DE3038219C2

DE3038219C2 -

Info

Publication number: DE3038219C2
Application number: DE3038219A
Authority: DE
Inventors: Mohammad Dr. 6719 Obrigheim De Munir
Original assignee: Sueddeutsche Zucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 1980-10-09
Filing date: 1980-10-09
Publication date: 1988-05-11
Also published as: FI812560L; IE51455B1; ATE16406T1; DK150310C; ES505364A0; ES8206623A1; FI70926C; DK150310B; DE3038219A1; DE3172822D1; DD201695A5; SU1512489A3; EP0049742B1; FI70926B; EP0049742A1; DK434981A; JPS5794298A; US4640894A; IE811670L

Description

Der Gegenstand der Erfindung betrifft die kontinuierliche Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose (Palatinose, 6-O-α-D-Glucopyranosido-D-fructose) mit Hilfe von toten immobilisierten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Mikroorganismen und hat die Verminderung der Nebenproduktbildung zum Ziel.

Isomaltulose ist ein Zwischenprodukt zur Herstellung von Glucopyranosido-1,6-mannit (DE-AS 25 20 173) und Gluco pyranosido-1,6-sorbit (Isomaltit, DE-PS 22 17 628). Beide Substanzen können als Zuckeraustauschstoffe eingesetzt werden.

Aus der deutschen Patentschrift 10 49 800 ist bekannt, daß Saccharose enzymatisch in Isomaltulose umgewandelt wird. Die Enzyme dazu sind mikrobiellen Ursprungs. Neben Prota minobacter rubrum sind weitere Bakterien wie Erwinia carotovora, Serratia marcescens, Serratia plymuthica und Leuconostoc mesenteroides zu dieser Umlagerung befähigt (S. Schmidt-Berg-Lorenz, W. Mauch, Zeitschrift für die Zuckerindustrie 14, 625-627 (1964); F. H. Stodola, 126th Meeting, Amer. Chem. Soc., Sept. 1954, Abstracts of papers, S. 5 D; W. Mauch, S. Schmidt-Berg-Lorenz, Zeit schrift für die Zuckerindustrie 14, 309-315 und 375- 383 (1964)).

Weiterhin ist aus der DE-PS 22 17 628 bekannt, daß die enzymatische Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose in einer 15- bis 40%igen Lösung unter starkem Rühren und aeroben Bedingungen bei 20 bis 37°C chargenweise oder kon tinuierlich durchgeführt werden kann.

Ferner ist aus der DE-OS 28 06 216 bekannt, die Züchtung von isomaltulose-bildenden Mikroorganismen unter gleich zeitiger Umsetzung von Saccharose in Isomaltulose konti nuierlich durchzuführen.

Die vorgenannten bekannten Verfahren haben unter anderem folgende Nachteile:

a) Die lebenden und sich vermehrenden Zellkulturen ver wenden bzw. veratmen einen Teil der zugesetzten Saccharose für die eigene Lebenstätigkeit (Wachstum und Vermehrung); dadurch geht dieser Teil der Saccharose für die Umsetzung von Isomaltulose ver loren.
b) Die Umwandlung der Saccharose in Isolmaltulose und die gleichzeitige Zellvermehrung erfordert eine Fermentation unter starker Rührung und Belüftung, was wiederum mit einem hohen Energieaufwand ver bunden ist.
c) Die Konzentration des Nährsubstrates mit 25% (DE-OS 28 06 216) bzw. 15 bis 40% (DE-PS 22 17 628) für die nachfolgende Gewinnung der Isomaltulose durch direkte Kristallisation ist zu gering. (Die umgesetzte Saccharoselösung muß nämlich nach Ab trennung der Zellmasse zunächst eingedampft werden, bevor sie einer Kristallisation unterworfen werden kann. So müssen aus 100 kg umgesetzter Saccharose lösung nach DE-OS 28 06 216 ca. 67 kg Wasser ver dampft werden, ehe die Isomaltulose auskristallisiert.)
d) Die Vermehrung der Zellmasse benötigt nicht nur eine geeignete Kohlenstoffquelle, sondern auch Stickstoff- und Nährsalze. (Bei dem obenerwähnten Verfahren er folgt die Stickstoff- und Nährsalzzugabe dadurch, daß man anstelle von reinen Saccharoselösungen Zucker lösungen geringer Reinheit, wie sie in einer Zucker fabrik anfallen, verwendet. Diese Verunreinigungen (Nichtzuckerstoffe) werden einerseits für das Zell wachstum unbedingt benötigt, andererseits verursachen sie bei der Kristallisation Isomaltuloseverluste durch Melassebildung.)

