DE3430375A1

DE3430375A1 - Kuhthymusextrakt

Info

Publication number: DE3430375A1
Application number: DE19843430375
Authority: DE
Inventors: Aliza Tel-Hashomer Eshkol; Russell W. East Weymouth Mass. Pelham; Charlotte S. Natick Mass. Redden; Gerald E. Duxbury Mass. Stiles
Original assignee: Serono Pharmaceutical Partners
Current assignee: Serono Pharmaceutical Partners
Priority date: 1983-08-29
Filing date: 1984-08-17
Publication date: 1985-03-07
Also published as: JPS60155121A; IT8422384A0; US4521407A; IT1175621B

Description

Beschreibung

Ein primärer Immunomangel kommt sehr selten vor. Ein Zustand jedoch, bei dem ein teilweiser oder vollständiger Kollaps 5 oder die Abwesenheit von einer oder mehreren Klassen von Immunoansprechmöglichkeiten auftritt, hat verheerende Folgen. Ein typisches Beispiel hierfür sind wiederkehrende oder chronische lebensbedrohende Infektionen und für die Opfer ist es erforderlich, bei genau kontrollierten sterilen Bedingungen zu leben. Derzeit gibt es keine andere Behandlung als die Isolierung des Patienten von allen möglichen Infektionsquellen.

Bei einem sekundären Immunomangel ist die Funktion des Immunsystems verringert und dieser kann als Folge des Alters, einer Krankheit oder bei dem Einsatz bestimmter Therapien, wie der cytostatischen Radiotherapie oder der Chemotherapie bei Krebs, auftreten. Patienten, bei denen die Funktion des Immunsystems verringert ist, sind gegenüber viralen und anderen Infektionen verletzbar und die Behandlung von solchen Infektionen kann kompliziert sein und/oder sehr lange dauern.

Das erlangte Immunmangelsyndrom (AIDS) ist ein seit kurzem identifiziertes Syndrom, bei dem das Immunsystem einer Person, nachdem es normal funktioniert hat, aufhört, richtig zu funktionieren. Obgleich AIDS etwas der klinischen Pathologie des sekundären Immunomangels ähnlich ist, ist es selbst alleine dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Helfer zu Suppressor-(HeIfer)-T-Zellenteilkollektiven (subsets) verringert ist.

Die Ätiologie des erlangten Immunmangelsyndroms ist unbekannt und bis jetzt wurde noch keine wirksame Behandlung gefunden. Bedingt durch das Versagen im Immunsystem sind derartige Individuen gegenüber Infektionen sehr verletzbar und es gibt eine hohe Mortalität durch opportunistische Infektionen und Kaposi's Sarcoma. Vgl. z.B. "Immunocompromised

Homosexuals" (Editorial) Lancet 1981; ii: 1325-6; Center for Disease Control, "Epidemiological Aspects of the Current Outbreak of Kaposi's Sarcoma and Opportunistic Infections", N. Engl. J. Med. 1982, ^6: 248-52; Gerstoft et al., "Severe Acquired Immunodeficiency in European Homosexual Men", Br. Med. J. 1982, 2j3_5: 17-19. Es wurde berichtet, daß die zweijährige Mortalitätsrate so hoch wie 80% ist.

Es ist weiterhin seit einiger Zeit bekannt, daß die Thymusdrüse im Zusammenhang mit den Iirununfunktionen des Körpers steht und daher haben Substanzen, die aus dem Thymus isoliert worden sind, großes Interesse erlangt. Innerhalb des Thymus wurden bestimmte Lymphozyten differenziert und die von Thymus abstammenden Zellen werden als T-Zellen bezeichnet, die in dem Blut zu der Lymphe, der Milz und den Lymphknoten zirkulieren. Vgl. beispielsweise US-PS 4 002 602, 4 010 148, 4 082 737, 4 148 886 und 4 167 557. Man hat Versuche in Versuchstieren und in Menschen unternommen, um die durch die Zellen vermittelte Immunität wieder herzustellen, indem man die thymusabhängigen T-Zellfunktionen wieder zum Leben brachte. Man hat dazu verschiedene Thymusextrakte mit unterschiedlichen chemischen, physikalischen und biologischen Aktivitäten verwandt. Bach, "Thymic Hormones: Biochemistry and Biological and Clinical Activity", Ann. Rev.

