DE8517148U1

DE8517148U1 - Kammer für die Behandlung von Zellen im elektrischen Feld

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Publication number: DE8517148U1
Application number: DE19858517148
Authority: DE
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1985-06-12
Filing date: 1985-06-12
Publication date: 1986-01-02

Description

Kernf orschiingsanlage Jülich Gesellschaft mit beschränkter Haftung

Kammer für die Behandlung von Zellen im elektrischen Feld

ρ crrxnaung bezieht sich auf eine Kammer

I für die Behandlung von Zellen im elektrischen

j! Feld mit einem zur Aufnahme der die Zellen

l| enthaltenden Suspension vorgesehenen Raum

f* mit einer zwischen zwei Elektroden liegenden

'< Zone, innerhalb der die Zellen einem zwischen

; ilen Elektroden ausgebildeten elektrischen

; Feld ausgesetzt werden.

Eine Kammer der eingangs bezeichneten Art

) ist aus der DE-OS 33 17 415 bekannt. Bei

; dieser bekannten Kammer wird der zur Aufnahme

j der Zellsuspension vorgesehene rlaum durch

\ einen zylinderförmigen Innenkörper und

einen diesen umgebenden Außenkörper gebildet.

' Die beiden Elektroden umgeben den Innen-

f körper in Form einer mehrgängigen Schraube,

so daß die Zone, innerhalb der die Zellen

. dem elektrischen Feld ausgesetzt werden,

als den Innenkörper in Farm einer mehrgängigen

I Schraube umgebenden Teilbereich ausgebildet

I ist. Diese Ausführungsform der Kammer bietet

I zwar die Möglichkeit, eine sehr große Zahl

I von Zellen zugleich einer elektrischen

I Behandlung zu unterziehen. Ein gewisser ÜPT 1.769

I ba/ha

• * · ·
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Nachteil besteht dabei jedoch darin, daß !'··

konstruktionsbedingt nicht alle in der X

Zone befindlichen Zellen der gleichen elektri- \\ sehen Feldstärke ausgesetzt werden. Dies '

erhöht die ohnehin durch die natürliche Streuung der Eigenschaften einer Zellpopulation bedingte Schwankungsbreite im Hinblick

auf das gewünschte Produkt. Darüberhinaus |

ist diese bekannte Kammer aufwendig in s

der Herstellung und daher kostspielig. |

Eine Kammer der eingangs bezeichneten Art ,;

ist ferner aus der DE-OS 33 21 239 bekannt. %

Diese besteht aus einer Grundplatte mit 3

I einem den Raum für die Zellsuspension bilden- 1

den weiteren Teil, wobei in den Raum zwei |

drahtförmige Elektroden hineinragen. Zwar |

ist diese Ausführungsform der Kammer leicht f

i und preiswert herstellbar. Bei der zwischen Jj

den Elektroden liegenden Zone treten jedoch |

die gleichen Nachteile wie bei der vorge- jj

nannten Kammer auf. |

Kammern der beschriebenen Art sind generell I

einsetzbar für die Behandlung von Zellen im elektrischen Feld, insbesondere auch zur Fusion von Zellen.

Ein Verfahren zur Fusion von Zellen ist aus Biochimica et Biophysica Acta, 694 (1982), 227 - 277 (Electric Field-Mediated Fusion and Related Electrical Phenomena,

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•J '

