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Die
Erfindung betrifft die Verwendung der Ermittlung der Proteasomenaktivität
zur Standardisierung und Überprüfung von (insbesondere
bei parenteraler Verabreichung) das Immunsystem beeinflussenden
Präparaten durch Prüfung des Effektes auf insbesondere
die Proteaseaktivität von Proteasomen in vitro, sowie entsprechende
Verfahren. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Ermittlung
der Proteasomenaktivität als Biomarker für die
Therapierbarkeit mit (insbesondere parenteral verabreichten) das
Immunsystem beeinflussenden Präparaten, sowie entsprechende
Verfahren und weitere Verwendungen, sowie das Immunsystem beeinflussende
Präparate (insbesondere zur parenteralen Anwendung) zur
Anwendung in Patienten, deren Proteasomenaktivität durch
die Verabreichung das Immunsystem beeinflussender Präparate
moduliert wird. Weitere entsprechende Erfindungsgegenstände
finden sich unten.
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Bei
dem Proteasom handelt es sich um einen großen Proteasekomplex
innerhalb von Zellen. Es stellt die dominierende „Maschinerie” zum
Proteinabbau dar und dient zum einen der Prozessierung von Antigenen, zum
anderen hat sich gezeigt, dass es in zahlreiche Aspekte der Immunantwort
involviert ist. So konnten Proteasomeninhibitoren erfolgreich zur
Verhinderung der Herz-Alloimplantat-Abstoßung, bei der
Behandlung von Autoimmunerkrankungen, und dergleichen mehr, eingesetzt
werden.
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Das
Proteasom weist eine Core-Struktur (Kernstruktur) auf, die als 20S-Proteasom
bezeichnet wird (nach dem Sedimentationsverhalten in der Ultrazentifuge),
die im wesentlichen zylinderförmig ist und aus vielen Untereinheiten
besteht. Die Proteaseaktivität ist dabei im inneren Hohlraum
des Zylinders aufzufinden und somit durch die Wand des Zylinders
abgeschirmt. Der Zylinder besteht aus vier gestapelten Ringen mit
jeweils sieben Untereinheiten. In Eukaryonten bestehen die äußeren
beiden Ringe aus sieben verschiedenen α-Untereinheiten,
während die inneren beiden Ringe aus sieben verschiedenen β-Untereinheiten
gebildet werden. Nur die β1-, β2- und β5-Untereinheiten
beinhalten Proteaseaktivitäten – mit fünf
charakterisierten Protease-Aktivitäten: chymotrypsin-artiger,
trypsin-ähnlicher, peptidylglutamyl-hydrolysierender (caspase-ähnlicher),
nach verzweigten Ketten spaltender und zwischen neutralen Aminosäuren
spaltender Aktivität. Das 20S-Proteasom kann nur entfaltete
Proteine in kurze Peptide spalten, wobei kein ATP benötigt
wird. Die Peptide können dann beispielsweise vom MHC-I
(Major Hisocompatibility Complex I = Haupthistokompatibilitätskomplex
I) dem Immunsystem präsentiert werden und so zur Immunsensibilisierung
und -reaktion, beispielsweise über T-Zellen, führen
und damit zu einer Aktivierung des Immunsystems.
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Die
Mehrzahl der Proteasomen in eukaryotischen Zellen liegt in einer
26S-Form vor, welche aus dem 20S-Core (Kern) und einem an den Enden
gebundenen regulatorischen 19S-Komplex besteht. Das 26S-Proteasom „verdaut” intakte,
aber ubiquitinylierte Proteine, wobei diesmal ATP benötigt
wird.
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Die
Ubiquitinylierung von Proteinen dient in der Zelle zu deren Markieren
für den spezifischen und zeitgerechten Abbau. Es hat sich
ferner gezeigt, dass in Immunzellen (wie T-Zellen, dendritischen
Zellen) ein sehr großer Teil des Proteasoms als sogenanntes
Hybrid-Proteasom vorliegt: Der zylinderförmige 20S-Core
hat auf der einen Seite einen 19S-Regulatorkomplex gebunden, auf
der anderen Seite aber einen Proteasomaktivator PA28 gebunden. Außerdem
liegt das 20S-Proteasom zum großen Teil als PA28/20S/PA28-Komplex
vor. Die vor- und nachstehend beschriebenen Effekte von LNCC und
TPCC beziehen sich auch auf diese Proteasom-Formen.
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Proteasomeninhibitoren
induzieren einen programmierten Zelltod (Apoptose) in non-Hodgkins-Lymphom-Modellen
und Multiplem Myelom. Proteasomen-Inhibierung wurde als ein Weg
zur Induktion der Chemosensitivierung und zum Überwinden
einer Chemoresistenz bei der Tumortherapie mit Chemotherapeutika beschrieben – beispielsweise,
indem eine Aktivierung des antiapoptotischen NF-κB-Wegs
durch Chemotherapeutika mittels Proteasomeninhibitoren verhindert
wird. Damit können durch Proteasomen-Hemmung maligne Zellen
für die Apoptose sensitiviert werden und damit beispielsweise
proliferative Erkrankungen, wie Tumoren, Psoriasis oder dergleichen,
einer verbesserten Therapie zugänglich gemacht werden.
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Detaillierte
Beschreibungen der Wirkungen und der Struktur und weitere Informationen
bezüglich der Proteasomen können beispielsweise Wu,
J., American J. of Transplantation 2 (2002), Seiten 904–912; Adams J.,
Trends Mol. Med. 8 (4) (Suppl.), 2002, S49–S54; Elliot,
P. J and Ross, J. S., Am. J. Clin. Pathol. 116 (2001), 637–646;
Antitumoreffekte von Proteasomeninhibitoren z. B. in Orlowski,
R. Z., und Kuhn, D. J., Clin. Cancer Res. 14 (6) (2008), 1649–55,
entnommen werden.