Pharmacol. Toxicol., JT7, 281 (1977); Trainin, "The Role of Thymic Hormones in Regulation of the Lymphoid System", in Loor et al (Eds.), B and T Cells in Immune Recognition (Wiley & Sons, London) 83-102 (1977). Es wurde beobachtet, daß hochgereinigte thymische Faktoren vermutlich unfähig sind, in Immunomangeltieren eine T-zellenabhängige Immunoansprechbarkeit sowohl in vitro als auch in vivo zu ergeben. Masuda, V. "Abstract from the Symposium on "Immunodeficiency, its Nature and Etiological Significance in Human Disease", Tokyo, September 13-17, 1976. Diese Beobachtung scheint die Annahme zu bestätigen, daß verschiedene Proteinhormone, die in dem Thymusextrakt vorhanden sind, erforderlich sind, um einen geeigneten Aktivitätsbereich zu erhalten.

Es wurde nun gefunden, daß ein besonderer Thymusextrakt, der im folgenden als TP-T bezeichnet wird, erfolgreich für die Stimulierung des zellularen Immunsystems von Personen, die ein erlangtes Immunmangelsyndrom aufweisen, verwendet werden kann. Diese Feststellung ist besonders überraschend, da die Ätiologie und Prophylaxe des erlangten Immunmangelsyndroms nicht bekannt ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die Stimulierung des zellularen Immunsystems in einer Person mit einem erlangten Immunmangelsyndrom zur Verfügung zu stellen. Die Erfindung betrifft die Behandlung eines erlangten Immunmangelsyndroms und insbesondere ein Verfahren zur Stimulierung des zellularen Immunsystems in einer Person, die ein erlangtes Immunmangelsyndrom aufweist, durch Verabreichung an eine solche Person von einer immunopotentierenden wirksamen Menge eines Kuhthymushormonextrakts, TP-1, wobei der Extrakt bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel bei pH 8,6 zwei hauptcharakteristische Banden mit einem Rf von etwa 0,25 und 0,44 aufweist.

Der Ausdruck "Kuh", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, umfaßt ebenfalls den Ausdruck "Kalb" und

entspricht dem angelsächsischen Ausdruck "calf"-Der Ausdruck _?- Kuhthymusextrakt umfaßt somit auch Kalbsthymusextrakt.

TP-1 ist ein bekannter Kuhthymusextrakt, der inter alia beschrieben wird von Falchetti et al., "Isolation, Partial Characterization and Biological Effects of a Calf Thymus Factor", Abstracts of Third European Immunology Meeting, Copenhagen, August 25-27, 1976; Falchetti et al., "Pharmacological and Biological Properties of a Calf Thymus Extract (TP-D", Drugs Exptl. Clin. Res. 3 (2) 39-47 (1977); Bergesi et al., "Chemical Characterization and Biological Activity of a New Thymic Extract", Folia Allergol. Immunol.

Clin. 2J_: 201, (1977); und Falchetti et al., "Bioassay for Thymic Extracts: Guinea Pig Spleen Lymphocytes - Rapid Red Blood Cells Rosette Method", Cancer Biochem. Biophys., Band

4, Seiten 69-74 (1979). TP-1 ist im Handel von Serono Laboratories, Inc., erhältlich.

Die Extraktion und Reinigung von TP-1 wird in Bergesi et al. Artikel wie folgt beschrieben: Kuh- bzw. Kalbthymusse, akurat homogenisiert, werden mit 0,15M Ammoniumacetat extrahiert und in Anwesenheit von Decalcit zentrifugiert. Die so erhaltene Flüssigkeit wird gesammelt und auf 70⁰C während 30 min erhitzt. Die Proteine, die bei der Durchführung dieses Verfahrens koagulieren, werden abfiltriert und die klare Flüssigkeit wird durch Zugabe von Ammoniumsulfat, bis eine 45%ige Sättigung erreicht wird, präzipitiert. Die erhaltene klare Flüssigkeit wird nach der Abtrennung des Präzipitats durch Zentrifugieren auf eine 90%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat gebracht. Das Präzipitat von diesem letzten Durchgang wird abfiltriert, in Wasser gelöst und längs einer PMrIO-Membran ultrafiltriert. Das Ultrafiltrat, welches Salze und Proteinmaterialien mit einem Molekulargewicht unter etwa 10000 enthält, wird dann lyophilisiert, an Sephadex G-25 entsalzt und anschließend an Sephadex G-50 gelfiltriert. Es werden die Fraktionen gesammelt, die bei der Elektrophorese in PoIyacrylamidgel bei pH 8,6 zwei charakteristische Banden mit einem Rf von etwa 0,25 und 0,44, verglichen mit Bromphenolblau, welches als Tracer verwendet wurde, zeigten.

