DE2832230A1 - Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha -hydroxycarbonsaeuren - Google Patents

Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha -hydroxycarbonsaeuren

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DE2832230A1
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DE2832230A
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Morio Fujiu
Hiromi Maruyama
Mayumi Ogawa
Toyoaki Sawada
Yasuji Suhara
Kimihiro Watanabe
Kazuteru Yokose
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Description

DH. ING. F. WUESTirOFF DR-E. ν. PECHMANN DR. ING. D. BEHRENS DIPL. ING. R. GOETZ PATENTANWÄLTE
. 3·
sooo münjiii;?; j ο SCmv'EIU KItSTHASSE 3 TELEFON (089) «0 20 01 TELEX 5 24 070
TEI.EOUAMMK :
PBOTECTPATKIiT ÄiÜNCHKJf
lA-50 895
Patentanmeldung
Anmelder:
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Grenzacherstr. 124-184, CH-4002 Basel, Schweiz
Titel:
Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven OC -Hydroxycarbonsäuren
809886/0859
-ta -s
RAN 441ΟΛ19
F. Hoffmann-La Roche «Se Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven g-Hydroxycarbonsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von optisch reinen D- oder L-ot-Hydroxy carbonsäur en.
Die Herstellung von optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren wurde bisher durch Racematspaltung von D ,L-a-Hydroxy car bonsäuren mit Hilfsmitteln, wie optisch aktiven Aminen, durchgeführt. Dieses bekannte Verfahren hat sich jedoch als unwirtschaftlich erwiesen, insbesondere weil die Hilfsmittel kostspielig sind und die Auftrennung kompliziert ist.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist es nun möglich, optisch reine a-Hydroxycarbonsäuren mit hoher Ausbeute in sehr einfacher Weise zu erhalten. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine D,L-a-Hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel
809886/0859
^/12.5.78
1 R-CH-COOH I
OH
worin R einen verzweigten oder geradkettigen Alkylrest mit 1-13 C-Atomen oder einen
Pyridylrest darstellt,
oder ein Salz davon mittels enantiospezifische Dehydrogenaseaktivität aufweisenden, zu den Genera Streptomyces, Pseudomonas oder Bacillus oder zur Coryneformgruppe gehörenden Mikroorganismen asymmetrisch zur a-Ketocarbonsäure bzw. zu einem Salz davon dehydriert, aus einem erhaltenen Salz die Säure freisetzt und schliesslich das nicht dehydrierte Enantiomere der cc-Hydroxycarbonsäure und gegebenenfalls die a-Ketocarbonsäure aus dem Reaktionsmedium isoliert.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die erhaltene α-Ketocarbonsäure in an sich bekannter Weise zur a-Hydroxycarbonsäure reduziert und
diese als Ausgangsmaterial in das Verfahren zurückgeführt. 20
Typische Beispiele von racemischen a-Hydroxycarbonsäuren der Formel I sind 2-Hydroxypropionsäure, 2-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyvaleriansäure, 2-Hydroxy-3-methy!buttersäure, 2-Hydroxycapronsäure, 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, 2-Hydroxy-3,3-dimethy!buttersäure, 2-Hydroxyheptylsäure, 2-Hydroxy-4-methylcapronsäure, 2-Hydroxycaprylsäure, 2-Hydroxypelargonsäure 2-Hydroxydecansäure, 2-Hydroxyundecansäure, 2-Hydroxydodecansäure, 2-Hydroxytridecansäure, 2-Hydroxytetradecansäure, 2-
Hydroxypentadecansäure, a-Hydroxy-3-pyridylessigsäure und dgl. 30
Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendbaren Mikroorganismen umfassen die zu den Genera Streptomyces, Pseudomonas oder Bacillus oder zur Coryneformgruppe gehörenden, enantiospezif ische Dehydraseaktivität aufweisenden Mikroorganismen. In Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "enanti spezifische Dehydraseaktivität" die Fähigkeit, eines der Enanti meren einer D,L-a-Hydroxycarbonsäure der Formel I oder eines Salzes
8098 8 6/0859
- Y-
■j davon durch asymmetrische Dehydrierung selektiv in die entsprechende a-Ketocarbonsäure oder ein Salz davon überzuführen, während das andere Enantiomere in Form einer optisch aktiven σ-Hydroxycarbonsäure oder eines Salzes davon übrig bleibt. Der Mikroorganismus kann in Form der Gärbrühe oder in Form eines Extraktes davon verwendet werden.
Bevorzugte im erfindungsgemässen Verfahren verwendbare Stämme sind die folgenden, aus Bodenproben von verschiedenen Gegenden von Japan isolierten Bakterien und Actinomyceten, sowie mit diesen verwandte Stämme und Varianten davon. In der nachstehenden Tabelle sind die taxonomisehen Merkmale solcher Bakterien sowie der Fundort angegeben. Alle in dieser Tabelle erwähnten Bakterien sind im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan unter den angegebenen FERM-P-Nummern deponiert worden. Entsprechende Kulturen sind ebenfalls in USA deponiert: die NRRL-Nummern beziehen sich auf in United States Department für Landwirtschaft, Northern Utilization Research and Development
IQ Division, Peoria, Illinois, deponierte Kulturen, die ATCC-Nummern auf Kulturen, welche in American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, deponiert wurden.
809886/0859
A-I) Morphologische Eigenschaften'und Kultureigenschaften von grampositiven, Sporen bildenden Stäbchen
" -__^_^ Stämme NRS-85KH2OB massig NRS-112KH25B NRS-137KH2OB
Eigenschaften— (FERM-P No. 3164) (FERM-P No. 3165) (FERM-P No. 3169)
(NRRL B-11084) reichlich (NRRL 11085) (ATCC 31301)
