DE3335882A1

DE3335882A1 - Teilchenanalysator

Info

Publication number: DE3335882A1
Application number: DE3335882A
Authority: DE
Inventors: Wallace H. Miami Springs Fla. Coulter; Marshall D. Framingham Mass. Graham; William A. Miami Fla. Newton
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1983-10-03
Publication date: 1985-04-11

Description

Teilchenanalysator

Die Erfindung bezieht sich auf einen elektrischen Teilchenanalysator unter Vervrendung des "Coulter-Prinzips" zum Zählen, zur Größenbestimmung und zum Analysieren von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen.

Seit den ersten Anfängen vor 27 Jahren hat das von Wallace H. Coulter erfundene Prinzip zum Zählen und zur Größenbestimmung von Teilchen zu zahlreichen Methoden und Apparaturen für das elektronische Zählen und die elektronische Größenbestimmung sowie Analyse mikroskopisch kleiner Teilchen geführt, die nach der US-PS 2,6^6,508 in einer Suspension abgetastet werden. Bei diesem "bekannten Teilchenanalysator wird zwischen zwei Behältern dadurch Gleichstrom erzeugt, daß man in die Behälter- mit der Suspensionsflüssigkeit Elektroden einhängt. Die. einzige Fluidverbindung zwischen den beiden Behältern erfolgt über eine Meßöffnung. Dadurch wird in der Meßöffnung ein elektrischer Strom und ein elektrisches EeId erzeugt. Die- Meßöffnung und das in dieser und um diese herum befindliche elektrische Feld bildet einen Abtastbereich. Beim Hindurchströmen eines Teilchens durch den Abtastbereich ändert sich für die Dauer des Hindurchströmens die Impedanz, wodurch sich der Stromfluß und das elektrische Feld in dem Abtastbereich ändern, so daß ein Signal erzeugt wird, das an einen Detektor abgegeben.wird, der auf eine soUie Veränderung in geeigneter Weise anspricht.

Bei der in der Industrie verwendeten Vorrichtung nach der genannten US-PS 2,656,508 erfolgt die Felderzeugung mit Hilfe von Gleichstrom oder einer Niederfrequenzquelle. Die elektrische Änderung, zum Beispiel des Gleichstromsignals, aufgrund des Hindurchsta?ömens eines Teilchens durch das enge elektrische Feld, ist in etwa proportional der Teilchengröße. Tn der vorliegenden Anmeldung wird für den Gleichstrom eine Null-Frequenz angenommen. Das Prinzip der elektrischen Impedanzabtastung ist jedoch inzwischen so weit fortentwickelt worden, daß nunmehr Teilcheninformationen erhalten werden können, die sich nicht nur auf die Größe'der Teilchen "beschränken, sondern auch Aufschluß über deren Zusammensetzung und die Art des Stoffes, aus dem die Teilchen bestehen, geben (vgl. US-PS 3,502,974 und 3,502,973 von Coulter et al.). Diese "bekannten Vorrichtungen weisen im allgemeinen zwei Stromquellen auf, die gleichzeitig an den Abtasfbereich angelegt werden. Die eine dieser Stromquellen weist Radiofrequenz (HB¹) auf ,und die andere liefert Gleichstrom mit "Null-Frequenz", oder aber sie weist eine genügend niedrige Frequenz auf, so daß der reaktive Teil der Teilchenimpedanz eine vernachlässigbare Wirkung auf die Ansprechbarkeit der Vorrichtung hat. Eine wichtige Information, die durch eine solche Doppelstromquelle erhältlich ist, bezieht sich auf die "Innenleitfähigkeit" bzw. die elektrische "Undurchlässigkeit" der Teilchen. Im einzelnen weisen die Membranen biologischer Zellen einen hohen Widerstand, wie den eines Nichtleiters, auf; das Innere der Zelle leitet dagegen verhältnismäßig gut. Der HF-Strom geht durch die Zellenmembran hindurch und erzeugt dabei ein erfaßbares HF-Signal, das der "Innenleitfähigkeit" des jeweiligen Teilchens entspr/icnt. Wird das Signal für eine Zelle in das HF-Signal für diese Zelle aufgeteilt, so erhält man einen der "Innenleitfähigkeit" der Zelle entsprechenden Meßwert.

Der Nachteil bei diesen Teilchenanalysatoren ist der, daß die erhaltenen Meßwerte bezüglich der Größe und der Innenleitfähigkeit der Zelle nicht genau mit dem tatsächlichen Volumen der Zelle bzw. der Innenleitfähigkeit derselben übereinstimmen. Im allgemeinen werden längliche Teilehen aufgrund ö.er hydro-

dynamischen Fokussierung in den meisten dieser Vorrichtungen so · ausgerichtet, daß ihre Längsachse im wesentlichen parallel zur Mittelachse der Meßöffnung verläuft. Bei Teilchen von gleichem Volumen, von d§nen das eine kugelförmig und das andere länglich ist, hat das kugelförmige Teilchen während des Hindurchströmens durch die Meßöffnung einen größeren Querschnitt senkrecht zur Strömungsrichtung als das längliche Teilchen. Dadurch verzerrt das kugelförmige Teilchen das elektrische Feld so, daß es trotz gleicher Volumina ein größeres Meßsignal erzeugt als das längliche Teilchen. Daher hat man die Teilchen nach·ihrer Form, dem sogenannten "Formfaktor" klassiert, der angewandt wird, um das in bezug auf die Größe gemessene Gleichstromsignal zu korrigie- j ren. Weist beispielsweise ein sehr langes Teilchen einen Form- ' faktor von 1,0 auf, so beträgt der Formfaktor eines kugelförmigen Teilchens mit dem gleichen Volumen 1,5.

Um diese Ungenauigkeiten der gemessenen Parameter aufgrund der Teilchenform zu berichtigen, kann man zur genauen Messung des Formfaktors auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis vorgehen, indem man zusätzlich zu dem HF-Signal und dem Gleichstromsignal ein

einführt drittes Signal, beispielsweise ein Langensignal, und aann zum Erhalt genauer Werte die geressenen Parameter korrigiert.(vgl. US-PS 4,298,836 von Groves et al.). Diese Vorrichtung hat jedoch den Kachteil, daß zum Erhalt des erforderlichen Längenwertes eine optische Quelle und ein Detektor erforderlich sind, um eine Messung der "Durchgangsgeschwindigkeit" vornehmen zu können.

Ein zweiter Nachteil bei den elektronisch arbeitenden Teilchenaiialy atoren ist der, daß eine Einzelabtastung der jeweiligen Zelle mit Hilfe eines Schlitzes nicht möglich ist. Dies ist nur möglich bei den optischen Teilchenanalysatoren nach der US-PS 3,657,537 von Wheeless. Bei diesen optischen Teilchenanalysatoren erzeugt ein gebündelter Lichtstrahl, der schmäler als die Länge der Zelle ist, die diesen durchquert, eine Fluoreszenz einer farbigen Zelle. Auf diese Weise läßt sich die Zusammensetzung des Zelleninneren untersuchen, beispielsweise die re- ©OPY lativen Größen des Zellkerns und des Zytoplasmas. Es ist be- "~

kannt, daß verschiedene Bereiche der Zelle unterschiedliche innere Widerstands-werte aufweisen, beispielsweise zwischen dem Kern und dem diesen umgebenden Zytoplasma. Jedoch is-t es bei diesen bekannten Analysatoren nicht möglich gewesen, diese Unterschiede im Zelleninneren zu messen oder zu quantifizieren, da der durch das elektrische Feld erzeugte Abtastbereich immer sehr viel langer war als die Zelle. Beispielsweise ist ein Abtastbereich in einer 100 Mikron langen Meßöffnung ν·;sentIicn langer als die 100 Mikron und nimmt typischerweise Zellen auf, die Längen zwischen 10 und 12 Mikron aufweisen.

Ein dritter Wachteil bei den bekannten elektronisch arbeitenden Teilchenanalysatoren ist der, daß das Volumen des Abtas.tbereichs sehr viel größer ist als das Volumen einer Zelle, was zu einem Verlust in der Signalauflösung führt. Beispielsweise ist bei einer Meßöffnung mit einem Querschnittsdurchmesser von 50 Mikron

und einer Länge von 50,Mikron „« nr··, , ,_r -. * on gegenüber einem Zellendurchmesser von 10 Mikron das Volumen mal größer als das der Zelle. Das Verhältnis zwischen dem tatsächlichen Abtastbereich und der Zelle ist sogar noch größer.

