DE29913707U1 - Konfokale optische Vorrichtung zur optischen Erfassung eines Beobachtungsvolumens - Google Patents

Description

Konfokale optische Vorrichtung zur optischen Erfassung eines Beobachtungsvolumens

Die Erfindung betrifft die konfokale Messung optischer Merkmale eines Target-Materials, und insbesondere konfokale Mikroskopie.

Konfokale Mikroskopie spielt eine zunehmend wichtige Rolle bei der Messung mikroskopischer Eigenschaften eines Target-Materials, insbesondere eines Target-Materials biologischen Ursprungs. Konfokale Mikroskope sind oftmals als Laser-Scanning-Mikroskope (LSM) konstruiert, bei denen Licht aus einer Laserquelle zuerst auf einen dichroitischen Spiegel auftrifft, der entweder zu 50% reflektierend ist oder nur die Wellenlänge des Laserlichtes reflektiert, und das vom Spiegel reflektierte Licht mittels einer Objektivlinse auf das Target-Material fokussiert wird. Das Licht wird entweder an der Oberfläche des Target-Materials oder in dessen Körper in einer gewünschten Tiefe gestreut, absorbiert und/oder phasenverschoben. Das rückwärtsgestreute Licht, das sich aufgrund von Rayleigh-Streuung, inelastischer (Raman-)Streuung oder Lumineszenz ergibt, wird zum Teil auf die gleiche Linse gerichtet und durch diese hindurchgelassen. Ferner wird das Licht zumindest teilweise durch den dichroitischen Spiegel durchgelassen. Im allgemeinen wird das Licht durch eine Lochblende mit einem Durchmesser von einigen zehn bis hundert Mikron hindurch fokussiert, bevor es auf den Detektor auftrifft. Diese Blende schirmt unerwünschtes Licht, das die Abbildung unscharf machen würde, größtenteils ab - insbesondere die Strahlen von Schichten des Präparates, die höher und tiefer liegen als die gewählte Untersuchungstiefe. Eine derartige Ausführung eines konfokalen Mikroskops ist beispielhaft in J.W. Lichtman's Artikel "Konfokale Mikroskopie" (Spektrum der Wissenschaft, S. 78-87, 1994) beschrieben. Es existieren jedoch einige Typen konfokaler Mikroskope, die keine Lochblende zwischen der Linse und dem Detektor benötigen. Falls z.B. eine Anregung fluoreszenter Materialien mit 2 Photonen verwendet wird, ist die Intensitätsdichte des

Anregungslichtes nur im Fokus des Lasers ausreichend, so daß auf die Lochblende verzichtet werden kann.

Im Gegensatz zur vorherrschenden Meinung bietet die konfokale Mikroskopie immer noch nicht das Maximum der Effizienz, die man theoretisch erreichen kann. So passiert sämtliches Licht, das von irgendeinem Punkt auf der optischen Achse des Mikroskops ausgegeben wird und das sich entlang dieser Achse fortpflanzt, die Lochblende, ohne blockiert zu werden. Die Sammeleffizienz für Punkte, die auf der optischen Achse, aber außerhalb der Fokusebene liegen, ist offensichtlich reduziert, kann jedoch immer noch für eine beträchtliche Unscharfe im LSM-BiId verantwortlich sein.

Dies gilt insbesondere, wenn fluoreszente Nachweissubstanzen verwendet werden, um bestimmte interessierende Bereiche des Target-Materials kenntlich zu machen. Derartige Substanzen tendieren oft zu einer Anhaftung an Glasflächen und somit auch an der Oberfläche von Deckgläsern, die bei der Mikroskopie häufig verwendet werden. Adhärente Zellen müssen normalerweise in enger Nähe zu der Glasfläche analysiert werden, wobei es sich oft um einen Abstand von weniger als 10 &mgr;&eegr;&igr; handelt. In diesen Fällen verursachen fluoreszente Nachweissubstanzen, die in unspezifischer Weise an der Glasoberfläche in der Umgebung der Fokusebene anhaften, ein starkes Hintergrundsignal, das in LSM-Bildern als massive Unscharfe sichtbar ist.