U. Zimmermann) bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren - dessen Ablauf unter dem Mikroskop beobachtet werden kann - wird der Membrankontakt zwischen wenigstens zwei Zellen durch Anlegen eines alternierenden, schwach homogenen Feldes erzeugt. Durch das elektrische Feld werden, bedingt durch Polarisationsprozesse in der Zelle, Dipole erzeugt, die sich gegenseitig anziehen, wenn sich die Zellen während ihrer Wanderung im elektrischen Feld einander nähern (sog. Dielektrophorese). Nach der Bildung der Zellenreihe werden die Störungen in der Membranstruktur zwischen benachbarten Zellen durch einen elektrischen Durchbruchpuls ausgelöst (J. Membrane Biol. 67, 165 - 182 (1982), Electric Field-Induced Cell-to-Cell Fusion, U. Zimmermann and J. Vienken). Dabei werden - nach den bisherigen Modellvorstellungen Löcher in der Membrankontaktzone benachbarter Zellen erzeugt, die zu einem zytoplastischen Kontinuum zwischen den beiden Zellen und zur Brückenbildung von Lipiden zwischen den Membranen der benachbarten Zellen führen. Die Lipidomoleküle ordnen sich nicht mehr in ihre ursprüngliche Membran ein. Sobald sich eine Brücke gebildet hat, kommt es aus energetischen Gründen zur Abrundung des entstandenen Gebildes, das aus den über die Lipidbrücken miteinander verbundenen Zellen besteht.

-A-

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Kammer zu schaffen, die einfach herzustellen und leicht handhabbar ist und bei der der oben erwähnte Nachteil der bekannten Kammern vermieden ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Kammer der eingangs bezeichneten Art gelöst, bei der die Zone - bis auf eine Einfüll- bzw. Ausfüllöffnung für die Zellsuspension - von äquidistant einander gegenüberliegenden, koaxial oder konzentrisch angeordneten Oberflächen der Elektroden begrenzt ist. Die Zone ist damit durch die Elektroden räumlich abgegrenzt. In jedem Bereich der Zone ist, da sie ja durch äquidistante Übezflächen der Elektroden umfaßt wird, die elektrische Feldstärke gleich, so daß für alle in der Zone befindlichen Zellen die gleichen elektrischen Bedingungen gegeben sind. Im Bereich der Zone ist damit zugleich euch der zur Aufnahme der Zellsuspension vorgesehene Raum mit der Zone identisch.

Bei einer ersten besonderen Ausführungsart der Kammer gemäß der Erfindung ist im Bereich der Zone die erste Elektrode als Innenelektrode mit zylindrischer oder im wesentlichen zylindrischer Oberfläche und die zweite Elektrode als Außenelektrode mit nach innen gerichteter zylindrischer oder im wesentlichen Zylindrischer Oberfläche ausgebildet, so daß die Zone ein zylindrischer oder nahezu

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* zylindrischer Ringraum ist. Die geometrische Form des Ringraumes kdnn dabei insofern

₍' von der zylindrischen Form abweichen, als

der Querschnitt nicht exakt kreisförmig sein muß, sondern beispielsweise auch oval sein kann.

Eine zweckmäßige Ausgestaltung der ersten Ausführungsart der Kammer besteht darin, daß die eine Stirnseite des Ringraumes nach außen offen ist und daß sich an der

'■·, anderen Stirnseite des Ringraumes zumindest

eine radial in der Innenelektrode verlaufende Querbohrung anschließt, die in einen axialen Kanal mündet, der in der Innenelektrode

'■■ verläuft und der zu der der Ausfüllöffnung

• entgegengesetzten Seite der Kammer nach ^: außen offen ist.

(j Zur Vorbereitung der elektrischen Behandlung

der Zellen wird dia Zellsuspension über den Kanal in die Zone eingedrückt, in der sie - bei üblichen Elektrodenabständen von 20 bis 500 pm - verbleibt, ohne herauszu tropfen. Nach der elektrischen Behandlung kann die Zellsuspension durch Nachdrücken von Gas (Luft) oder einer zweiten Lösung oder durch ZentrifU£.i.i5ren aus der Zone herausgedrückt werden.