Ein vierter Nachteil bei den bekannten elektronisch arbeitenden Teilchenanalysatoren ist der, daß für die Analyse mikroskopisch kleiner-Teilchen die Meßöffnung einen begrenzten Durchlaß für den elektrischen Strom,- im allgemeinen mit einem Durchmesser von nicht über 50 bis 100 Mikron, aufweisen muß, uir ausreichende Stromdichten zu gewährleisten. Diese mikroskopisch kleinen Abmessungen erschweren die Herstellung der Meßöffnung innerhalb annehmbarer Toleranzen, und im Betrieb verstopft sich die Meßöffnung häufig mit kleinen Trümmerstücken.

Die "US-PS 3,821,644 von Gohde et al. zeigt eine Elektrodenanordnung zur Erzeugung eines nur in einer !Richtung wirksamen elektrischen Abtastfeldes zwischen Platten, um die erfaßten Signale Teilchenbahnen gegenüber unempfindlich zu machen. Im einzelnen ist jedes Teilchen gezwungen, durch dieselbe Strommenge hindurchzugehen, unabhängig von der Verschiebung der Teilchenbahn in bezug auf die Mittelachse der Öffnung aufgrund dessen, daß das Feld nur in einer Sichtung wirksam ist. Die

Breite des Abtastfeldes bemißt sich, danach, wie dünn die mittleren Elektroden hergestellt werden können, was meist im Bereich von über 100 Mikron liegt. Hierbei ist die Länge des Abtastbereiches größer als die der Zelle; damit erreicht die Signalamplitude ihren Scheitel, wenn sich, die gesamte Zelle innerhalb der Grenzen des Abtastbereichs befindet.

33ie US-PS 3,720,470 von Serkham offenbart eine Durchflußkammeranordnung, bei der die Teilchen an einer Seite cJsr Durchflußkammerwand entlang geleitet werden, und die PCT/EP80/0021 von Lindmo et _<al_i offenbart eine Anordnung, um Teilchen an der Oberfläche eines Trägers entlangzuleiten. Die bereits genannte US-PS 3,502,973 zeigt Elektroden, die ein großes elektrisches EeId erzeugen, durch das die Teilchenbahn hindurchgeht.

Die Erfindung bezieht sich, auf einen Teilchenanalysator.mit den Maßnahmen des Oberbegriffs des Patentanspruches 1, dadurch, ge- >onnseichnet, daß das elektrische EeId so ausgelegt ist, daß das Abtastfeld eine Breite der vorbestimmten Bahn entlang aufweist, die kleiner ist als die Länge.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die vorbeschriebenen Nachteile zu vermeiden und eine einfach herstellbare Elektrodenanordnung zu schaffen.

Die Erfindung löst diese Aufgabe mit den kennzeichnenden Merkmalen des Patentanspruchs 1.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden mehrere Elektroden längs der Teilchenbahn angeordnet, um auf diese Weise die Breite des elektrischen Abtastfeldes zu reduzieren» Es werden mehrere Ausführungsformen dieser Art offenbart und beansprucht.

Noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Elektrodenpaar verwendet, das an einander gegenüberliegenden Seiten der vorbestimmten Bahn angeordnet ist, wobei eine der Elektroden ein Ende parallel zu der vorbestimmten Bahn mit einer Breite aufweist, die kleiner ist als die Länge eines bestimmten

BAD ORIGINAL

Teilchens, wobei das Elektrodenende in unmittelbarer Nähe der vorbestimmten Bahn angeordnet ist.

Die Elektrodenabtastvorrichtungen nach der Erfindung ermöglichen die Erzeugung eines elektrischen Abtastfeldes auf einem einzigen Träger, wobei die Träger eine dünne Flüssigkeitsschicht mit der flüssigen Suspension aufweisen. Ferner ergeben sich bei Anbringen der Elektrodenabtas ^vorrichtung auf einem einzigen Träger keine Ausrichtschwierigkeiten zwischen den Elektroden eines Elektrodenpaares, da die Elektroden genau und in fester Beziehung zueinander in die Trägeroberfläche eingeätzt bzw. eingearbeitet werden können. Darüber hinaus kann, je größer die Fokussierung des Abtastfeldes ist, je größer die mittleren Elektroden sind und je größer der Abstand zwischen diesen gemacht gemacht \verden kann, deren Herstellung erleichtert werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert. In der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 einen Querschnitt einer Abtastelektrodenanordnung nach der Erfindung, die in einer Öffnung einer Strömungszelle angeordnet ist;

Fig. 2 eine perspektivische Darstellung der Elektroden und der dazwischen angeordneten Isolierschichten nach Fig. 1;

Fig. 3 eine weitere Ausführungsform der Abtastelektrodenanordnung, bei der das Abtastfeld in zwei Richtungen . fokussiert ist;

Fig. 4- einen Querschnitt einer weiteren Ausführungsform der Abtastelektrodenanordnung;

Fig. 5 eine auf einen Träger aufgebrachte Abtastelektrodenanordnung ;

Fig. 6 eine vergrößerte Teildraufsicht der in der Oberfläche

des Objektträgers realisierten Elektrodenanordnung;

Fig. 6A eine andere Ausführungsform der A"btastelektrodenanordnung auf dem Objektträger;

Fig. 7 eine weitere Ausführungsform der Abtastelektrodenanordnung auf dem Objektträger;

Fig. 8 eine weitere Ausführungsform der Abtastelektrodenanordnung auf dem Objektträger;

Fig. 9 einen Querschnitt einer Abtastelektrodenanordnung auf dem Objektträger mit einer Abdeckung zur Bildung einer Durchflußkammer;

Fig. 10 einen Querschnitt nach der Linie 10-10 in Fig. 9;

Fig. 11 eine perspektivische Darstellung einer weiteren Ausführungsform eines Teilchenanalysators nach der Erfindung;

Fig. 12 einen Schnitt nach der Linie 12-12 in Fig. 11 und Fig. 13 einen Schnitt nach der Linie 13-13 in Fig. 11.

Fig. 1 zeigt eine erste Ausführungsform einer Durchflußzelle 10 mit einer Trennwand 11 und einer Meßöffnung 12 in dieser. An die Keßöffnung 12 grenzenan ihren beiden gegenüberliegenden Seiten . einen. . Elektrolyt enthaltende Kammern14- und 16. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, wird eine hydrodynamisch fokussierende Anordnung zur Flüssigkeitsbewegung verwendet, um eine Teilchenprobensuspension, beispielsweise Blutzellen, durch die Meßöffnung 12 in Eichtung des Pfeils 17 zu fördern. In bekannter Weise wird die Probensuspension über eine Zufuhrleitung 18 in eine laminare Hüllflüssigkeit 20 in der Kammer 14 eingeleitet, wodurch die Probensuspension beim Durchströmen durch die Meßöffnung 12 einen zentrierten, fokussierten Strom bildet. Die Durchflußzelle 10 ist entsprechend dem US-Patent 3,710,933 von FuIwyler et al. aufgebaut. ÖOPYJ

Bei einer Elektrodenabtastanordnung 21 sind zwei elektrisch leitende mittlere Elektrodenplatten 22 und 22' zwischen einem ersten Paar elektrisch leitender äußerer Elektrodenplatten 24 bzw. 24¹ auf der einen Sei.te und einem zweiten Paar elektrisch leitender äußerer Elektrodenplatten 26 bzw. 26' auf der anderen Seite angeordnet. Die mittleren Platten 22 und 22' sind von den daneben angeordneten äußeren Platten durch ein erstes Paar verhältnismäßig dünner, elektrisch nicht-leitender Schichten 28 und 28' sowie ein zweites Paar verhältnismäßig dünner, elektrisch nicht-leitender Schichten $0 und 30' getrennt und .isoliert. Die Platten sind in der elektrisch nicht-leitenden Trennwand 11 so angeordnet, daß ihre Enden vorzugsweise mit den Wänden der Meßöffnung 12 abschließen. Wie noch deutlicher aus Fig. 2 zu ersehen ist, welche die Platten und die Zwischenschichten räumlich darstellt, bilden die Platten und die Isolierschichten die zwei Wände der Meßöffnung 12.