a) Morphologie gering
1 Form Stäbchen keine Stäbchen Stäbchen
2 Grosse (μ) 1,4-1,8 χ 2,0-4,0 ur O,8-1,2 χ 3,0-7,0 0,5-1,0 x 1,5-4,0
3 Pleomorphismus - reichlich - -
4 Motilität (-) + + +
5 Sporen + + +
(I) Grosse (u) 0,8-1,0 χ 1,5-2,0 — 0,8-1,0 χ 1,5-2,0 0,4-0,8 χ O,8-1,2
(II) Form elliptisch + elliptisch elliptisch
(III) Ausdehnung
des
Sporangiums - - -
(IV) Position Zentrum Zentrum Zentrum
6 Gram-Färbung + + +
7 Säurefeste Färbung - - -
b) Kultureigenschaften
1 Agar-Nährplatte
Form konvex, ganzrandig flach, wellig flach, schizoid
glatt rauh rauh
Opazität lichtdurchlässig undurchsichtig lichtdurchlässig
Farbe der Kolonie hellgelb bis creme hellgelb bis
hellbraun creme
Lösliches Pigment bräunlich keines keines
2 Schrägagar- .
kultur
Wachstum reichlich reichlich massig
Form filiform ausbreitend stachelig
Glanz matt matt matt
Farbe der Kolonie creme bis weiss-creme hellbraun bis
hellbraun orange
Lösliches Pigment braun keines keines
3 Bouillonflüssigkeit
Wachstum massig reichlich
Oberflächen-
Wachstum keines gering
Niederschlag reichlich massig
Pigmentation keine keine
4 Gelatine-Stichkult
Wachstum sehr reichlich reichlich
Verflüssigung + +
5 Lackmusmilch
Lackmus - alkalisch
Peptonisierung + -
Koagulation
809886/0859
A- 2) Physiologische Eigenschaften von gram positiven, Stäbchen
Sporen bildenden
■—_^___^^ Stämme " ■— c) Physiologische NRS-85KH2OB NRS-112KH25B + + (FERM-P No. 3165) - + + / NRS-137KH2OB +
Eigenschaften Eigenschaften (FERM-P No. 3164) + / fNRRL 11085) - (FERM-P No. 3169) +
1 Nitratreduktion (NRRT, R-I 1O841 + + / (ATCC 31301)
2 Nitratrespiration + (unlöslich) / + Tobata-ku, Ki ta- +
3 MR-Test - Nerima-ku, Tokyo, + - Kyushu-shi, Japan Kiyosato, Nagano
4 VP-Test - + Japan - + + Pref., Japan
5 Indolproduktion - + + - -
6 H„S-Produktion - - - —
7 Stärkehydrolyse - 5,0-9,5 - + -
8 Citratverwertung - 2O°C-45°C — + -
a. Koser-Medium - + + + —
+ + -
Fermentation +
+ Säure Gas - +
b. Christensen-Medium + + +
9 Verwertung von + +
NaNO + I
Harnstoff - + +
Na-Glutamat + ■■ - +
10 Pigmentbildung + - -
11 Urease + + +
12 Oxidase + + +
13 Katalase + +
14 Wachstumbereich + 5,0-10,0
pH - 2O°C-37°C 5,0-10,0
Temperatur •4· ■" + 10°C-40°C
15 Aerobes Wachstum (+) + +
Anaerobes Wachstum + Fermentation +
16 O-F-Test + Säure Gas Fermentation
17 Säure und Gas - Säure Gas
1) L-Arabinose - -
2) D-Xylose + - ■ -
3) D-Glucose — -
4) D-Mannose - -
5) D-Fructose - -
6) D-Galactose - -
7) Maltose -
8) Saccharose -
9) Lactose -
10) Trehalose -
11) D-Sorbit -
12) D-Mannit _
13) Inosit (-)
14) Glycerin (-)
15) Stärke -
L8 Casein-Hydrolyse
L9 Tyrosin-Hydrolyse
2O Phenylalanin-
deaminase
rkunft der Bodenprobe
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B- 1) Morphologische Eigenschaften und Kultureigenschaften von pleomorphen Bakterien
— . Stämme a) Morphologie 4 Motilität NRS-112KH31B NRS-129KH5B2 NRS-13O-KH-2OB + NRS-135KH9B - CO
Eigenschaften"—-~-__^____^ 1 Pleomorphismus 5 Gram-Färbung (FERM-P No. 3166) (FERM-P No. 3167) (FERM-P No. 3657) (FERM-P No. 3168)
' —- 2 Form 6 Säurefeste Färbung (NRRL B-11086) (ATCC 31300) (NRRL B-11088) (NRRL B-11087)
7 Sporen
3 Grosse (μ) 24 Std. b) Eigenschaften der + + + +
48 Std. Kultur Stäbchen werden Stäbchen werden Stäbchen werden Stäbchen werden
1 Agar-Nährplatte kokkoide Zellen kokkoide Zellen kokkoide Zellen kokkoide Zellen
- Form 0,5-^1,0x3,0-5,0 0,5-1,0x3,0-5,0 0,5-1,0x3,0-5,0 1,2-1,5x2,5-6,0
0,5-0,8x1,0-1,5 0,5-0,8x1,0-1,5 0,5-0,8x1,0-1,5 0,5-1,0x1,0-1,5
Opazität — - - -
Farbe der Kolonie + + + + K>
Lösliches Pigment - - - - OO
2 Schrägagar- - - ■ . - - OJ
kultur K)
CX) Wachstum K)
Form OJ
40 Glanz konvex, ganzrandig konvex, ganzrandig konvex, ganzrandig konvex, ganzrandic CD
äO Farbe der Kolonie glatt glatt glatt glatt
03 Lösliches Pigment 1i chtdurchläs sig lichtdurchlässig lichtdurchlässig undurchsichtig
β) 3 Bouillonflüssigkeit creme creme creme-weiss creme
r—\ Wachstum keines keines keines keines
£3
OO		 Oberflächen-
(Π Wachstum
co Niederschlag reichlich reichlich reichlich reichlich
Pigmentation Filiform Filiform Filiform Filiform
4 Gelatine-Stichkultu glänzend glänzend glänzend glänzend
Wachstum creme-weiss creme-weiss creme-weiss . creme-weiss
keines keines keines keines
Verflüssigung
5 Lackmusmilch massig massig massig reichlich
keines keines keines reichlich
gering gering gering massig
keine keine keine keine
massig bis massig bis massig bis massig
reichlich reichlich reichlich
+ +
ηIVal i
r-h
B-2) Physiologische Eigenschaften von pleomorphen Bakterien
co cn co
-____^__£>tämme NRS-112KH31B (FERM-P No. 3166) NRS-129KH5B2 NRS-13OKH2OB NRS-135KH9B
Eigenschaften ' -^^_ (NRRL B-11O86} (FERM-P No. 3167) (FERM-P No. 3657) (FERM-P No. 3168)
c) Physiologische (ATCC 31300) (NRRL B-11088) (NRRL B-110871
Eigenschaften -
1 Nitratreduktion - - - +
2 Nitratrespiration - - - -
3 MR-Test - - - -
4 VP-Test - - - -
5 Indolproduktion - - -
6 H-S-Produktion - - - -
7 Stärkehydrolyse - - -
8 Citratverwertung +
a. Koser-Medium + + + . +
b. Christensen-Medium + + +
9 Verwertung von +
NaNO. + + + +
(Nri Ϊ SO
4 2 4
Harnstoff		 + + +
Na-Glutamat - + + +
10 Pigmentbildung - - - -
11 Urease - - (-)
12 Oxidase + - -
13 Katalase + + +
14 Wachstumbereich 5,0-9,5
pH 15°C- 37°C 5,0- 9,0 5,0- 10,0 5,0- 10,0
56C- 3O6C
Temperatur + 1O°C- 37°C 10°C- 37°C +
15 Aerobes Wachstum + + . + +
Anaerobes Wachstum (Fermentation) + + Fermentation
16 O-F-Test Säure Gas (Fermentation) (Fermentation) Säure Gas
17 Säure und Gas _ . Säure Gas Säure Gas _
1) L-Arabinose + - - _ _ (+)
2) D-Xylose + (+) (+) +
3) D-Glucose - + (+) -
4) D-Mannose + - (+) +
5) D-Fructose + + (+) -
6) D-Galactose - (+) - _
7) Maltose — — - (+) +
8) Saccharose
I ,		 (+)
B- 2) Fortsetzung
" ■—-—________^ Stämme
Eigenschaften		 NRS-112KH31B
(FERM-P No. 3166)
(NRRL B-11O86)		 NRS-129KH5B2
(FERM-P No. 3167)
(ATCC 31300)		 NRS-13OKH2OB
(FERM-P No. 3657)
(NRRL B-11088)		 NRS-135KH9B
(FERM-P No. 3168)
(NRRL B-11087)
9) Lactose
. 10) Trehalose
11) D-Sorbit
12) D-Mannit
13) Inosit
14) Glycerin
15) Stärke
18 Caseinhydrolyse
19 DN-ase
20 Wachstum in 5% NaCl
21 Wachstum in 10 NaCl		 I I I I + + I
I + I I
I I I I I I I 		I + + I I I I
I + + +
I I I I I I I 		ι + T + + + ι
ι + ι ι
ι ι ι ι ι ι ι
Herkunft der Bodenprobe Tobata-ku, Kita-
kyushu, Japan		 Shinano-Ohmachi
Nagano-Pref.,
Japan		 Fuji-shi, Shizu-
oka-Pref., Japan		 Shosenkyo, Yama-
nashi-Pref.,
Japan
C-I) Morphologische Eigenschaften und Eigenschaften der Kultur von gramnegativen Stäbchen
' Stämme NRS-137CZH5B NRS-146KH6B NRS-14OKH27B - NRS-139KH6B - alkalisch - .., .
