DE2903131A1 - Verfahren zur herstellung eines antihaemophilen globulin a enthaltenden konzentrats neben einem prothrombin-komplex und einer loesung von lagerstabilen serumproteinen - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines antihaemophilen globulin a enthaltenden konzentrats neben einem prothrombin-komplex und einer loesung von lagerstabilen serumproteinenInfo
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Description
- Verfahren zur Herstellung eines antihämophiles Globulin A
- enthaltenden Konzentrats neben einem Prothrombin-Komplex und einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen (Zusatz zu P 24 59 291.4-41) Im Hauptpatent (P (P 24 59 291.4-41) ist ein Verfahren zur Herstelleung eines antihämophiles Globulin A enthaltenden Konzentrats neben einem Prothrombin-Komplex und einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen beschrieben, bei dem als Ausgangsmaterial ein gefrorenes lonenaustauscherplasma verwendet wird, das bei Temperaturen von 2 bis 80C wieder aufgestaut wird und aus dem die überstehende Plasmaflüssigkeit von dem Faktor-1II-enthaltenden Proteinniederschlag abgetrennt und dieses Kryoprazipitat in an sich bebekannter Weise zu einem Faktor-VIII-Konzentrat aufgearbeitet wird während die Plasmaflüssigkeit durch Adsorption über handelsüblichem Tricalciumphosphat von den Faktoren II, VIID IX und X befreit wird, und anschließend aus der Plasmaflüssigkeit über kolloidaler Kieselsäure mit einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 400 m2 /g die noch im Plasma vorliegenden Gerinnungsfaktoren und andere unstabile Proteine adsorbiert werden und eine Lösung von lagerstabilen Serumproteinen zurückbleibt Bei diesem Verfahren des Hauptpatents wurde als Ausgangsmaterial ein gefrorenes Ionenaustauscher,plasma verwendet, das durch direkte Entnahme von Spender-Venenblut über einen Polystyrol/Sulfonat-Kationenaustauscher und Einfrieren auf etwa -400C innerhalb etwa 48 Stunden gewonnen worden war.
- Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß als Ionenaustauscherplasma im Verfahren des Hauptpatents auch ein übliches eingefrorenes Citratplasma verwendet werden kann, wenn man nach dem Auftauen und Abtrennen des Kryoprazipitates den über stand mit Anionenaustauscherharzen auf Basis Polystyrol/ Divinylbenzolquartäres Amin und Kationenaustauscherharzen auf Basis Polystyrol/Sulfonat behandelt. Da übliches Citratplasma jederzeit in ausreichender Menge zur Verfügung steht, läßt sich das Verfahren des Hauptpatents nunmehr jederzeit unabhängig von der Entnahme von Spenderblut durchführen.
- Bekanntlich wird Blut üblicherweise in citrathaltigen Stabilisatoren abgenommen, wobei durch Komplexbindung des Blutcalciums mit dem Citrat die Gerinnung des Blutes verhindert wird, da bekanntermaßen für den Ablauf des Gerinnungsvorganges freie CalciumJIonen vorhanden sein müssen. Calcium gehört daher zu den Gerinnungsfaktoren und wird auch als Gerinnungsfaktor IV bezeichnet. Durch die erfindungsgemäße Zugabe von Ionenaustauschern zu dem mit Citrat stabilisierten Plasma kann das Citrat an den Anionenaustauscher gebunden werden, wodurch Calcium-Ionen wieder freigesetzt werden und für den Ablauf des Gerinnungsgeschehens wieder zur Verfügung stehen.