Je nach dem gewünschten Verwendungszweck können die Platten durch eine JNiederfrequenzquelle, d.h. eine Gleichstrom unü/oder Bundfunkfrequenzen aufweisende Hochfrequenzquelle nach den Patenten 3,502,973 und 3,502,974, mit Strom gespeist werden. Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsfonnm werden die Platten durch einen Strom mit Hochfrequenz gespeist, der einem Gleichstrom überlagert ist, obwohl auch der Hochfrequenzstrom oder der Gleichstrom jeweils für sich nützliche Meßwerte liefern können.

Nach Fig. list eine Wechselstromquelle 32 mit einem Paar herkömmlicher phasenstarrer Oszillatoren 34 und 36 vorgesehen, wobei der eine ein Bezugsoszillator und der andere ein Synchronoszillator ist. Auf diese Weise erzeugen die Oszillatoren 34- und 36 phasengleiche elektrische Ströme, im allgemeinen im Hochfrequenzbereich, die unterschiedliche Amplituden aufweisen können. Mit Hilfe von Leitern 44 und 46 ist der Oszillator 34 mit dem äußeren Plattenpaar 24, 24', dem anderen äußeren Plattenpaar 26, 26' und einer Gleichstromquelle 48 elektrisch parallelgeschaltet, um auf diese Weise einen HF-Strom zu erzeugen, der zur Speisung der äußeren Platten einem Gleich-

strom überlagert wird. Desgleichen ist der Oszillator 36 mit dem Paar mittlerer Platten 22, 22¹, einer zweiten Gleichstrom quelle 56 und einem Detektorkreis 58 mit Schlitz über die Leiter 50 und 52 elektrisch parallelgeschaltet. Die Detektorschaltung 58 ist nach den US-PS 3,502,973 und 3,502,974 ausge bildet. Sie ist zu den mittleren Platten 22, 22' fgeschaltet, um auf herkömmliche Weise Änderungen der

elektrischen Ströme zwischen diesen mittleren Platten zu erfassen, die durjch das Hindurchströmen der Teilchen verursacht worden sind.

Bei der Ausfuhrungsform nach Fig. 1 befinden sich, wie vorstehend erläutert, die durch die Oszillatoren 34 "und 36 erzeugten HF-Ströme in Phase. Andererseits sind die Amplitude des durch den Oscillator 3^ erzeugten HF-Stroms und die Amplitude des durch die erste Gleichstromquelle 48 erzeugten Gleichstroms größer als die des durch den Oszillator 36 erzeugten HF-Stroms bzw. die des durch die zweite Gleichstromquelle erzeugten Gleichstroms. Infolgedessen verzerren sich die Stromlinien 60 und das elektrische Feld zwischen den äußeren Platten kissenförmig nach außen in Richtung der mittleren Platten, wodurch sich die Stromlinien und das elektrische Feld zwischen den mittleren Platten verengen. Darüber hinaus besteht zwischen den mittleren Platten und den daneben angeordneten äußeren Platten eine Stromverbindung, so daß sich der Bereich der mittleren Platten mit den durch die Meßöffnung 12 hindurchgehenden Stromlinien verengt. Die Stromlinien 60 geben im allgemeinen die Grenzen des Abtastfeldes 42 sowie die allgemeine Richtung des elektrischen Feldes zwischen den Platten an. Es muß dabei jedoch betont werden, daß der Abstand der Stromlinien untereinander nicht genau der Stärke bzw. Intensität des elektrischen Feldes entspricht, insofern, als die Anzahl der Stromlinien zwischen den äußeren Platten erheblich größer wäre, was nicht so ohne weiteres dargestellt werden kann. Durch diese Anordnung entsteht zwischen den mittleren Platten ein fokussiertes elektrisches Feld mit einer geringen Breite in^der Mitte, das einen Abtast- ■

bereich 42 zum Abtasten der hindurchströmenden Teilchen bildet. Die Breite des Abtastbereiches 42 kann einen verhältnismäßig kleinen Bruchteil der Teilchenlänge betragen, beispielsweise 2 Mikron gegenüber einer Teilchenlange von 10 Mikron.

Gegegbenenfalls kann nach Fig. 1 ein zweiter Detektorkreis 62 zu den äußeren Platten 26, 26' oder zu den äußeren Platten 24, 24' parallelgeschaltet werden. Alternativ kann der Detektorkreis 62 mit beiden äußeren Plattenpaaren elektrisch parallel verbunden werden. Der Detektorkreis 62 kann wieder nach den US-PS 3,602,973 und 3,502,974 ausgebildet sein. Auf diese Weise kann auch das elektrische Feld der äußeren Platten zum Abtastbereich für die Teilchen werden.

Je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck der Durchflußzelle 10 lassen sich die abgetasteten Teilchenimpulse des Detektorkreises 58 auf sehr verschiedene und bekannte Art und Weise weiterverarbeiten. Beispielsweise müssen bei den durch den Schlitzdetektor-Stromkreis 58 abgetasteten Gleichstromteilchenimpulsen die Gleichstromlinien zum größten Teil um das Zellenäußere herumverlaufen; dadurch ist die Amplitude des Gleichstromimpulses proportional dem Teilchenvolumen. Darüber hinaus läßt sich erforderlichenfalls die Breite dieses Gleichstromteilchenimpulses bei einer vorbestimmten Tmpulsschwelle ermitteln, die dann der Länge des Teilchens proportional ist. Unter Anwendung der mathematischen, Lehren nach der US-PS 4,298,836 läßt sich das tatsächliche Volumen eines jeden Teilchens berechnen.

Bei den durch den Schlitzdetektor-Stromkreis 58 erfaßten HP-Teilchenimpulsen verlaufen die EP-Stromlinien durch das Teilchen hindurch, wodurch eine Schlitzabtastung kleiner aufeinanderfolgender Zellenabschnitte durch den Schlitzabtastbereich 42 ermöglicht \^ird. Dieses HP-Signal kann dann zur Peststellung der Innenleitfähigkeit der Zelle integriert werden, wie dies . in der US-PS 3,864,571 für die Integrierung eines optischen Signals beschrieben wird. Darüber hinaus kann die Breite des

Impulses zur Peststellung der relativen Längen und der ungefähren relativen Größen des Kerns und des diesen umgebenden Zytoplasmas an verschiedenen Impulsschwellen gemessen werden, wie in der vorstehend erwähnten US-PS 3₅657»537 für die optische Längenmessung erläutert.

Durch den Erhalt sowohl der EF- als auch der Gleichstrom-Teilchenimpulse für ein bestimmtes Teilchen können der Größenmeßwert des Gleichstromsignals und der Leitwert des HP-Signals , zur Berechnung des Widerstandes im Inneren der Zelle verwendet werden, der auch als "Undurchlässigkeitswert" bezeichnet : wird. Erfolgt die Längemessung des Teilchens auch aufgrund : des Gleichstrom-Teilchenimpulses, so kann nach der US-PS i

4-,298,836 der Widerstand im Zelleninneren dadurch genauer be- - | rechnet werden, daß man die Form des Teilchens berücksichtigt. Darüber hinaus lassen sich aus den vorstehend beschriebenen j Heßparametern die Innenleitfähigkeit des Zytoplasmas und- des j Kerns bestimmen, wobei diese Parameter das im Hinblick auf die Form korrigierte tatsächliche Volumen der Zelle, die Länge der Zelle, d.h. des Zytoplasmas, die länge des Kerns und djle Innenleitfähigkeit der Zelle als einer Punktion der Zeit einschließen. Bei dem HP-Signal ist die Amplitude des Teilchens zu jedem Zeitpunkt eine Punktion des Volumens dieses j Zellenabschnitts, das sich in der Abtastzone befindet, und der durchschnittlichen Leitfähigkeit des Zellenabschnitts. Mit anderen Worten, der HP-Teilchenimpuls verkörpert die Leit- , fähigkeit eines sich ständig ändernden Zellensegments als, eine Funktion der Zeit. Somit ist die Größe der Veränderung ^: des. HP-Teilchenimpulses beimAbtasten des Kerns' eine Punktion der Größe und der Leitfähigkeit des Kerns, wenn die Zellenabschnitte neben denen mit dem Kern dieselbe relative Größe aufweisen. In diesem Fall kann bei Bekanntsein der Kerngröße dessen Leitfähigkeit berechnet werden. Durch Subtraktion des Volumens und der Leitfähigkeit des Kerns von dem Gesamtvolumen und der Gesamtleitfähigkeit des Kerns läßt sich die Leitfähigkeit des Zytoplasmas berechnen.