Um beide Elektroden in einfacher Weise ι en die elektrische Versorgung anschließen

zu kömnen, sind - bei der ersten Ausführungsart dlef Kammer - die beiden Elektroden

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außerhalb des Bereichs des Ringraumes durch ein Isolierteil voneinander getrennt, das bis zur Querbohrung reicht, einen Teil der Innenelektrode im Bereich des axialen Kanals umfaßt und die beiden Elektroden bis zur Außenseite der Kammer· voneinander trennt, so daß die Außenelektrode im wesentlichen Bereich des Ringraumes und die Irtnenelektrode im übrigen Teil der Kammer von außen zugänglich sind. Die elektrischen Anschlüsse können bei dieser Ausführungsform auf einfache Weise von außen an die Kammer angelegt werden, wobei es für die Durchführung der Fusion von Zellen in der Regel um Anschlüsse einer elektrischen Einrichtung zur Erzeugung eines alternierenden elektrischen Feldes und einer elektrischen Einrichtung zur Erzeugung elektrischer Spannungsimpulse handelt.

Eine weitere, sehr vorteilhafte Ausführungsform der ersten Ausführungoart der Kammer besteht darin, daß der axiale Kanal in einen sich nach außen hin erweiternden Innenkonus mündet, dessen Abmessungen so gewählt sind, daß in ihn eine Pipette eingeführt werden kann. Über die Pipette kann auf diese Weise eine an das Volumen der Zone angepaßte Menge an Zellsuspertsion in die Kammer eingeführt werden. Dies ermöglicht eine sehr einfache Handhabung der Kammer,

wobei bei Vorhändensein einer Vielzähl von Kammern auf sehr einfache Weise eine Serie von Behandlungen von Zellen, beispielsweise ganze Untersuchungsreihen an einer oder mehrerer Zellsuspensionen durchgeführt werden können.

Um die Kammern in eine elektrische Steckverbindung, die den Kontakt mit der elektrischen Versorgung herbeiführt, leicht einführen zu können, ist es ferner zweckmäßig, daß die Außenelektrode zur Seite der Ausfüllöffnung des Ringraumes hin sich verjüngend konisch ausgebildet ist.

Bei einer zweiten Ausführungsart der Kammer gemäß der Erfindung ist die erste Elektrode als Innenelektrode ausgebildet und im Bereich der Zone kugelförmig oder nahezu kugelförmig und die zweite Elektrode als Außenelektrode ausgebildet, wobei sie im Bereich der Zone eine der Oberfläche einer Kugel entsprechende oder nahezu entsprechende Innenoberfläche aufweist, so daß die Zone ein zwischen zwei konzentrischen Kugeloberflächen oder nahezu kugeligen Oberflächen liegender Raum ist.

Die als Innenoberfläche ausgebildete erste Elektrode ist zweckmäßigerweise stabförmig mit an einem Ende angebrachtem Kugelkopf ausgebildet. Diese Innenelektrode ragt

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in eine in der Form eines Reagenzglases ausgebildete Außenhülle hineinj wobei im Bereich der Zone die innere Oberfläche der Außenhülle zugleich die innere Oberfläche der Außenelektrode ist.

Zur Vorbereitung der elektrischen Behandlung dar ΖβΙΙθΓι wird die Inneneiektrode in die reagenzglasförmige Außenhülle eingebracht und erst dann die Zellsuspension oder eine Lösung und anschließend eine kleine Menge an Zellsuspension eingefüllt. Für den Fall, daß die eingefüllte Lösungsmenge größer ist, als es dem Volumen der Zone entspricht, sammeln sich die Zellen durch Sedimentation im Bereich der Zone an.

Zur Führung der Innenelektrode in der reagenzglasförmigen Außenhülle sind am stabförmigen Teil der Innenelektrode Führungsringe angebracht, die die Innenelektrode in dem zylindrischen Teil der reagenzglasförmigen Außenhülle führen.

Um den elektrischen Kontakt von außen an die Außenelektrode anlegen zu können, ist die Außenhülle im Bereich der Zone durch die Außenelektrode gebildet. Die Außenelektrode kann dabei vom übrigen Teil der Außen

hülle durch ein Isolierteil getrennt sein. Alternativ kann der übrige Teil der Außenhülle auch aus einem elektrisch isolierenden Material bestehen. Der zweite elektrische

J ♦ · · ! ί ί · ί ί

Kontakt liegt am stabförmigen Teil der Innenelektrode an.

