenelektrode in die rea­ genzglasförmige Außenhülle eingebracht und erst dann die Zellsuspension oder eine Lösung und anschließend eine kleine Menge an Zellsuspension eingefüllt. Für den Fall, daß die ein­ gefüllte Lösungsmenge größer ist, als es dem Volumen der Zone entspricht, sammeln sich die Zellen durch Sedimentation im Bereich der Zone an.

Zur Führung der Innenelektrode in der reagenz­ glasförmigen Außenhülle sind am stabförmigen Teil der Innenelektrode Führungsringe ange­ bracht, die die Innenelektrode in dem zylin­ drischen Teil der reagenzglasförmigen Außen­ hülle führen.

Um den elektrischen Kontakt von außen an die Außenelektrode anlegen zu können, ist die Aus­ senhülle im Bereich der Zone durch die Außen­ elektrode gebildet. Der zweite elektrische Kontakt liegt am stabförmigen Teil der Innen­ elektrode an.

Eine zweckmäßige Ausführungsform der zweiten Ausführungsart der Vorrichtung gemäß der Er­ findung besteht darin, daß an dem dem Kugelkopf entgegengesetzten Ende der Innenelektrode das von außen zugängliche Teil der Innenelektrode als Verschluß für die in der Form eines Rea­ genzglases ausgebildete Außenhülle ausgebildet ist.

Für den Fall, daß die Außenhülle im Bereich der Zone durch die Außenelektrode gebildet wird und der übrige Teil der Außenhülle aus einem elektrisch isolierenden Material besteht, besteht der Verschluß aus einem Metall, so daß der Anschluß der elektrischen Spannung an die Innenelektrode über diesen metallischen Ver­ schluß erfolgen kann.

Zur leichteren Handhabung der Vorrichtung ist am Verschluß eine Öffnung mit einem Stopfen vorgesehen. Durch diese Öffnung wird die Zell­ suspension eingefüllt. Zur Entnahme der Zell­ suspension nach erfolgter elektrischer Behand­ lung der Zellen wird der Verschluß abgenommen und damit die Innenelektrode aus der reagenzglas­ förmigen Außenhülle herausgenommen. Die wei­ tere Behandlung der Zellsuspension erfolgt dann wie bei jedem Reagenzglas üblich.

Die beiden Ausführungsarten der Vorrichtung gemäß der Erfindung sind in der Zeichnung sche­ matisch dargestellt und werden im folgenden näher erläutert: Es zeigt

Fig. 1 die erste Ausführungsart, welche mittels einer Pipette befüllbar ist,

Fig. 2 die zweite Ausführungsart der Vorrichtung mit reagenzglas­ förmiger Außenhülle und stab­ förmiger Innenelektrode mit Kugelkopf.

Beide Ausführungsarten der Vorrichtung weisen, wie aus den Fig. 1 und 2 ersichtlich ist, eine Zone 1 auf, die - bis auf eine Einfüll­ bzw. Ausfüllöffnung - je nach Ausführungsart durch koaxial oder konzentrisch angeordnete Oberflächen der Elektroden 2 und 3 begrenzt ist.

Bei der in Fig. 1 dargestellten Ausführungs­ art der Vorrichtung ist die Innenelektrode 2 im Bereich der Zone 1 als zylindrischer Körper ausgebildet und von der Außenelektrode 3 derart umgeben, daß die Zone 1 ein zylindrischer Ring­ raum ist. Dieser Ringraum ist an einer Stirn­ seite nach außen (unten) offen und hat hier seine Ausfüllöffnung 4. An der anderen Stirn­ seite schließt sich an den Ringraum 1 eine ra­ dial, in der Innenelektrode 2 verlaufende Querbohrung 5 an, die in einen axialen, in der lnnenelektrode 1 angeordneten Kanal 6 mündet. An diesen Kanal schließt sich ein sich nach außen hin erweiternder Konus 7 an, dessen Ab­ messungen so gewählt sind, daß eine Pipette eingeführt werden kann.

Innenelektrode 2 und Außenelektrode 3 sind durch ein Isolierteil 8 voneinander getrennt. Die Außenelektrode 3 ist im Bereich der Zone 1 und die Innenelektrode 2 im oberen Bereich der Vorrichtung von außen zugänglich. Die Außen­ elektrode ist außerdem konisch, nach unten sich verjüngend, ausgebildet. Die Vorrichtung kann dadurch an die zur Durchführung der elek­ trischen Behandlung der Zellen benötigten elek­ trischen Spannungen angelegt werden, indem sie in eine der Form der Vorrichtung entsprechende Steckverbindung eingesetzt wird.

Mittels der Pipette kann eine genau dosierte Menge an Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, in die Zone eingedrückt werden. Durch Einfüllen einer weiteren, ebenfalls genau dosier­ ten Lösungsmenge wird die behandelte Zellsuspen­ sion nach unten durch die Ausfüllöffnung 4 aus der Vorrichtung - beispielsweise in ein Reagenz­ glas - gedrückt.