Eigenschaften -____ (FERM-P No. 3658) (FERM-P No. 3172) (FERM-P No. 3659) (FERM-P No. 3170)
a) Morphologie (NRRL 11089) (ATCC 31303) (NRRL 11090) alkalisch (ATCC 31302)
1 Form Stäbchen Stäbchen Stäbchen - Stäbchen
2 Grosse (μ) 0,4- 0,6x1,5- 2,5 0,5- 0,8x1,5- 3,0 0,5- 0,8x2,0- 3,5 0,4- 0,7x1,0- 1,5
3 Pleomorphismus - - - -
4 Motilität + + + +
5 Sporen - - - -
6 Gram-Färbung - - - -
7 Säurefeste Färbung - - - -
b) Eigenschaften der Kultur
1 Agar-Nährplatte
Form konvex, ganzrandig gebuckelt, ganz- konvex, ganzrandig konvex, ganzrandig
glatt randig, runzlig runzlig glatt
CO Opazität lichtdurchlässig lichtdurchlässig lichtdurchlässig undurchsichtig
O Farbe der Kolonie hellgelb bis hellgelb bis . hellgelb creme-weiss
(O orange orange
00 Lösliches Pigment keines keines keines keines
00 2 Schrägagar-
CO kultur
*«s ■
^"%		 Wachstum reichlich reichlich reichlich massig
00 Form Filiform Filiform Filiform Filiform
Ol Glanz glänzend glänzend glänzend glänzend
ta Farbe der Kolonie hellbraun bis hellbraun bis hellbraun creme-weiss
orange orange
Lösliches Pigment keines keines keines keines
3 Bouillonflüssigkeit
Wachstum reichlich reichlich reichlich massig
Oberflächenwachstum gering reichlich reichlich reichlich
Niederschlag massig gering massig gering
Pigmentation leicht gelblich leicht gelblich keine keine
4 Gelatine-Stichkultur
Wachstum massig bis massig massig massig
reichlich
Verflüssigung +
5 Lackmusmilch
Lackmus alkalisch alkalisch
Peptonisation + -
Koagulation
CX) CO K) K) GJ O
C- 2) Physiologische Eigenschaften von gramnegativen Stäbchen
' . Stämme NRS-137CZH5B - NRS-146KH6B - NRS-14OKH27B - NRS-139KH6B Oxydation
Eigenschaf ten ' " ——____ (FERM-P No. 3658) + (FERM-P No. 3172) + (FERM-P No. 3659) + (FERM-P NO. 3170)
(NRRT, 11O891 +■ (ATCC 31303) + (NRRL 11090).. .. + .(ATCQ 3.13O2i
c) Physiologische
Eigenschaften 5.0 -10,0 5,0 -10,0 5,0 -9,0
56C - 37°C		 -
1 Nitratreduktion - 50C - 30°C + 5°C - 37°C - +
2 Nitratrespiration . - + - + -■ +.
3 MR-Test - + - + - Oxydation
I .^ 		-
4 VP-Test - Oxydation - Oxydation - -
5 Indolproduktion - - - -
6 H2S-Produktion - - - -
7 Stärkehydrolyse - - -
8 Citratverwertung +
a. Koser-Medium + + + +
b. Christensen-Medium + + +
9 Verwertung von +
NaNO3 + + + +
(NH4)2SO4 + + + +
Harnstoff + + + +
Na-Glutamat + + + keine
10 Pigmentbildung fluoreszierend fluoreszierend fluoreszierend
löslich löslich löslich +
11 Urease +
12 Oxidase +
13 Katalase
14 Wachstumbereich 5,0 -9,5
pH 200C - 30°C
Temperatur +
15 Aerobes Wachstum +
Anaerobes Wachstum
16 O-F-Test
C- 2) Fortsetzung
—_^______^ Stämme
Eigenschaften ~— 		NRS-137CZH5B
(FERM-P No. 3658)
(NRRT, 11O89)		 NRS-146KH6B
(FERM-P No. 3172)
IATCC 31303)		 NRS-14OKH27B
(FERM-P No. 3659)
' (NRRL 11090)		 NRS-139KH6B
(FERM-P No. 3170)
■ (ATCC 313O2)
17 Säure und Gas
1) L-Arabinose
2) D-XyIose
3) D-Glucose
4) D-Mannose
5) D-Fructose
6) D-Galactose
7) Maltose
8) Saccharose
9) Lactose
10) Trehalose
11) D-Sorbit
12) D-Mannit
13) Inosit
14) Glycerin
15) Stärke
18 Caseinhydrolyse
19 Argininhydrolyse		 Säure Gas
+ ■
4- —		 Säure Gas Säure Gas Säure Gas
+■
Herkunft der Bodenprobe Kiyosato,
Nagano Pref.,
Japan		 Sarugakyo,
Gumma Pref.,
Japan		 Shimada-shi
Shizuoka Pref.,
Japan		 Kiyosato, Nagano
Pref., Japan'
OO CO K) K) CO CD
Aus diesen Resultaten geht hervor, dass man diese Stämme anhand von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8th Ed., 1974; 7th Ed., 1957); Riichi Sakazaki, "Identification of Medical Bacteria", Kindai Shuppan, 1971; und Kazuhiko Yamada and Kazuo Komagata., J. Gen. Appl. Microbiol. , JL8, 417, 1972 wie folgt identifizieren kann:
1) Stamm FERM-P No. 3164 (NRRL B-11084):
Eine aus Glucose anaerob säurebildende Variante von Bacillus •JO megaterium.
2) Stamm FERM-P No. 3165 (NRRL 11085):
Bacillus species, mit gewisser Aehnlichkeit mit B. circulans und B. firmus. Der Stamm unterscheidet sich jedoch vom ersteren Stamm durch die Morphologie der Sporen und vom letzteren Stamm durch.das anaerobe Wachstum.
3) Stamm FERM-P No. 3169 (ATCC 31301):
Als Bacillus freudenreichii identifiziert. 20
4) Stämme FERM-P No. 3166 (NRRL B-11086), FERM-P No. 3167 (ATCC 31300), FERM-P No, 3657 (NRRL B-11088) und FERM-P No. 3168 (NRRL 11087):
Diese vier Stämme sind aerob bis fakultativ anaerob, grampositiv, nichtbeweglich, nicht-sporenbildend und nichtsäurefest, gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen in der ersten Wachstumsphase, und kugelförmig bis eiförmig nach mehr als Tag Wachstum. Diese Eigenschaften zeigen, dass alle diese Stämme der sogenannten Coryneform-Gruppe angehören. Bekanntlich (siehe z.B. Yamada, Komagata, J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 417, 1972) ist es schwierig, für diese Gruppe die Familie und Gattung anzugeben. Jedoch ist die folgende Identifizierung anhand von Bergey's Manual möglich. Die verschiedenen Gattungen der Coryneform-Gruppe unterscheiden sich alle von der Gattung Arthrobacter durch die Säureproduktion aus Glucose, Fructose und anderen Zuckern, von der Gattung Kuruthia durch die fehlende Motilität, von der Gattung Microbacterium dadurch,
809886/0859
dass alle diese Stämme beim Erhitzen in abgerahmter Milch auf 72 C während 15 Minuten nicht überleben, und von der Gattung Cellulomonas durch die Unfähigkeit, Cellulose zu verwerten.
5 Stamm Ferm-P No. 3168 (NRRL B-11087):
Aus den in der Tabelle angegebenen Eigenschaften dieses Stammes geht hervor, dass er mit Corynebacterium callunae, Brevibacterium lactofermentum, B. vitaruman und C. hydrocarboclastus sehr nah verwandt ist. Die drei letzten Stämme unterscheiden sich jedoch vom Stamm No. 3168 durch ihre pleomorphen Eigenschaften und durch Granulabildung. Trotz des Unterschiedes in der Verwertung von Zuckern und in der Säureproduktion ist der Stamm FERM-P No. 3168 (NRRL B-11087) am nächsten mit C. hydrocarboclastus verwandt und wurde daher als eine Variante von C. hydrocarboclastus identifiziert.
Stamm FERM-P No. 3657 (NRRL B-11088):
Die Eigenschaften dieses Stammes, nämlich fehlende Bildung von Granula, Säureproduktion, hydrolytische Aktivitäten gegen Gelatine und Casein, positive DN-ase, negative Urease und Fehlen von Wachstum in 10% NaCl lassen darauf schliessen, dass der Stamm No. 3657 mit Brevibacterium albidum sehr nah verwandt ist. Trotz einiger Unterschiede in der Säureproduktion aus D-Mannose, Saccharose, Inosit und Glycerin wurde der Stamm FERM-P No. 3657 (NRRL B-11088) auf Grund der Analogie zwischen allen anderen Eigenschaften als B. albidum identifiziert.
Stämme FERM-P No. 3166 (NRRL B-11086) und FERM-P No. 3167 (ATCC 31300):
Diese beiden Stämme sind sich sehr ähnlich und nicht voneinander unterscheidbar. Unter den in Bergey's Manual (7. und 8. Ausgabe) und Komagata et al. (J. Gen. Appl. Microbiol. , 18, 399, 1972) beschriebenen Arten wurde Brevibacterium tegmenticola am nächsten verwandt gefunden. Da sich jedoch diese Stämme von B. tegmenticola durch die Grosse der Zelle, die Reaktionen in Lackmusmilch und die Säureproduktion aus Maltose und Saccharose unterscheiden, kann hier nicht von
809886/0859
-μ-
Identität gesprochen werden. Es scheint daher zweckmässig, diese Stämme als neue Arten, die eine gewisse Aehnlichkeit mit B. tegmenticola haben, anzusehen.