- Die Calciumionen des mit Citrat stabilisierten Plasmas können erfindungsgemäß durch Zugabe eines Xationenaustaus chers gegen Natrium- oder Wasserstoff-Ionen ausgetauscht werden Wird im Anschluß an diesen Austausch das Citrat erfindungsgemäß mit einem Anionenaustatjcher gegen Chlorid- oder Hydroxyl-Ionen ausgetauscht, so wird überraschenderweise der gleiche Effekt der Stabilisierung des Plasmas erreicht wie dEr, den man erhält, wenn Calcium dem Blut direkt bei der Blutabnahme mit einem Kationenaustauscher entzogen und gegen Wasserstoff-oder Natrium-Ionen ausgetauscht wird. Der Austausch der Calcium-Ionen und Citrationen eines Citratplasmas kann auch in einem Schritt unter Verwendung eines sogenannten Mischbettes (Mischung aus Kationen- und Anionenaustauscher) erfolgen. Durch diesen Austausch der Calcium und Citrat-Ionen gegen Wasserstoff- und Hydroxyl-Ionen oder auch Natrium-und Chlorid-Ionen wird es erfindungsgemäß möglich, aus einem Citratplasma ein Ionenaustauscherplasma herzustellen, aus dem sich sodann die gleichen drei therapeutisch anwendbaren Produkte wie nach dem Hauptpatent und gegebenenfalls noch als viertes Produkt Fibrinogen herstellen lassen.
- Im erfindungsgemäßen Verfahren werden daher aus einem mit Citrat stabilisierten Blutplasma unter Vermeidung des Gerinnungsvorganges drei oder vier hepatitissichere und therapeutisch anwendbare Produkte erhalten. Die vier Produkte ßinda 1 Antihämophiles Globulin A 2. Prothrombinkomplex (Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X) 3. Lösung lagerstabiler Serumproteine 4. Fibrinogen Die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X werden bekanntlich auch als PPSB-Faktoren bezeichnet gemäß folgender Bedeutung: P = Prothrombin (Faktor II) P = Proonvertin (Faktor VII) S = Stuart-Prower-Faktor (Faktor X) B = antihämophiles Globulin B (Faktor IX).
- Das verwendete Citratplasma soll vorzugsweise spätestens 48 Stunden nach der Blutabnahme bei etwa -40°C eingefroren werden. Diese Maßnahme dient dem Erhalt der Faktor VIII-Aktivität. Die Gewinnung von Kryopräzipitat aus diesem Citratplasma erfolgt in an sich bekannter Weise. Das vom Kryopräsipitat befreite Citratplasma wird bei Zimmertemperatur mit Kationenaustauschern auf Basis Polystyrol/Sulfonat und Anionenaustauschern auf Basis Polystyrol/Divinylbenzol/ quartäres Amin behandelt, wobei die überführung des Citratplasmas in Antionenaustauscherplasma im diskontånuierlichen ("batch") Verfahren oder durch Säulenchromatographie erfolgen kann.
- Durch den Kationenaustauscher wird Calcium im Citratplasma entweder gegen Natrium- oder Wasserstoff-Ionen ausgetauscht.
- Der Anionenaustauscher tauscht die Citrationen des Citratplasmas gegen Hydroxyl- oder Chlorid-Ionen aus. Der Austausch der Calcium-Ionen und Citrat-Ionen des Citratplasmas kann entweder nacheinander oder gleichzeitig im sogenannten Mischbettverfahren erfolgen.
- Die verwendeten Kationenaustauscher auf Basis Polystyrol/ Sulfonat und Anionenaustauscher auf Basis PolystyrolDivinylbenzol/quartäres Amin werden nach Vorschrift der Harzherstell e"tweder die Natrium- und Chlorid- oder in die Wasserstoff- und Hydroxyl-Form gebracht, wobei bei der Umwandlung des Citratplasmas in Ionenaustauscherplasma im Mischbettverfahren die Harze in der Wasserstoff- bzw.
