DE3177285T2 - Purin- und pyrimidin-verbindungen und deren verwendung als antivirusmittel. - Google Patents

Purin- und pyrimidin-verbindungen und deren verwendung als antivirusmittel.

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DE3177285T2 DE8787104286T DE3177285T DE3177285T2 DE 3177285 T2 DE3177285 T2 DE 3177285T2 DE 8787104286 T DE8787104286 T DE 8787104286T DE 3177285 T DE3177285 T DE 3177285T DE 3177285 T2 DE3177285 T2 DE 3177285T2
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Description

  • Diese Erfindung betrifft Purin- und Pyrimidinverbindungen und die Verwendung solcher Verbindungen als antivirale Mittel.
  • Nucleoside umfassen eine D-Ribose- oder 2-Desoxy-D-ribose-Zuckereinheit, die chemisch über ein zum Kern gehöriges Stickstoffatom der Base an eine Purin- oder Pyrimidinbase, die aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil ausgewählt ist, gebunden ist. Da sie Einheiten von natürlicherweise in lebenden Zellen gefundenen Nucleinsäuren sind, ist zuvor spekuliert worden, daß Nucleoside und Nucleotide und ihre Analoga ein Potential als chemotherapeutische Mittel aufweisen könnten. Irgendein praktischer Wert, den sie haben können, wird jedoch oft in großem Maß durch ihre rasche in-vivo-Desaminierung durch Desaminasen reduziert. Studien sind durchgeführt worden, um die Beziehung zwischen Struktur und Wirkung sowohl für Substrate als auch Inhibitoren von Adenosindesaminase zu bestimmen, wobei in einigen der Studien ringgeöffnete Analoga von Nucleosiden beteiligt waren.
  • Bis heute sind jedoch trotz mehrerer vielversprechender Bereichte von neuen Verbindungen keine derartigen Verbindungen zur chemotherapeutischen Verwendung hergestellt und entwickelt worden, mit der möglichen Ausnahme von Acycloguanosin, welches eine der Purinverbindungen ist, die in US-A-4 146 715 beschrieben werden und die Formel
  • Z-CHR&sup6;-X-CHR³-CHR&sup4;R&sup5;
  • haben, worin Z eine Puringruppe ist; X Sauerstoff oder Schwefel ist; R³ H, Alkyl, Hydroxyalkyl, Benzyloxyalkyl oder Phenyl ist; R&sup4; H, Hydroxy oder Alkyl ist; R&sup5; H, OH, Amino, Alkyl, Hydroxyalkyl, Benzoyloxy, Benzoyloxymethyl, Benzyloxy, Sulfamoyloxy, Phosphat, Acyloxy oder substituiertes Carbamoyl ist, und R&sup6; H oder Alkyl ist; mit der Maßgabe, daß, wenn X Sauerstoff ist, R³, R&sup4; und R&sup6; H sind und R&sup5; H, OH oder Benzyloxy ist, Z nicht Adenin oder 6-N-Methyladenin ist.
  • Ogilvie et al., Tetrahedron Letters, 21 (1980) 327-330, offenbaren Purin- und Pyrimidinverbindungen der Formel
  • Z-CH&sub2;-O-CH(CH&sub2;OR')-CH&sub2;OR (I)
  • worin Z Adenin oder Thymin ist und R und R' ausgewählt sind aus H, Monomethoxytrityl, t-Butyldimethylsilyl und Benzyl.
  • Neue 9-substituierte Purin- und 1-substituierte Pyrimidinverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung haben die Formel I, worin Z eine Uracil-, 5-Fluoruracil-, Cytosin-, 5-Azacytosin- oder N²-Acetylguaningruppe darstellt; und R und R' unabhängig ausgewählt sind aus H, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl und Phenyl(C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl); und pharmazeutisch annehmbare Salze davon; vorausgesetzt, daß wenn Z N²-Acetylguanin ist, R und R' nicht beide Wasserstoff oder Benzyl sind.