5) Stamm FERM-P No. 3658 (NRRL 11089):
Identifiziert als Pseudomonas fluorescens.
6) Stämme FERM-P No. 3172 (ATCC 31303) und FERM-P No. 3659 (NRRL 11090):
-JO Identifiziert als Pseudomonas putida. Es wurden einige Unterschiede zwischen den Eigenschaften der beiden Stämme, wie z.B. der Nitratreduktion, festgestellt. Da man feststellen konnte, dass die Nitratreduktion bei 16-85% der Stämme dieser Art positiv war, kann der Stamm FERM-P No. 3659 (NRRL 11090) als
Ί5 eine Nitrat nicht-reduzierende Variante von Ps. putida angesehen werden.
7) Stamm FERM-P No. 3170 (ATCC 31302):
Pseudomonas species. Unter verschiedenen Pseudomonas-Stämmen ist der Stamm FERM-P No. 3170 (ATCC 31302) am nächsten mit Ps. cepacia verwandt. Auf Grund der Unterschiede in der Gelatineverflüssigung, der Caseinhydrolyse, des Wachstums bei 42°C und der Nitratreduktion kann
mit Ps. cepacia angesehen werden.
42°C und der Nitratreduktion kann der Stamm nicht als identisch
Die isolierten Actinomyceten haben folgende Wachtumseigenschaften:
1) Stamm FERM-P No, 3160 (NRS-79KH-1A, NRRL 11083):
Dieser aus einer Bodenprobe von Uwajima-shi, Ehime Pref., Japan, isolierte Stamm entwickelt sich gut auf verschiedenen ISP-Agarmedien für Actinomyceten und bildet ein gutentwickeltes Luftmycel mit sporenbildenden Hyphen. Die Sporen, die in Form von Ketten von etwa 50 Sporen pro Kette vorkommen, sind zylindrisch, haben eine stachlige Oberfläche und eine Grosse von 0,4 ν 0,8 χ 0,8-v1,4 μ. Die Bildung von irgendeinem anderen spezifischen Organ wurde nicht beobachtet.
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Auf den meisten getesteten Agarmedien ist das Wachstum (vegetatives Mycel) leicht bräunlich-grau bis hellbraun und das Luftmycel ist leicht grau bis grau. Das lösliche Pigment ist bräunlich bis rötlich. Die Bildung von Melanin-artigem Pigment wurde nicht beobachtet.
2) FERM-P No. 3660 (NRS-125KH-27A, NRRL 11091):
Dieser aus einer Bodenprobe von Suwa-shi, Nagano Pref., Japan isolierte Stamm entwickelt sich auch gut auf verschiedenen ISP-Agarmedien. Aus einem gut entwickelten vegetativen Mycel bildet sich ein relativ langes, gerades oder gekrümmtes Luftmycel. Weder Wirbel- noch Spiralbildungen werden beobachtet. Die Sporen, in Ketten von mehr als 50 Sporen pro Kette, sind zylindrisch, haben eine glatte Oberfläche und eine GrÖsse von 0,5 — 0,7 X 0,8—1,2 μ.
Das Wachstum ist schwach gelblich-braun bis schwach gelb und das Luftmycel ist weiss. Es bildet sich ein gelbliches lösliches Pigment. Es wurde kein Melanin-artiges Pigment beobachtet.
Aus den obigen Eigenschaften geht klar hervor, dass die Stämme FERM-P No. 3160 (NRRL 11083) und FERM-P No. 3660 (NRRL 11091) typische Streptomyces Species sind.
Die erfindungsgemässe asymmetrische Dehydrierung kann beispielsweise dadurch durchgeführt werden, dass man die Kulturbrühe oder kultivierte Zellen der Mikroorganismen mit einer DL-a-Hydroxycarbonsäure oder einem Salz hiervon zusammenbringt. Die Kulturbrühe kann durch Beimpfen eines zweckmässigen Mediums mit dem Mikroorganismus hergestellt werden. Das Kulturmedium kann beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Maisquellwasser, weitere üblicherweise verwendete Natursubstanzen oder Gemische davon, sowie Saccharide oder andere Kohlenstoffquellen, oder organische oder anorganische, Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Aminosäuren oder Salpetersäure, enthalten. Nötigenfalls kann das pH des Kulturmediums
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durch Zugabe von geeigneten Salzen, wie Natriumphosphat oder Natriumchlorid oder eines anderen Metallsalzes auf 7 gestellt werden. Es können Submerskulturen, Schüttelkulturen oder stationäre Kulturen verwendet werden. Die Kultivierung wird jedoch vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von 20-40 C, vorzugsweise im Bereich von 25-35°C. Die Kultivierung dauert zweckmässig 20-80 Stunden. Unter den oben beschriebenen Kultivierungsbedingungen erreicht das Wachstum
10. der Stämme die stationäre Phase. Eine DL-a-Hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel I oder ein Salz hiervon kann als Substrat der Kulturbrühe zugesetzt werden,' in der das Wachstum des Stammes die stationäre Phase erreicht hat. Die Konzentration des Substrats ist zweckmässig 1-200 mg/ml, vorzugsweise 3-120 mg/ml. Die asymmetrische Dehydrierung kann unter den oben beschriebenen Bedingungen durch Fortsetzung der Submerskultur, der Schüttelkulturen oder der stationären Kultur durchgeführt werden. Die Reaktionszeit hängt unter anderem vo der Spezies und dem Stamm des verwendeten Mikroorganismus, der Zusammensetzung des Mediums, der Natur und der Konzentration des Substrats ab. Im allgemeinen genügt jedoch eine Reaktionszeit von 70-360 Stunden. Das Ende der Reaktion kann durch Messung der Menge an Reaktionsprodukt mittels gaschromatographischen oder kolorimetrischen Methoden, wie weite
25 unten beschrieben, bestimmt werden.
Die asymmetrische Dehydrierung kann unter den oben beschriebenen Bedingungen auch durch Zusatz des Substrats zum Kulturmedium und darauffolgendes Beimpfen mit den Mikroorgani men vorgenommen werden.
Die asymmetrische Dehydrierung kann ferner durch Zusamme bringen behandelter Zellsubstanz mit DL-a-Hydroxycarbonsäurer oder Salzen hiervon durchgeführt werden. Der Ausdruck "behanc te Zellsubstanz" bezeichnet alle Materialien, die durch Behandlung der Mikroorganismen erhalten wurden und fähig sind, die enantiospezif ische Dehydrogenaseaktivität beizubehalten oder
809886/0059
zu erhöhen. Solche Materialien sind beispielsweise das Mycel oder Zellen, die aus der Kulturbrühe isoliert und gewaschen wurden, oder lyophilisierte Pulver davon; in an sich bekannter Weise aus den kultivierten Zellen oder aus dem Mycel erhaltener zellfreier Extrakt; oder gereinigte oder teilweise gereinigte Dehydrogenasepräparate, welche in an sich bekannter Weise durch Reinigung aus den besagten zellfreien Extrakten erhalten wurden. Falls eine solche behandelte Zellsubstanz verwendet wird, kann die asymmetrische Dehydrierung in einer wässrigen Lösung, beispielsweise einer Pufferlösung oder einem frischem Medium, durchgeführt werden. Das pH der Reaktionslösung liegt gewöhnlich zwischen 7 und 8,5, insbesondere bei etwa 8. Die Reaktionstemperatur liegt zweckmässig bei 20-60 C, insbesondere bei 25-50 C. Das Ende dieser Reaktion kann durch Messung der
-|5 Menge und der optischen Reinheit der zurückbleibenden a-Hydroxycarbonsäure sowie der Menge der in der Kulturbrühe oder dem Reaktionsgemisch gebildeten Ketocarbonsäure mittels gaschromatographischer oder kolorimetrischer Methoden bestimmt werden.
Durch die erfindungsgemässe asymmetrische Dehydrierung wird eines der Enantiomeren der DL-cc-Hydr oxy car bonsäure der allgemeinen Formel I oder ein Salz hiervon selektiv in die entsprechende a-Ketocarbonsäure oder ein Salz hiervon übergeführt, während das andere Enantiomere in Form der optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäure oder eines Salzes davon zurückbleibt. Ob die zurückbleibende optisch aktive Substanz in D- oder L-Form vorliegt, hängt von der Natur des verwendeten Mikroorganismus ab.