- Hydroxyl-Form und bei aufeinanderfolgender Adsorption die Harze in der Natrium- bzw. Chlorid-Form verwendet werden. Die Adsorption Kann im Batch-Verfahren oder durch Chromatographie an geeigneten Chromatographierohren (Säulentechnik) erfolgen. Bei Anwendung der Ionenaustauscher im Mischbettverfahren kann das Mischungsverhältnis von Anionen- zu Kationenaustauscher variiert werden. In der Praxis hat sich ein Mischungsverhältnis von Kationen- zu Anionenaustauscher von 1:1,5 gut bewährt. Die Harze können auch in der Nat:ium-bzw. Chlorid-Form verwendet werden, was lediglich zu einer etwas höheren Natriumchloridionenkonzentration im Ionenaustauscherplasma führt.
- Die Ionenaustauscher können auch in Mischungen in der Wasserstoff-und Natrium-Form bzw. Hydroxyl- und Chlorid-Form vorliegen Das auf diese Weise hergestellte Ionenaustauscherplasma eignet sich zur Herstellung von Prothrombikomplex-Konzentrat und lagerstabilen Serumproteinen.
- Zusätzlich wurde gefunden, daß die kolloidale Kieselsäure, die vorzugsweise eine spezifische Oberfläche von 50 bis 400 m2/g hat, und die die Aufgabe hat , noch im Plasma vorliegende Gerinnungsfaktoren und andere unstabile Proteine zu adsorbieren, ein geeignetes Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Fibrinogen ist. Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an die kolloidale Kieselsaure adsorbierte Fibrinogen läßt sich durch Kochsalz, vorzugsweise in Form einer 10%igen Kochsalzlösung, wieder von der kolloidalen Kieselsäure eluieren. Durch Dialyse und Ultrafiltration des Eluates läßt sich eine sterilfiltrierbare Fibrinogenlösung herstellen Das Fibrinogen kann durch Gefriertrocknung stabilisiert werden und ist nach Lösen mit sterilem Wasser für die therapeutische Anwendung geeignet. Dieses Verfahrens schema, das der der beigefügten Zeichnung gezeigt ist, und bei dem therapeutisch anwendbare Gerinnungstherapeutika und Humanserum gewonnen werden, hat gegenüber den im Hauptpatent aufgeführten Vorteilen den weiteren Vorteil, auch das üblicherweise bei Plasmapheresen und Blutspenden anfallende Citratblut verwenden zu können, indem der diesen Bluten und Plasmen anhaftende Nachteil des Stabilisatorzusatzes durch die Behandlung mit Ionenaustauschern wieder eliminiert wird.
- Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert: Beispiel 1 A) Herstellung von Ionenaustauscherplasma aus Citratplasma Neun Teile Spender-Venenblut wurden zu einem Teil einer 3,8%gen Natriumcitrat-Stabilisatorlösung gegeben. Das Blut wurde möglichst bald nach der Blutentnahme zentrifugiert und die in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschlemmten Erythrozyten dem Spender reinfundiert. Das Plasma wurde spätestens innerhalb von 48 Stunden, vorzugsweise bei -400C, eingefroren.
- Das gefrorene Plasma wurde bei einer Temperatur unter +4 0C aufgetaut. Es wurde im kontinuierlichen Fluß zentrifugiert.
- Die erhaltene Kälteausfällung (Kryopräzipitat) wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 1.A des Hauptpatents zu einem Faktor Vill-Konzentrat aufgearbeitet. Das Restplasma wurde mit den Kationen-und Anionenaustauschern behandelt und sodann der weiteren Fraktionierung zwecks Gewinnung des Prothrombinkomplex-Konzentrats, des Fibrinogens und der Lösung der lagerstabilen Serumproteine unterworfen.
- Die Behandlung mit den Ionenaustauschern wurde einmal im Batch-Verfahren und mit einer anderen Probe im Chromatographieverfahren durchgeführt: A 1) Batch-Verfahren: Zu 1 000 ml Plasma wurden 75 ml eines Anionenaustauscr.erharzes auf Basis Polystyrol/Divinylbenzol/quartäres Amin in der Hydroxyl-Form gegeben. Nach Adsorption und Zentrifugation wurde die Adsorption noch zweimal mit dem regenerierten Anionenaustauscher wiederholt. Dann wurde die Citratkonzentration des adsorbierten Plasmas bestimmt.
