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Verfahren zur Ilerstellung eines Süßungsmittels Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung eines Süßungsmittels, wobei manOt-Glucosyltransferase
auf eine Steviosid und eine i-Glucosyl-Zuckerverbindung enthaltende wässrige Lösung
einwirken läßt, wobei einoC-Glcosyl-Steviosid gebildet wird, und das aC-Glycosyl-steviosid
oder ein das cL-Clycosyl-Steviosid enthaltendes Süßungsmittel erhält.
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Da in jüngster Zeit die Verwendung künstlicher Süßstoffe, wie beispielsweise
Dulcin, Natriumcyclamat und Saccharin, aus Gründen der Freihaltung der Lebensmittel
von bedenklichen Substanzen unterbunden oder eingeschränkt worden ist, steigt der
Bedarf an unschädlichen natürlichen Süßungsmitteln ständig. Aufgrund dieses Bedarfes
ist unter den mit landwirtschaftlichen Produkten und Süßungsmitteln befaßten Herstellern
ein starkes Bestreben zur Erhöhung der Produktion von Steviosid erkennbar.
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Steviosid ist ein natürlich vorkommenes Glycosid, das durch Extraktion
der Oerirdischen Teile, d.h der Blätter und Stengel, von Stevia Rebaudiana BERTONI
( im Folgenden einfach als Stevia bezeichnet ), aus der Familie Chrysanthemum erhalten
wird. Das Glycosid ist, wie in der folgenden Formel gezeigt, ein ß-Glucosyl-Glycosid,
dessen Aglycon Steviol ist Chemische Struktur von Steviosid
Steviosid wird als Extrakt von Steviablättern in roher und gereinigter Form oder
im Gemisch mit anderen Süßungsmitteln zur Süßung von Nahrungsmitteln und Getränken
verwendet.
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Bekanntlich ist das Anwendungsgebiet von Steviosid oder herkömmlichen
Süßungsmitteln mit einem Gehalt an Steviosid beschränkt bzw erfordert besondere
Vorsichtsmaßnahmen oder bereitet Schwierigkeiten,
weil Steviosid
die folgenden Nachteile besitzt: 1. Steviosid ist nicht nur züß, sondern auch bitter
und adstringierend.
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2. Die Süße von Steviosid entwickelt sich langsamer im Mund als die
von Saccharose und besitzt außerdem einen länger anhaltenden unangenehmen Nachgeschmack.
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3. Steviosid löst sich nur schwierig in Wasser ( o,12% bei 2o0C).
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Aufgabe der Erfindung ist daher die Eliminierung der genannten Schwierigkeiten
mit Hilfe biochemischer Mittel.
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Die Schwierigkeiten wurden durch das erfindungsgemäße Verfahren man
gelöst, bei dem eine wässrige Lösung, die Steviosid und eines oder mehrere a6-Glucosyl-Zuckerverbindungen
aus der Gruppe der Maltooligosaccharide, wie beispielsweise Maltose, Maltotriose,
Maltotetraose oder Teilhydrolysate von Stärke, und der Zuckerverbindungen mit einem
αGlucosylrest, wie beispielsweise Saccharose, enthält, der Einwirkung einer
oder mehrerer >AGlucosyltransferasen unterwirft, die in der Lage ist, einen αGlucosylrest
auf das Steviosid zu übertragen,wie beispielsweise °C-Glucosidase (E.C.3.2.1.20),
oU-Amylase (E.C.3.2.1.1.), Cyclodextrin-glucanotransferase (E.C.2.4.1.19), und Dextransaccharase
(E.C.2.4.1.5).
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Dabei wird ein Süßungsmittel erhalten, das das durch die Umsetzung
gebildete CC -Glycosyl-Steviosid enthält und die folgenden außergewöhnlichen wünschenswerten
Eigenschaften besitzt, die mit herkömnlichen Steviosidprodukten oder Steviosid enthaltenden
Süßungsmitteln nicht erreichbar sind;
1, Das neue Süßungsmittel
ist weder bitte noch Antringierend, sondern liefert eine milde, weiche, runde und
angenehme Süße, 2, Es besitzt keinen länger anhaltenden Nachgeschmack.
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3. Es besitzt eine beträchtlich verbesserte Wasserlöslichkeit.
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Außerdem wurde durch Dünnschichtchromatographie gefunden, daß die
Umwandlung zur Uberführung eines Teiles oder nahezu der Gesamtmenge des bei der
Umsetzung verwendeten Steviosids in ein αGlycosyl-Steviosid, wie beispielsweise
α ot-Monoglucosylsteviosid, ot -Diglucosylsteviosid und α-Triglycosylsteviosid,
führt.
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Kürzlich wurden neue Verbindungen, die Rebaudiosid A und Rebaudiosid
B genannt wurden und von Steviosid völlig verschieden sind, in den Blättern von
Stevia gefunden. Wie sich aus den folgenden Formeln ergibt, sind Rebaudiosid A und
Rebaudiosid B ß-Glucosyl-glycoside, in denen wie im Falle von Steviosid das Aglycon
Steviol ist.