Wünscht man die D-Form, können folgende Mikroorganismen verwendet werden:
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- ία -
- Bacillus megaterium
- Bacillus sp.
- Pseudomonas fluorescens
- Brevibacterium sp. verwandt mit B. tegmenticola
- Brevibacterium albidum
- Streptomyces sp.
(FERM-P No. 3164, NRRL B-11084) (FERiI-P No. 3165, NRRL 11085) (FERM-P No. 3658, NRRL 11089)
(FERM-P No. 3166, NRRL B-11086 und FERM-P 3167, ATCC 31300) (FERM-P No. .3657, NRRL B-11088) (FERM-P No. 3160, NRRL 11083)
-ΙΟ Wünscht man die L-Form, können folgende Mikroorganismen verwendet werden:
Bacillus freudenreichii Pseudomonas putida
Pseudomonas sp. Corynebacterium hydrocarboclastus var. Streptomyces sp.
(FERM-P No. 3169, ATCC 31301) (FERM-P No. 3172, ATCC 31303 und FERM-P 3659, NRRL 11090) (FERM-P No. 3170, ATCC 31302)
(FERM-P No. 3168, NRRL B-11087) (FERM-P No. 3660, NRRL 11091)
Falls die Reaktionsprodukte in Form von Salzen erhalten werden, können letztere durch Zusatz einer Säure in die freien optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren und oc-Ketocarbonsäuren übergeführt werden.
Die optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren und die a-Ketocarbonsäuren können in an sich bekannter Weise, beispielsweise auf Grund von Löslichkeitsunterschieden, durch chromatographische Fraktionierung mittels eines Ionenaustauscherharzes oder Silicagel oder fraktionierte Destillation, aus der Reaktionslösung isoliert werden. Die Verbindungen können auch mit Hydrazinen in an sich bekannter Weise behandelt werden, wobei die a-Ketocarbonsäuren selektiv in die Hydrazone übergeführt werden, welche durch übliche Fraktionierungsmethoden abgetrennt werden können.
809886/0859-
■j Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden optisch reine D- oder L-ct-Hydr oxyc arbonsäuren und a-Ketocarbonsäuren mit hoher Ausbeute in einfacher Weise erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die erhaltene a-Ketocarbonsäure in an sich bekannter Weise hydriert und das Hydrierungsprodukt als Ausgangsmaterial in die asymmetrische Dehydrierung zurückgeführt. Die Hydrierung kann in an sich bekannter Weise, vorzugsweise mittels eines Katalysators, wie Raney-Nickel, durchgeführt werden. Falls bei der katalytischen Hydrierung Wasser als Lösungsmittel verwendet wird, wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat konzentriert und das Konzentrat kann dann direkt für die asymmetrische Dehydrierung verwendet werden.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen a-
Hydroxycarbonsäuren können als Zwischenprodukte für die Herstellung von pharmazeutischen Produkten, beispielsweise von Penicillinen (vgl. die US Patentschrift 3839322 und die Reissue davon Nr. 29003 sowie die US Patentschriften 3956323 und 3957758), Aminosäuren und dergleichen, sowie als biochemische Reagenzien verwendet werden. Als wichtige Vertreter der besagten a-Hydroxycarbonsäuren können die D- und die L-MiIchsäure genannt werden.
Die in den nachstehenden Beispielen verwendeten Medien sind wässrige Medien folgender Zusammensetzung:
30 Medium A (pH 7,0)
Glucose 0,1%
Pepton 1/0%
Fleischextrakt 0,3%
Natriumchlorid 0,5% :5
Medium B (pH 7,0)
Glucose 0,1%
Maisquellwasser 2,0%
.809886/0859
·- 20 -
-) Die in den Beispielen angegebene Menge an verbleibender
a-Hydroxycarbonsäure, deren optische Reinheit und die Menge an erhaltener cc-Ketocarbonsäure kann durch folgende Methoden bestimmt werden.
1) Quantitative Bestimmung der 2-Hydroxycarbonsäuren in
den Fermentationsbrühen:
2,0 ml Fermentationsbrühefiltrat werden in einem 1,6 g
■|0 Ammoniumsulfat enthaltendem 10 ml Zentrifugenglas aufgenommen, mit lO%iger Schwefelsäure angesäuert und dann mit 2,0 ml Aethylacetat extrahiert. 1,5 ml des Aethylacetatextraktes werden unter vermindertem Druck eingedampft. Dem Rückstand werden 2 ml Toluol zugesetzt und das Gemisch wird erneut zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 0,2 ml Pyridin gelöst und 0,1 ml Benzoylchlorid werden zugesetzt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch im Eisbad abgekühlt, mit 1,0 ml eines 0,4% Diäthylterephthalat (interner Standard, I.S.) enthaltenden 5:1-Gemisches von Toluol und n-Propanol behandelt und 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach Zusatz von 2,0 ml Wasser wird das Gemisch geschüttelt und dann 5 Minuten unter 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die Toluolschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und ein Teil der Lösung (gewöhnlich 2 μΐ) wird unter den folgenden Bedingungen durch GasChromatographie analysiert:
Temperatur: Kolonne 185°C, Injektor 225°C,
Detektor 2O5°C
Säule: Glasschlange
30 Länge 2m
interner Durchmesser 3 mm Packung der Säule: 5% QF-1/chromosolve W, MMCS
80-900 mesh
Trägergas: 30 ml/min Helium
35 Detektion: - FID
809886/0859
- 21 -.
■j Die Retentionszeiten des I. S. und der Derivate der α-
Hydroxycarbonsäuren, z.B. der a-Hydroxy-y-methylvaleriansäure und der α-Hydroxyhexansäure, sind unter den obigen Bedingungen 4,4, 6,6 bzw. 7,8 Minuten. Die den Peaks zugehörigen Flächen werden mittels der Eichkurve in Konzentrationswerte umgerechnet.
2) Bestimmung der optischen Reinheit der a-Hydroxycarbonsäuren in Fermentationsbrühen:
7 ml· des Ferraentationsbrühefiltrats werden mit 1 ml
10%iger Schwefelsäure angesäuert und mit 5 ml Aethylacetat extrahiert. 4 ml Teilmengen des Aethylacetatextrakts werden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit 2 ml 4% HCl enthaltendem n-Propanol behandelt. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gemisch unter vermindertem Druck eingedampft und die letzten Spuren von n-Propanol werden mittels Toluol entfernt. Dem Rückstand werden 0,2 ml L-(-)-Menthyloxycarbonylchloridlösung (hergestellt nach der Methode von J.W. Westley, J. Org. Chem. J3, 3798, 1968) und 0,2 ml Pyridin zugesetzt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit 2 ml kaltem Wasser behandelt. Dann werden 0,8 ml Toluol zugesetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und zentrifugiert. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wird ein Teil der Toluolphasen unter den gleichen Bedingungen wie für die quantitative Bestimmung der a-Hydroxycarbonsäuren durch Gaschromatographie analysiert. Beispiele von Retentionszeiten für einige aus α-Hydroxycarbonsäuren abgeleitete diastereomere Carbonate sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich. Die optische Reinheit kann mittels folgender Gleichung ermittelt werden:
809886/0859
2b.
AL : Fläche des Peaks des L-Enantiomers
AD : (Fläche des Peaks des D-Enantiomers)/k
k : Verhältnis zwischen den Detektorangaben der Diastereomeren (LD/LL)
Optische Reinheit =
t AlJ
χ 100 (%)
■ R in der Formel I Retentionszeit des
L-Enanti omeren		 Retentionszeit des
D-Enantiomeren		 k
CH3(CH2)2 8,5 (Min) 9,2 (Min) O,96
(CH3J2CHCH2 8,8 9,6 1,OO
CH3(CH2J3 1O,8 11,8 1,16
CH3(CH2J4 14,0 15,3 1,14
CH3(CH2J5 18,4 20,2 1,17
CH3(CH2J6 24,5 26,7 1,15
CH3(CH3J7 32,4 35,3 1,05
CH3(CH2J9 57,8 63,0 1,OO
3) Quantitative Bestimmung der a-Ketocarbonsäuren
Es wird die kolorimetrische Methode von H. Katsuki et al., Anal. Biochem. 43, 349 (1971) verwendet.