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Es
wurde nun überraschend gefunden, dass die Protease-Aktivität
von Proteasomen durch das Immunsystem beeinflussende pharmazeutische
Präparate moduliert werden kann; insbesondere vorteilhaft durch
Hemmung (was auch möglicherweise zu vermindertem Abbau
von Antigenen führen kann) oder vorteilhaft (da dann von
verstärkter Antigenpräsentation beispielsweise
durch den MHC-I auszugehen ist) durch Aktivierung der Aktivität
von Proteasomen.
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Dieser
Befund einer Modulation der Proteaseaktivität in Proteasomen
ermöglicht einerseits, das Immunsystem beeinflussende Präparate
auf ihre Wirksamkeit hin zu prüfen und/oder zu standardisieren:
Wird ein bestimmter Effekt am Proteasom gefunden, kann dies zum
einen qualitativ, zum anderen auch nach entsprechender Normierung
quantitativ zur Überprüfung und/oder Standardisierung
der Präparate (beispielsweise auf Konformität
unterschiedlicher Chargen oder dergleichen) verwendet werden.
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Der
Befund ermöglicht andererseits auch, Patienten oder Patientenkollektive
herauszufinden, die einer Therapie mit den das Immunsystem beeinflussenden
pharmazeutischen Präparaten zugänglich sind: Dort, wo
eine Änderung der Protease-Aktivität der Proteasomen
in vitro gefunden wird, ist davon auszugehen, dass auch eine Verabreichung
an die Patienten eine modulierende Wirkung auf das Immunsystem erzielt.
Die Modulierbarkeit der Protaseaktivität der Proteasomen
in vitro dient somit als ein Biomarker für die Therapierbarkeit von
Patienten. Insbesondere kann also mit einer Probe herausgefunden
werden, ob sie aus einem einer Therapie zugänglichen Patienten
oder Patientenkollektiv stammt. Daraus können, müssen
jedoch nicht, Rückschlüsse darauf gezogen werden,
ob ein Proband für eine bestimmte Therapie mit einem das
Immunsystem beeinflussenden Präparat zugänglich
sein kann, so dass entsprechende Therapieentscheidungen möglich werden.
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Dies
ist aus folgenden Gründen verständlich: Bisher
wurden das Immunsystem beeinflussende Präparate, wie insbesondere
LeukoNorm® oder Thymophysin®, parenteral, vor allem durch intramuskuläre
Injektion, verabreicht. Dies lässt vermuten, dass die in
den oben und unten beschriebenen Testverfahren gefundene Modulierung
der Proteaseaktivität der Proteasomen auch in vivo gefunden
werden können, da Zellen mit den Wirkstoffen direkt in
Kontakt kommen können.
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Die
Erfindung betrifft daher in einer ersten Ausführungsform
die Verwendung der Ermittlung der Proteasomenaktivität
zur Standardisierung und/oder Überprüfung von
(insbesondere bei parenteraler Verabreichung) das Immunsystem beeinflussenden
Präparaten durch Prüfung des Effektes auf die
Proteaseaktivität von (insbesondere aus Probanden, vor
allem aus Blut oder Milzproben gewonnenen) Proteasomen in vitro,
wobei der Effekt, insbesondere das Vorhandensein (bevorzugt) oder
Fehlen einer Modulierung der Proteaseaktivität von Proteasomen
durch Zugabe der das Immunsystem beeinflussenden Präparate,
vor allem im Vergleich zu Proben ohne Zugabe das Immunsystem beeinflussender
Präparate, gemessen und vorzugsweise mit einem zuvor (z.
B. als Mittelwert verschiedener Messungen oder als Mittelwert von
solchen Präparaten, bei denen gute Aktivität an
Probanden gefunden wurde) ermittelten Standard verglichen wird.
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Die
Erfindung betrifft in einer zweiten Ausführungsform ein
Verfahren (oder eine Methode) zur Standardisierung und/oder Überprüfung
von (insbesondere bei parenteraler Verabreichung) das Immunsystem
beeinflussenden Präparaten durch Prüfung deren
Effektes auf die Proteaseaktivität von Proteasomen in vitro,
wobei das Vorhandensein oder Fehlen einer Modulierung der Proteaseaktivität
von Proteasomen durch Zugabe der das Immunsystem beeinflussenden
Präparate gemessen und mit (z. B. zuvor ermittelten) Standardwerten verglichen
wird.
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Die
Erfindung betrifft in einer dritten Ausführungsform die
Verwendung der Ermittlung der Proteaseaktivität von Proteasomen
als Biomarker für die Therapierbarkeit mit (insbesondere
parenteral verabreichten) das Immunsystem beeinflussenden Präparaten,
wobei eine (zuvor entnommene, direkt oder nach Lagerung z. B. im
gekühlten oder gefrorenen Zustand verwendete) Gewebs- oder
Flüssigkeitsprobe eines Patienten (in Anwesenheit oder
vorzugsweise Abwesenheit des Patienten) (oder mehrere Proben aus
mehreren Patienten zur Überprüfung eines Patientenkollektives)
in vitro darauf hin geprüft wird, ob die Proteaseaktivität
darin vorhandener Proteasomen durch Zugabe der das Immunsystem beeinflussenden
Präparate moduliert wird, sowie eine entsprechende Methode,
um herauszufinden, ob in einer solchen Probe die Proteaseaktivität
darin vorhandener Proteasomen durch Zugabe der das Immunsystem beeinflussenden
Präparate moduliert wird. In beiden Fällen wird
also in der Regel die Proteaseaktivität in Proteasomem
in Anwesenheit und in Abwesenheit der das Immunsystem beeinflussenden
Präparate bestimmt und bei Finden einer Differenz auf eine
Modulierung der Proteaseaktivität in Proteasomen geschlossen.