Eine zweckmäßige Ausführungsform der zweiten Ausführungsart der Kammer gemäß der Erfindung besteht darin, daß an dem dem Kugelkopf entgegengesetzten Ende der Innenelektrode ein Verschluß für die in der Form eines Reagenzglases ausgebildete Außenhülle angebracht ist.

Für den Fall, daß die Außenhülle im Bereich der Zone durch die Außenelektrode gebildet

wird und der übrige Teil der Außenhülle aus einem elektrisch isolierenden Material * besteht, besteht der Verschluß aus einem

Metall, so daß der Anschluß der elektrischen Spannung an die Innenelektrode über diesen metallischen Verschluß erfolgen kann.

Zur leichteren Handhabung der Kammer ist

.5 am Verschluß eine Öffnung mit einem Stopfen

' vorgesehen. Durch diese Öffnung wird die

f Zellsuspension eingefüllt. Zur Entnahme

y der Zellsuspension nach erfolgter elektrischer

Behandlung der Zellen wird der Verschluß

§ abgenommen und damit die Innenelektrode

aus der reagenzförmigen Außenhülle heraus-

gf genommen. Die weitere Behandlung der ZeIl-

suspension erfolgt dann wie bei jedem Reagenz-

Q glas üblich.

Die beiden Ausführungsarten der Kammer gemäß der Erfindung sind in der Zeichnung schematisch dargestellt und werden im folgenden näher erläutert:

- 10 Es zeigen ;

Figur 1 die erste Ausführungsart, I

welche mittels einer Pipette i befüllbar ist,

Figur 2 die zweite Ausführungsart

der Kammer mit reagenzglas-

förmiger Außenhülle und

stabförmiger Innenelektrode |

mit Kugelkopf. I;

Beide Ausführungsarten der Kammer weisen, I

wie aus den Figuren 1 und 2 ersichtlich f

ist, eine Zone 1 auf, die - bis auf eine Einfüll- bzw. Ausfüllöffnung - je nach Ausführungsart durch koaxial oder konzentrisch angeordnete Oberflächen der Elektroden 2 und 3 begrenzt ist.

Bei der in Figur 1 dargestellten Ausführungsart der Kammer ist die Innenelektrode 2 im Bereich der Zone 1 als zylindrischer Körper ausgebildet und von der Außenelektrode 3 derart umgeben, daß die Zone 1 ein zylindrischer Ringraum ist. Dieser Ringraum ist an einer Stirnseite nach außen (unten) offen und hat hier seine Ausfüllöffnung 4. An der anderen Stirnseite schließt sich an den Ringraum 1 eine radial, in der Innenelektrode 2 verlaufende Querbohrung 5 an, die in einen axialen, in der Innenelektrode 1 angeordneten Kanal 6 mündet. An diesen Kanal schließt sich ein sich nach außen hin erweiternder Konus 7 an, dessen Abmessungen so gewählt sind, daß eine Pipette eingeführt werden kann.

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Innenelektrode 2 und Außenelektrode 3 sind durch ein Isolierteil 8 voneinander getrennt. Die Außenelektrode 3 ist im Bereich der Zone 1 und die Innenelektrode 2 im oberen Bereich der Kammer von außen zugänglich. Die Außenelektrode ist außerdem konisch, nach unten sich verjüngend, ausgebildet. Die Kammer kann dadurch an die zur Durchführung der elektrischen Behandlung der Zellen benötigten elektrischen Spannungen angelegt werden, indem sie in eine der Kammerform entsprechende Steckverbindung eingesetzt wird.