809886/0859
1 Beispiel 1
Vier mit Schikane versehene 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit je 100 ml des Mediums A wurden im Autoklav behandelt und
dann mit Bacillus sp. NRS-112KH25B (FERM-P No. 3165, NRRL 11085) aus der Schrägkultur beimpft. Die Inkubation wurde 26 Stunden bei 27°C unter Schütteln (180 Bewegungen pro Minute) durchgeführt. Danach wurden jedem Kolben 3,54 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat zugesetzt und die Fermentation wurde 84
Stunden bei 27°C unter Schütteln fortgeführt. Mittels der oben beschriebenen gaschromatographischen Methode wurde gefunden, dass das in der Kulturbrühe zurückbleibende Substrat 15,5 mg/ml freie D-Hydroxysäure (optische Reinheit: 100%) enthielt.
Die so erhaltene Gärbrühe (390 ml) wurde mit 50 ml 20%iger Schwefelsäure angesäuert und mit 300 ml Aethylacetat extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden nochmals mit 100 ml Aethylacetat extrahiert. Die vereinigten Aethylacetatextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter ver-
mindertem Druck eingeengt. Nach Kristallisation des Rückstandes aus Diäthyläther-Petroläther erhielt man 4,95 g D-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, Schmelzpunkt 79,6°C, ta]D = +26,3 (c = 2, IN NaOH), durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung ermittelte Bruttoformel: Cg11.?0?·
Die Mutterlauge wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der gelbliche braune, ölige Rückstand der fraktionierten Destillation unterworfen, wobei man 3,6 g 4-Methy1-2-oxovaleriansäure in Form eines farblosen OeIs erhielt, Siedepunkt 65-75°C (10 mmHg), durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung ermittelte Bruttoformel: C^Hn-O-,.
ο XO j
809386/0859
Beispiel 2
Ein mit Schikane versehener 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 90 ml des Mediums A wurde mit Bacillus freudenreichii NRS-137KH2OB (FERM-P No. 3169, ATCC 31301) von der Schrägkultur beimpft. Die Inkubation wurde unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen 24 Stunden durchgeführt. Danach wurden 3,17 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat zugesetzt und die Gärung wurde 82 Stunden fortgesetzt. Das in der Fermentationsbrühe zurückbleibende Substrat enthielt 15,2 mg/ml freie L-Hydroxysäure, optische Reinheit 100%. Die so erhaltene Gärlösung wurde dann in zu Beispiel 1 analoger Weise behandelt und man erhielt 1,18 g kristalline L-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, Schmelzpunkt 79,1°C, [a]^5 = -26,8° (c = 2, IN NaOH)
und 0,7 g 4-Methyl-2-oxovaleriansäure, Siedepunkt 65-75°C (10 mmHg).
Beispiel 3
Zehn mit Schikane versehene 500 ml Erlenmeyer-Kolben, ententhaltend je 100 ml des Mediums B, wurden mit Coryneform-Stamm NRS-13OKH2OB (FERM-P No. 3657, NRRL B-11088) von der Schrägkultur beimpft und 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 bebrütet. Jedem Kolben wurden als Substrat 8,19 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat zugesetzt und die Gärung wurde 120 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Nach der oben beschriebenen Methode wurde gefunden, dass 120 Stunden nach Zusatz des Substrats 35 mg/ml 4-Methyl-2-oxovaleriansäure und 37 mg/ml reine D-Hydroxysäure vorlagen. Die Gärung wurde daher abgestellt und die Gärlösungen wurden kombiniert und zentrifugiert. Der Ueberstand wurde mit 38 ml 50%iger Schwefelsäure auf pH 1,5 angesäuert und dreimal mit 1 Liter Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Aetherextrakte wurden dreimal mit 10 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Dem Rückstand wurden 100 ml Toluol zugesetzt und das Gemisch wurde unter vermindertem Druck zwecks Entfernung von
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Wasser eingeengt. Der gelblich-braune, ölige Rückstand wurde in 400 ml Petroläther gelöst und die Lösung über Nacht im Kühlschrank gehalten. Das Kristallisat wurde durch Filtrieren gesammelt, mit 50 ml kaltem Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 28>1 g D-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure in Form von farblosen Kristallen, Schmelzpunkt 79,90C, [cc]p° = +26,67° (c = 2, IN NaOH).
Beispiel 4
Die 4-Methyl-2-oxovaleriansäure und eine kleine Menge D-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure enthaltende Mutterlauge und Waschwässer aus Beispiel 3 wurden vereinigt und in einen Scheidetrichter verbracht. Dann wurde unter Schütteln IN NaOH zugesetzt bis das pH der wässrigen Schichten 7,0 erreichte (Zugabe von 299 ml IN NaOH). Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf etwa 150 ml eingeengt. Dem Rückstand wurden 100 ml destilliertes Wasser, enthaltend Raney-Nickel T4 (hergestellt aus 36 g einer 42% Nickel enthaltenden Nickel/Aluminiumlegierung nach der Methode von Nishimura, Bull. Chem. Soc. Japan, 32, 61-64, 1959), zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter normalem Druck bis zum Ende der Wasserstoffaufnähme hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit 25 ml 50%iger Schwefelsäure angesäuert und dann viermal mit 500 ml Aethyläther extrahiert. Die Aetherextrakte wurden vereinigt, mit 10 ml •gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Rückstand wurden 100 ml Toluol zugesetzt und das Gemisch wurde nochmals unter vermindertem Druck zu einem leicht gelben OeI eingeengt. Zwecks Kristallisation wurden 160 ml Petroläther zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht im Kühlschrank behalten, dann filtriert und die Kristalle wurden mit kaltem Petroläther gewaschen, wobei man 32,3 g 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure in Form von
farblosen Kristallen erhielt, Schmelzpunkt 73,9°C, [a]D° = +4.24° (c = 2, IN NaOH).
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Beispiel 5
DL-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure wurde bis zu einer Konzentration von 3,0 mg/ml im Medium A gelöst und das pH durch Zugabe von 5N NaOH auf 7,0 gestellt. Drei 500 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend je 100 ml des so hergestellten Mediums wurden im Autoklaven sterilisiert und dann mit einem der folgenden Stämme beimpft: Bacillus megaterium NRS-85KH2OB (FERM-P No. 3164, NRRL B-11084), Pseudomonas fluorescens NRS-137CZH5B (FERM-P No. 3658, NRRL 11089) und Streptomyces sp. NRS79KH1A (FERM-P No. 3160, NRRL 11083). Die Kultivierung wurde unter Schütteln (180 Bewegungen/Minute) bei .270C durchgeführt. Nach 72 und 144 Stunden wurde das Substrat, wie oben beschrieben, gaschromatographisch analysiert. Es wurden folgende Resultate ermittelt:
Stämme Menge des zurückbleibenden Substrats
(optische Reinheit als D-Enantiomer)		 72 Stunden 144 Stunden
FERM-P No. 3164,
NRRL B-11084
FERM-P No. 3658,
NRRL 11089
FERM-P No. 3160,
NRRL 11083		 O Stunden
(Beginn der Kulti
vierung)		 1,9 mg/ml (76%)
1,2 (100%)
1,2 (100%)		 1,8 mg/ml (92%)
1,1 (1OO%)
1,2 (100%)
3,O mg/ml (0%)
3,O (0%)
3,0 (0%)
Beispiel 6
Nach der Methode von Beispiel 5 wurden folgende Stämme im Medium A, das 3,0 mg/ml DL-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure enthielt, kultiviert: Bacillus freudenreichii NRS-137KH2OB (FERM-P No. 3169, ATCC 31301), Pseudomonas putida NRS-146KH6B (FERM-P No. 3172, ATCC 31303), Pseudomonas sp. NRS-139KH6B (FERM-P No. 3170, ATCC 31302), Coryne-Form NRS-135KH9B (FERM-P No. 3168, NRRL B-11O87) und Streptomyces sp. NRS-125KH27A (FERM-P No. 3660, NRRL 11091). Die Gärlösung wurde unter Ver-
809886/0859
-V-
.30-
wendung der oben angegebenen Methode nach 72 und 144 Stunden analysiert. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
3169, 3660, 0 Stunden
(Beginn der
Kultur)		 ,0 mg/ml Zurückbleibende Menge
(optische Reinheit als		 72 Stunden (98%) des Substrats
L-Enantiomer)		 144 Stunden
Stamm 3172, 3 ,0 1,6 g/ml (93%) (93%) mg/ml (100%)
FERM-P No.