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In
einer vierten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein
Kit zur Ermittlung der Änderung der Proteaseaktivität
an Proteasomen, beinhaltend ein oder mehrere fluorogene Substrate
(insbesondere wie unten genannt) zur Bestimmung mindestens einer
der Proteaseaktivitäten ausgewählt aus trypsin-ähnlicher,
nach verzweigten Ketten spaltender, zwischen neutralen Aminosäuren
spaltender Aktivität oder insbesondere aus chymotrypsin-ähnlicher
und caspase-ähnlicher Aktivität von Proteasomen,
insbesondere 20S- oder vor allem 26S-Proteasomen, zur Anwendung
als Biomarker für die Therapierbarkeit eines Probanden
mit das Immunsystem beeinflussenden Präparaten, insbesondere
zur Verwendung unter Einbezug mindestens einer der nachfolgenden
Definitionen.
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In
einer fünften Ausführungsform betrifft die Erfindung
die Verwendung eines fluorogenen Substrates, insbesondere zur Herstellung
eines Diagnostikums, oder eines Kits wie vorstehend genannt, zur
Bestimmung oder hergerichtet zur Bestimmung mindestens einer der
Proteaseaktivitäten ausgewählt aus trypsin-ähnlicher, nach
verzweigten Ketten spaltender, zwischen neutralen Aminosäuren
spaltender Aktivität oder insbesondere aus chymotrypsin-ähnlicher
und caspase-ähnlicher Aktivität von Proteasomen
als Biomarker für die Therapierbarkeit eines Probanden
mit das Immunsystem beeinflussenden Präparaten, vorzugsweise
einem Thymusextrakt oder einem Leukozytenextrakt.
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Die
nachfolgenden Definitionen, wie auch zuvor gegebene Präzisierungen,
können anstelle allgemeinerer Begriffe einzeln oder zu
mehreren eingesetzt werden, was zur Definition bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung führt.
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Unter „die
Proteaseaktivität modulierend” oder „Modulierung
der Proteaseaktivität” von Proteasomen ist vor
allem eine Aktivierung und/oder Inaktivierung von einer oder mehrerer
der Proteaseaktivitäten an Proteasomen zu verstehen, beispielsweise
der chymotrypsin-ähnlichen, trypsin-ähnlichen,
peptidylglutamyl-hydrolysierenden (caspase-ähnlichen),
der nach verzweigten Ketten spaltenden oder der zwischen neutralen Aminosäuren
spaltenden Aktivität. Dabei können bestimmte Proteaseaktivitäten
in gleicher Richtung beeinflusst werden (Hemmung oder Aktivierung),
oder verschiedene Pro teaseaktivitäten können teils
gehemmt, teils aktiviert werden, teils unbeeinflusst bleiben.
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Bevorzugt
ist die Aktivierung oder alternativ die Inaktivierung von mindestens
einer der genannten Proteaseaktivitäten, insbesondere der
caspase- und/oder der chymotrpysin-ähnlichen Aktivität
von Proteasomen.
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Bevorzugte
Beispiele betreffen die Hemmung der caspase-ähnlichen Aktivität
bei 20S-Proteasomen (besonders bevorzugt, da Teilhabe an proapoptotische
Aktivität, z. B. gegen proliferative Erkrankungen), insbesondere
mittels Thymophysin; die Aktivierung der caspase-ähnlichen
Aktivität bei 26S-Proteasomen (besonders bevorzugt, da
Teilhabe an Antigenpräsentation und damit Modulierung,
insbesondere Aktivierung, der Immunabwehr), insbesondere mittels
Thymophysin; die Hemmung der chymotrypsin-ähnlichen Aktivität
am 20S-Proteasom (besonders bevorzugt, da Teilhabe an proapoptotische
Aktivität, z. B. gegen proliferative Erkrankungen), insbesondere
mittels Leukonorm; oder die Hemmung der chymotrypsin-ähnlichen
Aktivität am 26S-Proteasom (besonders bevorzugt, da Teilhabe
an proapoptotische Aktivität, z. B. gegen proliferative
Erkrankungen), insbesondere mittels Leukonorm.
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Unter
einer modulierenden Wirkung auf das Immunsystem ist einerseits eine
Aktivierung zu verstehen, aber auch eine Hemmung, oder allgemein
eine Abstimmung unterschiedlicher Komponenten des Immunsystems,
welche Inaktivierungen und Aktivierungen verschiedener Komponenten
des Immunsystems beinhalten kann, beispielsweise, um eine begleitende
Therapie von proliferativen Erkrankungen, insbesondere von Zellen des
Immunsystems, mittels das Immunsystem beeinflussenden Präparaten
zu erzielen.
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Unter „einer
Therapie mit den das Immunsystem beeinflussenden pharmazeutischen
Präparaten zugänglich” ist insbesondere
zu verstehen, dass bei einem Patienten oder einem Patientenkollektiv
aufgrund eines erfindungsgemäß an Proben gewonnenen
Befundes der Modulierbarkeit mindestens einer Proteaseaktivität
von Proteasomen als Biomarker eine Therapie als sinnvoll erscheint – bei
Patienten ohne solche Beeinflussbarkeit der Proteaseaktivitäten
ist dagegen von keiner oder nur geringer Therapierbarkeit auszugehen. Beispielsweise
ist eine Hemmung einer Proteaseaktivität an Proteasomen
ein möglicher Indikator einer Aktivierbarkeit der Apoptose
und somit einer Therapierbarkeit proliferativer Erkrankungen, während
eine Aktivierung einer Proteaseaktivität an Proteaseomen
ein Indikator für eine Fähigkeit zur Modulierung
des Immunsystems in einem Probanden ist.
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Proband,
Patient oder dergleichen bezieht sich auf Tiere oder insbesondere
Menschen, insbesondere menschliche Patienten.