Anstelle des Schlitzdetektor-Kreises 58 kann erforderlichenfalls der Detektorkreis 62 zur Messung der Gesamtleitfähigkeit der Zelle, wenn das HF-Signal erfaßt ist,oder zur Nessung des augenscheinlichen Gleichstromvolumens verwendet werden, wenn das Gleichstroinsignal erfaßt ist. Da der Erfassungsbereich· des Plattenpaares 26, 26' in der Länge ein Mehrfaches der.Längen der Zellen beträgt, erfolgt die Erfassung dieser Signale auf herkömmliche Weise. Der Detektor 62 kann entweder mit einem der beiden äußeren Plattenpaare oder aber mit beiden Paaren parallelgeschaltet werden. Desgleichen könnte das Gleichstrom-Volumensignal dadurch auf herkömmliche Art und Weise erhalten werden, daß man ein Elektrodenpaar zu beiden Seiten der Meßöffnung ' anordnet, um einen Stromfluß durch diese zu erzeugen.

Fach der in Fig. 1 gezeigten bevorzugten Ausführungsform ist das. elektrische Feld 40 in der Mitte nur in einer Dimension eingeengt, nämlich parallel zur Strömungsrichtung der Probe. Da in dem Abtastbereich 42 die Breite des Feldes 40 in der Mitte sehr klein gewählt werden kann, beispielsweise 2 Mikron, kann die Breite der mittleren Platten 22, 22' mehrere hundert Mikron betragen, wobei die Stromdichte in dem Abtastbereich immernoch größer ist als die, wenn derselbe Strom auf herkömmliche Weise durch eine Meßöffnung mit einem Durchmesser von 50 bis 100 Mikron geschickt wird. Darüber hinaus können die Elektroden 22, 24, 26 von den Elektroden 22', 24', 26' in einem Abstand von mindestens mehreren hundert Mikron angeordnet werden. Aufgrund dieser Feldanordnung kann die Meßöffnung 12 genügend groß gewählt werden, um die Herstellung der Elektrodenanordnung zu erleichtern.

Nach Fig. 3 kann bei der Elektrodenabtastvorrichtung 21 das mittlere elektrische Feld in zwei Dimensionen fokussiert werden, wobei die zusätzliche Dimension parallel zu den mittleren Platten und senkrecht zur Strömungsrichtung verläuft. Ττη einzelnen sind zwei mittige Elektrodenplatten 68 und 68' von äußeren Elektroden 70 bzw. 70' umgeben. Die Elektronik 53 bleibt die gleiche wie in F g. 1, ausgenommen, daß nur ein Satz elektrischer Verbindungen zu den Außenelektroden 70 und

70' erforderlich ist. Vorzugsweise, jedoch nicht unbedingt, weisen die mittigen Elektrodenplatten eine wesentlich größere Breite senkrecht zur Strömungsrichtung auf, als sie parallel zur Strömungsrichtung lang sind. Durch diese Abmessungen kann ein Abtastbereich mit einem Querschnitt von beispielsweise 2 χ 20 Mikron erzeugt werden. Dadurch entsteht eine Zone 'senkrecht zur Strömungsrichtung, die "breit genug ist, um eine genügend starke !Fokussierung der durch diese hindurchströmenden Teilchen zu ermöglichen; gleichzeitig entsteht aber auch eine ausreichend hohe Stromdichte, so daß die Meßöffnung 12 gegenüber der in Fig. 1 dargestellten vergrößert werden kann, wodurch wiederum die Herstellung der Elektrodenanordnung erleichtert wird. Mit anderen Worten, die zusätzliche Fokussierung des Abtastfeldes führt zu einer vergrößerten und damit leichter herstellbaren Elektrodenanordnung.

Alternativ können die äußeren Elektroden 70 und 70' jeweils in zwei Paare einander gegenüber angeordneter Elektrodenplatten unterteilt werden, wobei jedes gegenüberliegende Elektrodenpaar eine getrennte, in Phase speisende Stromquelle aufweist. Dadurch wäre eine 'leichtere Einstellung der Fokussierung des Mittelfeldes zwischen den mittleren Elektroden möglich.

Fig. 4- zeigt eine alternative Ausführungsform der Elektrodenabtastanordnung 21, bei der die zwei Paare äußerer Platten" 24, 24-' und 26, 26¹ in einem Winkel zueinander angeordnet sind, so daß ihre äußeren Enden in Richtung der Mittelachse der Öffnung 12 geneigt sind.und ihre inneren Enden neben den mittleren Platten 22, 22' angeordnet bleiben. Torzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, sind die äußeren Platten immer eben ausgebildet. Die Stromquelle und die Detektoranordnung für diese Ausführungsform können die gleichen sein wie bei der Ausführungsform nach Fig. 1. Die kissenförmige Verzerrung der äußeren Felder zur Erzeugung eines schmalen elektrischen Mittelfeldes ist jedoch, wie nachstehend erklärt, nur durch die winklig angeordneten Elektroden, ohne einen Spannungsunterschied zwischen den äußeren Platten und den angrenzend en

mittleren Platten, möglich. Im einzelnen können ggfs. die äußeren Platten 24 und 26 und die mittlere Platte 22 auf einem gleichen Gleichspannungspotential und die äußeren Platten ' 24' und 26' sowie die mittlere Platte 22' auf einem unterschiedlichen Gleichspannungspotential gehalten werden. Obwohl zwei Gleichstromquellen wünschenswert wären, ist es klar, daß "bei dieser Ausf uhrungsform eine einzige Gleichstromquelle ausreichend wäre. Desgleichen sind die Oszillatoren 34 und 36 " nicht nur in Phase, sondern können ggfs. auch, so eingestellt werden, daß sie HF-Ströme erzeugen, die die gleichen Scheitelamplituden aufweisen. Gegebenenfalls können aber auch Spannungsunterschiede zwischen benachbarten mittleren und äußeren Platten vorgesehen werden.

Im Betrieb nutzt die Alternativausführungsform der Abtastelektrodenanordnung 21 nach Fig. 4 den Vorteil aus, daß die Stromlinien 64 die Plattenoberfläche unter einem rechten Winkel verlassen, was dazu führt, daß die elektrischen Felder der äußeren Platten das elektrische Feld zwischen den mittleren Platten zu einer schmalen Teilchenabtastzone 66 einengen. Darüber hinaus hat diese Abtastzone 66 über einen großen Bereich ihres Mittelteils eine verhältnismäßig gleichmäßige Breite, wodurch die Teilchensignale weniger von den Teilchenbahnen abhängen, wodurch ein hydrodynamisch fokussierter Teilchenstrom weniger wichtig ist.

Fig. 5 zeigt eine auf eine Oberfläche 91 eines Mikroskopobjektträgers 92 aufgebrachte Elektrodenanordnung 21. Dies zeigt, daß die Erfindung außer in einer Durchflußζeile auch in anderen Zusammenhängen Verwendung finden kann. Der Mikroskopobjektträger 92 befindet sich in einer bekannten Zytoiaeter-Durchflußanordnung, wie diese in der norwegischen Patentanmeldung 791*229 sowie in "Further Developments of a Microscope-Based Flow Cytometer: Light Scatter Detection and Excitation Intensity Compensation", Zytometrie, Bd. I (1980), S. 28, von H. B. Steen dargestellt ist.