  • Zum Beispiel sind R und R' unabhangig aus H und Benzyl ausgewählt. Z ist vorzugsweise 5-Fluoruracil (in welchem Fall R und R' vorzugsweise jedes H oder Benzyl sind), 5-Azacytosin (in welchem Fall R und R' vorzugsweise jedes H sind), Cytosin (in welchem Fall R und R' vorzugsweise jedes Benzyl sind) oder N²-Acetylguanin.
  • Man wird erkennen, daß die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, wie jene, die von Ogilvie et al. offenbart wurden, bezüglich Struktur und Gruppierungen eng analog zu natürlich vorkommenden Nucleosiden und Nucleotiden sind. Die wesentlichen Kettenanordnungen und -längen sind beibehalten. Die geeigneten funktionellen Gruppen O und OH, die sich in biologischen Umgebungen aktiv an biologische Zentren binden, sind in ihren natürlichen Sequenzen und ihrer natürlichen Anordnung relativ zur Base beibehalten, aber gegebenenfalls mit "Schutz"-Gruppen modifiziert. In der Tat sind die Gruppen, die in Nachbarschaft zu den Basen liegen, bezüglich der chemischen Konstitution so ähnlich mit Desoxyriboseverbindungen, daß sie unter geeigneten Bedingungen die wesentliche Konformation des Desoxyriboserings annehmen können. Der fundamentale Unterschied besteht darin, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie jene, die von Ogilvie et al. offenbart wurden, nicht die strukturelle Starrheit des Kohlenhydratrings aufweisen, was sie unvorhersehbar verschieden bezüglich Eigenschaften und Verhalten macht. Auch ist die C-4'-Stellung bei Verbindungen der Formel I nicht chiral, so daß keine Stereoisomeren entstehen. Jedes Hydroxyl ist primär. Es kann keine Syn-Anti-Isomerie um die glycosidische Bindung herum auftreten.
  • Verbindungen der Formel I können hergestellt werden, indem man die geeignet halogenierte Purin- oder Pyrimidinbase mit dem geeigneten Alkylrest kuppelt. Die Synthese kann begonnen werden, indem man 1,3-Dichlor-2-propanol mit Natriumbenzylat unter Stickstoffatmosphäre, gefolgt von s-Trioxan und HCl, behandelt, um das Chlormethoxyderivat herzustellen, wobei man darauf achtet, überschüssiges Wasser zu entfernen. Dieses Derivat von 1,3-Dibenzyloxy-2-propanol kann in DMF unter Verwendung von Triethylamin als Säureabfänger an die geeignet halogenierte Base, wie z.B. 6-Chlorpurin, gekuppelt werden. Die behandlung der so gebildeten Chlorverbindung mit methanolischem Ammoniak in einem stählernen Reaktionseinschlußgefäß ergibt das (nicht beanspruchte) 6-Aminoderivat. Das Produkt kann z.B. mit Wasserstoff über Palladiumoxid in Methanol debenzyliert werden, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben. Schutzgruppen werden, falls gewünscht, durch bekannte Standardverfahren angebracht. Alternativ können halogenierte Alkylreste mit halogenierten oder nicht-halogenierten Purin- oder Pyrimidinbasenverbindungen gekuppelt werden.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen antivirale Wirksamkeit, begleitet von geringer Zelltoxizitat, was sie potentiell in therapeutischen Zusammensetzungen zur Bekämpfung spezifischer viraler Eindringlinge in lebende Säugerzellen brauchbar macht.
  • Erfindungsgemäße Verbindungen können einem Patienten parenterial, interthekal, topisch als Salbe, Creme, Aerosol oder Pulver appliziert oder bei Gelegenheit sogar als Augen- oder Nasentropfen gegeben oder oral verabreicht werden. Im allgemeinen folgen Verfahren der Verabreichung und Dosierungsformulierungen den bekannten, publizierten Verfahren, die bei bekannten antiviralen Arzneimitteln, wie z.B. Acycloguanosin, Adeninarabinosid und 2'-Desoxy-5-iodurin, verwendet werden. Wirksame Einheitsdosierungen zur interthekalen oder parenteralen Verabreichung der Zusammensetzungen bewegen sich geeigneterweise im Bereich von 0,1 bis 100 mg, als freie Base berechnet, pro kg Säuger-Körpergewicht, und sind am meisten bevorzugt ungefähr 5 mg pro kg, auf der Basis einer zwei- bis viermal täglich verabreichten Dosierung.