ATCC 31301		 3170, 3 ,0 (0%) 1,4 (83%) 1,4 (100%)
FERM-P No.
ATCC 31303		 FERM-P No. 3168,
NRRL B-11087		 3 ,O (0%) 1,3 (97%) 1,4 (100%)
FERM-P No.
ATCC 31302		 FERM-P No.
NRRL 11091
1		 3 ,O (0%) 1,6 1,0 (100%)
3 (0%) 1,3 0,6 (97%)
(0%) 1,2
Beispiel 7
Ein mit Schikane versehener, 100 ml Medium A enthaltender Erlenmeyer-Kolben wurde mit einem der Stämme FERM-P No. 3166, (NRRL B-11086), FERM-P No. 3657 (NRRL B-11088), FERM-P No. 3658 (NRRL 11089), FERM-P No. 3167 (ATCC 31300), FERM-P No. 3659 (NRRL 11090) und FERM-P No. 3170 (ATCC 31302) ab einer 2-10 Tage alten Agar-Schrägkultur beimpft und 24-72 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 kultiviert. Die Kulturbrühe wurde IO Minuten unter Kühlung zentrifugiert und die ausgeschiedenen Zellen wurden zweimal mit 100 ml 0,85% NaCl enthaltendem Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und dann in 100 ml dieses Puffers suspendiert. Die Zellsuspension wurde in 5-ml-Portionen mit DL-a-Hydroxycarbonsäure versetzt, sodass die Konzentration 20 mg/ml betrug. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei 27°C inkubiert. Die Aktivität jedes Organismus für die verschiedenen Substrate wurde durch die oben beschriebene spektrophotometrische Analyse der entsprechenden entstandenen 2-0xocarbonsäure ermittelt. Die Resultate sind in der nach-
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stehenden Tabelle angegeben, worin die Reaktivität als relative Reaktivität gegenüber dem Substrat DL-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure (100) ausgedrückt ist. Die spezifische Aktivität jedes Stamms mit 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure ist: 5,8; 6,0; 0,95; 5,5; 3,5 und 0,54 nMol/min/mg Protein mit den Stämmen FERM-E No. 3166, 3657, 3658, 3167, 3170 bzw. 3659.
Die Zellen wurden durch Beschallung (70 W, 15 Minuten) aufgebrochen und 10 Minuten unter Kühlung zentrifugiert. Der erhaltene üeberstand (Rohextrakt), wurde wie oben beschrieben, mit verschiedenen Substraten in einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0) oder einem 0,02 M Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0) inkubiert. Es wurden ähnliche relative Aktivitäten gefunden, obwohl die spezifische Aktivität kleiner war, z.B. 0,50 nMol/ Min/mg Protein mit dem Stamm No. 3657.
^S. FERM-P No. 3166 Relative Aktivität in jedem Stamm 3657 32 3658 i
I		 j 3167 80 3170 41 39 30 i 3659
Hydroxy- ^s.
säure = R ^v		 D D 16 D . D 49 L 150 1OO 13 L
CH3- - - 68 1310 159 25 - - - 12 -
CH3CH2- 1,9 - 100 560 14 6,5 6,8 -
CH3(CH2J2- 32 - 130 42 6,3 O,9 -
(CH3J2CH- 69 133 19 25 14 - -
CH3(CH2)3- 72 79 194 59 4OO
(CH3J 2CHCH2~ 1OO 55 100 100 IOO
(CH3J3C- - 13 - - 71
CH3(CH2J4- 120 0,6 2OO 1220
CH3(CH2J5- 68 - 160 693
0V0Ve" 52 53 250
CH3(CH2J7- 39 23 -
CH3 (CH2J9- 3,5 14
CH3(CH2)13- 3,4 - -
Substrat:
(DL)
R-CH-COOH
I
OH
8G9888/D8S9
.32-
Beispiel 8
Ein mit Schikane versehener, 100 ml Medium A enthaltender Erlenmeyer-Kolben wurde mit Brevibacterium albidum NRS-13OKH2OB (FERM-P No. 3657, NRRL B-11088) von der Schrägkultur beimpft und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 24 Stunden kultiviert. Die Kulturbrühe (90 ml) wurde zu 22 ml sterilisiertem 50%igem Glycerin gegeben, suspendiert und bei -196 C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Ein mit Schikane versehener, 100 ml des Mediums B enthaltender Erlenmeyer-Kolben wurde durch Zugabe von 2 ml der obigen, aufgetauten Zellsuspension beimpft und 24 Stunden unter identischen Bedingungen kultiviert. Dieser Kultur wurden 8,8 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat als Substrat zugesetzt und die Fermentation wurde fortgesetzt. 72 und 120 Stunden nach Zusatz des Substrats wurden die zurückbleibenden Mengen des Substrats in der Brühe, die optische Reinheit (ausgedrückt in % des D-Enantiomeren) und die Menge der erhaltenen 4-Methyl-2-oxovaleriansäure durch die oben beschriebenen Methoden ermittelt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
Beim Zusatz
des Substrats		 72 Stunden 120 Stunden
2-Hydroxy-4-methylvalerian-
säure (mg/ml)		 75 41 39
Optische Reinheit
des D-Enantiomeren in %		 0 85 100
4-Methyl-2-oxovalerian-
säure (mg/ml)
ι		 O 32 33
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. 33.
Beispiel 9
Ein 1 Liter-Glasfermentor mit 3O1O ml des Mediums B wurde sterilisiert, dann mit 6 ml der wie in Beispiel 8 hergestellten Zellsuspension No. 3657 beimpft und 16 Stunden bei 27°C unter aeroben Bedingungen (Luftströmung 0,5 l/Min, 300 Umdrehungen/ Minute) kultiviert. Als Substrat wurden 24,6 g Natrium-2-hydroxy-4-methylvalerianat zugesetzt und das pH der Kultur durch Zusatz von 2N HCl auf 8,5 eingestellt. Die Fermentation wurde bei pH 8,5 unter den gleichen Bedingungen fortgeführt (Luftströmung 0,3 l/Min, 300 Umdrehungen/Minute). Die Analyse des Substrats, 72 und 120 Stunden nach Substratzugabe, ist in der folgenden Tabelle angegeben:
Bei Zugabe
des Substrats		 72 Stunden 120 Stunden
2-Hydroxy-4-methylvalerian-
säure'(mg/ml)		 70 39 35
Optische Reinheit
des D-Enantiomeren in %		 0 89 98
4-Methyl-2-oxovalerian-
säure (mg/ml)		 0 36 36
Beispiel 10
Ein mit Schikane versehener 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des Mediums B wurde mit 1 ml der gemäss Beispiel 8 hergestellten Zellsuspension von B. albidum NRS-13OKH2OB (FERM-P No. 3657, NRRL B-11088) beimpft und 24 Stunden bei 27°C unter Rühren und den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen kultiviert. Dann wurden 1,48 g des Natriumsalzes der DL-cc-Hydroxy-3-pyridylessigsäure zugesetzt und die Fermentation wurde 120 Stunden fortgeführt. Die Kulturbrühe (pH 9,2) wurde zentrifugiert und durch eine Säule mit 71 ml Dowex-lx4 (Acetatform, 200-400 mesh) geführt. Der Anionenaustauscher wurde dann mit Wasser gewaschen und mit einem Gemisch von 2N Essigsäure/
€09885/0859
- 3ί -
1 Methanol (1:1, ν/ν) eluiert. Das Eluat wurde durch
Dünnschichtchromatographie (Platte: Silicagel, Lösungsmittel: Aethylacetat-Essigsäure-Wasser-Methanol, 10:2:1:2, v/v; Nachweis: UV-Strahlen) kontrolliert. Die UV-Absorptionsflecken (Rf 0,12) aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser gelöst und zu 793 mg Pulver lyophilisiert. Nach Kristallisation aus Methanol-Aethylacetat erhielt man 625 mg optisch aktive a-Hydroxy-3-pyridylessigsäure in Form von farblosen Kristallen, Schmelzpunkt 140°C, [a]^ = -119° (c = 1, H2O), Mol. Formel: C7H7NO3.