Bei diesem System umgibt ein Hüllrohr 94 eine Probeneinspeiseleitung 95, so daß die Probensuspension, welche mit Überdruck

über eine Leitung 96 in die Speiseleitung 95 eingespeist wird, durch die Hüllflüssigkeit hydrodynamisch fokussiert wird, die mit Überdruck über eine Leitung 97 in das Rohr 9^ eingespeist wird. Ein laminarer Flüssigkeitsstrahl 98 tritt aus dem Hüllrohr 9^· aus und ist gegen die Oberfläche 91 des Objektträgers 92 gerichtet. Beim Auftreffen des Strahls 98 auf den Mikroskopobjektträger breitet sich die Flüssigkeit als dünne Schicht 99 auf diesem mit einer durchgehenden Dicke von beispielsweise 15 Mikron aus. In dieser dünnen Schicht 99 verbleiben die Teilchen in einem schmalen, in sich gleichmäßigen Fließabschnitt entlang einer Strömlingsachse 100. Die Flüssigkeitsschicht wird über eine Ableitung 101 abgesaugt, die an eine (nicht dargestellte) Saugquelle angeschlossen ist.

Wie aus Fig. 6 hervorgeht, ist die El ektrodenabtast anordnung 21 in der Oberfläche 91 <3es Mikr ο skopob j ektträgers 92 so angeordnet, daß die Oberseiten der Elektroden 24-, 24-^! ; 22 und 22" und 26, 26¹ vorzugsweise mit der Oberfläche 91 abschließen. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, sind die Leiter 44, 46, 50 und 52 mit den Elektroden über die Unterseite des Objektträgers 92 verbunden. Der Rest des Stromkreises (nicht dargestellt) ist der gleiche wie in Fig. 1. Wenngleich die Elektrodenanordnung 21 der Ausführungsform nach Fig. 1 in den Ausführungsformen nach den Fig. 5 und 6 enthalten ist, so können die Elektrodenanordnungen der Ausführungsform nach Fig. 4- auch in der Objektträgeranordnung nach den Fig. 5 und 6 Verwendung finden - siehe Fig. 6A. Darüber hinaus -kann die Oberfläche 91 jede Fläche auf einem dielektrischen Träger mit Oberflächenspannungseigenschaften ähnlich Glas sein. Abweichungen von einer durchgehend ebenen Konfiguration sind möglich.

Bisher wurde beim Stand der Technik ein Mikroskop 102 mit einer Dunkelfeld-Onordnung so eingebaut, daß seine optische Achse 104- sich mit der Strömungsachse 100 schnitt. Bei der vorliegenden Erfindung ist diese optische Abtastung der Teilchen fakultativ. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, fällt die optische Achse 104- im wesentlichen mit dem elektrischen Abtastbereich 4-2 bzw. 66 zusammen. Die optische Achse

104 und der Abtastbereich 42 sind für eine verbesserte Teilchenausrichtung verhältnismäßig nahe an dem Hüllrohr 94 angeordnet. Die Elektroden können unter Anwendung herkömmlicher Techniken bei der Herstellung von Mikro-Stromkreisen in die Oberseite des Objektträgers an Stellen eingeätzt werden, die sich in einer Entfernung von einigen 100 Mikrometern von der Strömungsachse 100 und zu beiden Seiten von dieser befinden, um dadurch vollständig von einer dünnen Flüssigkeitsschicht 99 bedeckt zu sein. Da die Stromlinien nach Verlassen der Oberseite des Objektträgers oder vor Erreichen derselben um 90° abgebogen verlaufen, sind die Elektroden von der Strömungsachse 100 genügend weit entfernt angeordnet, um zu gewährleisten, daß die Stromdichte möglichst einheitlich auch in den tieferen Bereichen der Flüssigkeitsschicht 99 ist. Ohne die äußeren Elektroden würde diese Anordnung der Elektroden in einem Abstand im allgemeinen zu einem sehr breiten, kissenartig verzerrten elektrischen Feld in bezug auf die Strömungsachse 100 führen. Durch die äußeren Elektroden wird der Abtastbereich 42 schmäler, wodurch eine Koinzidenz von Teilchen bei zufriedenstellendem Durchsatz verhindert und eine gute Stromdichte, eine gute Teilchenjmpulsauflösung und, wenn gewünscht, eine elektrische Schlitzabtastung möglich ist. Aufgrund der gleichmäßigen Tiefe der Flüssigkeitsschicht 99 und der sehr schmalen effektiven Abtastzone werden elektronische Störsignale vermindert.

Wie aus dem nachstehenden Ausführungsbeispiel hervorgeht, ist der Umfang der Erfindung, die auf eine elektrische Abtastanordnung auf einem Träger gerichtet ist, wesentlich größer als die der schlitzartigen Abtastzone 42 nach Fig. 6. Im einzelnen geht aus Fig. 7 hervor, daß, wenn die Spannung der mittleren Elektroden auf demselben Niveau gehalten wird wie die der benachbarten äußeren Elektroden, ein homogenes elektrisches Feld entsteht. Obwohl hier eine elektrische Schlitzabtastung der Zelle nicht möglich ist, bewirken die äußeren Elektroden, daß das elektrische Feld 40 sich innerhalb annehmbarer Breitenabmessungen parallel zur Strömungsachse 100 hält. Mit anderen Worten, das Feld 40 ist, wie vorstehend beschrieben, nun genügend schmal, um einen annehmbaren Teilchendurchsatz bei

Verringerung der Anzahl von Teilchenzusammenstößen zu gewährleisten. Typischerweise "beträgt die Breite des elektrischen Feldes 40 über 100 Mikron. Darüber hinaus kann eine kissenartige Verzerrung des elektrischen Feldes 40 nach außen als annehmbar, wenn auch·nicht als wünschenswert, angesehen werden. Zusammenfassend ergibt sich als ein erstrebenswertes Merkmal der Elektrod nabtastvorrichtung nach der Erfindung, daß durch Fokussieren des elektrischen Feldes 40 unter Verwendung benachbarter elektrischer Felder die Elektroden 22 und 22' in genü-' gend weitem Abstand voneinander angeordnet werden können, um auf diese Weise eine verhältnismäßig gleichmäßige Stromdichte auch in den tieferen Bereichen der dünnen Schicht 99 in dem Abtastbereich 42 zu gewährleisten.

Da gemäß Fig. 7 die Breite des Abtastbereichs 42 größer ist als die Teilchenlänge, kann eine Längenmessung der Zelle .nach der US-PS von Leary et al. erfolgen. Im einzelnen kann die Flankenimpulsbreite eines Teilchenimpulses zwischen zwei Schwellwerten, die die konstanten Teile der Impuls-Scheitelamplitude darstellen, als Maß der Länge des Teilchens gemessen werden. Bei. der vorliegenden Erfindung erfolgt eine bessere Signalauflösung als bei dem Patent von Leary dadurch, daß der Teilchenimpuls ein im wesentlichen gleichmäßiges elektrisches Intensitätsprofil aufweist, anstatt des Gauß¹sehen Profils . nach dem Patent von Leary.

Ein weiteres neues Merkmal bei der vorstehend beschriebenen Elektrodenabtastano3ⁿdnung besteht darin, daß die Elektrodenanordnung in die Oberfläche 91 des jeweiligen Objektträgers' bzw. Trägers eingeätzt werdai kann. Eine solche Ausführungsform der Elektrodenanordnung auf einem Träger räumt die üblichen Schwierigkeiten aus, die bei den bekannten Abtastvorrichtungen mit Meßöffnungen auftreten. Hierzu wird nach Fig. 8 eine Ausfuhr ungs form einer Mehrfachabtastvorrichtung, für die Aufschlüsselung einer biologischen Zelle und für die Erfassung der elektrischen Eigenschaften der Zelle vor, während und nach deren Aufschlüsselung gezeigt. Im allgemeinen ist die rechte Seite der Elektrodenanordnung die gleiche wie in Fig. 7

umfaßt die äußeren Platten 26, 26' und die mittleren Platten 22, 22'. Das äußere, mit den Bezugszeichen 105 und 105¹ versehene Plattenpaar verläuft mit seinen von dem Abtastbereich 42 entfernten Enden in "bezug auf die Strömungsachse 100 schräg nach innen. Aufgrund dieser Anordnung in einem Winkel aimmt die Stromdichte "beim Durchstrom der Zelle durch ein Auflöse-Abtastfeld 107 zu. Ein weiteres elektrisches Feld entsteht in dem eng begrenzten Raum zwischen den Endplatten 106, 106¹. Nach einer Ausführungsform der Platten-Spannungs"bedingungen werden die Platten 26, 22, 105 und 106 mit Hilfe mehrerer Spannungsquellen 108, 110, 112 "bzw. 114 auf .einer ersten Spannung V1 gehalten. Dabei werden die Platten 26', 22·, 105¹ und 106' auf Erdpotential gehalten. Die vorstehend genannten Spannungsquell en liefern zwar Gleichstrom; jedoch könnten diesen auch KP-Ströme überlagert sein.