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Vorzugsweise
ist in allen Ausführungsformen der Erfindung die Aktivitätsmodulierbarkeit
an 26S-Proteasomen der wichtige und damit bevorzugt zu ermittelnde
Parameter, da diese stärker der physiologischen Form entsprechen.
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Eine
Modulierung des Immunsystems, insbesondere eine Aktivierung oder
Inaktivierung oder allgemein Abstimmung verschiedener Komponenten
des Immunsystems, ist beispielsweise bei folgenden Erkrankungen
(was Zustände einschließt) angezeigt: Erkrankungen,
bei denen eine eingeschränkte Funktionsfähigkeit
der körpereigenen Abwehr (Immunsystem) nachgewiesen wurde
oder mit hoher Wahrscheinlichkeit zu vermuten ist, wie primäre
(angeborene) Immundefekte, z. B. Wiskott-Aldrich-Syndrom oder DiGeorge-Syndrom;
sekundäre (erworbene) Immundefekte, z. B. stets wiederauftretende
(chronisch-rezidi vierende) therapieresistente Infektionen durch
Bakterien oder durch Mycoplasmen (z. B. Tuberkulose), durch Viren
(z. B. Herpes- oder HPV-Infektionen, Hepaptididen oder HIV-Infektionen),
oder durch Pilze (z. B. chronisch rezidivierende Candidosen), Immunschwäche
nach Strahlen- bzw. Chemotherapie von malignen (bösartigen)
Krebserkrankungen, oder intensivmedizinische Notfälle,
einschließlich Sepsis; Autoimmunerkrankungen, z. B. Rheumatische
Erkrankungen, wie Rheumatoide Arthritis, endogene Uveitis, insbesondere
mit häufig rezidivierenden Charakter, Multiple Sklerose,
Amyotropische Lateralsklerose, Psoriasis oder Atopisches Ekzem;
oder bei sonstigen Indikationen, wie (oft immunologisch bedingten)
habituellen Aborten, Verbesserung der Ergebnisse bei immunologisch
bedingten, mehrfachen frustranen Behandlungszyklen bei künstlicher
Befruchtung (IVF oder ICSI) oder chronischem Müdigkeitssyndrom,
oder zwei oder mehr dieser Erkrankungen oder Zustände.
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Proliferative
Erkrankungen (einschließlich Zustände) sind beispielsweise
Krebs, wie Erkrankungen an soliden Tumoren, z. B. Brustkrebs, Prostatakrebs,
Ovarialkrebs, Gebärmutter(hals)krebs, Nierenkrebs, Hodenkrebs,
Hautkrebs, Leberkrebs, Krebs des Gastrointestinaltraktes, Hirntumoren,
Kopf- oder Nackenkrebs oder dergleichen, proliferative Erkrankungen
des Immunsystems, wie maligne Lymphozytenerkrankungen, z. B. Lymphome,
Leukämien oder dergleichen, oder andere Erkrankungen, die
mit ungeregelter Vermehrung von Zellen einhergehen, wie Psoriasis,
vaskulär proliferative Erkrankungen oder dergleichen mehr.
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Bei
all diese Erkrankungen kann mittels der erfindungsgemäßen
Verwendungen, Methoden und Verfahren geprüft werden, ob
sie einer Therapie mit einem das Immunsystem beeinflussenden Präparat
zugänglich sind.
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Das
Immunsystem beeinflussende (anregende und/oder hemmende) Präparate
(wobei bei Verwendung dieser Formulierung auch und vorzugsweise
ein einzelnes entsprechendes Präparat gemeint ist, oder mehrere,
das heißt, der Plural steht für „ein
oder mehrere” solche Präparate oder „mindestens
ein” solches Präparat, vorzugsweise ein solches
Präparat) sind insbesondere Thymusextrakte, insbesondere
Thymostimulin (insbesondere bekannt unter dem Namen Thymophysin®, CytoChemia AG, Ihringen, Deutschland)
oder Extrakte aus Leukozyten, insbesondere Leukozytenultrafiltrat,
wie vorzugsweise Leukonorm® (CytoChemia
AG, Ihringen, Deutschland).
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Bei
LeukoNorm
® CytoChemia (CytoChemia
AG, Ihringen, Deutschland) handelt es sich um ein Humanes Leukozyten-Ultrafiltrat – ein
aus menschlichen Leukozyten des peripheren Blutes gewonnenes Medikament,
welches nach etlichen Filtrations- und Reinigungsvorgängen,
wie in der
DD 301 781 beschrieben,
nur noch Bruchstücke der ursprünglichen Leukozyten
enthält. Es umfasst sämtliche Inhaltsstoffe, also
auch Botenstoffe, bis zu einer bestimmten Maximalgröße
von ungefähr 10 000 Dalton. Als Präparat wird
dieses Gemisch beispielsweise in physiologischer (0,9%-iger) Kochsalzlösung
zur Injektion verwendet.
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Bei
Thymophysin handelt es sich im einen Thymusextrakt, der im wesentlichen
wie in
DE 34 30 375 und
den darin genannten Referenzen hergestellt werden kann (
DE 34 30 375 und die die
Herstellung betreffenden Referenzen darin werden hier durch Bezugnahme
aufgenommen). In kurzer Darstellung kann es hergestellt werden wie
folgt: im wesentlichen wie folgt hergestellt wird:
Thymostimulin
wird aus einem Extrakt von Peptiden aus Thymusdrüsen des
Rinds gewonnen (z. B. Thymophysin CytoChemia
® 25/50):
Nach Entfernung höhermolekularer Zellkomponenten und Proteine
werden niedermolekulare aktive Thymuspeptide isoliert und auf einen
definierten Peptidgehalt standardisiert. In einem ersten Schritt
wird hierzu homogenisierter Kalbsthymus mit einer Ammoniumacetatlösung
extrahiert. Der erhaltene Überstand wird zweimal mit Ammoniumsulfat
gefällt. Danach folgt Dialyse zum Entsalzen, welche Moleküle
mit einem Molekulargewicht unter 1000 Dalton entfernen kann. Dies
wird gefolgt von einer Ultrafiltration der resultierenden Lösung,
wobei eine Lösung von Komponenten mit 10 000 Dalton oder
weniger erhalten wird. Diese resultierende Lösung (beinhaltend
Peptide mit bis maximal 10 000 Dalton) wird lyophilisiert, wobei das
endgültige aktive Prinzip (Wirkstoff) erhalten wird (als
Präparat wird er beispielsweise in physiologischer (0,9%-iger)
Kochsalzlösung zur Injektion verwendet).