Es wurde gefunden, daß TP-1 die Kapazität besitzt, das Ansprechen von lymphoiden Mäusemilzzellen gegenüber Phytohämoagglutinin (PHA) und gegenüber der Koncanavalin-A-Stimulierung zu erhöhen, wohingegen es das Ansprüchen gegenüber Lipopolysaccharidstimulierung nicht erhöht, eine Erhöhung in E-rosettebildenden Lymphozyten von humanem Rückenmarkblut zu stimulieren, den Prozentgehalt der theta-positiven Zellen der Mäusemilzpopulation zu erhöhen und die Kapazität von allogeneinen Mäuseknochenmarkzellen, eine Kurve gegenüber itopsdbai auf eireiJ;t=*<± m der rät Röntgenstrahlen bestrahlten Maus zu induzieren, zu stimulieren. TP-1 zeigt keine akute toxische Wirkung oder bemerkenswerte Nebeneffekte bei Dosis-

mengen bis zu 100 mg/kg, wenn es Mäusen während 21 Tagen oder Ratten während 31 Tagen intraperitoneal verabreicht wird noch wenn es Ratten während 180 Tagen in Dosismengen von bis zu 50 mg/kg subkutan verabreicht wird noch wenn es Hunden während 180 Tagen in Dosismengen von bis zu 10 mg/kg intramuskulär verabreicht wird. Es ändert die neuromuskuläre Transmission bestimmt in vitro im diaphragmatischen Zwerchfellnerv von Ratten und in vivo im tibialen Muskel der Maus nicht. Es ändert den Blutdruck und das elektrokardiographische und pneumographische Muster nicht.

TP-1 kann leicht von anderen Thymusextrakten unterschieden werden, da es zwei charakteristische Hauptbanden bei der Elektrophorese am Polyacrylamidgel bei pH 8,6 zeigt, während die anderen derzeit bekannten Thymusextrakte nur eine einzige charakteristische Bande aufweisen. Bei pH 8,6 zeigt TP-1 zwei Banden bei Rf = 0,25 - 0,05 und Rf'= 0,45 - 0,05.

Bis heute wurde TP-1 hauptsächlich durch intramuskuläre Injektion verabreicht, obgleich andere Verabreichungswege ebenfalls verwendet werden können. Die pharmazeutischen Zubereitungen enthalten eine immunopotentierende wirksame Menge von TP-1 zusammen mit einem verträglichen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel, welches im Falle der intramuskulären Zubereitung steriles Wasser sein kann. Andere üblicherweise verwendete Adjuvantien, wie Mannit, können ebenfalls verwendet werden und die üblichen Arten von Adjuvantien können in den anderen Verabreichungsformen eingesetzt werden. Es ist bevorzugt, daß die Zubereitungen für die intramuskuläre Verabreichung 5 bis 25 mg Protein pro ml enthalten.

Die immunopotentierende wirksame Menge von TP-1 hängt von dem Alter und dem Gewicht der zu behandelnden Person, der Art der Verabreichung und der Anwesenheit oder Abwesenheit opportunistischer Infektionen, Kaposi's Sarcoma oder anderer Krankheiten ab. Obgleich die pro Tag verabreichte Dosis-

menge typischerweise im Bereich von etwa 0,5 bis 1,0 mg/kg liegen kann, hängt das Ansprechen beachtlich von Individuum zu Individuum ab und sie wird daher am besten durch den behandelnden Arzt bestimmt.
5

TP-1 wurde in vitro durch Inkubation mit Blutproben aus verschiedenen Patienten mit einem diagnostizierten erlangten Immunomangelsyndrom und mit verschiedenen Blutproben von Kontrollpatienten untersucht. Die erste Untersuchung erfolgte für die Phytohämoagluttinstimulierung (PHA). Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, daß die peripheren Blutlymphozyten in Anwesenheit von Monozyten eine Teilung erleiden, wenn sie durch PHA stimuliert werden, und die geteilten Zellen sind Lymphozyten, die sich vom Thymus ableiten. Das Ausmaß der Teilung kann quantitativ bestimmt werden, wenn man H-Thymidin in der zellularen DNA einverleibt. Nach dem Zählen der Lymphozyten, die in der serumfreien Hanks-Balanced-Salzlösung (HBSS) enthalten sind, und nach Entfernung jener Zellen für den T-Zellenrosetteassay wird der Rest der Zellen in supplementiertem Medium (RPMI-1640, enthaltend 25mM Hepes-Puffer) bei einer Konzentration von 2 χ 10 /ml resuspendiert. Aliquote Teile der Zellen werden zu 10 μΐ der geeigneten PHA-Dosis (0,5 μg, 2 μg oder 10 μg) pro ml Lymphozytensuspension gegeben. 4x10 Zellen pro aliquotem Teil werden zugegeben, die Versuche werden in dreifacher Form durchgeführt und dann wird 72 h bei 37⁰C in einer 5%igen CO--angefeuchteten Atmosphäre inkubiert, mit 0,5μ Ci H-Methylthymidin markiert und weitere 4,5 h inkubiert. Die Zellen werden dann