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Chemische Struktur von Rebaudiosid A
Chemische Struktur von Rebaudiosid B
Während das α-Glycosylsteviosid, das in dem erfindungsgemäß hergestellten
Süßungsmittel vorhanden ist, von Enzymen, die ot-glucosidische Bindungen hydrolysieren,
wie beispielsweise Glucoamylase, oQ -Glucosidase, ß-Amylase und Isomaltodextranase,
zu Steviosid, D-Glucose, Maltose oder Isomaltose zersetzt wird, erwiesen sich Rebaudiosid
A und B (im folgenden,wenn nicht anders angegeben, einfach als Rebaudioside bezeichnet)
als von solchen ot-glucosidische Bindungen hydrolysicrenden Enzymen unzersetzlich.
Außerdem werden, wenn man eine wässrige Lösung, die einen α-Glucosylzucker
und Rebaudioside enthält, der Einwirkung von L-Glucosyltransferase unterwirft, die
Rebaudioside nicht zersetzt, sondern bilden oC-Glycosylrebaudioside ähnlich wie
in dem oben beschriebenen Fall, bei dem das Enzym auf Steviosid einwirken gelassen
wird. Das erhaltene
Reaktionsgemisch besitzt ebenfalls eine ähnlich
milde, weiche, runde-und angenehme Süße, die derjenigen des nicht umgesetzten Gemisches
in ihrer Qualität wesentlich überlegen ist. Demzufolge ist das vC -Glycosylsteviosid,
das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, offensichtlich
von dem herkömmlichen bekannte Steviosid oder den Rebaudiosiden verschieden.
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Das Steviosid, das zur Herstellung des erfindungsgemäß erhaltenen
Süßungsmittels in Gegenwart einer 2 -Glucosylzuckerverbindung verwendet wird , ist
nicht notwendigerweise ein hochraffiniertes oder gereinigtesSteviosidprodukt, sondern
kann ein Gemisch aus Steviosid oder Rebaudiosiden oder ein rohes Steviosidprodukt
oder sogar ein Steviosidnebenprodukt sein, das Verunreinigungen enthält, wie beispielsweise
Mutterlauge, die noch eine große Menge an Steviosid und Rebaudiosiden enthält und
durch Extraktion von Stevia erhalten wird und aus der kristallines Steviosid entfernt
worden ist.
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Die -Glucosylzuckerverbindung, die sich beim erfindungsgemäßen Verfahren
verwenden läßt, kann eine solche sein, die aus Steviosid o&-Glycosylsteviosid
bildet, wenn beide der Einwirkung einer oU-Glucosyltransferase unterworfen werden.
Demzufolge werden vorzugsweise solche Substrate gewählt, die die Einwirkung einer
oL-Glucosyltransferase begünstigen, nämlich >t-Glucosylzuckerverbindungen,wie
beispielsweise ein partielles Stärkehydrolysat, Saccharose und dergleichen. Wenn
als oC-Glucosyltransferase Ot-Glucosidase (E.C.3.2.1.20) verwendet wird, sind geeignete
Substrate für sie beispielsweise it-Glucosylzuckerverbindungen, wie
Maltooligosaccharide,
zum Beispiel Maltose, Maltotriose, Maltotetraosetein partielles Stärkehydrolysat
mit einem Dextroseäquivalent (DqE.) von etwa 1o bis etwa 70 oder Saccharose; für
α-Amylase (E.C.3.2.1.1) geeignete Substrate sind beispielsweise α-Glucosylzuckerverbindungen,
die von einem gelatinierten Stärkeprodukt mit einem Dextroseäquivalent von nicht
über 1 bis zu einem partiellen Stärkehydrolysat (Maltodextrin) mit einem Dextroseäquivalent
von etwa 30 reichen; für Cyclodextrin-glucanotransferase (E.C.2.4.1*19) geeignete
Substrate sind beispielsweise ein Cyclodextrin oder α-Glucosylzuckerverbindungen
, die von einem gelatinierten Stärkeprodukt mit einem Dextroseäquivalent von nicht
über 1 bis zu einem partiellen Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent von
etwa 60 reichen, und für Dextrans accharase (E.C.2.4. 1.5) ist ein geeignetes Substrat
Saccharose.
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Von den bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Ot-Glucosylzuckerverbindungen
kann das gelatinierte Stärkeprodukt oder das partielle Stärkehydrolysat ein Produkt
sein, das aus Getreidestärke, wie beispielsweise Weizen- oder Maisstärke, oder aus
Knollen- und Wurzelstärke, wie beispielsweise Süßkartoffelstärke, Kartoffelstärke
oder Tapiocastärke, erhalten worden ist.