  • Oral verabreichbare Zusammensetzungen liegen vorzugsweise in Form von feinem Pulver oder Granulat mit Verdünnungs- und/oder Dispergierungs- und/oder oberflächenaktiven Mitteln, z.B. in Wasser oder in einer Sirupdispersion, oder als Tabletten oder Kapseln, vor. Lösungen der Verbindungen in destilliertem Wasser oder Kochsalzlösung, z.B. isotone Lösungen und gegebenenfalls mit Phosphat gepuffert, mit Konzentrationen von 1 bis 20%, vorzugsweise 2 bis 15%, und am meisten bevorzugt ungefähr 10%, sind zur parenteralen oder interthekalen Verabreichung geeignet. Salben (topisch oder Creme) können zur Behandlung von externen Infektionen, z.B. mit einer Öl-in-Wasser-Cremebasis in einer Konzentration von 0,1 bis 10%, vorzugsweise bis zu 3%, am meisten bevorzugt ungefähr 1% Gew/Vol aktivem Bestandteil, hergestellt werden. Sie können mit Paraffinöl, mit Vaseline um eine Emulsion zu bilden, gegebenenfalls mit einem Tensid zu Stabilisierungszwecken, oder mit Dimethylsulfoxid hergestellt werden.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht-limitierenden Beispiele erläutert.
    • Beispiel 1 1-[[Bis(benzyloxymethyl)methoxy]methyl]-5-fluoruracil (Dibenzyl-5FU*)
  • 5-Fluoruracil (1,0 g, 0,0077 Mol) und einige Kristalle Ammoniumsulfat wurden in 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan (HMDS) (15 g) suspendiert und unter Rühren zum Refluxieren gebracht. Nach 50 Minuten hatte sich die Base gelöst, und das überschüssige HMDS wurde unter reduziertem Druck verdampft, um einen Sirup von Silyl-geschützter Base (Struktur nicht bestimmt) zu liefern. Der Sirup wurde in 1,2-Dichlorethan (80 ml) gelöst, und wasserfreies Zinn(IV)chlorid (0,4 ml) wurde hinzugefügt. 1,3-Dibenzyloxy-2-chlormethoxypropan (0,007 mMol) von einer Vorratslösung wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde mit Stopfen verschlossen, und man ließ sie bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Die Reaktionsmischung wurde mit wäßrigem Natriumbicarbonat geschüttelt, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft, um 4,57 g Material zu liefern. Das NMR- Spektrum des Rohmaterials legte nahe, daß der Anteil von gewünschter Verbindung in der Mischung 88% war. Das Material wurde mit 15 g Kieselgel (Fisher-S-662) gemischt und auf eine Kieselgelsäule (93 x 2,0 cm) gegeben. Die Säule wurde mit 1% Methanol in Chloroform (250 ml), 3% Methanol in Chloroform (200 ml) und 5% Methanol in Chloroform (700 ml) eluiert. Als gefärbtes Material zu erscheinen begann, wurden Fraktionen gesammelt. Die ersten 16 Reagenzgläser enthielten das gewünschte Material. Die Fraktionen wurden einzeln zu Sirupen eingedampft, die bei Stehen über Nacht kristallisierten. Etwas Methanol wurde hinzugefügt, die Kristalle wurden zerbrochen, und das Lösungsmittel wurde mit einer Pasteur-Pipette entfernt. Die Kristalle wurden einmal mit Methanol gewaschen, um 0,886 g Kristalle und 2,231 g Mutterlaugenrückstände zu liefern. Die Rückstände wurden aus Tetrachlorkohlenstoff kristallisiert, und die resultierenden Mutterlaugenrückstände wurden auf präparative tlc-Platten gegeben und mit 5% Methanol in Chloroform eluiert. Schließlich wurden 1,81 g (0,0044 Mol, 62%) kristallines Dibenzyl-5FU* erhalten. Eine analytische Probe wurde durch Umkristallisieren des obigen Materials (tlc zeigte immer noch eine Verunreinigung) aus einem Minimum an heißem Ethanol erhalten. Die Kristalle ergaben: Fp. 84 bis 86ºC und UV-Spektrum (EtOH) mit λmax 265 nm.