- A 2) Chromatographie-Verfahren: eines Ein Chromatographierohr wurde mit 75 ml/Anionenaustauscherharzes auf der Basis Polystyrol/Divinylbenzol/ quartäres Amin in der Hydroxyl-Form gefüllt. Über die Säule wurde 1 1 Citratplasma gegeben. Es wurden jeweils 100 ml Fraktionen gesammelt und die Citratkonzentration in den Fraktionen bestimmt.
- In Tabelle I sind die Ergebnisse der Ionenkonzentrationen des Citrats für die vorstehenden Vergleichsversuche A 1) und A 2) aufgeführt.
- Tabelle I Entfernung von Citratplasma im Batch- und Chromatographieverfahren Batchverfahren Chromatographieverfahren Citrat (mäq/l) Citrat (mäq/l) Ausgangsmaterial (Citratplasma) 48,8 Ausgangsmaterial 48,8 1. Adsorption 24,5 Fraktion 1 0,15 2. Adsorption 11,9 Fraktion 2 0,37 3. Adsorption 4,4 Fraktion 3 1,29 Fraktion 4 3,01 Fraktion 5 6,28 Fraktion 6 13,7 Fraktion 7 30,6 B) Herstellung von Prothrombi1nkomplex-Konzentrat und lagerstabilen Serumproteinen Nach der Arbeitsweise von Beispiel IB und C des Hauptpatents wurden aus dem aus Citratplasma durch Verwendung von Ionenaustauschern gewonnenen Ionenaustauscherplasma der Stufe A ein Prothrombinkomplex-Konzentrat und eine Lösung lagerstabiler Serumproteine hergestellt.
- Beispiel 2 250 ml eines Kationenaustauscherharzes auf Basis Polystyrol/ Sulfonat (in der Wasserstoff-Form) und 375 ml eines Anionenaustauscherharzes auf Basis Polystyrol/Divinylbenzol/quartäres Amin (in der Hydroxyl-Form) wurden gemischt (Mischungsverhältnis von Kationen- zu Anionenaustauscher 1:1,5) und in ein Chromatographierohr gegeben. Über die Harzmischung wurden 1,45 1 Citratplasma gegeben. Die Tabelle II zeigt die Ergebnisse dieses Versuches.
- Tabelle II Entfernung von Citrat- und Calcium-Ionen aus Citratplasma im Mischbettverfahren Ionenkonzentration in mäq/l Citrat Calcium Natrium Chlorid Ausgangsmaterial (Citratplasma) 66,1 4;15 216 83 Nach Chromatographie 1,74 0 84 (Ionenaustauscher-Plasma) Beispiel 3 A) Herstellung von Ionenaustauscherplasma In ein Chromatographierohr wurden 120 ml eines Kationenaustauscherharzes auf Basis Polystyrol/Sulfonat in der Natrium-Form gegeben. Über diese Säule wurde 1 1 Citratplasma gegeben. Anschließend wurde dieses Plasma über 180 ml eines Anionenaustauscherharzes auf Basis Polystyrol/ Divinylbenzol/quartäres Amin in der Chlorid-Form in einem zweiten Chromatographierrohr gegeben. Tabelle III zeigt die Ergebnisse dieses Versuches.
- Tabelle III Entfernung von Citrat- und Calciumionen aus Citrat-Plasma durch aufeinanderfolgende Adsorption Ionenkonzentration in mäq/l Citrat Calcium Ausgangsmaterial (Citratplasma) 64,0 4,10 nach Kationenaustauscher 63,0 0,60 nach Anionenaustauscher 0,49 0,60 (Ionenaustauscher-Plasma) B) Herstellung von lagerstabilen Serumproteinen und Fibrinogen 1 Liter des in Stufe A) erhaltenen Ionenaustauscher-Plasmas wurde zur Herstellung der lagerstabilen Serumproteine nach der Arbeitsweise von Beispiel 1C des Hauptpatents mit kolloidaler Kieselsäure behandelt. Nach Abtrennung der kolloidalen Kieselsäure wurde diese zweimal mit 500 ml 0,9%iger NaCl, die 60 mäq/l an Citrat enthielt, gewaschen.