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Die
Bestimmung der Proteaseaktivität beinhaltet die Ermittlung
einer der drei folgenden proteolytischen Aktivitäten der
Proteasomen:
Die chymotrypsin-ähnliche Aktivität
wird beispielsweise mittels des Substrats Suc-LLVY-MCA (SEQ ID NO:
1) (ENZO Life Sciences GmbH, Lörrach, Deutschland), was
für N-Succinyl-Leucyl-Leucyl-Valyl-Tyrosyl-MCA (4-methylcoumarin-7-amid),
ein fluorogenes Substrat (das nach Spaltung Fluoreszenz zeigt),
steht, ermittelt.
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Die
caspase-ähnliche Aktivität wird beispielsweise
mittels des Substrates Z-LLE-MCA (SEQ ID NO: 2) (Enzo Life Sciences
Inc., Farmingdale, NY, USA) ermittelt, was für Benzyloxycarbonyl-Leucyl-Leucyl-Glutamyl-MCA,
ein fluorogenes Substrat, steht.
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Die
trypsin-ähnliche Aktivität wird beispielsweise
mittels des Substrates Cbz-VGR-MCA (SEQ ID NO: 3) (Enzo Life Sciences
Inc.) ermittelt, was für Carbobenzoxy-Valyl-Glycyl-Arginyl-MCA,
ebenfalls ein fluorogenes Substrat steht.
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Alternative
Substrate sind denkbar, wie auch Prüfungen anderer der
eingangs genannten Proteaseaktivitäten mit anderen dafür üblichen
Substraten.
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Fluorogene
Substrate sind allgemein insbesondere solche, die eine Oligopeptidkette
(beispielsweise mit 2 bis 50 Aminosäuren) mit einer geeigneten
Spaltstelle für die Ermittlung der chymotrypsin-ähnlichen,
trypsin-ähnlichen, caspase-ähnlichen, nach verzweigten
Ketten spaltenden und zwischen neutralen Aminosäuren spaltenden
Aktivität und eine fluorophore und eine fluoreszenzquenchende
Gruppe enthalten, die durch die entsprechende Proteaseaktivität
unter Spaltung einer Peptidbindung voneinander getrennt werden,
so dass verstärkte Fluoreszenz möglich wird. Beispiele
sind die genannten fluorogenen Substrate.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere die in den Ansprüchen genannten
Erfindungsgegenstände, vorzugsweise die in den Unteransprüchen
genannten. Die Ansprüche werden hier durch Bezugnahme aufgenommen.
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Sehr
bevorzugt betrifft die Erfindung die in den Beispielen genannten
Methoden und Verfahren, insbesondere hinsichtlich der caspase- und/oder
der chymotrypsin-ähnlichen Aktivität der Proteasomen
und insbesondere die als „Standard” gekennzeichneten
Ausführungsformen mit Erythrozyten.
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Die
nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung, ohne
ihre Bedeutung einzuschränken.
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Die
In vitro-Bestimmung gemäß der Erfindung wird mit
aus dem Blut (roten Blutkörperchen aus Tier oder Mensch),
dann nachfolgend als „Standard” bezeichnet, oder
aus (für reine Standardisierungszwecke zu bevorzugendem)
tierischem (wie Nagetier- oder Rinder-) oder alternativ (insbesondere,
wenn es um den Wert für Therapierbarkeit geht) humanem
Milzgewebe isolierten Proteasomen (dann als „Immuno” bezeichnet) durchgeführt.
Sie wird mit 26S-Proteasomen (mit regulatorischer Einheit) oder
20S-Proteasomen (ohne regulatorische Einheit) durchgeführt,
wie nachfolgend angegeben.
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Die
Isolierung für 20S-Proteasomen wird durchgeführt
nach dem in der Publikation von Schmidt F. et al. in Proteomics
6, 4622–4532 (2006) beschriebenen Verfahren: Die
Blutzellen oder das Milzgewebe werden in einem 3-fachen Volumen
w/v 20 mM Tris/HCl/1 mM EDTA/1 mM NaN3/1
mM DTT, ph 7.0 (TEAD-Puffer) homogenisiert. Das Homogenisat wird
bei 15 000 g während 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand
einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung unterworfen. Proteine, die bei
einer Sättigung zwischen 45 und 65% bezüglich
Ammoniumsulfat ausfallen, werden in TEAD-Puffer gelöst
und gegen den selben Puffer dialysiert. Die dialysierte Proteinlösung
wird auf eine DEAE-Sephacel-Säule (5 × 15 cm;
schwacher Anionenaustauscher mit Diethalaminoethyl-gruppen, basierend
auf kugelförmiger Cellulose, Ausschlussgrenze etwa 1 000
000 Dalton für globuläre Proteine; GE Healthcare,
München, Deutschland), die mit TEAD-Puffer äquilibriert
ist, aufgetragen. Die gebundenen Proteine werden mit einem linear
ansteigenden Natriumchlorid-Gradienten 0 bis 400 mM, gelöst
in TEAD-Puffer, eluiert. Um das Proteasom im Eluat zu detektieren,
werden die gesammelten Fraktionen mit dem fluorogenen Substrat Suc-LLVY-MCA
(SEQ ID NO: 1) wie in Dahlmann et al., J. Mol. Biol. 303 (2000),
643–653 beschrieben geprüft. Proteasom-haltige
Fraktionen werden vereint und dann einer Gelfiltration auf einer
Sepharose 6B- Säule (3 × 80 cm; kügelchenförmige
Agarose; GE Healthcare, München, Deutschland), die in TEAD-Puffer äquilibriert
ist, unterzogen. Fraktionen, die 20S-Proteasom enthalten, werden
vereinigt und weiter durch Chromatography auf einer Mono Q(HR5/5)-Säule
(Anionenaustauscher basierend auf kugelförmigem hydrophilem
Harz, geladene Gruppe ist Trimethylaminomethyl; GE Healthcare, München, Deutschland).