    • Beispiel 2 5-Fluor-1-[[bis(hydroxymethyl)methoxy]methyl]uracil (5FU*)
  • Dibenzyl-5-5FU*, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, (0,0656 g, 0,00158 Mol) wurde in Ethanol (26 ml) gelöst. Frisches Palladiummohr (10 ml) wurde hinzugefügt, gefolgt von Cyclohexen (13 ml). Nach einer halben Stunde zeigte tlc, daß das meiste Ausgangsmaterial verschwunden war, aber daß immer noch eine beträchtliche Menge Monobenzylverbindung anwesend war. Nach 5 Stunden zeigte tlc, daß die Reaktion vollständig war; die Mischung wurde filtriert, und das Palladiummohr wurde mit Ethanol gewaschen. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck eingedampft, um 0,413 g Sirup zu ergeben, der nach der Zugabe von etwas Methanol kristallisierte. Die Probe wurde in 3 ml heißem Ethanol gelöst, und dann wurde das Volumen durch Blasen mit Stickstoff auf 1 ml reduziert. Die resultierenden Kristalle (in einem Greg-Röhrchen enthalten) wurden dreimal mit Ehanol gewaschen, und das rückständige Lösungsmittel wurde durch Zentrifugieren entfernt, um 0,185 g (0,00079 Mol, 50%) Kristalle zu liefern. Die Mutterlaugen lieferten nochmal 0,089 g (0,00038 Mol, 24%) Krsitalle. Ein zweites Umkristallisieren ergab Fp. 126-128ºC und ein UV-Spektrum (EtOH) λmax 266 nm. Das NMR-Spectrum in CD&sub3;OD und TMS ergab: 3,58 (m, 5H, -CH&sub2;CHCH&sub2;-), 5,28 (s, 2H, OCH&sub2;N), 7,85 (d, 1H, JF6 = 6,0 Hz, H-6).
    • Beispiel 3 5-Aza-[[1-bis(benzyloxymethyl)methoxy]methyl]cytosin (Dibenzyl-5-aza-C*)
  • 5-Azacytosin (5,0 g, 0,0446 Mol) und etwas Ammoniumsulfat (100 mg) wurden in HMDS (40 ml) suspendiert und unter Rühren zum Refluxieren gebracht. Nach 20 Minuten wurde mehr Ammoniumsulfat hinzugefügt, und 20 Minuten später wurde die Mischung klar. Das überschüssige HMDS wurde unter reduziertem Druck verdampft, um einen weißen Festkörper, Silyl-geschütztes 5-Azacytosin, zu liefen, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Der Festkörper wurde in DCE (100 ml) gelöst, und wasserfreies Zinn(IV)chlorid (3,5 ml) wurde hinzugefügt. Dann wurde 1,3- Dibenzyloxy-2-chlormethoxypropan (0,040 Mol) hinzugefügt, und man ließ die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die Reaktionslösung wurde in wäßriges Bicarbonat geschüttet, mit Chloroform verdünnt und geschüttelt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Filtration über Celite (eingetragenes Warenzeichen) entfernt. Die Phasen wurden getrennt. Die wäßrige Phase wurde einmal mit Chloroform extrahiert. Die organischen Phasen wurden zusammengegeben, einmal mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 15 g Sirup zu liefern. Der Sirup wirde in Chloroform (20 ml) gelöst, und auf eine tlc-Kieselgelsäule (14,5 x 6,5 cm) gegeben. Die Säule wurde zuerst mit Chloroform (450 ml) eluiert. Man wechselte das Lösungsmittel zu 5% Methanol in Chloroform, und die Sammlung von Fraktionen (10 bis 15 ml) begann. Dibenzyl-5-aza-C* wurde in drei Gruppierungen von Fraktionen, die 40 bis 42 (1,48 