Signalverarbeitungstechniken, die auf einer statistischen und/oder Koinzidenz-Analyse des zeitlich aufgelösten optischen Signals basieren, und insbesondere derartige Techniken, die auf einer einzelnen Einzelmoleküldetektion basieren - z.B. Fluoreszenzkorrelationsanalyse (FCS) und verwandte, insbesondere auf Fluoreszenz basierende Verfahren (wie molmassenunabhängige Analyseverfahren, die in WO 98/16814 und in der europäischen Patentanmeldung 98 105 160.0 beschrieben

•^! ir-.-i ·"

sind; Verfahren zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer; Multiparameter-Analyseverfahren, die z.B. in der europäischen Patentanmeldung 97 109 353.9 beschrieben sind, etc.) - leiden drastisch unter Streulichteinflüssen außerhalb des Fokus des Lasers. Das Signal-Rausch-Verhältnis bei diesen Techniken hängt stark von der Anzahl von Photonen ab, die pro Molekül und Zeitintervall detektiert werden. Es ist bekannt, daß das Signal-Rausch-Verhältnis des G(O)-Wertes der FCS exakt linear von der Anzahl der pro Molekül und Zeitintervall gesammelten Photonen abhängt. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen Intensitätsmessungen, bei denen man ein Signal-Rausch-Verhältnis erwarten kann, das der Wurzel der Anzahl detektierter Photonen proportional ist.

In der Mikroskopie sind bei der Beleuchtung des Target-Materials und bei der Detektion des Ausgangslichtes häufig Filter verwendet werden.

Bei der herkömmlichen optischen Mikroskopie wird die Dunkelfeldbeleuchtung weithin als Verfahren zum Verstärken des Kontrastes des Target-Materials verwendet. Bei diesem Verfahren wird mittels einer entlang der zentralen Achse der Beleuchtungslichtquelle angeordneten Lichtblende, die Form des ausgegebenen Lichtkegels zu derjenigen eines Hohlkegels verändert. Bei der Transmissionsmikroskopie wird dieser Effekt erzielt, indem der mittlere Teil des Mikroskop-Kondensors verdunkelt wird, während bei der Reflexionsmikroskopie eine ringförmige Lichtquelle um das Mikroskop-Objektiv plaziert wird. Beide Konzepte gewährleisten, daß aus der Lichtquelle austretendes Licht, das keine Interaktion mit dem Target-Material eingeht, die Linse nicht erreicht. Da nur gestreutes Licht die Linse erreichen kann, wird in dieser Weise ein verbesserter Kontrast für schwach absorbierende Target-Materialien erzielt.

Bei einem Lumineszenzmikroskopie-Verfahren wäre eine Hellfeldbeleuchtung nicht praktikabel. Das Licht aus der Anregungslichtquelle würde durch dielektrische Filter

auf der optischen Achse blockiert, während die Lumineszenz isotrop emittiert würde. Selbst bei Verwendung in Verbindung mit konfokaler Beleuchtung ist dieses Verfahren ungeeignet, um die Streulichtintensität aus einer Position nahe dem konfokalen Volumen zu reduzieren.

Ein weiteres Konzept in diesem Zusammenhang wird als Phasenkontrast-Mikroskopie bezeichnet. Unter Verwendung von Hell- oder Dunkelfeldbeleuchtung wird das von dem Target-Material ausgehende Ausgangslicht, das durch die Mikroskop-Linse getreten ist, auf einen Filter gerichtet, der entweder kreis- oder ringförmig ausgebildet ist und der entweder eine positive oder eine negative Phasenverschiebung von im wesentlichen einer Viertel-Wellenlänge bewirkt. Ein derartiger Filter reduziert die Intensität des nicht abgelenkten Lichtes der Lichtquelle und erhöht somit die relative oder absolute Intensität des phasenverschobenen Ausgangslichtes. Auch dieses Verfahren wird durch verstärkte Seitenkegel beeinträchtigt. Für Lumineszenz-Verfahren ist die ausgegebene Phase zufallsbestimmt und bietet keine Information.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine konfokale optische Vorrichtung zu schaffen, mit der sich ein Beobachtungsvolumen in einer Probe, welche insbesondere Moleküle und/oder Molekülkomplexe enthält, genau untersuchen läßt.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird mit der Erfindung eine konfokale optische Vorrichtung vorgeschlagen, die versehen ist mit

einer Strahlungserzeugungsvorrichtung zum Erzeugen von Anregungsstrahlung,

einer Fokussiervorrichrung zum Fokussieren der Anregungsstrahlung auf das Beobachtungsvolumen und

einer Detektorvorrichtung zur Erfassung der von dem Beobachtungsvolumen ausgehenden Ausgangsstrahlung.