Bei der vorstehend beschriebenen Anordnung nach Fig. 8 wird das Zellenvolumen in einem Abtastfeld 116 abgetastet; die elektrische Schlitzabtastung kann in der Jbtastzone 42 erfolgen; die Zellenauflösung kann in dem Abtastfeld 107 erfaßt werden und die Zellengröße"nach der Auflösung, die der Innenkonduktanz entspricht, kann in dem Abtastbereich 118 gemessen werden. Einzelheiten zur Bestimmung der Zellenauflösung sind aus der US-PS Nr. 3,831,087 von Schulz et al. bekannt. Durch Dividieren des in dem Abtastbereich 118 erhaltenen Größenwertes, der der Innenkonduktanz entspricht, durch das Volumensignal aus dem Abtastfeld 116 läßt sich der Innenwiderstand (die Undurchlässigkeit) messen. Gegebenenfalls können die Platten 105 und 105" zum Erhalt eines in etwa linearen Teilchen-Rampen-Impulssignals beim HindurcLströmen eines nicht aufgelösten Teilchens gewinkelt oder gebogen werden. Nach der US-PS 3,560·,847 bewirkt die Auflösung einer Zelle eine abrupte Veränderung des im wes ntlichen linearen Ausgangssignals. Dadurch ist feststellbar, bei welcher Spannung die Zellenauflösung erfolgt ist. Zur Analyse der Zellenauflösung können die Elektroden 105 und 105' ohne Zuhilfenahme der äußeren Elektroden für sich verwendet werden.

Die Fig. 9 und 10 zeigen eine Alternativmöglichkeit für die in

den Fig. 5 bis 8 dargestellten Objekttrageranordnungen. Bei dieser alternativen Ausführungsform ist über dem Objektträger 92 unter Anwendung einer Gummidichtung 122 eine Deckplatte 120: angeordnet. Die Gummidichtung 122 weist zur Bildung einer Kammer 126 zwischen diesen beiden Platten einen zentralen Ausschnitt 12A- auf. Der Deutlichkeit halber sind die Tiefe dieser Kammer 126 und die Größe der Elektrodenplatten in diesen Figuren übertrieben dargestellt. Die Elektrodenplatten sind mit Hilfe feiner leitender Drähte 128 an Elektrodenkontakte 150 angeschlossen. Die Probeneinspeisleitung 95 und das Hüllrohr 9^ sowie die Absaugleitung 101 sind die gleichen wie die in Fig. 5 dargestellten. Die Kammertiefe kann beispielsweise 130 Mikron bebragen, wenngleich auch kleinere Abmessungen möglich sind.

Sind die Elektroden 26¹, 22¹ und 24' in der Deckplatte 120 angeordnet; und zusammenwirkend oberhalb der Flektrodenplatten 26, 22 und 24 fluchtend ausgerichtet, so ergibt sich im wesentlichen die gleiche Elektrodenanordnung wie in Fig. 1, jedoch ohne die Konfiguration der Meßöfinung zwischen den beiden Flüssigkeiten. Aus Herstellungsgründen ist jedoch die Ausführungsform nach den Fig. 5 ^un<ä 6 entschieden vorzuziehen, weil

zwei es schwierig ist, die Elektroden auf verschiedenen Trägern fluchtend ausrichten zu müssen. Bei Verwendung nur eines einzigen Trägers sind die Elektroden genauestens in eine von deren freiliegenden Oberflächen eingearbeitet, so daß keine -usrichtprobleme entstehen.

Zusammenfassend können die Elektrodenabtasteinrichtungen nach der vorliegenden Erfindung in einer Anordnung mit einer Meßöffnung realisiert werden, wobei sich die Meßöffnung zwischen zwei Flüssigkeitsbehältnissen in der Durchflußzelle 10 befindet. Alternativ können die El ektrodenabtas tan Ordnungen in der Oberfläche eines einzigen Trägers, beispielsweise des Trägers 92 nach den Fig. 5 ^is 10 und des Trappers ?62 nach den Figuren 11 bis 1J angeordnet sein, wodurch das Problem der Meßöffnungsbegrenzung entfällt. Darüber hinaus kann bei Anordnung auf dem Träger die Analyse der Teilchen in einer Kammer einer Durchflußzellenanordnung, wie in den Fig. 9 und 10 unter 126 und in

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den Figuren 11 "bis 13 unter 220 gezeigt, erfolgen. Die Elektroden können in Querrichtung zur Kammer in einem Abstand voneinander angeordnet sein, was einer Elektrodenabtastanordnung nach Fig. 1 entspricht. Mit anderen Worten, die Stromlinien verlassen entweder die gemeinsame Oberfläche, durchqueren den Teilchenabtastbereich und kehren zu derselben Oberfläche zurück, oder aber, die Stromlinien verlassen die eine Oberfläche, durchqueren den Abtastbereich und enden auf einer zweiten Oberfläche auf der anderen Seite des Äbtastbereichs.

Zur Beanspruchung der Abtastanordnung nach der Erfindung kann in den Ansprüchen die Bezeichnung "Platte" für die Elektroden in den verschiedenen Ausführungsformen des elektrischen Feldes verwendet werden. Zu beachten ist jedoch, daß nur die T.ndoberfläche einer jeden Elektrode, die im allgemeinen -mit der Suepensionsflüssigkeit in Berührung kommt und zur Erzeugung des elektrischen Feldes beiträgt, eine"plattenartige" Konfiguration aufweist. Wenngleich diese Oberflächen im allgemeinen . eben sind, so können sie auch gerundet sein. Der restliche Teil der in dem Isoliermaterial eingebetteten Elektrode kann in Größe, Konfiguration und Ausrichtung variieren. Bei den Ausführungsformen nach den Figuren 1 bis 4 sind die Elektroden typischerweise in einer DurchflußζelIe aus Kunststoff eingebettet, während bei den Ausführungsformen nach den Figuren 5 bis 13 die Elektroden typischerweise in Substrate bzw. Träger aus Glas oder geschmolzenem Quarz eingebettet sind.

Bei den elektrischen Schlitzabtastvorrichtungen gemäß den Figuren 1, 4-, 6 und 6A können die Stromquellen 34 und 48 zur allmählichen Vergrößerung oder Reduzierung der Breite der Abtastzone 42 bzw. 66 gemeinsam kontinuierlich oder schrittweise gegenüber den Stromquellen 36 bzw. 56 variiert werden. Beispielsweise kann während des Verarbeitens einer bestimmten Probe die Breite eines ursprünglich schmalen Abtastbereichs 42 bzw. 66 schrittweise um jeweils 1 Mikron erhöht werden. Eine solche Steuerung der vorstehend genannten Stromquellen kann dadurch erfolgen, daß man diese auf herkömmliche Art und Weise

so über von Mikroprozessoren gesteuerte Potentiometer verbindet, daß eine "programmierte" Abtastzone entsteht. Bei dem vorstehenden Beispiel können bei verhältnismäßig homogenen Teilchenpopulationen die von dem HF-Signal des Schlitzdetektors 58 erhaltenen Daten zusätzliche Informationen über die Population, beispielsweise über deren Form und Länge vermitteln, da das Ausgangssignal von der zunehmenden Schlitzdicke in bezug auf die Teilchen abhängt. Im einzelnen nehmen die Amplituden der HF-Teilchenimpulse nach Normalisierung durch die entsprechenden Amptituden des HF-Erregerstroms mit zunehmender Breite des Abtastbereichs solange zu, bis die Breite des Abtastbereichs die Länge der Zellen überschreitet. Wird dieselbe Methode bei einer nicht-homogenen Teilchenpopulation mit verschiedenen Teilchengrößen angewandt, so kann das Verhältnis der durch den Strom·normalisierten HF-Teilchenimpulse zu den Großen-Signalen, die beispielsweise von dem Detektor 62 erhalten worden sind, Auskunft geben über die Form der Populationen. Der Fachmann wird ohne weiteres noch weitere Verwendungsmöglichkeiten eines elektrischen Schlitzabtastfeldes, das in der Breite variiert werden kann, erkennen.