Um die vorgenannten Nachteile zu vermeiden, hat die An melderin die Umwandlung der Saccharose in Isomaltulose von der Zellvermehrung getrennt und versucht, aus reinen Saccharoselösungen mit einer hohen Konzentration mit Hilfe von toten immobilisierten Zellen von isomaltulose-bilden den Mikroorganismen, zum Beispiel Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) oder den anderen Stämmen die Saccharose zu Isomaltulose umzuwandeln.

Im Rahmen dieses Verfahrens wurden Saccharoselösungen mit Konzentrationen von 45 Gew.-% bis 75 Gew.-%, vorzugsweise 65 Gew.-% bis 75 Gew.-%, bei einer Temperatur von 45°C bis 65°C kontinuierlich durch einen mit den immobilisierten Zellen gefüllten Reaktor geleitet und daraus die entstan dene Isomaltulose durch an sich bekannte Methoden kristallin gewonnen.

Die mit diesem Verfahren verbundenen Vorteile sind:

a) Die isomaltulosehaltige Lösung kann ohne Vorein dampfung sofort zur Kristallisation gebracht werden, wodurch eine erhebliche Energieeinsparung erzielt wird.
b) Die Verwendung toter Zellen erhöht die Ausbeute an Isomaltulose, da Saccharose nicht mehr für den Stoff wechsel der Bakterienmasse benötigt wird.
c) Die Isomaltulose-Ausbeute wird nochmals dadurch erhöht, daß man reine Saccharoselösungen einsetzen kann und somit eine Melassebildung weitgehend ver meidet.
d) Da Saccharoselösungen mit Konzentrationen von über 65 Gew.-% mikrobiologisch stabil sind, kann auf eine Sterilisation des Substrats verzichtet werden.
e) Ein weiterer, nicht zu vernachlässigender Vorteil besteht darin, daß man aufgrund der höheren Substrat konzentration kleinere Volumina zu behandeln hat und somit mit kleineren Apparaturen auskommt.
f) Die Vermehrung der Bakterienmasse zur Herstellung von immobilisierten Zellen kann unter optimierten Wachstumsbedingungen erfolgen, und es brauchte dem nach nicht mehr ein Kompromiß zwischen den optimalen Bedingungen für die Umsetzung zu Isomaltulose und für das Wachstum der Bakterien eingegangen zu werden.
g) Es kann ein billiges Nährsubstrat, zum Beispiel sogenannter Dicksaft oder verdünnte Melasselösung, zur Herstellung der Bakterienmasse eingesetzt werden mit einer optimalen Zellvermehrung in einem saures Ammoniumphosphat enthaltenden Nährmedium, das nur etwa 5 Gew.-% Trockensubstanzgehalt aufweist.

Für die vorgenannte Immobilisierung der erzeugten Zellen eignen sich grundsätzlich alle von I. CHIBATA (Immobilized Enzymes, John Wiley and Sons, New York, London, 1978) ge nannten Methoden zur Immobilisierung von ganzen Zellen.

Die dabei gewonnenen Präparate werden zur Verhinderung eines Ausblutens vernetzt, wofür man bifunktionelle Rea genzien, wie zum Beispiel Glutaraldehyd, verwendet.

Die immobilisierten und vernetzten Zellen werden nun vor Beginn der Reaktion in einen geeigneten Säulenreaktor ge füllt, der temperierbar sein muß und einen Durchmesser zum Betthöhen-Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 20, vorzugs weise 1 : 1 bis 1 : 10, insbesondere 1 : 1,5 bis 1 : 5 hat.

Im Zuge der praktischen Durchführung des Verfahrens mit einer reinen Saccharoselösung von 65 bis 75 Gew.-%, die bei einer Temperatur von 40 bis 60°C ent weder von oben nach unten oder von unten nach oben durch die Säule gepumpt wird, wurde unter Einstellung einer Kon taktzeit von 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise 4 bis 7 (das entspricht 0,2 bis 0,8 g Saccharose, vorzugsweise 0,4- 0,6 g Saccharose pro g immobilisierte Zelle (trocken) pro Stunde), gefunden, daß die eingesetzte Saccharose voll um gesetzt wird, doch entstanden außer ca. 82% Isomaltulose auch ca. 1% Glucose, 4% Fructose und 13% 1-O-α-D-Gluco pyranosido-D-fructose.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diese Nebenprodukt bildung zu verhindern.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man die Saccharose lösung schneller durch die Säule leitet und nur etwa 75 bis 80% der Saccharose umsetzt, aus dem Produktstrom einen Teil der Isomaltulose durch Kühlen auskristallisiert und den Rest nach Ergänzung mit frischer Saccharoselösung nochmals über die mit den immobilisierten Zellen gefüllte Säule leitet. Der Vorteil dieser Arbeitsweise liegt darin, daß durch die kürzere Kontaktzeit die Bildung von 1-O-a- D-Glucopyranosido-D-fructose unterdrückt wird und man im Endeffekt eine größere Ausbeute des gewünschten Produktes Isomaltulose erzielen kann.