Beispielsweise bei Abmessungen von D=4,4 mm, d=4,0 mm und einer Höhe der Zone von h=12 mm ergibt sich ein Zonenvolumen von ca. 32 µl bei einem Elektrodenabstand von 0,2 mm.

Bei der in Fig. 2 dargestellten Ausführungsart der Vorrichtung ist die Innenelektrode 2 stabför­ mig mit einem Kugelkopf ausgebildet. Die Außenhül­ le der Vorrichtung weist die Form eines Reagenz­ glases auf, sie besteht im unteren Teil aus der Außenelektrode 3 und ist im oberen zylindri­ schen Teil 9 aus Kunststoff gefertigt.

An den stabförmigen Teil der Innenelektrode 2 schließt sich der Verschluß 10 an, der aus Metall besteht. Der Verschluß weist eine Öffnung 11 mit Stopfen 12 auf. Zur Führung der Innenelektrode im zylindrischen Teil der reagenzglasförmigen Außen­ hülle sind Führungsringe 13 vorgesehen.

Zur Durchführung der elektrischen Behandlung der Zellen wird die elektrische Spannung von außen im Bereich der Zone 1 an die Außenelektrode und an die Innenelektrode über den Verschluß 10 ange­ legt.

Bei einem Durchmesser der Kugel von 19,6 mm und einem inneren Durchmesser der Außenelektrode von 20 mm ergibt sich bei einem Elektrodenabstand von 0,2 mm ein Zonenvolumen von etwa 250 µl.

Zur Vorbereitung der elektrischen Behandlung der Zellen bei einer Vorrichtung der angegebenen Ab­ messungen werden über die Öffnung 11 etwa 250 µl Lösung und danach 10 bis 200 µl Zellsuspension eingefüllt. Nachdem die Zellen in die Zone durch Sedimentieren gelangt sind, wird die Vorrichtung für die Zeit der Durchführung der elektrischen Behandlung an die elektrische Versorgung ange­ schlossen. Anschließend wird die Innenelektrode aus der Außenhülle herausgenommen und die hierin befindliche Lösung in üblicher Weise weiterbehan­ delt.

Claims (9)

1. Vorrichtung für die Behandlung von Zellen im elektrischen Feld mit zwei Elektroden, die im Bereich einer Zone des für die die Zellen enthaltende Suspension von außen zugänglichen Raumes gleichbleibende Abstände zueinander aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Elektroden im Bereich der Zone (1) als Innen- bzw. Außenelektrode ausgebildet sind, wobei die Außenelektrode (3) die Innen­ elektrode (2) derart umschließt, daß die einander im gleichen Abstand gegenüberliegenden Flächen der Elektroden die Wände der Zone (1) bilden und daß die Innenelektrode durch ein sich an die Außenelektrode anschließendes, beide Elektroden voneinander trennendes Isolierteil (8, 9) geführt ist, über das hinaus sie sich in ein von außen zugängliches Teil erstreckt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenelektrode (2) im Bereich der Zone (1) mit zylindrischer oder im wesentlichen zylindrischer Oberfläche und die Außenelektrode (3) mit nach innen gerichteter zylindrischer oder im wesent­ lichen zylindrischer Oberfläche ausgebildet sind, so daß die Zone (1) ein zylindrischer oder nahezu zylindrischer Ringraum ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Stirnseite des Ringraumes (1) nach außen eine Ausfüllöffnung (4) aufweist und daß sich an der anderen Stirnseite des Ringraumes zumindest eine radiale, in der Innenelektrode (2) verlaufende Querbohrung (5) anschließt, die in einen axialen Kanal (6) mündet, der im Bereich des Isolierteils (8) in der Innenelektrode (2) verläuft und der im von außen zugänglichen Teil der Innenelektrode in eine Einfüllöffnung mündet.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der axiale Kanal (6) in einen sich nach außen hin erweiternden Innenkonus (7) mündet, dessen Ab­ messungen so gewählt sind, daß in ihn eine Pipette eingeführt werden kann.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Außenelektrode (3) zur Seite der Ausfüll­ öffnung (4) des Ringraumes (1) hin sich verjün­ gend konisch ausgebildet ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenelektrode (2) stabförmig ist und in eine reagenzglasförmige Außenhülle (3, 9) hinein­ ragt und im Bereich der Zone (1) kugelförmig oder nahezu kugelförmig ist und daß die Außenelektrode (3) im Bereich der Zone (1) eine der Oberfläche einer Kugel entsprechende oder nahezu entspre­ chende Innenoberfläche aufweist, so daß die Zone ein zwischen zwei konzentrischen Kugeloberflä­ chen oder nahezu kugeligen Oberflächen liegen­ der Raum ist, wobei der obere Teil der Außen­ hülle ein Isolierteil (9) ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß am stabförmigen Teil der Innenelektrode (2) Führungsringe (13) angebracht sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß an dem dem Kugelkopf entgegengesetzten En­ de der Innenelektrode (2) das von außen zugäng­ liche Teil der Innenelektrode als Verschluß (10) für die in der Form eines Reagenzglases ausgebildete Außenhülle (3 und 9) ausgebildet ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß (10) eine Öffnung (11) mit Stopfen (12) aufweist.