-4 entnommen und auf ein Raster mit einem Volumen von 10 ml ausgestrichen. Der mittlere Stimulierungswert, der aufgezeichnet wird, ist das Maximum der drei PHA-Dosismengen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

Inkuba- Dosis A.I.D.S. % Er- A.I.D.S. % Er- A.I.D.S. % Ertions- mcg. Patient hö- Patient hö- Patient hösubstanz Nr. 1 hung Nr. 2 hung Nr. 3 hung

keine	0	94	-	53	-	145	-
5 PHA	-	103	-	99	-	25588	-
TP-1+PHA	10	65	-422	66	-72	21170	-17
TP-1+PHA	50	104	11	112	28	33226	30
TP-1+PHA	100	167	711	116	37	231 15	-10
TP-1+PHA	250	113	111	154	120	18603	-27
0 max. % Inkr.	71 1		119		30

Bei den Vergleichsuntersuchungen zeigten zwei Individuen negative Prozenterhöhungen bei allen Dosismengen von TP-1 und vier Individuen zeigten positive Erhöhungen (maximal 16, 20, 7 und 36%), obgleich jedes eine negative Erhöhung bei 250 meg. aufweist. Die vierte dieser Kontrollen hatte ebenfalls eine negative Erhöhung bei 10 meg.

Eine zweite Untersuchungsreihe wurde für die allogenische Stimulierung (allogeneic stimulation) durchgeführt. Die Grundlage dieser Untersuchung ist die Tatsache, daß periphere Blutlymphozyten in Anwesenheit von Monozyten eine Teilung erleiden, wenn sie durch allogene (fremde) Zellen stimuliert werden, und die Geschwindigkeit der Teilung kann durch quantitative Bestimmung der radiomarkierten Thymidinaufnähme in DNA gemessen werden. Nach der Zählung der Lymphozyten, die in dem serumfreien HBSS enthalten sind, und Entfernung von jenen Zellen für den T-Zellenrosetteassay werden die restlichen Zellen in ergänztem Medium bei einer Konzentration von 2x10 /ml resuspendiert. Ein aliquoter Teil der Kontrollzellen wird mit 3000 Rad bestrahlt. Für jede Kultur werden 2x10 Ansprechzellen (in 0,1 ml) mit sterilen bestrahlten Stimulatorzellen 2x10 (in 0,1 ml) jeweils in dreifacher Ausfertigung vermischt. Die Kulturen werden während ungefähr 120 h bei 37⁰C in einer angefeuchteten 5%igen CO^-Atmosphäre inkubiert, mit 0,5μ Ci H-Methylthymidin markiert, in 50 μΐ phosphatgepufferter Salzlösung gegeben und

während weiterer 18 bis 24 h reinkubiert. Die Zellen werden dann entnommen und gezählt. Vgl. Wara et al., New England Journal of Medicine, 1975, 292.70. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

	Inkubations substanz	Dosis mcg.	A.I.D.S Patient Nr. 1	% Er hö hung	190	A.I.D.S. Patient Nr. 2	-13	% Er hö hung
	keine	-	185	-		234		-
10	MLC	-	330	-	929	-
	TP-1 + MLC	10	605	190	648	-40
	TP-1 + MLC	50	498	116	399	-76
	TP-1 + MLC	100	387	39	426	-72
	TP-1 + MLC	250	575	169	840	-13
15
	maximale % Er
	höhung oder minimale %
	Inhibier.(-)	-
20

maximale % Inhibier. (-)
oder minimale

% Erhöhung - 39 -76

Die Ergebnisse der Vergleichsversuche mit den Sera der fünf Individuen, die kein erlangtes Immunmangelsyndrom aufweisen, sind:

Vergleichspatienten 12 3 4 5 maximale % Erhöhung oder minimale % Inhibier. (-) 12 16 30 6 70 maximale % Inhibier. (-) oder
minimale % Erhöhung -4 3 4 18 -11 -23