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Das gelatinierte Stärkeprodukt wird durch Gelatinieren hergestellt,
das dadurch erreicht wird, daß man eine Stärkeaufschlämmung auf die Temperatur oberhalb
des Gelatinierungspunktes, im allgemeinen auf eine Temperatur von 70 bis 14o0C,
erhitzt. Das partielle Stärkehydrolysat wird durch Hydrolysieren einer Stärkeaufschlämmung
mit einer oder mehreren Säuren undXoder mehreren Amylasen bis zu dem
gewünschten
Dextroseäquivalent erhalten, Erfindungsgemäß kann die -Glucosylzuckerverbindung
aus einer einzigen Art bestehen, oder es können mehrere Arten gemeinsam verwendet
werden.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren können beliebige>t-Glucosyltransferasen
frei gewählt werden, so lange sie α-Glycosylsteviosid bilden, ohne das Steviosid
zu zersetzen, wenn sie auf eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an einer α-Glucosylzuckerverbindung
(einem geeigneten Substrat für das Enzym ) und Steviosid einwirken gelassen werden.
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Verwendbart α-Glucosyltransferasen, die günstige Ergebnisse
erzielen lassen, sind beispielsweise oC-Glucosidase (E.C.3.2.1.20) tierischer Herkunft,
wie beispielsweise aus Schweineleber, pflanzlicher Herkunft, wie beispielsweise
aus Buchweizensamen, oder aus Pilzen, wie denen der Gattungen Mucor und Penicillium,
oder aus Hefen stammend, wie denen der Gattung Saccharomyces; a -Amylase (E.C.3*2.1.),
aus verschiedenen Mikroorganismen stammend, insbesondere aus Bakterien der Gattung
Bacillus, sowie aus Pilzen der Gattung Aspergillus stammend; Cyclodextrin-glucanotransferase
(E.C.2.4.1 .19) ebenfalls aus verschiedenen Mikroorganismen stammend, insbesondere
aus Bakterien der Gattungen Bacillus und Klebsiella; Dextran-saccharase (E.C.2.4.1.5),
aus Bakterien der Gattung Leuconostoc stammend; Dextrin-dextranase (E.C.2.4.1.2),
aus Bakterien der Gattung Acetobacter stammend; oder Amylosaccharase (E.C.2.4.1.4),
aus Bakterien der Gattung Neisseria stammend.
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Die Reinigung der J&--Glucosyltransferase muß nicht notwendigerweise
erfolgen, so lange die obenbeshriebenen Bedingungen eingehalten werden und die Ziele
des erfindungsgemäßen Verfahrens üblicherweise mit einer rohen ob -Glucosyltransferase
erreichbar sind.
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Beispielsweise wird eine rohe qC-Glucosyltransferase tierischer oder
pflanzlicher Herkunft erhalten, indem man eine Extraktionslösung von gemahlenen
oder zerhackten tierischen oder pflanzlichen Geweben mit Ammoniumsulfat aussalzt
oder die Extraktionslösung mit organischen Fällungsmitteln, wie beispielsweise Alkohol
oder Aceton, ausfällt und das Produkt abtrennt. Nötigenfalls kann die rohe Transferase
vor ihrer Verwendung nach einer beliebigen bekannten Methode gereinigt werden.
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Die bekannte mikrobielle ot-Glucosyltransferase umfaßt Produkte aus
Bakterien, Pilzen, Hefen und anderen Mikroorganismen. Gewöhnlich werden für die
Herstellung derartiger Transferasen die Festkulturmethode, wie sie für "Koji' verwendet
wird, und die Flüssigkulturmethode, wie beispielsweise das Tankkulturverfahren,
angewandt.
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Analog wie im Fall der Transferase tierischen oder pflanzlichen Ursprungs
wird die mikrobielle oL-Glucosyltransferase durch Extraktion hergestellt und kann
nötigenfalls vor ihrer Verwendung nach beliebigen bekannten Verfahren gereinigt
werden.
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Wenngleich im Falle der Verwendung einer flüssigen Kultur die Kulturbrühe
als Ganzes als ol-Glucosyltransferase verwendet werden kann, wird üblicherweise
nur die überstehende Flüssigkeit, aus der die unlöslichen Bestandteile entfernt
worden sind, als Ot-Glucosyltransferase
verwendet. Alternativ
kann das entwickelte Enzym in Form von Zcllen oder nach einer Extraktion aus den
Zellen verwendet werden und nötigenfalls vor seiner Verwendung weiter gereinigt
werden.
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Gleichfalls verwendbar ist im Handel erhältliche i-Glucosyltransferase.
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α -Glucosyltransferase kann auf geeigneten Trägern immobilisiert
werden, und das immobilisterte Enzym kann wiederholt in absatzweise oder kontinuierlich
arbeitenden Systemen verwendet werden. Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel
kann hergestellt werden, indem man einen oc-Glucosyltransferase erzeugenden Mikroorganismus
bzw. ein oC-Glucosyltransferase erzeugendes tierisches oder pflanzliches Gewebe
in einem eine 4-Glucosylzuckerverbindung und Steviosid enthaltenden Medium zur Erzeugung
von α-Glycosylsteviosid züchtet Die Umsetzungsbedingungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens sind derart, daß ct-Glucosyltransferase auf eine Steviosid und eine oC
-Glucosylzuckerverbindung enthaltende wässrige Lösung einwirken gelassen wird.