Bei dieser Vorrichtung ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß im Strahlengang der Ausgangsstrahlung und/oder im Strahlengang der Anregungsstrahlung ein Abschattungselement zum Ausblenden eines zentralen Teils der Ausgangsstrahlung bzw. Anregungsstrahlung angeordnet ist.

Bei der erfindungsgemäßen konfokalen optischen Vorrichtung (nachfolgend auch Analysegerät genannt) wird ein Teil der von der Probe bzw. dem Beobachtungsvolumen kommenden, und insbesondere ohne besondere Maßnahmen auf den Detektor auftreffenden Strahlung und/oder ein Teil der Anregungsstrahlung durch ein zentrales Abschaltungselement ausgeblendet. Damit wird beispielsweise verhindert, daß Emissionsstrahlung, die von zu untersuchenden und optisch markierten Molekülen bzw. Molekülkomplexen ausgeht, welche in Erstreckung der optischen Achse vor und hinter dem Fokus der Anregungsstrahlung entsteht, auf die Detektorvorrichtung auftrifft. Dasselbe gilt für Streustrahlung und reflektierte Strahlung, die außerhalb des Fokus der Anregungsstrahlung bzw. des Beobachtungsvolumens entsteht.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist insbesondere zur Detektion von optisch markierten Molekülen bzw. Molekülkomplexen geeignet, die sich in dem Beobachtungsvolumen befinden und untersucht werden sollen. Derartige Untersuchungen werden beispielsweise im Zusammenhang mit der Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt. Sofern die Moleküle bzw. Molekülkomplexe des Beobachtungsvolumens mit beispielsweise einem fluoreszierenden Farbstoff markiert sind, senden sie bei Anregung durch die Anregungsstrahlung Emissionsstrahlung aus. Durch die erfindungsgemäße Ausblendung der Emissionsstrahlung all derjenigen markierten Moleküle bzw. Molekülkomplexe, die sich entlang der optischen Achse vor bzw. hinter dem Fokus befinden bzw. durch Ausblendung eines zentralen Teils der Anregungsstrahlung, wird der Anteil an von der Detektorvorrichtung erfaßter Hinter-

O 6-MrI-UQ

gmndstrahlung reduziert, wodurch sich das Signal/Rausch-Verhältnis der von der Detektorvorrichtung erfaßten Strahlung vergrößert.

Überraschenderweise erzielt man durch Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Ermitteln der Anzahl an beispielsweise fluoreszierenden Molekülen in einem B eobachtungs volumen verbesserte Ergebnisse. Durch das Abschattungselement wird nämlich all die Emissionsstrahlung ausgeblendet bzw. wenn das zentrale Abschattungselement in der Anregungsstrahlung angeordnet ist, an ihrer Entstehung unterdrückt, die von den außerhalb des Fokus liegenden Molekülen bzw. Molekülkomplexen herrührt. Damit aber steigt die detektierbare Zählrate pro Molekül, also die Anzahl von Photonen pro Molekül pro Zeiteinheit an. Damit erhöht sich die Genauigkeit der Meßergebnisse.

In Abhängigkeit der Gestaltung des Transmissionsprofils des Abschattungselements kann Einfluß auf denjenigen Bereich des Beobachtungsvolumens um den Fokus herum genommen werden, aus dem Emissionsstrahlung auf die Detektorvorrichtung auftreffen soll. Insbesondere kann durch graduelle Veränderung der Transmission des Abschattungselements die Grenze zwischen dem ausgeblendeten bzw. nicht ausgeblendeten Bereich des Beobachtungsvolumens mehr oder weniger scharf ausgestaltet sein.

Als Strahlungserzeugungsvorrichtung eignet sich insbesondere eine Strahlungsquelle für monochromatische und kohärente Strahlung, insbesondere ein Laser.

Um zu verhindern, daß beispielsweise gestreute Anregungsstrahlung auf den Detektor auftrifft, ist gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, in den zur Detektorvorrichtung führenden Strahlengang einen Filter zum Filtern dieser Streustrahlung anzuordnen.

Ein derartiger Filter wird insbesondere bei einem Aufbau der optischen Vorrichtung eingesetzt, bei der die Anregungsstrahlung über einen Strahlteiler in das Beobachtungsvolumen und die Ausgangsstrahlung durch den Strahlteiler zurück zur Detektorvorrichtung gelangt. Ein geringer Anteil der den Strahlteiler verlassenden Anregungsstrahlung gelangt als Streustrahlung dabei in Richtung auf den Detektor. Um diesen Streustrahlungsanteil herauszufiltern, wird dann zwischen dem Strahlteiler und der Detektorvorrichtung dem Filter angeordnet.

In vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung ist ferner vorgesehen, daß die Anregungsstrahlung über einen Lichtleiter in Richtung auf das Beobachtungsvolumen gerichtet wird. Das Austrittsende des Lichtleiters ist dabei von einem Halteelement gehalten, das sich demzufolge auf der optischen Achse zwischen dem Beobachtungsvolumen und der Detektorvorrichtung befindet. Bei einem derartigen Aufbau ist es dann zweckmäßig, das Halteelement zugleich auch als Abschattungselement zu nutzen.

Zur Begrenzung der Menge an von der Detektorvorrichtung zu erfassender Ausgangsstrahlung ist eine Lochblende vorgesehen, die insbesondere einen Durchmesser von < 100 &mgr;&idiagr;&eegr; und vorzugsweise von < 20 bis 30 &mgr;&pgr;&igr; aufweist. Eine derartige Lochblende (auch Pinhole genannt) dient dazu, Strahlung, deren Ursprung auf der optischen Achse vor und hinter dem Fokus der Anregungsstrahlung liegt, daran zu hindern, auf die Detektorvorrichtung aufzutreffen. Auf die Lochblende kann verzichtet werden, wenn die sensitive Fläche der Detektorvorrichtung gleich dem Querschnitt der Lochblende ist. In diesem Fall übernimmt also die Detektorvorrichtung sozusagen die Funktion der Lochblende.

Nachfolgend wird anhand der Zeichnung, in der der Aufbau eines konfokalen Analysegeräts schematisch.dargestellt ist, ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert.

Fig. 1 zeigt schematisch ein optisches Analysegerät 10, wie es beispielsweise in der Fluoreszenzspektroskopie eingesetzt wird. Das Analysegerät 10 weist als Erzeugungsvorrichtung für die Anregungsstrahlung einen Laser 12 auf, der kohärente monochromatische Anregungsstrahlung als Bündel 14 aussendet. Die Anregungsstrahlung wird durch eine Linse 16 parallelisiert und trifft auf einen unter 45° zur optischen Achse 18 angeordneten dichroitischen Spiegel 20 auf. Der dichroitische Spiegel 20 reflektiert die Anregungsstrahlung in Richtung auf eine Objektivlinse 22, deren Fokus 24 innerhalb eines Beobachtungsvolumens 26 angeordnet ist. Das Beobachtungsvolumen ist zur Objektivlinse 22 hin durch eine strahlungsdurchlässige Platte 28 begrenzt.

In dem Beobachtungsvolumen 26 befindet sich die zu untersuchende Probe, die im Falle der Anwendung des Analysegeräts 10 für die Fluoreszenzspektroskopie beispielsweise durch Fluoreszenzfarbstoffe markierte Moleküle bzw. Molekülkomplexe aufweist. Infolge der Anregung durch die Anregungsstrahlung emittieren die markierten Moleküle bzw. Molekülkomplexe Emissionsstrahlung, die als Bündel 30 durch die Objektivlinse 22 hindurch auf den dichroitischen Spiegel 20 auftrifft. Da der dichroitische Spiegel 20 für die Emissionsstrahlung 30 durchlässig ist, breitet sich diese über den dichroitischen Spiegel 20 in Richtung der optischen Achse 32 aus. Auf dieser optischen Achse 32 sind ein Filter 34 und eine Kollimationslinse 36 angeordnet. Im Fokus der Kollimationslinse 36 befindet sich eine Lochblende (Pinhole) 38. Die durch die Lochblende 38 hindurchtretende Emissionsstrahlung 30 trifft auf eine weitere Linse 40, hinter der ein Photodetektor 42 angeordnet ist, der die Emissionsstrahlung erfaßt.