Fig.. 11 zeigt einen Teilchenanalysator 210 mit einer Durchflußzelle 212, die aus einer ersten Kunststoffplatte 214, welche fest an der Oberseite einer zweiten Kunststoffplatte 216 angebracht ist, gebildet ist. Zur Bildung einer Durchflußkammer 220 ist ein kreisförmiger Ausschnitt 218 in der zweiten Kunststoffplatte 216 ausgebildet.

Ein Hüllrohr 222 umgibt eine Probeneinspeiseleitung 224. Aus einem ersten Druckbehälter 226 wird eine Hüllflüssigkeit über eine Leitung 228 in eine Einspeiseleitung 230 geleitet, so daß die Hüllflüssigkeit in das Hüllrohr 222 eintritt. Aus einem unter Druck stehenden Probenbehälter 2J2 wird eine Teilchensuspension über eine Leitung 234 in die Probeneinspeiseleitung 224 geleitet. Die Probensuspension wird durch die Hüllflüssigkeit hydrodynamisch fokussiert, so daß aus dem Ende der Probeneinspeiseleitung 224 ein laminarer Flüssigkeitsstrom austritt, der sich in Richtung der Bodenfläche der

Durchflußkammer 220 erstreckt. Aus einem unter Druck stehenden Flüssigkeitsbehälter 236 wird über eine Leitung 238 eine zweite Flüssigkeit"in eine Leitung 240 eingespeist. Die Flüssigkeit aus der Durchflußkammer 220 wird über eine Abzugsleitung 242 abgezogen und gelangt über eine Leitung 244· zu einem Abwasserbehälter 246, der durch eine (nicht dargestellte) Vakuumquelle auf Unterdruck gehalten wird.

In die erste Kunststoffplatte 214 ist eine erste Elektrode 248 und in die zweite Kunststoffplatte 216 unter der ersten Elektrode 248 ist eine zweite Elektrode 250 eingebettet. Die Elektroden.248 und 250 sind über elektrische Leiter 252 bzw. 254 an eine Parallelschaltung einer Stromquelle 256 und eines Teilchenimpulsdetektors 258 angeschlossen.

Die Figuren 12 und 13 sind Teildarstellungen der Durchflußkammer 220^r'und zeigen die erfindungs gemäß en Bauteile im einzelnen. Die Elektroden 248 und 250 sind zur besseren Erläuterung der Erfindung übertrieben groß dargestellt. Die Bahn der Teilchensuspension ist mit der Linie 260 gekennzeichnet. Die Teilchen treten aus dem Hüllrohr 222 aus, bewegen sich in einem Strahl ' in Sichtung der Bodenfläche 262 der Durchflußkammer, strömen entlang der Oberfläche 262 an den Elektroden 248 und 250 vorbei und werden dann durch die Absaugleitung 242 abgezogen.

Die Elektroden 248 und 250 sind in einer geometrischen Ebene zentriert dargestellt, welche vorzugsweise senkrecht zur Teilchenbahn 260 verläuft. Die zweite Elektrode 250 ist, wie aus Fig. 12 ersichtlich, in Richtung der Teilchenbahn gesehen, sehr schmal ausgebildet. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, beträgt die Breite etwa 2 bis 3 Mikron. Die erste Elektrode 248 sollte ebenfalls sehr schmal ausgebildet sein, ist jedoch etwas breiter dargestellt, um zu .zeigen, daß ihre Breite nicht so kritisch ist und auch etwas größer bemessen sein kann als die der zweiten Elektrode 250. Die Elektroden 248 und 250 weisen an ihren äußeren Enden ein Paar Leiteranschlüsse 266 bzw. 268 auf. Die Durchflußkammer 220 Xann längs der Ebene 264 eine Tiefe von beispielsweise 200 bis 300 Mikron aufweisen, wobei

die Tiefe kein kritischer Faktor ist und im wesentlichen den Erfordernissen entsprechend variiert werden kann.

Tm Betrieb verlassen die Stromlinien das Ende der Elektrode ' · 250 im rechten Winkel zur Elektrodenoberfläche, durchqueren die Teilchenbahn 260 und enden an der ersten Elektrode 248.' ' Die vorliegende Erfindung macht sich die Tatsache zunutze, daß j die Stromlinien beim Verlassen der freiliegenden Oberfläche j der Elektrode 250 in rechten Winkeln zu dieser die Durchfluß- j kammer durchqueren, ohne anfangs merklich abzuweichen bzw. ; ohne kissenartige Verzerrungen zu bilden. Infolgedessen strö- _; men die Teilchen auf ihrem Weg durch das Abtastfeld, das sich in nächster Nähe zur unteren Oberfläche 262 befindet, durch ; eine sehr enge Zone. Beispielsweise strömen rote Blutkörperchen mit einer länge von etvia 12 Mikron durch ein elektrisches ' Feld, dessen Breite, in Richtung der Teilchenbahn 260 gesehen, i kürzer ist als die Zellenlänge. Somit werden bei Verwendung von | Hochfrequenzstrom sich ständig ändernde, schmale Teile der ZeI- j len untersucht, wie im Folgenden noch naher erläutert wird. ; Dabei wird vorzugsweise die Stromdichte in dem Teil der Ebene [ 264 verhältnismäßig gleichmäßig gehalten, durch den das Teil- r chen gerade hindurchströmt. Dsher weisen die Elektroden Vorzugs- ! weise eine längliche Form, -parallel zu der Ebene 264 auf, wie j aus Fig. 13 hervorgeht. Somit verursachen leichte Abweichungen j von der Teilchenbahn 260 entlang der Oberfläche 262 keine Ver- j änderungen der Signalamplitude. ' _v ',

Wie aus Vorstehendem ersichtlich ist, ist es erstrebensi-jert, die Te:Π chen so nahe wie möglich an der zweiten Elektrode 250 vorbeisl-römen zu lassen. Die zweite Flüssigkeit wird vorzugsweise über die Leitung 240 eingespeist, um die Teilchenbahn 260 nahe an der unteren Oberfläche 262 zu halten. Vorzugsweise reichen die Druckunterschiede zwischen den Vorratsbehältem 226 und 236 sowie 236 und 246 aus, daß die Hüll- und die Suspensionsflüssigkeit aus dem Hüllrohr 222 mit verhältnismäßig hoher Geschwindigkeit austreten und der Flüssigkeitsstrahl so auf die Oberfläche 262 auftrifft und sich auf diesel¹ verteilt, daß die Teilchen sehr nahe an die Oberfläche 262 ge-

drückt werden. Die Behälter 226, 236 und 24-6 werden in "bekannter Weise in bezug zueinander auf nacheinander abnehmendem Druck gehalten, so daß die Flüssigkeit in einem Strahl aus dem Hüllrohr 222 austritt und über die Abzugsleitung 24-2 aus der Kammer 220 austritt. Darüber hinaus bleiben die Teilchen nach dem Auftreffen auf die Oberfläche 262 über mehrere hundert Mikron der Teilchenbahn 260 entlang hydrodynamisch fokussiert. Bekanntermaßen liefert eine gleichbleibende Ausrichtung der Teilchen eine beusere Information über deren Zellenlänge. Daher müssen sich die Elektroden 248 und 2^0 in nächster Nähe zu dem Hüllrohr 222 befinden. Das Strömungssystem ist im wesentlichen das gleiche wie in der vorstehend genannten PGT/ EP80/0021, ausgenommen, daß die die Teilchen enthaltende dünne Flüssigkeitsschieht unter einem zweiten Flüssigkeitsstrom aus dem Behälter 236 gebildet wird. Dadurch kann die Teilchenbahn 260 in dem elektrischen PeId beispielsweise in einer Entfernung von unter 10 Mikron von der Oberfläche 262 verlaufen. Selbstverständlich gibt es für den Fach-aann viele Möglichkeiten, einen Teilchenstroia an einer Oberfläche einer Durchflußkammer wie der Durchflußkamner 20 entlsngzuleiten. Eine Alternativmöglichkeit ist beispielsweise in der US-PS 3,720,470 beschrieben. Das Erfinderische besteht hier darin, zur Bildung eines für den Durchstrom der Teilchen sehr begrenzten elektrischen Feldes eine sehr schmale Elektrode in unmittelbarer Nähe der Teilchenbahn anzuordnen.