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Die Steviosid und die oC-Glucosylzuckerverbindung enthaltende wässrige
Lösung wird hergestellt, indem man sie bis zur Auflösung des Steviosids erhitzt
und auf eine Steviosidkonzentration von etwa o,l bis 20% (Gewicht/Gewicht) sowie
eine Konzentration an der
ot-Glucosylzuckerverbindung von etwa
1 bis etwa 50% ( Gewicht/ Gewicht) bringt, Das bevorzugte Verhältnis Von &-Glucosylzuckerverbindung
zu Steviosid liegt im Bereich von etwa o,5 bis etwa 500, bezogen auf feste Trockensubstanz.
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PH-Wert und Temperatur der Umsetzungslösung müssen in dem Bereich
liegen, in dem die Bildung von α-Glycosylsteviosid durch die Eilt wirkung
von ot-Glucosyltransferasel n) herbeigeführt wird, weshalb üblicherweise ein pH-Wert
von 3 bis lo und eine Temperatur von 20 bis 80°C gewählt werden. Bei der Umsetzung
hängt die Menge an verwendetem Enzym eng mit der Reaktionsdauer zusammen. Deshalb
wird aus wirtschaftlichen Gründen normalerweise eine Enzymmenge verwendet, die ausreicht,
um die Umsetzung in etwa 5 bis 80 h vollständig ablaufen zu lassen.
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Die Umsetzungslösung, in der auf diese Weise α-Glycosylsteviosid
gebildet wird, kann als Ganzes als Süßungsmittel verwendet werden.
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Gewünschtenfalls wird die Umsetzungslösung erhitzt, um das Enzym zu
inaktivieren, filtriert, durch Hindurchleiten des Filtrats durch Ionenaustauscherharze,
wie starksaures Ionenaustauscherharz vom H-Typ und schwachbasisches Ionenaustauscherharz
vom OH Typ, entsalzt und zu einem sirupösen Süßungsmittel konzentriert, oder das
Konzentrat kann getrocknet und zu einem pulverförmigen Süßungsmittel pulverisiert
werden. Zum Konzentrieren, Trocknen und Pulverisieren kann jede beliebige Methode
angewandt werden, wie beispielsweise Vakuumverdampfen, Vakuumtrocknen und Sprühtrocknen.
Die Süße des erhaltenen oC-Glycosylsteviosid enthaltenden Süßungsmittels ist
im
allgemeinen ungefähr gleich derjenigen oder nur geringfügig schwächer als diejenige
der gleichen Gewichtsmenge Steviosid, die in die Umsetzung eingesetzt wurde. Außerdem
ist die Süße des erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittels mild, weich, rund
J und angenehm, verleiht kaum einen bitteren oder astringierenden Geschmack und
weist außerdem keinen länger anhaltenden Nachgeschmack auf.
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Das gebildete ot-Glycosylsteviosid sowie in dem erfindungsgemäß hergestellten
sirupösen Süßungsmittel vorhandenes1 nicht umgesetztes Steviosid kristallisieren
selbst nach längerem Aufbewahren nicht aus. Das erfindungsgemäß hergestellte pulverförmige
Süßungsmittel ist eine sog. pulverförmige Feststofflösung, bei der sich das gebildete
oC-Glycosylsteviosid , nicht umgesetztes Steviosid sowie umgesetzte und nicht umgesetzte
α bL-Glucosylzuckerverbindungen wechselseitig lösen. Demzufolge ist die Wasserlöslichkeit
des pulverförmigen Süßungsmittels so groß, daß es sich unbegrenzt und sofort löst;
es löst sich selbst mit hoher Konzentration ohne weiteres zu einem Sirup oder eine
Paste.
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Wie oben beschrieben, ist das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel
von herkömmlichen Steviosidprodukten oder einfachen Gemischen, die Steviosid und
andere Süßungsmittel enthalten, dadurch verschieden, daß es sich vermöge seiner
beträchtlich höheren Löslichkeit ohne weiteres und ohne Erwärmen löst. Wie im folgenden
im einzelnen beschrieben, kann dieses Merkmal zur Erzielung hervorragender Ergebnisse
bei der Süßung von pulverförmigen Instantnahrungsmitteln,
ersten
Nahrungsmitteln ( first foods ) sowie bequem zubereitbaren Nahrungsmitteln (sonvenient
foods) und Bestandteilen davon ausgenutzt werden.
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Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel kann als Ganzes zum
Süßen von Nahrungsmitteln und Getränken verwendet werden.
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Das Süßungsmittel kann auch mit anderen Süßungsmitteln vermischt werden,
wie beispielsweise mit Stärkesirupen, Glucose, Maltose, isomerisiertem Zucker, Saccharose,
Honig, Ahornzucker, Sorbit, Maltit, Dihydrochalon, L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
Saccharin, Alanin und Glycyrrhizin, sowie mit Füllstoffen, wie Dextrinen, Stärke
und Lactose, Aromastoffen und Farbstoffen vermischt werden.