Wie in der Zeichnung dargestellt, befindet sich im Strahlengang der Emissionsstrahlung 30 zwischen dem dichroitischen Spiegel 20 und dem Photodetektor 42 ein zentral angeordnetes Abschattungselement 44, das den zentralen Teil der Emissionsstrahlung 30 ausblendet. Durch dieses zentrale Abschattungselement 44

wird derjenige Teil der Emissionsstrahlung 30, der von Molekülen bzw. Molekülkomplexen ausgeht, die sich in Erstreckung der optischen Achse 32 betrachtet vor und hinter dem Fokus 24 der Anregungsstrahlung 14 befinden, ausgeblendet. Damit trifft nur noch diejenige Emissionsstrahlung auf den Photodetektor 42 auf, die von den Molekülen bzw. Molekülkomplexen im Fokus 24 bzw. in dessen unmittelbarer Umgebung ausgeht. Die von vor und hinter dem Fokus 24 angeordneten Molekülen bzw. Molekülkomplexen ausgehende Emissionsstrahlung wird durch die Lochblende 38 ausgeblendet. Durch die Lochblende 42 wird also erreicht, daß nur diejenige Emissionstrahlung, die innerhalb des Bereichs 46 und dem Fokus der Anregungsstrahlung entsteht, auf den Photodetektor 42 auftrifft.

Durch die erfindungsgemäße Anordnung des zentralen Abschattungsteils 44 innerhalb des Strahlengangs der Emissionsstrahlung 30 und außerhalb des Strahlengangs der Anregungsstrahlung 14 wird zusätzlich auch gestreute und/ oder vom Beobachtungsvolumen 26 reflektierte Strahlung ausgeblendet. Das Abschattungselement 44 blendet innerhalb des durch die Lochblende 42 bereits eingeschränkten "sensitiven" Bereichs 46 nochmals die Teilbereiche 48 aus. Insgesamt verbessert sich damit das Signal/ Rausch-Verhältnis, so daß die emittierende Moleküle bzw. Molekülkomplexe exakter detektiert werden können.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich insbesondere in Kombination mit dem in WO-A-98/16814 beschriebenen molmassenunabhängigen Analyseverfahren, das in einer bevorzugten Ausführungsform als FIDA ("Fluorescence Intensity Distribution Analysis") bekannt ist.

Claims (11)

1. Konfokale optische Vorrichtung zur optischen Erfassung eines Beobachtungsvolumens mit

1. einer Strahlungserzeugungsvorrichtung (12) zum Erzeugen von Anregungsstrahlung (14),

2. einer Fokussiervorrichtung (22) zum Fokussieren der Anregungsstrahlung (14) auf das Beobachtungsvolumen (26) und

3. einer Detektorvorrichtung (42) zur Erfassung der von dem Beobachtungsvolumen (26) ausgehenden Ausgangsstrahlung (30),

dadurch gekennzeichnet,

1. daß im Strahlengang (32) der Ausgangsstrahlung (30) oder der Anregungsstrahlung (14) ein Abschattungselement (44) zum Ausblenden eines zentralen Teils der Ausgangsstrahlung (30) bzw. Anregungsstrahlung (14) angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Abschattungselement (44) über seine gesamte Erstreckung ein im wesentlichen konstantes Transmissionsprofil zum gleichmäßigen Abschauen des betreffenden Teils der Ausgangsstrahlung (30) aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Abschattungselement (44) eine in Richtung radial auswärts sich vergrößernde Transmission aufweist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich im Strahlengang (32) der Ausgangsstrahlung (30) ein Filter (34) zum Herausfiltern von gestreuter Anregungsstrahlung angeordnet ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungserzeugungsvorrichtung (12) eine Strahlungsquelle für monochromatische und kohärente Anregungsstrahlung aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsstrahlung eine Fluoreszenzstrahlung ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang (32) der Ausgangsstrahlung (30) ein Strahlteiler (20) angeordnet ist und daß die optischen Achsen (18, 32) der Anregungsstrahlung (14) und der Ausgangsstrahlung (30) im Bereich zwischen dem Strahlteiler (20) und dem Beobachtungsvolumen (26) identisch sind.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Strahlungserzeugungsvorrichtung einen Lichtleiter mit einem Austrittsende für die Anregungsstrahlung aufweist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Austrittsende des Lichtleiters von dem Abschattungselement (44) gehalten ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich im Strahlengang (32) der Ausgangsstrahlung (30) in der Bildebene konfokal zum Beobachtungsvolumen (26) eine Lochblende (38) zur Begrenzung der Menge an von der Detektorvorrichtung (42) zu erfassenden Ausgangsstrahlung befindet.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Detektorvorrichtung (42) im Strahlengang (32) der Ausgangsstrahlung (30) in der Bildebene konfokal zum Beobachtungsvolumen (26) befindet.