g), 43 bis 62 (8,17 g) und 63 bis 79 (0,42 g) waren, gefunden. Die Gruppierungen wurden in 2,3 ml, 12 ml bzw. 1,5 ml heißem Ethanol gelöst und geimpft. Die zweite Probe lieferte 5,292 g Kristalle, während die anderen beiden Proben wenige Kristalle ergaben. Deshalb wurden die erste und die dritte Probe mit der Mutterlauge der zweiten Probe vereinigt und auf eine kurze Kieselgelsäule (4,0 x 6,3 cm) gegeben und zuerst mit Chloroform (125 ml) und dann mit 5% Methanol in Chloroform, wobei die Sammlung von Fraktionen (20 ml) begann, eluiert. Das gewünschte Material erschien in den Fraktionen 7 bis 8 (1,35 g) und 9 bis 11 (1,9 g). Die 1,9 g-Probe wurde in Ethanol (3 ml) gelöst, und 0,917 g Kristalle resultierten. Die Ausbeute an Verbindung war 6,209 g (0,0157 Mol, 39%). Die Kristalle (6,209 g) wurden durch Kristalle (1,461 g) aus anderen Experimenten vermehrt und aus Ethanol (10 ml) umkristallisiert, um 6,95 g weiße Kristalle zu ergeben. Eine Probe wurde zweimal aus Ethanol umkristallisiert und ergab: Fp. 120 bis 122,5ºC. Das UV-Spektrum ergab: max (EtOH) 228, 236, (H&sub2;O) 241, (pH 1) 251, (pH 13) 250. Das NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) ergab: 3,52 (d, 4H, J=5,5 Hz, CH&sub2;CHCH&sub2;-), 4,02 (m, 1H, -CH&sub2;CHCH&sub2;-), 4,45 (s, 4H, 2 x PhCH&sub2;-), 5,30 (s, 2H, OCH&sub2;N), 5,95 (bs, 1H, HNH), 7,27 (m, 11H, 2 x PhCH&sub2;-, HNH), 8,07 (s, 1H, H-6).
    • Beispiel 4 5-Aza-1[[bis(hydroxymethyl)methoxy]methyl]-cytosin (5-Aza-C*)
  • Dibenzyl-5-Aza-C* (6,432 g, 0,0162 Mol) wurde in Ethanol (200 ml, erwärmt) gelöst. Gebrauchtes Palladiumoxid (8 g) wurde hinzugefügt, gefolgt von Cyclohexen (100 ml). Die gerührte Mischung wurde zum Refluxieren gebracht, und 3 Stunden später legte tlc nahe, daß die Reaktion langsam war. Deshalb wurde frisches Palladiumoxid (2 g) hinzugefügt, und man fuhr fort zu refluxieren. Nach einer Gesamtzeit von 22 Stunden war etwas Material ausgefallen, aber die tlc zeigte immer noch etwas Ausgangsmaterial und das Monobenzylanalogon. Das Material wurde filtriert, und der Rückstand wurde mit heißem 95%igem Ethanol gewaschen, bis kein weißer Niederschlag mehr anwesend war. Das Filtrat und die Waschlösung wurden zusammengegeben und eingedampft, um ungefähr 4,5 g Material zu ergeben. Das Material wurde aus heißem Ethanol und etwas Wasser (um die Auflösung zu erleichtern) umkristallisiert, um leicht grünliche Kristalle (0,816 g, 0,00377 Mol, 23,3%), Fp. 181 bis 5ºC, zu ergeben; das Filtrat war grün. Das Filtrat wurde eingedampft, und der Rückstand wurde in heißem Ethanol (3,5 ml) gelöst und geimpft. Kristalle bildeten sich nicht. Das Material wurde mit Wasser und Chloroform geschüttelt, und die Phasen wurden getrennt. Die wäßrige Phase wurde zusammen mit Ethanol eingedampft, um 2 g Material zu liefern. Kristallisation auf dem üblichen Weg war nicht erfolgreich. Die tlc zeigte eine Anzahl von Komponenten, wobei die gewünschte Verbindung ungefähr 30 bis 40% der Mischung umfaßte. Das