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Unter den erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmitteln können die
pulverförmigen Produkte als solche oder nach Verformen zu Granula, Kugeln und Tabletten
mit Hilfe geeigneter zugesetzter Füllstoffe und Bindemittel verwendet werden, während
im Falle von sirupösen Produkten die Konzentration entsprechend dem Endverbrauch
eingestellt und der Sirup in beliebigen Behältern verpackt werden kann, Da, wie
oben beschrieben, die Süße des erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittels etwa
gleich oder nur geringfügig schwächer ist als die derselben Feststoffgewichtsmenge
Steviosid, die in die Umsetzung eingesetzt wurde, variiert die Süße mit dem Verhältnis
von Steviosid zu ot-Glucosylzuckerverbindung, das bei
der Umsetzung
angewandt wurde. Die Süße, die unter Anwendung eines Verhältnisses von Steviosid
zu ot-Glucosylzuckerverbindung von etwa 1:50 bis loo erzielt wird, ist im allgemeinen
gleich der Süße von Saccharose, bezogen auf trockene Feststoffe.
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Wenn das Verhältnis jenseits von etwa 1:loo liegt und insbesondere
wenn gelatinierte Stärke, partielles Stärkehydrolysat oder ein Maltooligosaccharid
als oC-Glucosylzuckerverbindung verwendet wird, ist die erhaltene Süße schwächer
als diejenige von Saccharose, bezogen auf trockene Feststoffsubstanz. Deshalb kann
ein derartiges Süßungsmittel als ein Süßungsmittel verwendet werden, das Nahrungs-Zuckerwaren
mitteln, Getränken, und Arzneimitteln eine erwünschte Textur, wie beispielsweise
Dicke, Viskosität, Konsistenz, Schwere oder Körper verleiht und das die Süße des
Endproduktes vermindert.
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Wenn andererseits das Verhältnis jenseits von etwa 1:50 liegt, ist
die Süße des erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittels im allgemeinen größer
als diejenige von Saccharose, bezogen auf trockene Feststoffe; die Süße wird umgekehrt
proportional zur Abnahme des Verhältnisses verstärkt. Völligeßeseitigung des Anteils
der ct-Glucosylzuckerverbindung aus dem erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel
führt zu einer Zunahme der Süße auf etwa das 50- bis loo-fache der Süßkraft von
Saccharose. Die Verwendung derartiger, in ihrer Süßkraft verstärkter Süßungsmittel
zum Süßen Zuckerwaren von Nahrungsmitteln, Getränken und führt zu einer Senkung
ihres Nährwertes, da beträchtlich weniger Süßungsmittel zur Erzielung derselben
Süße erforderlich ist, wie sie durch Saccharose
bewirkt wird Illit
anderen Worten, das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel kann als nährwertarmes,
diätetisches Süßungsmittel für Korpulente, Diabetiker und solche Personen verwendet
werden, deren Nahrungsaufnahme beschränkt wird, sowie zum Süßen von nd"hrwertarmen,
diätetischen Nahrungsmitteln, Getränken und Zuckerwaren, d.h, für die sog. Schönheitsdiät,
Gesundheitsdiät und andere Diäten.
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Außerdem kann das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel als Süßungsmittel
verwendet werden, das nur im geringen Maße Karies erzeugt, da es von kariogenen
Mikroorganismen nur schlecht vergärbar ist. Anwendungsgebiete hierfür sind Nahrungsmittel
und Getränke einschließlich Zuckerwaren, die nur im geringen Maße Karies hervorrufen,
wie beispielsweise Kaugummis, Schokoladen, Biskuits, Kekse, Karamel-bonbons, Sahnekaramellen
und Bonbon; alkoholfreie Getränke, wie beispielsweise Cola, Fruchtsäfte, Kaffee,
Tee und Getränke auf Milchsäurebasis, alkoholische Getränke; ferner Zahnputzmittel,
Mundwässer und Arzneimittel, die dem gleichen Zweck dienen.
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Da das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel mit Nahrungsmittelbestandteilen
oder Nahrungsmittelzusätzen, die andere Geschmacksrichtungen, wie Säure, Salzigkeit,
Adstringenz, Bitterkeit und allgemeine Schmackhaftigkeit betreffen, verträglich
ist und mit ihnen gut und zweckmäßig harmonisiert, so daß Geschmack und Qualität
der Endprodukte verbessert werden und das auch äußerst widerstandsfähig gegenüber
Säuren und Hitze ist, kann es in beliebigem Ausmaß in Nahrungsmitteln, Getränken
und
Genußmitteln auch außerhalb der oben beschriebenen Produkte
ganz allgemein verwendet werden, wobei es zufriedenstellende Ergebnisse liefert
und zu einer Verbesserung des Geschmacks der Erzeugnisse führt.
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Weiterhin kann das Süßungsmittel auch als Geschmacksverbesserer für
solche Nahrungsmittel verwendet werden, die an Haustiere verfüttert werden, wie
beispielsweise Rindvieh, Pferde, Geflügel, Fische, Bienen, Seidenraupen und andere.