Die Säule wurde dann mit einem Gemisch von IN HCl und Aceton (1:1, v/v) eluiert. Das Eluat wurde nach dem gleichen Dünnschichtchromatographiesystem kontrolliert. Die UV-Absorptionsflecken (Rf 0,37.) aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt, mit Wasser verdünnt und dann durch eine Säule, enthaltend 30 ml Dowex-50 (H -Form), gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit l%igem wässrigem Ammoniak eluiert.
) Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, lyophilisiert und das entstandene Pulver aus Methanol kristallisiert. Man erhielt 362 mg α-0xo-3-pyridylessigsäμre in Form von farblosen Kristallen, Schmelzpunkt 177-179°C (Zers.), Mol. Formel: C7H5NO3.
Beispiel 11
Ein mit Schikane versehener 500 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 100 ml des Mediums B, wurde mit 2 ml der nach Beispiel 8 hergestellten Zellsuspension von B. albidum NRS-13OKH2OB (FERM-No. 3657, NRRL B-IIO88) beimpft und 24 Stunden bei 27 C unter Schütteln (180 Bewegungen/Minute) kultiviert. Die Kulturbrühe wurde 10 Minuten zentrifugiert, die ausgeschiedenen Zellen wurden dreimal mit 100 ml 0,85% Natriumchlorid enthaltendem 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und dann in 100 ml des gleichen Puffers suspendiert. 50 ml dieser Suspension wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben umge-
309886/0859
schüttet, mit 1,14 g Natrium DL-2-Hydroxyoctanoat versetzt und der Kolben 48 Stunden bei 27°C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus dem Reaktionsgemisch entfernt, der Ueberstand durch Zusatz von 50%iger Schwefelsäure auf pH 1,5 angesäuert und dreimal mit 50 ml Diäthylather extrahiert. Die vereinigten Aetherextrakte wurden mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit 26 ml 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens, hergestellt nach der Methode von CD. Johnson, J. Am. Chem. Soc. ~n_, 5888, (1951), versetzt und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die entstandenen gelben Kristalle wurden gesammelt und aus Benzol umkristallisiert. Man erhielt 761 mg 2,4-Dinitrophenylhydrazon der 2-Oxooctansäure, Schmelzpunkt 137 C, Mol. Formel: ci4HioN40g·
Die Hydrazon-Mutterlauge wurde zweimal mit 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Aetherextrakte wurden mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und das pH der wässrigen Schicht unter Schütteln und Zugabe von IN NaOH auf 7,0 einge-
stellt. Die wässrige Schicht wurde zweimal mit 20 ml Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde zu 237 mg Natrium D-2-Hydroxyoctanoat, [a]D = +9,6° (c = 2, H2O) lyophilisiert.
25 Beispiel 12
Die Spaltung von verschiedenen DL-ot-Hydroxycarbonsäuren wird wie in Beispiel 11 mit den restlichen Zellen von B. albidum NRS-13OKH2OB (FERM-P No. 3657, NRRL B-11088) durchgeführt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
809886/0859
Substrat CH3 Zugesetzte
Menge
(mg)		 Inkubie-
rungs-
zeit
(Std.)		 D- (»Hydroxycarbonsäure (C-S 0 *1
,H2O		 *2
Optische
Reinheit		 a-Ketocarbonsäure *4 Schmelzpunkt
CH (CH.)-CHCOOH ^CHCHCOOH
CH3CH2 OH		 1510 72 *1
Ausbeute
(mg)		 +10 ,iö 90 *3
,Ausbeute
(mg)		 166,5-167
OH 474 405 *4
CH,(CH0),CHCOOH
3 2 3|
OH		 890 48 +12 ,1° 100 *5 134
CH,(CH0) .CHCOOH
J 2 4|		 820 48 389 +12 ,5° 100 : 368 103-104
I
OH		 372 440
*4
840 72 +8, 9° 96 169-171
200 619
*1 : als Natriumsalz
*2 : gaschromatographisch ermittelt
*3 : als 2,4-Dinitrophenylhydrazon
*4 : umkristallisiert aus Benzol
*5 : umkristallisiert aus Benzol-Hexan
K) 00 Cx) K) K) Ca) CD
Beispiel 13
Das gewaschene Zellpräparat, hergestellt aus 100 ml der nach Beispiel 11 hergestellten Kultur von B. albidum NRS-13OKH2OB (FERM-P No. 3657, NRRL B-11088) wurde nochmals mit destilliertem Wasser gewaschen und lyophilisiert, wobei man 478 mg Lyophilisat (trockenes Zellpulver) erhielt. Das trockene Zellpulver wurde in 100 ml 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,5) suspendiert. Das Gemisch wurde mit 2,34 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat versetzt und nach Einstellen des pH auf 7,5 bei 27°C geschüttelt (180 Bewegungen/Minute)."Nach 48 und 72 Stunden Schütteln wurde das im Puffer, zurückbleibende Substrat, die optische Reinheit und die Menge der erhaltenen 4-Methyl-2-oxovaleriansäure durch die oben beschriebene Methode ermittelt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
Vor dem
Schütteln		 48 Stunden 72 Stunden
2-Hydroxy-4-methylvalerian-
säure (mg/ml)		 20,0 11,6 10,9
Optische Reinheit des
D-Enantiomeren in %		 0 100 100
4-Methyl-2-oxovaleriansäure
(mg/ml)
I		 0 9,6 9,9
803886/0859

Claims (4)

  1. ¥■
    Patentansprüche
    1/ Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven oc-Hydroxycarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man eine D,L-a-Hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel
    R-CH-COOH I
    OH
    worin R einen verzweigten oder geradkettigen Alkylrest mit 1-13 C-Atomen oder einen ' Pyridylrest darstellt,
    oder ein Salz davon mittels enantiospezifische Dehydrogenaseaktivität aufweisenden, zu den Genera Streptomyces, Pseudomonas, Bacillus oder zur Coryneformgruppe gehörenden Mikroorganismen asymmetrisch zur a-Ketocarbonsäure bzw. zu einem Salz davon dehydriert, aus einem erhaltenen Salz die Säure freisetzt und schliesslich das nicht dehydrierte Enantiomere der a-Hydroxycarbonsäure und gegebenenfalls die a-Ketocarbonsäure aus dem Reaktionsmedium isoliert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltene α-Ketocarbonsäure in an sich bekannter Weise zur α-Hydroxycarbonsäure hydriert und diese als Ausgangsmaterial in den Prozess zurückführt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangssäure der Formel I 2-Hydroxypropionsäure, 2-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyvaleriansäure, 2-Hydroxy-3-methy!buttersäure, 2-Hydroxycapronsäure, 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, 2-Hydroxy-3, 3-dimethylbuttersäure, 2-Hydroxyheptylsäure, 2-Hydroxy-4-methylcapronsäure, 2-Hydroxycaprylsäure, 2-Hydroxypelargonsäure, 2-Hydroxydecansäure, 2-Hydroxyundecansäure, 2-Hydroxydodecansäure, 2-Hydroxytridecansäure, 2-Hydroxytetradecansäure, 2-Hydroxypentadecansäure oder a-Hydroxy-3-pyridylessigsäure verwendet.
    809886/0859
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus megaterium FERM-P No. 3164, NRRL B-11084; Bacillus FERM-P No. 3165, NRRL 11085; Bacillus freudenreichii FERM-P No. 3169, ATCC 31301; einen der Coryneform-Gruppe angehörenden Stamm FERM-P No. 3166, NRRL B-11086; FERM-P No. 3167, ATCC 31300; FERM-P No. 3657, NRRL B-11088; oder FERM-P No. 3168, NRRL B-11087; Pseudomonas fluorescens FERM-P No. 3658, NRRL 11089; Pseudomonas putida FERM-P No. 3172, ATCC 31303 oder No. 3659, NRRL 11090; Pseudomonas FERM-P No. 3170, ATCC 31302, Streptomyces FERM-P No. 3160 (NRS-79KH-1A), NRRl 11083 oder FERM-P No. 3660 (NRS-125KH-27A), NRRL 11091 verwendet.
    809886/0859
DE2832230A 1977-07-26 1978-07-21 Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha -hydroxycarbonsaeuren Withdrawn DE2832230A1 (de)

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CH921877A CH628009A5 (de) 1977-07-26 1977-07-26 Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-hydroxycarbonsaeuren.

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