Material wurde auf 4 präparative tlc-Platten aufgetragen ud mit 50% Methanol in Chloroform entwickelt. Die gewünschte Bande wurde mit 25% Methanol in Chloroform eluiert, um 0,5 g Material zu liefern. Kristallisation auf dem üblichen Weg lieferte nur eine Spur von Kristallen. Die erste Fraktion von Kristallen wurde aus Wasser (1 ml) und Ethanol (7 ml) umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben, die Fp. 189,5 bis 191ºC ergaben. Die gewünschte Verbindung ergab das UV-Spektrum: λmax (EtOH) 220 nm, (H&sub2;O) 220, 245S, (pH 1) 250 (pH 13) 248. Das NMR-Spektrum (CD&sub3;OD + 5 Tropfen DMSO-d6 + TMS) ergab: 3,43-3,83 (m, 5H, -CH&sub2;CHCH&sub2;-), 5,37 (s, 2H, OCH&sub2;N), 8,27 (s, 1H, H-6).
    • Beispiel 5 1-[[Bis(benzyloxymethyl)methoxy]methyl]cytosin (Dibenzyl-C*)
  • Cytosin (5,0 g, 0,045 Mol) wurde in 80 ml (60 g) HMDS suspendiert, und mehrere Kristalle Ammoniumsulfat wurden hinzugefügt (nach dem Modell von G. Ritzmann und W. Pfleiderer, Chem. Ber. 106, 1401 (1973). Die gerührte Mischung wurde vor Feuchtigkeit geschützt und refluxiert, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Falls nach einer halben Stunde Refluxieren keine klare Lösung erhalten wurde, ergab die Zugabe von mehr Ammoniumsulfat nach weiteren 10 Minuten Refluxieren eine klare Lösung. Die klare heiße Lösung wurde mit einer Wasserstrahlpumpe verbunden, und das überschüssige HMDS wurde sorgfältig auf einem heißen Wasserbad entfernt, um einen weißen Festkörper zu liefern, der in der nächsten Stufe ohne Reinigung verwendet wurde.
  • Das 2,4-Bis(trimethylsilyl)cytosin wurde in trockenem DCE (200 ml) gelöst, und Zinn(IV)chlorid (3,4 ml, 29,1 Mol, wasserfrei, frisch destilliert) wurde hinzugefügt. Dann wurden 40 g einer Vorratslösung von 1,3-Dibenzyloxy-2- chlormethoxypropan (40 Mol) hinzugefügt, und man ließ die gelbe Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen (nach dem Modell von B.U. Niedballa und H. Verbruggen, Angew. Chem.).
    • Beispiel 6 N²-Acetyl-9-[[1-bis(benzyloxymethyl)methoxy]methyl]guanin (Dibenzyl-N-acetyl-G*)
  • 2-N-Acetylguanin (1,93 g, 10 mMol) und Ammoniumsulfat (100 mg) wurden in HMDS (20 ml) suspendiert. Die gerührte Mischung wurde drei Stunden refluxiert, wo sie klar wurde. Das überschüssige HMDS wurde unter reduziertem Druck auf einem heißen Wasserbad entfernt, um einen weißen Festkörper, Silyl-geschütztes 2-N-Acetylguanin, zu liefern, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Der weiße Festkörper wurde in DCE (50 ml) gelöst. 1,3-Dibenzyloxy-2-chlormethoxypropan (5 mMol) wurde hinzugefügt, gefolgt von frisch destilliertem wasserfreiem Zinn(IV)chlorid (1 ml). Man ließ die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die Lösung wurde in eine Mischung von wäßrigem Natriumcarbonat und Chloroform gegossen und geschüttelt. Die Mischung wurde durch Celite filtriert, um den Niederschlag zu entfernen. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde einmal mit Chloroform extrahiert.
  • Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft, um 2,19 g Material zu liefern. Das Reaktionsprodukt wurde in Chloroform (5 ml) gelöst und auf eine tlc-Kieselgelsäule (9 x 6,5 cm) gegeben. Die Säule wurde zuerst mit Chloroform (60 ml) eluiert, und dann anderte man das Lösungsmittel zu 2% Methanol in Chloroform. Drei einigermaßen reine Fraktionen wurden aus den Reagenzgläsern 15 (0,047 g), 19 bis 20 (0,148 g) und 23 bis 27 (0,43 g) erhalten. Jede der Proben wurde mit Ethanol kristallisiert und ergab ungefähr 20 mg, 64 mg bzw. 250 mg Material. Auf der Basis von UV-Spektren wurde nachgewiesen, daß das 250 mg- Material das gewünschte Produkt war. Es wurde aus Ethanol umkristallisiert und ergab Fp. 142-144ºC. Das UV-Spektrum ergab λmax (EtOH) 257, 281 nm min. 227, 272, λmax (H&sub2;O) 259, 278 (Schulter), (pH 1) 262, (pH 13) 263.
    • Testen und Auswertung
  • Herpes-simplex-virus-(HSV)-Stämme wurden gezüchtet und bei 36ºC in menschlichen fetalen Fibroblasten, die aus fetalen Geweben abgeleitet waren, titriert und für Arbeit mit dem Virus vor der zehnten Passage verwendet. Zellen wurden gezüchtet und im Basalmedium Eagle (BME; Auto-Pow, Flow Laboratories), ergänzt mit 0,112% Natriumbicarbonat, 2 mM 1-Glutamin, 2 mg Neomycin pro 100 ml und 5 bis 20% Kälberserum, gehalten. 5%iges BME, wie hernach beschrieben, zeigten Medium an, das 5 ml Kälberserum in einem Gesamtvolumen von 100 ml enthielt.
  • Der Titer der HSV-Stämme wird durch ein Plaque-Titrationsverfahren (Roizman und Roane, "Virology", 15, 75-79, 1961) bestimmt. Gewebekulturschalen werden mit Zellen geimpft und für Assays verwendet, wenn sie ungefähr 75% Monoschicht aufweisen. Volumina (0,2 ml) logarithmischer Verdünnungen des Stamms werden auf jede von zwei Gewebekulturschalen inokuliert und eine Stunde adsorbiert, wobei zwischendurch geschüttelt wird. Das Inokulum wird entfernt, und 2 ml 5%iges BME, das 0,5% Immunserumglobulin vom Menschen enthält, werden hinzugefügt. Nach einem Inkubationszeitraum von 48 Stunden bei 36ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre wird das überstehende Medium entfernt, und die Zell-Lagen werden mit einer 0,05%igen wässrigen Kristallviolettlösung angefärbt. Die Anzahl von Plaques wird gezählt, die zwei Proben werden gemittelt, und die Anzahl von Plaque-bildenden Einheiten wird berechnet.
  • Die Verbindungen werden unter Verwendung einer Vorratslösung von jeder Verbindung, die frisch durch Lösen von 1,2 mg in BME hergestellt wird, auf ihre Aktivität gegen die Herpes-Simplex-Stämme getestet. Eine geeignete Verdünnung jeder Verbindung wird in 5%igem BME, das 0,5% Immunserumglobulin vom Menschen enthält, unmittelbar vor Verwendung hergestellt.