Diese nicht zu erwartende Verminderung der hier uner wünschten Bildung der 1-O-α-D-Glucopyranosido-D-fructose folgt aus dem nachstehenden Ergebnis. Bei der Abwandlung der Versuchsbedingungen in Richtung an den anspruchsge mäßen Umsatz der Saccharose samt teilweisem Auskristalli sieren der Isomaltulose, Zusatz von frischer Saccharose lösung und nochmaligem Durchleiten durch die Säulen fielen - bei den oben angeführten Temperatur- und Konzen trationsbedingungen - unter entsprechender Erhöhung der Isomaltulose-Ausbeute lediglich 9,6% (nachgereicht) der 1-O-α-D-Gluco pyranosido-D-fructose an.

Die Arbeitsweise des Verfahrens wird anhand von zwei Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1

a) Von einer Abimpfung des Stammes Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) werden Zellen mit 10 ml eines sterilen Nährsubstrates, bestehend aus 8 kg Dick saft aus einer Zuckerfabrik (Trockensubstanzgehalt = 65%), 2 kg Maisquellwasser, 0,1 kg (NH₄)₂HPO₄ und 89,9 kg dest. Wasser (bei Bedarf auf pH 7,2 einge stellt) abgeschwemmt. Diese Suspension dient als Impfgut für die Schüttenmaschinen-Vorkultur in 1-1- Kolben mit 200 ml Nährlösung obiger Zusammensetzung.
Nach einer 30stündigen Bebrütungszeit bei 29°C werden mit je 20 Kolben (4 l) 16 l Nährlösung obiger Zusammen setzung in einem 30-1-Kleinfermenter beimpft und bei 29°C mit 20 l Luft pro Minute und einer Rührgeschwin digkeit von 350 min^-1 fermentiert. Die anwachsende Keim zahl wird mikroskopisch bestimmt. Nach Erreichen von 5 · 10⁹ Keimen/ml wird der Fermenterinhalt in ein anderes Gefäß transferiert, dort mit einem kationen aktiven Flockungsmittel versetzt. Die ausge flockten Zellen werden absetzen gelassen, abde kantiert, mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 ge waschen und an der Zentrifuge entwässert. Die Masse wird dann zu Strängen extrudiert, an der Luft ge trocknet und gemahlen.
b) die Siebfraktion 0,3 bis 8,0 mm aus dem oben ge wonnenen Präparat wird in einer 0,1%igen Glutaralde hydlösung 10 Minuten gerührt, mit Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) gewaschen und unter Wasser in eine temperierbare Säule gefüllt. Die Säule wird dann auf 50°C erwärmt und mit einer 70gew.-%igen Saccharoselösung kontinuierlich durchströmt. Die Strömungsgeschwindigkeit wird dabei so eingestellt, daß am Ende der Säule keine Saccharose mehr nachweis bar ist. Die so gewonnene Isomaltuloselösung wird einem Kühlungskristallisator zugeführt, auf 20°C gekühlt und die auskristallisierte Isomaltulose an Siebkorbzentrifugen von der Mutterlauge abgetrennt.

Beispiel 2

Von einer Abimpfung des Stammes Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) werden Zellen mit 10 ml eines sterilen Nähr substrates, bestehend aus 6,25 kg Rübenmelasse (Trocken substanzgehalt = 80%), 0,1 kg (NH₄)₂HPO₄ und 93,65 kg dest. Wasser (falls erforderlich, mit HCl auf pH 7,2 ein gestellt) abgeschwemmt. Diese Suspension dient als Impf gut für die Schüttelmaschinen-Vorkultur in 1-1-Kolben mit 200 ml Nährlösung obiger Zusammensetzung. Nach einer 30stündigen Bebrütungszeit bei 29°C werden mit je 20 Kolben (4 l) 16 l Nährlösung obiger Zusammensetzung in einem 30-l-Kleinfermenter beimpft und bei 29°C mit 20 l Luft pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 350 min^-1 fermentiert.

Es wird weiter so verfahren, wie in Beispiel 1a und 1b beschrieben.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Isomaltulose (6-O-α- D-Glucopyranosido-D-fructose) aus reinen Saccharoselösun gen mit Hilfe von toten immobilisierten Zellen von Iso maltulose aus Saccharose bildenden Mikroorganismen, da durch gekennzeichnet, daß man reine Saccharoselösungen mit Konzentrationen von 45 Gew.-% bis 75 Gew.-% bei einer Temperatur von 40°C bis 65°C kontinuierlich durch einen mit den toten immobilisierten Zellen gefüllten Säulenreak tor leitet, nach einem Umsatz von etwa 75 bis 80% der Saccharose einen Teil der gebildeten Isomaltulose aus kristallisiert und die Restlösung nach Ergänzung mit frischer Saccharoselösung nochmals mit den immobilisierten Zellen in Kontakt bringt.