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Verfahren zur Vergrösserung der Abbildungstiefe
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bei Lichtmikroskopen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung
der Abbildungstiefe bei Lichtmikroskopen.
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Bei lichtmikroskopi schen Unterschungen mit hohen Vergrösserungen
ergibt sich bisher das Problem, daß das mikroskopische Bild nur eine sehr geringe
Schärfentiefe aufweist. Unter Schärfentiefe oder Abbildungstiefe versteht man den
Bereich eines Körpers mit Tiefenausdehnung, der in einem ebenen Bild "scharf" abgebildet
werden kann. Es werden namlich nur alle in der Einstellebene gelegenen Punkte auch
wieder als Punkte abgebildet, während alle anderen Punkte, die vor oder hinter der
Einstellebene des Objektives liegen, im Abbild nicht mehr als Punkte, sondern als
Zers treuungskreise dargestellt werden.Unter Zerstreuungskreisen versteht man die
Durchstossungsfiguren von Strahlenkegeln auf dem Auffangschirm.
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Je weiter ein Punkt von der Einstellebene entfernt ist, desto grösser
wird auch der zugehörige Zerstreuungskreis. Dieser Zerstreuungskreis darf einen
gewissen Durchmesser nicht überschreiten, weil sonst das Auge ihn nicht mehr als
Punkt wahrnimmt und somit unscharf sieht. Die maximal zulässige Grösse der Zerstreuungskreise
ist abhängig vom Auflösungsvermögen des Auges, das durch die Struktur der Netzhaut
bedingt ist. Es hat sich gezeigt, daß Zerstreuungskreise bis zu einer Grösse von
ca. 1/7 mm noch als ein Punkt wahrgenomman werden und damit dem Auge scharf erscheinen.
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Daraus ergibt sich, daß die Tiefenausdehnung von Körpern, die in einem
ebenen Bild scharf dargestellt werden können, begrenzt ist. Die Abbildungstiefe
oder Schärfentiefe ist abhängig von der numerischen Apertur des Objektives, der
Endvergrösserung des Bildes und der Wellenlänge des Lichtes. Je grösser die
numerische
Apertur und die Endvergrösserung werden, desto geringer wird die Abbildungstiefe,
während andererseits mit zunehmender Wellenlänge auch die Abbildungstiefe zunimmt.
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Theoretisch könnte also eine Vergrösserung der Abbildungstiefe dadurch
erreicht werden, daß man die numerische Apertur rrerkleinert und die Wellenlänge
des Lichtes erhöht. Das hat aber den entscheidenden Nachteil, daß dadurch das Auf
lösungsvermögen des Mikroskopes sehr stark beeinträchtigt würde.
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Die Abbildungstiefe ist aber für die Auswertung von Präparaten beispielsweise
biologischen, medizinischen oder paläontologi schen Präparaten eine wichtige- Voraussetzung.
Bei der Betrachtung mit 400-facher Vergrösserung beträgt die Abbildungstiefe bei
den üblichen bEkroskopen nur einige Mikrometer, während Strukturen bei biologischen
Präparaten oder Mikrofossilien Grössen bis zu wenigen Millimetern oder darunter
erreichen konnten.
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Zwar sind Stereoprisuenmikroskope mit grosser Abbildungstiefe bekannt,
mit ihnen können aber höchstens Vergrösserungen bis zum 200-fachen erreicht werden.
Bei notwendiger weiterer Vergrösserung besteht die einzige Möglichkeit, solche Untersuchungen
durchzufthren, z.Zt. in der Verwendung eines Elektronenrastermikroskopes, das natürlich
gegenüber dem Lichtmikroskop finanziell wesentlich aufwendiger ist und bei dem zum
Teil die Präparate auch eine Vorbehandlung verlangen wie beispielsweise aufdampfen
bestimmter Verbindungen.
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Zur Vermeidung der oben geschilderten Nachteile wird daher ein Verfahren
zur Verbesserung der Abbildungstiefe bei Lichtmikroskopen vorgeschlagen, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß das Präparat in schnelles konstantes Schwingen parallel
zur optischen Achse versetzt und mit einer stark gebündelten und getriggerten Lichtquelle
beleuchtet wird.