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Das Süßungsmittel kann auch zum Süßen verschiedener Tabakwaren, Genußmittel,
Kosmetika und Arzneimittel verschiedener Form (Feststoffe, Pasten, Flüssigkeiten)
verwendet werden, wie beispielsweise für Lippensalbe, Lippenstifte, Zahnputzmittel,
Munderfrischungsmittel, Mundwässer, Atemreinigungstabletten, Pastillen, Zuckerbeschichtungstropfen
von Lebertran oder einzunehmende Medizin.
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Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel kann auch in beliebiger
Weise als Geschmacksverbesserungsmittel verwendet werden.
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Zur Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittels in
den obenbeschriebenen Nahrungsmitteln, Getränken, Zuckerwaren, Futtermitteln, Kosmetika
oder Zahnputz- und Arzneimitteln kann jede beliebige bekannte Methode angewandt
werden, beispielsweise Einmischen, Einkneten, Lösen, Eintauchen, Durchdringenlassen,
Dispergieren, Beschichten, Besprühen, Tränken usw.
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Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel wird nun im folgenden
anhand von Versuchen näher beschrieben, Versuch 1: Herstellung des Süßungsmittels
1-(1) Herstellung von α-Glucosyltransferase 10 Liter eines sterilisierten
Kulturmediums mit einem Gehalt von 2% ( Gewicht/Volumen) löslicher Stärke, 1 % (Gewicht/Volumen)
AmmonJ-; nitrat, 0,1% (Gewicht/Volumen) Dikaliumhydrogenphosht, 0 ,o5% (Gewicht/Volumen)
Magnesiumsulfat . 7H20, o,5% (Gewicht/Volumen) Maiseinweichflüssigkeit und 1% (Gewicht/Volumen)
Calciumcarbonat wurden mit einem Stamm von Bacillus Stearothermophilus FERM-P Nr.2222
beimpft und das Gemisch bei 50°C drei Tage lang unter Belüften und Rühren bebrütet.
Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit
wurde mit Ammoniumsulfat sättigung o,7) ausgesalzt, wodurch ein rohes Enzympräparat
mit einer Aktivitt von etwa 80 ooo Einheiten erhalten wurde. Die enzymatische Aktivität
wurde wie folgt festgestellt. Ein Gemisch, das durch Zugabe von o,2 ml einer Enzymlösung
zu 5 ml einer Lösung mit einem Gehalt von o,3 g/dl löslicher Stärke, o,o2 Mol/l
Acetatpuffer vom pH 5,5 und 10-3 3 Mol/l Calciumchlorid hergestellt war, wurde lo
min bei 40 C reagieren gelassen. Ein aliquoter Teil von o,5 ml des Umsetzungsgemisches
wurde entnommen, in 15 ml o,o2n Schwefelsäure gegossen, um die Umsetzung zu beendigen
und nach Zusatz von o,2 ml 0,1n Jod/Jod/Kali-Lösung bei 660 nm auf die optische
Dichte untersucht. Als Aktivitätseinheit wurde die Enzymmenge bestimmt, die bei
40°C innerhalb 10 min das Verschwinden eines Jodflecks in 15 mg löslicher Stärke
bewirkte.
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1-(2)Umsetzung 200 g Steviazucker der Morita Kagaku Kogyo Co " Ltd.
Osaka, Japan, bestehend aus annähernd gleichen Mengen an gereinigtem Steviosid und
Lactose, im folgenden als handelsübliches Steviosid bezeichnet, und 1000 g Maltodextrin
vom Dextroseäquivalent 30 wurden unter Erhitzen in 3000 ml Wasser gelöst. Nach Abkühlen
aquf 60°C wurde Einheiten die Lösung mit looo roher Cyclodextrin-Glucanotransferase,
die in Versuch 1-(1) erhalten worden war, versetzt, der pH-Wert auf 6,o eingestellt
und das Ganze 40 h bei 60°C bebrütet. Nachdem die Umsetzungslösung 10 min bei 950C
gehalten wurde, um das Enzym durch Warme zu inaktivieren ( die Herstellung entspricht
Probe 3 in der folgenden Tabelle I ), wurde das durch Filtrieren erhaltene Filtrat
mit einer geringen 25enge Aktivkohle entfärbt und anschließend durch Hindurchleiten
durch Ionenaustauscherharze Amberlite IR-200C ( H-Typ) und Amberlite IRA-93 (OH-Typ)
von Rohm und Haas Co., Philadelphia USA bei SV 2 entsalzt. Anschließend wurde die
Lösung bei 70° C oder darunter unter vermindertem Druck eingedampft und zu einem
Pulver getrocknet. ( die Herstellung entspricht Probe Nr. 4 in Tabelle I). Vergleichsproben
wurde' nach analogen Verfahren nach der Auflösung durch Erwärmen erhalten, wie beispielsweise
durch Umsetzung und Inaktivierung durch Erwärmen, wobei die Ausgangsmaterialien
dèVretUleichsverfahren in der folgenden Tabelle I zusammengestellt sind.