Das Proteasom wird von der Säule mittels eines ansteigenden
Natriumchlorid/TEAD-Gradienten (0–300 mM) eluiert. Dann
werden die proteasomenhaltigen Fraktionen vereinigt, bis zu einer
Endkonzentration von 1,2 M Ammoniumsulfat zugesetzt und die Lösung
auf einer Phenyl-Superose-Säule (Derivat der Agarose-basierten
Superose 12 mit kovalent gebundenen hydrophoben Phenyl-Gruppen;
GE Healthcare, München, Deutschland). Von dieser Säule
werden die Proteasomen mit einem linear abnehmenden Gradienten (1,2–0,0
M) Ammoniumsulfat in TEAD eluiert und dann ausgiebig gegen TEAD-Puffer
dialysiert. Die erhaltenen Proteasomen werden im Testssystem verwendet.
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Das
Isolierungsverfahren für 26S-Proteasomen erfolgt nach der
Methode, die in Dahlmann B. et al., Biochem. J. 309, 195–202
(1995) beschrieben ist, wobei zusätzlich der Enzymkomplex
einem Reinigungsschritt per Glycerin-Gradienten-Zentrifugation unterzogen
wird, wie in Kopp F. et al., J. Mol. Biol. 313, 465–471 (2001) beschrieben.
In Kurzfassung werden Blut oder die Gewebeprobe in 400 ml TSG-Puffer
(10 mM Tris/HCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 20% Glycerin (v/v),
pH 7.0) und wird mit einem Waring Blendor innerhalb zwei Minuten
homogenisiert. Das Homogenat wird bei 20 000 g für zwei
Stunden zentrifugiert und durch eine Schicht Glaswolle filtriert,
wobei der Rohextrakt erhalten wird. Der Rohextrakt wird auf eine
Säule (2 × 15 cm) Fractogel TSK DEAE 650 S (Anionenaustauscher;
Merck, Darmstadt, Deutschland), äquilibriert mit TSDG-Puffer
(10 mM Tris/HCl, 25 mM KCl, 1,1 mM MgCl2,
0,1 mM EDTA, 1 mM DTT und 20% Glycerin (v/v), pH 7.0), aufgetragen.
Nach Waschen mit 125 mM KCl, gelöst in TSDG-Puffer, werden
die gebundenen Proteine mit einem linearen Gradienten (400 ml) 125–300
mM KCl in TSDG-Puffer eluiert. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt.
Die enzymhaltigen Fraktionen werden in einer Amicon-Zelle (YM-100-Membran;
Millipore, Billerica, USA) aufkonzentriert und dann einer Gelfiltration
auf mit TSDG-Puffer äquilibrierter Sepharose 6B (5 × 95
cm; siehe oben) unterzogen. 10-ml-Fraktionen werden gesammelt. Arginin-Sepharose
(arginin-modifizierte Agarose; GE Healthcare, München,
Deutschland) wird mit TSDG-Puffer äquilibriert und die
zuvor erhaltene Enzym-Lösung auf die Säule (1 × 4
cm) aufgetragen. Die Säule wird mit TSDG-Puffer gewaschen,
bis die Lichtabsorption bei 280 nM zur Basislinie zurückkehrt.
Die Säule wird dann mit einem Bettvolumen 100 mM KCl/TSDG-Puffer
gewaschen, gefolgt von Flution mit einem linearen Gradienten (200
ml) von 100–200 mM KCl/TSDG-Puffer. 2-ml-Fraktionen werden
gesammelt. Nach Konzentrierung durch Zentrifugation für
24 Stunden bei 35 000 Umdrehungen pro Minute (rpm) in einem Beckman
Ti45-Rotor (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) werden 120 μg
des konzentrierten Proteins auf einen 20%–40%-Glycerin-Gradienten
(v/v) in 20 mM Tris-HCl, 1.1 mM MgCl2, 0,1
mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM NaN2, 2 mM ATP,
ph 7,5 (Puffer mit niedriger Ionenstärke) aufgetragen.
Nach 24 Stunden bei 25 000 rpm in einem Beckman SW40-Rotor und Fraktionierung
(0,4 ml/Fraktion) werden 10 μl-Aliquots auf Proteaseaktivität
getestet (z. B. auf chymotryptische Aktivität mit Suc-LLVY-MCA,
100 μM Endkonzentration). Die erhaltenen Proteasomenfraktionen
werden weiter eingesetzt für die Prüfung auf Proteaseaktivität.
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Die
isolierten 20S- bzw. 26S-Proteasomen werden in TEAD-Puffer bei 4°C
oder wie angegeben bis zur Weiterverwendung aufbewahrt.