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Uberraschenderweise wurde festgestellt, daß sich die AW,ildungstiefe
eines Präparates bei lichtmikroskopischen Untersuchungen
selbst
mit einfachsten Mitteln mindestens verdoppeln läßt, wenn das Präparat in schnelles
konstantes Schwingen parallel zur optischen Achse versetzt wird und die Beleuchtung
durch eine stark gebündelte, getriggerte Lichtquelle erfolgt, deren Frequenz mit
der Frequenz des Schwingers gekoppelt ist.
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Die Schwingung des Präparates muß zwei wesentliche Bedingungen erfüllen,
nämlich, sie muß absolut parallel zur optischen Achse, d.h. also ohne seitlichen
Versatz und schnell genug erfolgen, damit das Auge die Bewegung im mikroskopischen
Bild aufgrund seiner Trägheit nicht mehr als Einzelbilder wahrnimmt.
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Die Lichtquelle muß getriggert sein, da die Flimmergrenze des Auges
zwischen 20 Bildern pro Sekunde bei Dunkeladaption und 60 Bildern bei Helladaption
liegt, so daß gewährleistet sein muß, daß die einzelnen Schärfenebenen nicht mehr
getrennt, sondern nur noch als großer Bereich wahrgenoarmen werden. Außerdem hat
sich herausgestellt, daß zur Verbesserung der Abbildungstiefe die Lichtquelle stark
gebündelt sein oder itonochronatisches Licht erzeugen muß, um zu verhindern, daß
das Gesamtbild unschärfer wird. Wird diese Bedingung nicht erfüllt, überlagern sich
nicht nur die scharf dargestellten Einzelheiten, die vom Objektiv auch scharf abgebildet
werden, sondern auch die unscharfen Bereiche, so daß nur der Bereich des Präparates
beleuchtet werden darf, der vom Objektiv auch scharf abgebildet wird. Alle Bereiche
die sich darüber oder darunter befinden, werden nicht beleuchtet und können sich
deshalb auch nicht als unscharfe Bereiche im Bild störend bemerkbar machen.
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Als Beleuchtung können alle Lichtquellen eingesetzt werden, die stark
gebündelt sind oder monochromatischtes Licht aussenden, vorausgesetzt, daß sie getriggert
sind, beispielsweise durch einen elektronischen Impulsgeber oder durch eine Umlallfhlende.
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Die Schwingung des Präparates kann piezo-elektrisch, mechanisch, pneumatisch,
hydraulisch oder elektromagnetisches beispielsweise durch Membranschwingungen erfolgen.
Dabei ist darauf zu achten, daß die Frequenz der Lichtquelle mit der des Schwingers
gekoppelt wird, um ein konstantes Frequenzverhältnis zu erhalten. Dies führt dazu,
daß man genau definierte Schärfenebenen erhalt, während im anderen Falle bei jeder
Schwingung andere Bereiche beleuchtet wurden und daher im Bild die Schärfenebene
auf- und abwandern.
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Der Schärfentiefenbereich ist direkt abhängig von der Amplitude der
Schwingung und der Frequenz der Lichtquelle. Erhöht man die Amplitude der Schwingung,
so vergrössert sich auch der Bereich, der beleuchtet wird. Gleichzeitig muß daher
die Frequenz der Lichtquelle erhöht werden, um mehr Schärfenebenen zu erhalten,
da es sonst eintreten kann, daß es zwischen zwei Schärfenebenen, die übereinander
liegen, Bereiche des Präparates gibt, die überhaupt nicht beleuchtet werden.
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Die Beobachtung des Präparates kann in üblicher Weise direkt erfolgen
oder das Bild kann auch auf einen Schirm oder über eine Videoanlage projiziert oder
fotografisch festgehalten werden.
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Bereits bei einfachster Versuchsanordnung, bei der als Schwinger ein
Lautsprecher verwendet wird, auf dessen Membran das Präparat fixiert wurde, und
als getriggerte Lichtquelle ein Stroboskop eingesetzt wurde und wobei ein Pulsgenerator
das Stroboskop mit einer Frequenz von 300 Hz und der Lautsprecher über einen Teiler
mit einer Frequenz von 30 Hz schwingt, wurde eine Verbesserung der Abbildungstiefe
auf das Doppelte erreicht.