Mittels der Pipette kann eine genau dosierte Menge an Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, in die Zone eingedrückt werden. Durch Einfüllen einer weiteren, ebenfalls genau dosierten Lösungsmenge wird die behandelte Zellsuspension nach unten durch die Ausfüllöffnung 4 aus der Kammer - beispielsweise in ein Reagenzglas - gedrückt.

Beispielsweise bei Abmessungen von D = 4,4 mm, d = 4,0 mm und einer Höhe der Zone von h = 12 ergibt sich ein Zonenvolumen von ca. 32 μΐ bei einem Elektrodenabstand von 0,2 mm.

Bei der in Figur 2 dargestellten Ausführungsart der Kammer ist die Innenelektrode 1 stabförmig mit einem Kugelkopf ausgebildet. Die Außenhülle der Kammer Weist die Form eines Reagenzglases auf, sie besteht im

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- 12 -

unteren Teil aus der Außenelektrode 2 und ist im oberen zylindrischen Teil 9 aus Kunststoff gefertigt.

An den stabförmigen Teil der Innenelektrode schließt sich der Verschluß 10 an, der aus Metall besteht. Der Verschluß weist eine Öffnung 11 mit Stopfen 12 auf. Zur Führung der Innenelektrode im zylindrischen Teil der reagenzglasförmigen Außenhülle sind Führungsringe 13 vorgesehen.

Zur Durchführung der elektrischen Behandlung der Zellen wird die elektrische Spannung von außen im Bereich der Zone 1 an die AuPsnelektrode und an die Innenelektrode über den Verschluß 10 angelegt.

Bei einem Durchmesser der Kugel von 19,6 mm und einem inneren Durchmesser der Außenelektrode von 20 mm ergibt sich bei einem Elektrodenabstand von 3,2 mm ein Zonenvolumen von etwa 250 μΐ.

Zur Vorbereitung der elektrischen Behandlung der Zellen bei einer Kammer der angegebenen Abmessungen werden über die Öffnung 11

etwa 250 μΐ Lösung und danach 10 bis 200 μΐ Zellsuspension eingefüllt. Nachdem die Zellen in die Zone durch Sedimentieren gelangt sind, wird die Kammer für die Zeit der Durchführung der elektrischen Behandlung an die elektrische Versorgung angeschlossen. Anschließend wird die Innenelektrode aus

- 13 -

der Außenhulle herausgenommen und die hierin befindliche Lösung in üblicher Weise weiterbehandelt .

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Claims

Kernforschungsanlage Julien Gesellschaft mit beschränkter Haftung Parerrtffinsprüche

1. Kammer für die Behandlung von Zellen im elektrischen Feld mit einem zur Aufnahme der die Zellen enthaltenden Suspension vorgesehenen Raum mit einer zwischen zwei Elektroden liegenden Zone, innerhalb der die Zellen einem zwischen den Elektroden ausgebildeten elektrischen Feld ausgesetzt werden,

dadurch gekennzeichnet, daß die Zone (1) - bis auf eine Einfüllbzw., Ausfüllöffnung (4) für die Zellsuspension von squidistant einander gegenüberliegenden, koaxial oder konzentrisch angeordneten Oberflächen der Elektroden (Z, 3) begrenzt ist.

2. Kammer nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß im Bereich der Zone (1) die erste Elektrode (2) als Innenelektrode mit zylindrischer oder im wesentlichen zylindrischer Oberfläche und die zweite Elektrode (3) als Außenelektrode mit nach innen gerichteter zylindrischer oder im wesentlichen zylindrischer Oberfläche ausgebildet sind, so daß die Zone (1) ein zylindrischer oder nahezu zylindrischer Ringraum ist.
PT 1.769

ba/hä

4 4 4 4
4 4 4 4
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I η

3. Kammer nach Anspruch 2,

< dadurch gekennzeichnet, • daß die eine Stirnseite des Ringraumes (1)

nach außen offen ist (4) und daß sich an der anderen Stirnseite des Ringraumes zumindest eine radiale, in der Innenelektrode (2)

< verlaufende Querbohrung (5) anschließt, ■% die in einen axialen Kanal (6) mündet,

f der in der Innenelektrode verläuft υπα

I der zu der der Ausfüllöffnung (4) entgegen-

"·' gesetzten Seite der Kammer hin nach außen

&' offen ist.