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Ermittlung der proteolytischen Aktivität
der 20S-Proteasomen:
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Die
wie oben beschrieben aus humanen Erythrozyten oder humanem Milzgewebeisolierten
20S-Proteasomen werden in TEAD-Puffer (siehe oben) getestet mit
folgenden Substraten:
Suc-LLVY-MCA (SEQ ID NO: 1)
Z-LLE-MCA
(SEQ ID NO: 2)
Cbz-VGR-MCA (SEQ ID NO: 3)
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Zur
Spezifizität siehe oben im allgemeinen Teil der Beschreibung
und unterhalb der nachfolgenden Tabellen.
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Die
Substrate werden als Stammlösung (10 mM) in Dimethylsulfoxid
(DMSO) gelöst und dann mit TEAD-Puffer auf eine Konzentration
von 200 μM (Suc-LLVY-MCA) oder 400 μM (Cbz-VGR-MCE,
Z-LLE-MCA) verdünnt.
-
10 μl
Enzyme (50–100 ng), verdünnt mit TEAD-Puffer,
10 μl (3,5–7 μg) TPCC oder LNCC, gelöst
in 0,9% NaCl und 20 μl Substratlösung werden gemischt
und für 10 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert.
Dann werden 200 μl Stop-Lösung (100 mM Natriumchloracetat
gelöst in 30 mM Natriumacetat, 70 mM Essigsäure,
pH 4,3) zugegeben. Die Fluoreszenz wird in einem Mikroplatten-Fluorometer
(SLT Labinstruments Deutschland GmbH, Achterwehr, Deutschland) bei
355 nM Exzitation und 460 nm Emission bestimmt.
-
Die
molare Substrathydrolyse wird mittels eines 7-Amino-4-methylcoumarin(MCA)-Standards
berechnet.
-
Ermittlung der proteolytischen Aktivität
der 26S-Proteasomen:
-
Im
Falle der 26S-Proteasomen wird wie folgt vorgegangen: Die 26S-Proteasomen
aus humanen Erythrozyten oder humanem Milzgewebe werden gereinigt
und in Proteasomen-Speicherpuffer bei –20°C bis
zur Verwendung aufbewahrt.
Proteasomen-Speicherpuffer: 40%
Glycerin/10 mM Tris/HCl/25 mM KCl/1,1 mM MgCl2/0,1
mM EDTA/1 mM DTT/1 mM NaN3/2 mM ATP, pH
7,0.
Substratpuffer: 30 mM Tris/HCl/0,5 mM DTT/1 mM NaN3/5 mM MgCl2/10 mM
KCl, pH 7,2.
-
Die
Substrate sind wie bei der Messung mit 20S-Proteasomen genannt.
-
Die
Substrate werden in einer Stammlösung (10 mM) in DMSO gelöst
und dann mit Substratpuffer bis auf eine Konzentration von 200 μM
(Suc-LLVY-MCA) oder 400 μM (Cbz-VGR-MCA, Z-LLE-MCA)
-
10 μl
Enzym (50–100 ng), verdünnt mit Substratpuffer,
10 μl (3,5–7 μg) TPCC oder LNCC, gelöst
in 0,9% NaCl sowie 20 μl Substratlösung werden
10 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann werden 200 μl
Stoplösung, wie bei der Messung für 20S-Proteasomen
beschrieben, zugefügt und wie dort die Fluoreszenz und die
molare Substrathydrolyse bestimmt.
-
Folgende
Ergebnisse lassen sich beispielsweise finden: Tabelle
A) Hemmwirkung der chymotrypsin-artigen Aktivität (Substrat
Suc-LLVY-MCA) mit Leukonorm von Proteasomen aus humanen Erythrozyten
(„Standard”) oder Milz („Immuno”)
(S. D. = Standarabweichung, T-Test = Student-T-Test, p-Wert)
| LNCC | | | |
| | | | |
| 20S
Standard | Aktivität | S.
D. | T-test |
| LNCC μg/Test | (%
der Kontrolle) | | p |
| 0 | 100 | 0 | |
| 5 | 98 | 6 | 0,065330165 |
| 10 | 86 | 10 | 3,82361E–09 |
| 20 | 75 | 18 | 3,82361E–09 |
| 40 | 46 | 20 | 4,18939E–07 |
| 80 | 29 | 20 | 4,73994E–12 |
| 160 | 23 | 17 | 6,61281E–12 |
| 320 | 17 | 13 | 3,6115E–05 |
| | | | |
| 20S
Immuno | | | |
| LNCC μg/Test | | | |
| 0 | 100 | 0 | |
| 10 | 59,5 | 3,5 | 0,00738574 |
| 20 | 41 | 4 | 0,00456493 |
| 40 | 26 | 3 | 0,00163949 |
| 80 | 19 | 4 | 0,00242977 |
| 160 | 13,5 | 5,5 | 0,00401855 |
| | | | |
| TPCC | | | |
| | | | |
| 20S
Standard | Aktivität | S.