TP-1 wurde in vivo zur Behandlung eines 43 Jahre alten Man-

nes mit einem erlanten Immunmangelsyndrom verwendet. Das Individuum wurde zuerst im Januar 1981 untersucht und beklagte sich über ein Exanthem, Unwohlsein, Alopecie und Gewichtsverlust während des letzten Jahres. Die Untersuchungen zeigten Ichthyosis, Alopecie und Lymphadenopatie. Es folgte ein Jahr intensiver Untersuchungen, aber eine genaue Diagnose konnte erst gegen Ende 1981, als Untersuchungen mit Lymphozytenmarkern eine T-Zellenlymphopenie mit abnormalem OKT4:OKT8-Verhältnis anzeigten, gestellt werden. OKT4 und OKT8 sind monoklonale Antikörper, die spezifisch auf T-Zellensubsets (-Untergruppen) sind, nämlich der humanai Inducer/Helfer-T-LymphozytensubklassB und der humanan Suppressor/cytotoxischen T-Lymphozytensubklasse. Dieses in Kombination mit abnormalen Immunoglobulinkonzentrationen (IgA 7,6 g/l (normaler Bereich 0,5 bis 3 g/l), IgM 3,3 g/l (normaler Bereich · 0,5 bis 1,7 g/l) und IgG 8,3 g/l (normaler Bereich 5 bis 16 g/l)) und den Ergebnissen der Leberfunktionstests (Aspartattransaminaseaktivität periodisch auf 7 3 IU/1 erhöht (normaler Bereich 17 bis 35 IU/1)) plus dem klinischen Bild ergab die Diagnose.

Im März 1982 bekam der Patient Fieber, Schüttelfrost, Atemlosigkeit und einen Husten. Eine Brustkorbradiographie zeigte weitverbreitete Infiltrate. Der Patient weigerte sich, eine Bronchoskopie durchführen zu lassen, und klinisch wurde Pneumocystis carinii pneumonia diagnostiziert. Parenterales Co-Trimoxazol wurde begonnen (20 mg Trimethoprim/kg und 100 mg Sulphamethoxazol/kg) und beim Patienten trat eine Besserung auf. Über Nacht induzierte die Inkubation in vitro der Lymphozyten des Patienten mit TP-1 bei einer Konzentration von 100 mg/1 einen normalen Anteil von OKT4+-Zellen, wodurch man eine Basis für die Verwendung von TP-1 in vivo erhielt. Dementsprechend wurde die Verabreichung von 0,75 mg TP-1/kg an alternierenden Tagen intramuskulär kurz nach dem Co-Trimoxazol begonnen. Man suchte nach einer Cytomegalovirusinfektion und der Virus wurde darauffolgend wiederholt aus Halswaschungen und Urin isoliert.

Am 17. März betrug die Zahl der OKT4+-Zellen 15 χ 10⁴/l und die Zahl der Zellen nahm auf 100 χ 10 /1 am 16. April und auf 121 χ 10 /1 am 23. April zu. Zwischen dem 23. April und dem 5. Mai 1982 wurde diagnostiziert, daß der Patient eine Candidiasis hatte. Die Behandlung mit TP-1 wurde abgebrochen, nach zwei Monaten war die Lymphozytenzahl auf Werte vor der Behandlung gefallen. Der Patient starb im Juni an einer encephalitischen Krankheit, die gegenüber der Chemotherapie einschließlich antiviraler Mittel resistent war. Das Versagen der Immunostimulierung zur Unterstützung der Lymphocytosis ist vermutlich seiner starken Morbidität zuzuschreiben.

Claims

KRAUS ■ WEISERT & PARTNEP/qnq7c PATENTANWÄLTE O *+ O U O /O UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. DIPL.-1NG. ANNEKÄTE WEISERT . DIPL.-PHYS. JOHANNES SPII IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077 TELEGRAMM KRAUSPATENT · TELEX 5-212156 kpat d · TELEFAX (O89) 7 9182 33 4598 AW/rm SERONO PHARMACEUTICAL PARTNERS Randolph, Mass. / USA Kuhthymusextrakt Patentansprüche

1. Kuhthymusextrakt für die Stimulierung des zellularen Immunsystems einer Person, die ein Immunmangelsyndrom erworben hat, wobei der Extrakt bei der Elektrophorese am PoIyacrylamidgel bei einem pH-Wert von 8,6 zwei charakteristische Hauptbanden mit einem Rf von etwa 0,25 und 0,44 zeigt.

2. Kuhthymusextrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß er in einer für die parenterale Verabreichung geeigneten Form vorliegt.

3. Kuhthymusextrakt nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß er in einer für die intra-

1 muskuläre Verabreichung geeigneten Form vorliegt.

4. Kuhthymusextrakt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß er etwa 5 bis 25 mg Protein 5 pro ml zeigt.