Die Stromquelle 2^6 und der Teilchenimpulsdetektor 2^8 können dabei verschiedene Formen des Standes der Technik annehmen. Je nach dem gewünschten Verwendungszweck können die Elektroden 248 und 2^0 nach den US-PS 3,502,973 und 3,502,974 von einer Niederfrequenzquelle, die Gleichstrom liefert, und/oder einer Hochfrequenz quelle mit normalerweise .Radiofrequeiizen gespeist werden. Diese Hoch- oder Niec? !.rfrequenzströme können entweder für sich ode. in Kombination wertvolle Meßwerte liefern.

Je nach dem vorgesehenen. Verwendungszweck kann der Detektor 258 auf verschiedenste Art und Weise zur Erfassung undj[er|rbeitung von Teilchenimpulsen verwendet werden. Der Teilchen-

analysator 210 eignet sich "besonders für die Untersuchung biologischer Zellen. Wird "beispielsweise von der Stromquelle 256 Gleichstrom geliefert, so müssen die Gleichstromlinien zum großen Teil um das Zellenäußere herum verlaufen» damit stellt die Breite der fl?eil! chenimpulse bei einem vorbestimmten Impulsschwellwert die Zellenlänge dar. Entsprechend liefert die Integration dieses Signals einen Meßwert über das Zellenvolumen. Liefert die Stromquelle 256 einen Hochfrequenzstrom, so laufen die Hochfrequenzstromlinien zum größten Teil durch die Zelle hindurch, wodurch kleine Einzelabschnitte der Zelle in dem elektrischen Abtastbereich erfaßt werden können. Mit anderen Worten, es werden fortlaufend andere schmale Zeileriabschnitte untersucht. Das von dem Detektor 258 empfangene Teilchenimpulssjgnal kann zur Untersuchung der Bestandteile im Zelleninneren verwendet werden. Die Verwendung sowohl hochfrequenter als auch n:i oderfrequenter überlagerter Ströme nach der US-PS 4,298,836 ermöglicht eine Bestinimung der Innenleitfähigkeit der Zelle. Bei einer solchen Methode erfolgt die Läiigenbestimmung der Zelle anstatt auf optischem Wege durch Messung der Iropulsb3?eite.

Die Elektroden bestehen vorzugsweise aus Platin und können in die Oberflächen der Durchflußkammer 220 eingeätzt werden. Die Flüssigkeiten in den Behältern 226, 232 und 236 sind Elektrol;yte , beispielsweise eine »Jalzlösung.

Patentanw Dipi.-Ing.i Dlpi;-ing. K/

8 München 40,

Leerseite -

Claims

Patentanwälte

Dlpl.-lng, E. Ede Dlpl.-ing. K. Series-

B München AO,

COULTER ELECTRONICS, INC. Hi aleah/Flor id a U.S.A.

Teilchenanalysator

Patentansprüche

H J Teilchenanalysator mit Strömungsmitteln (18; 96, 98; 220, 224, 230) zur Erzeugung eines Stroms (17; 60; 100) einer flüssigen Teilchen-Suspension entlang einer vorbestimmten Bahn (12; 262), Mitteln zur Erzeugung eines elektrischen Feldes (21, 22, 32-40; 48; 248-2^6) für die Herstellung eines Abtastfeldes (42;_:66; 264) quer zu der vorbestimmten Bahn und mit Abtastmitteln (58, 2^8) zur Erfassung von Teilchenimpulsen, die von durch das elektrische Feld hindurchströmenden Teilchen erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrische Feld so "beschaffen und ausgelegt ist (24-30; 68,70; 105; 128; 130; 250), daß das Abtastfeld (42; 66, 264) eine Breite entlang der vorbestimmten Bahn gesehen aufweist, die kleiner als die Länge eines bestimmten, durch das Abtastfeld hindurchströmenden, Teilchens ist.
2. Teilchenanalysator nach Anspruch 1, bei welchem die Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Feldes mehrere Elektroden umfassen, die an einander gegenüberliegenden Seiten eines vor- . bestimmten Teilchenkanals angeordnet sind, sowie Speisequellen

copyI

zur Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen einem ^jeden Elektrodenpaar, dadurch gekennzeichnet, daß einige der Elektroden (24, 24', 26, 26'; 68, 68¹; 70, 70'; 105, 105') und die Mittel zu deren Stromspeisung so beschaffen und ausgelegt sind, daß sie das genannte Abtastfeld mit einer gewünschten Breite entlang der Bahn (12) erzeugen.
3. Teilchenanalysator nach Anspruch 2, dadurch ©kennzeichnet, daß die Mittel zur Stromspeisung (34, 48, 36, 56) für einen größeren Spannungsunterschied zwischen mindestens einem der Elektrodenpaare (24, 26) gegenüber einem anderen Elektrodenpaar (24',26·) sorgen, um durch die kissenartige Verzerrung des elektrischen Feldes (60) in Richtung des Abtastfeldes (42) eine Verengung dieses Feldes zu bewirken.
4. Teilchenanalysator nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Elektrodenpaare (24, 24', 26, 26') in bezug auf die anderen Elektroden (22, 22') in einem Winkel angeordnet ist, so daß dieses eine Elektrodenpaar so unter einem einem Winkel nach innen in Sichtung einer vorbestimmten Teilchenbahn (17; 100) verläuft, daß das elektrische Feld (66) dieses einen Elektrodenpaares in Richtung des Abtastfeldes. (42) verläuft und dieses in der Breite reduziert.
5. Teilchenanalysator nach Anspruch 4, bei dem die Teilchen biologische Zellen umfassen, dadurch gekennzeichnet, claß das eine in einem Winkel angeordnete Elektrodenpaar (105, 105') in bezug auf die Teilchenbewegung der vorbestimmten Bahn (100) entlang einen zunehmenden Spannungsgradienten (107) erzeugt.
6. Teilchenanalysator nach einem der Ansprüche 2 bis 5» bei dem das eine Elektrodenpaar (22, 22') mit einem Teil der Stromspeisemittel (36, 56) ein Abtastfeld (42) bildet, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden anderen Elektrodenpaare (24, 241, 26, 26') an einander gegenüberliegenden Seiten des einen genannten Elektrodenpaares angeordnet.und mit einem weiteren Teil der Mittel zur Stromspeisung (34, 48) verbunden sind, so daß zur Herstellung eines verengten Abtastfeldes getrennte elektrische Felder (60, 64, 66) erzeugt werden.
7. Teilchenanalysator nach Anspruch 1, "bei dem die Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Feldes ein Elektrodenpaar (48, 50) aufweisen, das an einander gegenüberliegenden Seiten der vorbestimmten Teilchenbahn (262) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das eine Ende einer der Elektroden (50) sich in unmittelbarer 3$ähe .der Teilchenbahn befindet und eine Breite parallel zu der genannten Bahn aufweist, wobei diese Breite kleiner ist als die Länge eines bestimmten Teilchens.
8. Teilchenanalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Strömungsmittel ein Substrat (92; 216) und eine Anordnung zur Aufbringung eines Stroms einer flüssigen Suspension in einer verhältnismäßig dünnen Schicht auf die Oberfläche (91; 262) des Substrats umfaßt.
9. Teilchenanalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 9₅ dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (48, 56; 256) zur Stromspeisung einiger der genannten Elektrodenpaare so beschaffen und ausgelegt sind, daß sie im Hinblick auf die Messung der Teilchengrößen und -längen elektrische Felder mit Null-Frequenz oder aber einer niedrigen Frequenz erzeugen.
10. Teilchenanalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (32; 256) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes so beschaffen und ausgelegt sind, daß das elektrische Feld eine hohe Frequenz aufweist und damit durch die Teilchen hindurchgeht, um auf diese Weise kontinuierlich immer neue bzw. aufeinanderfolgende Abachnitte eines bestimmten Teilchens zu untersuchen.

I.-Ing. K-. ^o

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