  • Gewebekulturschalen (35 auf 10 mm) mit einer ungefähr 75%igen Zell- Monoschicht werden mit ungefähr 50 Plaque-bildenden Einheiten von HSV pro 0,2 ml inokuliert, und der Virus wird 1 Stunde adsorbiert, wobei zwischendurch geschüttelt wird. Nach Entfernung des Inokulums werden 2 ml 5%iges BME mit 0,5% Immunglobulin und dreifache Verdünnungen des geeigneten Arzneistoffs hinzugefügt. Ein Satz von Schalen erhält keinen Arzneistoff und wird als Kontrolle verwendet. Nach einem 48stündigen Inkubationszeitraum bei 36ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre wird das überstehende Medium entfernt, die Zellen werden wie oben beschrieben angefärbt, und die Plaques werden gezählt. Die Zählergebnisse von gleichen Platten werden gemittelt, und die Anzahl an Plaques, die in Gegenwart jeder Arzneistoffverdünnung entstehen, wird berechnet. Auch die Verminderung der Plaquegröße, die von der Konzentration an Arzneistoff verursacht wird, verglichen mit der relevanten Kontrolle, wird visuell gemessen. Eine Verringerung der Plaque-Anzahl zeigt an, daß die hinzugefügte Verbindung die Reproduktion der viralen Zellen verhindert. Eine Verringerung in der Fläche der wachsenden Plaque zeigt eine Hemmung von Plaquewachstum, d.h. die von dem Arzneistoff verursachte Hemmung von viraler Reproduktion an.
  • Die Verbindung von Beispiel 4, 5-Aza-C*, zeigte hohe Wirksamkeit gegen HSV. Sie reduzierte die Plaque-Größe um 25% bei 5 ug/ml, um 50% bei 30 ug/ml und um 75% bei 110 ug/ml. Sie reduzierte die Plaque-Anzahl um 25% bei 8 ug/ml, um 50% bei 30 ug/ml und um 75% bei 140 ug/ml. Sie zeigte bei Konzentrationen, die so hoch wie 304 ug/ml waren, keine Anzeichen von Toxizität.
  • Die Verbindung von Beispiel 5, Dibenzyl-C*, zeigte auch Wirsamkeit gegen HSV.
  • Die Verbindung von Beispiel 1, Dibenzyl-5FU*, zeigte Wirksamkeit gegen HSV, indem sie die Plaque-Größe um 25% bei 10 ug/ml und um 50% bei 50 ug/ml und die Plaque-Anzahl um 25% bei 70 ug/ml und um 50% bei 110 ug/ml reduzierte. Sie zeigte bis zu Konzentrationen von 110 ug/ml keine Anzeichen von Toxizität.
  • Die Verbindung von Beispiel 6, Dibenzyl-N-acetyl-G*, zeigte etwas Wirksamkeit gegen HSV, indem sie die Plaque-Größe um 25% bei 60 ug/ml und um 50% bei 150 µg/ml reduzierte und die Plaque-Anzahl um 25% bei 20 ug/ml, um 50% bei 130 ug/ml und um 75% bei 310 ug/ml reduzierte.

Claims (9)

1. 9-Substituierte-Purin- oder 1-substituierte-Pyrimidinverbindung der Formel
Z-CH&sub2;-O-CH(CH&sub2;OR')-CH&sub2;OR I
worin Z eine Uracil-, 5-Fluoruracil-, Cytosin-, 5- Azacytosin- oder N²-Acetylguaningruppe darstellt; und R und R' unabhängig aus H, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl und Phenyl(C&sub1;&submin;&sub6;- alkyl) ausgewählt sind, mit der Maßgabe, daß, wenn Z N²-Acetylguanin ist, R und R' nicht beide Wasserstoff oder Benzyl sind; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
2. 1-Substituierte-Pyrimidinverbindung gemäß Anspruch 1, worin Z 5-Fluoruracil ist.
3. 1-Substituierte-Pyrimidinverbindung gemäß Anspruch 1, worin Z 5-Azacytosin ist.
4. 1-Substituierte-Pyrimidinverbindung gemäß Anspruch 1, worin Z Cytosin ist.
5. 9-Substituierte-Purinverbindung gemäß Anspruch 1, worin Z N²-Acetylguanin ist.
6. Verbindung gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin R und R' unabhängig aus H und Benzyl ausgewählt sind.
7. Verbindung gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 3, worin R und R' beide H sind.
8. Verbindung gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 4, worin R und R' beide Benzyl sind.
9. Verbindung gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Behandlung von Virusinfektionen in lebenden Säugerzellen.
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