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Tabelle I 1 2 3 4 Probe Vergleich Vergleich gemäß Erfindung gemäß
Erfindung 200 g handelsübliche 200 g handelsübliches 200 g handelsübliche 200 g
handelsübliches Steviosid Steviosid Steviosid Steviosid Aus- + + + gangsmaterial
1 000 g 1 000 g 1 000 g Maltodextrin Maltodextrin Maltodextrin + + + 1 000 Eiheiten
1 000 Eiheiten 1 000 Eiheiten Enzyme, voraktiviert Enzyme Enzyme durch Erhitzen
hergestellt wie hergestellt wie rohes, flüssiges pulverförmiges Probe 3 Probe 3
Süßungsmittel, Süßungsmittel, Bemer- durch Erhitzen hergestellt durch kungen hergestellt
Reinigen und Trocknen von Probe 3
Versuch 2; Geschmacksteste 2-(1)
Vergleich der Süße Die Konzentration jeder Geschmackstestlösung wurde je nach dem
Ergebnis von Vorversuchen zur Angleichung der Süße eingestellt.
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Im Einzelnen wurde die Konzentration der Vergleichs proben auf eine
Konzentration an handelsüblichem Steviosid von o,13%( Gewicht/Volumen ) und die
Konzentration für das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel so eingestellt,;
daß sie einer Konzentration von o,2o% (Gewicht/ Volumen)- an handelsüblichem Steviosid
entsprach, einer Die glieder Jury gaben die Ergebnisse ihrer Geschmacksuntersuchung
auf Süßigkeit in bezug auf eine Lösung aus granulierter Saccharose von bestimmter
Konzentration ab, indem sie angaben, ob sie die Versuchslösung süßer, weniger süß
oder genauso süß wie die Saccharoselösung gefunden hatten. Die Versuche wurden mit
einer Jury aus 20 Mitgliedern bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Ergebnisse sind
in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt.
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Tabelle II
| Probe 1 2 3 4 |
| Vergleich der Vergleich Vergleich erfindungsgemäß erfindungsgemäß |
| Süße (Süßkraft) süßergleich weni- |
| Saccharose süß ger s, g.s. w.s. s. g.s w.s. s. g.s. w.s. |
| % (Gew./ Gew.) süß |
| 6 13 5 2 15 3 2 / / / / / / |
| 7 10 2 8 8 5 7 / / / 20 0 0 |
| 8 4 4 12 3 3 14 16 2 2 15 4 1 |
| 9 1 3 16 1 2 17 10 5 5 8 6 6 |
| 10 0 2 18 0 1 19 7 4 9 0 6 14 |
| 11 / / / / / / 2 3 15 0 6 14 |
| 12 / / / / / / 0 2 18 0 2 18 |
Bem.: Die Zahlen bedeutend die Anzahl der Voten.
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Wie die Ergebnisse der Tabelle II zeigen, war das Votenverhältnis
bei Probe 1 von "süßer" zu 11weniger süß" in bezug auf die damit Verglichene 6-
und 7%ige Saccharoselösung 13:2 bzw. 10:8, während in bezug auf die 8- und 9%ige
Saccharoselösung das Verhältnis 4;12 bzw, 1;16 betrug. Aufgrund des ausgeglichenen
Verhältnisses wurde festgesetzt, daß Probe 1 und die 7%ige Saccharoselösung annähernd
gleich in ihrer Süße waren.
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Analog erwies sich auch Probe 2 mit der 7%igen Saccharoselösung als
annähernd gleich süß. Somit wurde die Süßkraft von Probe 1 als derjenigen einer
7%igen Saccharoselösung entsprechend angesehen, Analog wurde die Süßkraft von Probe
3 als derjenigen einer obigen Saccharoselösung und die Süßkraft von Probe 4 als
derjenigen einer 9%igen Saccharoselösung entsprechend angesehen.
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Demzufolge wurden zwischen der Süßkraft der Proben 1 und 2, bezogen
auf die Menge an handelsüblichem Steviosid, die in beiden Proben, bezogen auf trockene
Feststoffsubstanz, verwendet wurde, keine Unterschiede festgestellt, und die Süßkraft
wurde als das den 53-fache der Süßkraft von Saccharose errechnet. Bei Proben 3 und
4 errechnete sich die Süßkraft als das 50- bzw. 45-fache derjenigen von Saccharose,
d,h. ihre Süßkraft war annähernd gleich derjenigen bzw. geringfügig niedriger als
diejenige der Proben 1 und 2.
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Mit anderen Worten liegt die Süßkraft der erfindungsgemäß hergestellten
Süßungsmittel annähernd auf dem gleichen Wert oder ist nur geringfügig niedriger
als diejenige von Steviosid in der als Material verwendeten Menge
2-(2)
Vergleichsversuche zür Qualität der Süße Es wurden mit den Vergleichsproben 1 und
2 und den Proben 3 und 4 ungs der erfindungsgemäß hergestellin Süßmittel Untersuchungen
über die Qualität ihrer Süße durchgeführt.
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Dazu wurden wässrige Lösungen der obigen Proben so hergestellt, daß
eine Süße bzw, Süßkraft erhalten wurde, die derjenigen einer 5%igen, 10%igen bzw.