- Die abzentrifugierte kolloidale Kieselsäure wurde zur Gewinnung des Fibrinogens zweimal mit 400 ml einer 10%igen NaCl-Lösung, die 60 mäq/l Citrat enthielt, für eine Stunde bei Zimmertemperatur extrahiert. Aus den Eluaten wurde das Fibrinogen durch Alkoholfällung isoliert, in citrathaltiger physiologischer NaCl-Lösung gelöst, steril filtriert und gefriergetrocknet. Tabelle IV onthält die Ergebnisse dieses Versuches.
- Tabelle IV Fibrinogenherstellung
Volumen Protein Fibrinogen Ausbeute ml g % mg % Ausgangsmaterial (Ionenaustau- scher-Plasma) 1 000 6,5 235 100 1. Elution 400 0,66 140 2. Elution 400 0,47 200
Claims (5)
- P a t e n t a n 5 p r ü c h e: 1. Verfahren zur Herstellung eines antihämophiles Globulin A enthaltenden Konzentrats neben einem Prothrombin-Komplex und einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen, bei dem ein gefrorenes Ionenaustauscherplasma bei Temperaturen von 2 bis 80c wieder aufgetaut wird und aus dem die überstehende Plasmaflüssigkeit von dem Faktor-VIII-enthaltenden Proteinniederschlag abgetrennt und dieses Kryoprazipitat in an sich bekannter Weise zu einem Faktor-VIII-Konzentrat aufgearbeitet wird, während die Plasmaflüssigkeit durch Adsorption über handelsüblichem Tricalciumphosphat von den Faktoren II, VII, IX und X befreit wird, und anschließend aus der Plasmaflüssigkeit über kolloidaler Kieselsäure mit einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 400 m2/g die noch im Plasma vorliegenden Gerinnungsfaktoren und andere unstabile Proteine adsorbiert werden und eine Lösung von lagerstabilen Serumproteinen zurückbleibt, nach Patent...............(DE-AS 24 59 291), dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial ein übliches Citratplasma verwendet und nach dem Auftauen und Abtrennen des Kryopräzlpitates den überstand mit Anionenaustauscherharzen auf Basis Polystyrol/Divinylbenzol/ quartäres Amin und Kationenaustauscherharzen auf Basis PolystyrollSulfonat behandelt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Adsorptions-Produkt der kolloidalen Kieselsäure durch Eluieren mit 5 bis 20 % Alkalihalogenide enthaltenden Pufferlösungen Fibrinogen gewinnt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das aufgetaute Citratplasma mit einem Gemisch der Anionen- und Kationenaustauscherharze in Berührung bringt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das aufgetaute Citratplasma nacheinander mit dem Kationen-und Anionenaustauscherharz in Berührung bringt.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kationenaustauscherharz in der Natrium- oder Wasserstoff-Form und das Anionenaustauscherharz in der Chlorid- oder Hydroxyl-Form einsetzt.
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Cited By (2)
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| EP0549964A3 (en) * | 1991-12-24 | 1994-07-13 | Octapharma Ag | Process for preparing a virus inactivated prothrombin complex concentrate |
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-
1979
- 1979-01-27 DE DE19792903131 patent/DE2903131A1/de not_active Withdrawn
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| EP2264069A2 (de) | 2004-02-24 | 2010-12-22 | CSL Behring GmbH | Reinigung von Fibrinogen |
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| EP2264069A3 (de) * | 2004-02-24 | 2011-05-04 | CSL Behring GmbH | Reinigung von Fibrinogen |
| EP2267025A3 (de) * | 2004-02-24 | 2011-05-04 | CSL Behring GmbH | Reinigung von Fibrinogen |
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