D. | t-Test |
| TPCC μg/Test | (%
der Kontrolle) | | p |
| 0 | 100 | 0 | |
| 0,438 | 46,4 | 17,9 | 0,0039 |
| 0,875 | 37,2 | 21,3 | 0,0041 |
| 1,75 | 34,5 | 19,4 | 0,0025 |
| 3,5 | 31,6 | 16,1 | 0,0011 |
| 7 | 29,6 | 15,9 | 0,0009 |
| | | | |
| 20S
Immuno | | | |
| TPCC μg/Test | | | |
| 0 | 100 | 0 | |
| 0,438 | 22,2 | 19,0 | 0,0012 |
| 0,875 | 18,1 | 15,3 | 0,0004 |
| 1,75 | 15,1 | 13,5 | 0,0002 |
| 3,5 | 11,3 | 11,0 | 0,0001 |
| 7 | 9,3 | 9,3 | 0,0000 |
| | | | |
| 26S
Standard | | | |
| TPCC μg/Test | | | |
| 0 | 100 | 0 | |
| 0,438 | 180,4 | 43,9 | 0,0215 |
| 0,875 | 286,7 | 102,4 | 0,0218 |
| 1,75 | 394,4 | 108,2 | 0,0055 |
| 3,5 | 421,3 | 112,9 | 0,0047 |
| 7 | 421,6 | 93,5 | 0,0023 |
| | | | |
| 26S
Immuno | | | |
| TPCC μg/Test | | | |
| 0 | 100 | 0 | |
| 0,438 | 171,9 | 45,6 | 0,0721 |
| 0,875 | 224,8 | 86,1 | 0,0870 |
| 1,75 | 235,6 | 104,5 | 0,0603 |
| 3,5 | 246,0 | 113,1 | 0,0611 |
| 7 | 238,3 | 97,1 | 0,0465 |
-
Die
in der Tabelle angegebenen Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
(S. D.) für Messungen mit 2 bis 5 unterschiedlichen Leukonorm-(LNCC)
bzw. Thymophysin-(TPCC)Chargen. Statistische Signifikanz mit Student's
t-Test als p angegeben.
-
Es
zeigt sich, dass LNCC die Aktivität mit dem Substrat Suc-LLVY-MCA,
welches für die chymotrypsin-artige Aktivität
spezifisch ist, hemmt. Auf die tryptische Aktivität (Substrat
Cbz-VGR-MCA) zeigt sich dagegen kein oder nur ein geringer Hemmeffekt
(nicht gezeigt).
-
Für
die Hemmung von TPCC zeigt sich, dass die chymotrypsin-ähnliche
Aktivität des 20S-Proteasoms (Substrat Scu-LLVY-MCA) durch
TPCC gehemmt wird. Im Falle des 26S-Proteasoms dagegen findet eine
Aktivierung durch TPCC statt.
-
Ebenso
ist der Effekt von TPCC auf die caspase-ähnliche Aktivität
der Proteasomen uneinheitlich (nicht gezeigt): Hemmung der 20S-
und der 26S-Standard-Proteasomen, aber Aktivierung der 26S-Immuno-Proteasomen.
Aus diesem Grunde scheint der Effekt von TPPCC auf die chymotryptische
Aktivität ein gut geeigneter Parameter für die Überprüfung
der Wirksamkeit (Stabilität) des Präparates zu
sein.
-
Für
die trypsin-ähnliche Aktivität (Substrat Cbz-VGR-MCA) zeigt
sich bei TPCC bei 20S-Proteasomen eine leichte, bei 26S-Proteasomen
eine deutliche Aktivierung.
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Speziell
in Bezug auf die Beispiele und generell gilt im Rahmen der vorliegenden
Offenbarung:
Wo Hemmung oder Aktivierung stattfindet, ist ein
Hinweis auf eine zu erwartende modulierende Wirkung auf das Immunsystem
auch in vivo gegeben.
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Beispielsweise
ist bei Aktivierung der Protease-Wirkung von Proteasomen mit einer
Aktivierung der Immunantwort zu rechnen (z. B. durch verstärkte
Präsentation von Peptidbruchstücken durch den
MHC-I, die beispielsweise zu verstärkter Aktivierung von
T-Zellen führen kann).
-
Andererseits
ist bei Hemmung der Protease-Wirkung beispielsweise mit einer pro-apoptotischen
Wirkung zu rechnen, die eine Therapierbarkeit z. B. von proliferativen
Erkrankungen, wie Krebs oder dergleichen, plausibel macht. Die Ergebnisse
können also auch als Biomarker verwendet werden, um die
Therapierbarkeit von Patienten (auch alleine oder zusätzlich
zu den das Immunsystem beeinflussenden Präparaten gemäß der Erfindung
in Kombination mit ein oder mehreren Chemotherapeutika) zu prüfen.
-
Außerdem
ermöglichen die Bestimmungen der Proteaseaktivitäten
die Bestimmung und Standardisierung von unterschiedlichen Chargen
das Immunsystem beeinflussender Präparate: Bei unterschiedlichen
und beispielsweise absichtlich unterschiedlich vorbehandelten Chargen
von LeukoNorm und Thymophysin können leicht unterschiedliche
Effekte auf die Proteaseaktivitätsmodulierung festgestellt
werden (nicht gezeigt). Hier kann Normierung auf (beispielsweise
zuvor ermittelte) Standardwerte zu einer Standardisierung und/oder
Bestimmung (beispielsweise der Aktivität) unterschiedlicher
Chargen verwendet werden. Dies ermöglicht, ein weiteres
Kriterium zur Standardisierung und Bestimmung der Aktivitäten
der Präparate zur Verfügung zu stellen und so
beispielsweise ältere Methoden, wie den Rosettentest, zu
ergänzen oder zu ersetzen.
-
Zusammenfassend
ermöglicht die Erfindung somit einerseits eine Qualitätskontrolle,
andererseits eine individualmedizinisch optimierte Behandlung von
Patienten.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - DD 301781 [0029]
- - DE 3430375 [0030, 0030]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Wu, J., American
J. of Transplantation 2 (2002), Seiten 904–912 [0007]
- - Adams J., Trends Mol. Med. 8 (4) (Suppl.), 2002, S49–S54 [0007]
- - Elliot, P. J and Ross, J. S., Am. J. Clin. Pathol. 116 (2001),
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- - Orlowski, R. Z., und Kuhn, D. J., Clin. Cancer Res. 14 (6)
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- - Schmidt F. et al. in Proteomics 6, 4622–4532 (2006) [0040]
- - Dahlmann et al., J. Mol. Biol. 303 (2000), 643–653 [0040]
- - Dahlmann B. et al., Biochem. J. 309, 195–202 (1995) [0041]
- - Kopp F. et al., J. Mol. Biol. 313, 465–471 (2001) [0041]