4. Kammer nach Anspruch 3,

,* dadurch gekennzeichnet,

daß die beiden Elektroden (2, 3) außerhalb des Bereichs des Ringraumes (1) durch ein Isolierteil (8) voneinander getrennt sind, das bis zur Querbohrung (5) reicht, einen

if Teil der Innenelektrode (2) im Bereich

v. des axialen Kanals (6) umfaßt und die beiden

' Elektroden bis zur Außenseite der Kammer

,' voneinander trennt, so daß die Außenelektrode (3)

? im wesentlichen im Bereich des Ringraumes (1)

''' und die Innenelektrode (2) im übrigen Teil

der Kammer von außen zugänglich sind.

5. Kammer nach Anspruch ^A,

dadurch gekennzeichnet,

daß der axiale Kanal (6) in einen sich

nach außen hin erweiternden Innenkonus (7)

, mündet, dessen Abmessungen so gewählt sind,

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3 -

daß in ihn eine Pipette eingeführt werden kann.

6. Kammer nach Anspruch 5,

dadurch gekennzeichnet, daß die Außenelektrode (3) zur Seite der Ausfüllöffnung (4) des Ringraumes (1) hin sich verjüngend konisch ausgebildet ist.

7. Kammer nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die erste Elektrode (2) als Innenelektrode ausgebildet und im Bere'.ch der Zone (1) kugelförmig oder nahezu kugelförmig ist und daß die zweite Elektrode (3) als Außenelektrode ausgebildet ist und im Bereich der Zone (1) eine der Oberfläche einer Kugel entsprechende oder nahezu entsprechende Innenoberfläche aufweist, so daß die Zone ein zwischen zwei konzentrischen Kugeloberflächen oder nahezu kugeligen Oberflächen liegender Raum ist.

8. Kammer nach Anspruch 7,

dadurch gekennzeichnet, daß die als Innenelektrode ausgebildete erste Elektrode (2) stabförmig mit an einem Ende angebrachtem Kugelkopf ausgebildet ist.

9. Kammer nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet,

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daß die Innenelektrode (2) in eine in der Form eines Reagenzglases ausgebildete Außenhülle (3 und 9) hineinragt, wobei im Bereich der Zone (1) die Innenobeffläche der Außenhülle zugleich die Innenoberfläche der Außenelektrode (3) ist.

10. Kammer nach Anspruch 9,

dadurch gekennzeichnet, daß am stabförmigen Teil der Innenelektrode (2) Führungsringe (13) angebracht sind.

11. Kammer nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Außenhülle (3 und 9) im Bereich der Zone (1) durch die Außenelektrode (3) gebildet wird.

12. Kammer nach Anspruch 11,

dadurch gekennzeichnet, daß die Außenelektrode (3) vom übrigen Teil der Außenhülle durch ein Isolierteil getrennt ist.

13. Kammer nach Anspruch 11,

dadurch gekennzeichnet, daß der übrige Teil (9) der Außenhülle aus einem elektrisch isolierenden Material besteht.

14. Kammer nach einem der Ansprüche 8 bis sowie wahlweise nach Anspruch 12 oder 13,

dadurch gekennzeichnetj daß an dem dem Kugelkopf entgegengesetzten Ende der Innenelektrode (2) ein Verschluß (10) für die in der Form eines Reagenzglases ausgebildeten Außenhülle (3 und 9) angebracht ist.

15. Kammer nach Anspruch 14,

dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß (10) aus Metall besteht.

16. Kammer nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß (10) eine Öffnung (11) mit Stopfen (12) aufweist.