15%igen wässrigen Saccharoselösung entsprach; hierzu wurden Berechnungen auf der
Grundlage der Ergebnisse von Versuch 2-(1) durchgeführt, Die Jury aus den 20 Mitgliedern
wurde dahingehend angewiesen, daß sie bei Raumtemperatur unter den wässrigen Versuchs
lösungen der Proben 1 bis 4 die entsprechenden Proben heraussuchen sollte, die die
am meisten und am wenigsten wünschenswerte Süße aufweisen. Die Ergebnisse sind in
der folgenden Tabelle III zusammengefaßt
Tabelle III
| Probe 1 2 3 4 |
| Vergleich Vergleich erfindungsgemäß erfindungsgemäß |
| Qualität der |
| am am am am am am am am |
| Süße meisten wenig- meisten wenig- meisten wenig- meisten wenig- |
| Süße, ent- sten sten sten sten |
| sprechend wünschenswert wünschenswert wünschenswert wünschenswert |
| 5 % Saccha- |
| roselösung 0 10 0 10 4 0 16 0 |
| 10% Saccha- |
| roselösung 0 8 0 12 6 0 14 0 |
| 15% Saccha- |
| roselösung 0 11 0 9 7 0 33 0 |
Bem.: Die Zahlen bedeuten die Anzahl der Voten
Wie sich aus den
Ergebnissen von Tabelle III ergibt, wurde die Qualität der Süße der Vergleichsproben
1 und 2 auf jeder Süßkraftstufe als am schlechtesten eingruppiert, so daß zwischen
den Proben 1 und 2 keine Unterschiede festgestellt wurden,während die Qualität der
Süße der Proben 3 und 4 auf jeder Süßkraftstufe über -legen war. Insbesondere das
weitergereinigte Süßungsmittel gemäß Probe 4 erwies sich hinsichtlich der Qualität
seiner Süße als der Probe 3 leicht überlegen, Die Voten der Jurym.itglieder in bezug
auf die Qualität der Süße sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt,
Tabelle
IV Probe 1 2 3 4 Süße, ent- Vergleich Vergleich erfindungsgemäß erfindungssprechend
gemäß süß, bitter, ad- süß, bitter, ad- süß, leicht, weich, süß, weich, rund, stringierend,
kein stringierend, kein rund, angenehm, angenehm, ähnlich 5 % Saccharose- länger
anhaltender länger anhaltender ähnlich Saccharose Saccharose, kein lösung Nachgeschmack,
Nachgeschmack, kein länger anhal- länger anhaltenschlecht unver- schlecht unver-
tender Nachgeschmack, der Nachgeschmack, ändert zu verwen- ändert zu verwen- mit
Vorteil unver- mit Vorteil unverden den änedrt verwendbar änedrt verwendbar süß,
scharf , sti- süß, scharf, sti- süß, weich, rund, ange- süß, weich, rund, mulierend,
stark mulierend, stark nehm, ähnlich Saccha- angenehm, ähnlich 10% Saccharose- bitter,
adstrin- bitter, adstrin- rose, kein länger an- Saccharose, kein lösung gierend,
kein gierend, kein haltender Nachgeschm., länger anhaltenlänger anhalten- länger
anhalten- mit Vorteil unverändert der Nachgeschmack, der Nachgeschmack, der Nachgeschmack,
verwendbar mit vorteil verwendschlecht unver- schlecht unver- verändert verwendändert
zu ver- ändert zu ver- bar wenden, wenden süß, scharf , sti- süß, scharf, sti- süß,
weich, rund, ange- süß, weich, rund, mulierend, bitter, mulierend, bitter, nehm,
ähnlich Saccha- angenehm, ähnlich 15% Saccharose- adstringierend, adstringierend,
rose, kein länger an- Saccharose, kein lösung kein länge an- kein länger an- haltender
Nachge- länger anhaltenhaltender Nachge- haltender Nachge- schmack, mit Vorteil
der Nachgeschmack, schmack, schlecht schmack, schlecht unverändert verwend- mit
Vorteil ununverändert zu unverändert zu bar verändert verwendverwenden verwenden
bar
Wie die obigen Ergebnisse zeigen, besitzt das erfindungsgemäß
hergestellte Süßungsmittel im Gegensatz zu dem herkömmlichen Steviosid oder einem
Gemisch aus Steviosid und anderen Süßungsmitteln eine milde, weiche, runde und angenehme
Sße, die derjenigen von Saccharose sehr stark ähnelt, ohne daß ein unerwünschter,
länger anhaltender Nachgeschmack auftritt, so daß die erfindungsgemäß hergestellten
Süßungsmittel ausgezeichnet sind und unmittelbar im Mund eine angenehme und erfreuliche
Süße ergeben Versuch 31 Löslichkeitsvergleich Anteile der Proben 2 und 3, die in
Versuch 1-(2) hergestellt worden waren, wurden in Reagenzgläser überführt und 15
Tage in einem bei 40C gehaltenen Raum stehengelassen. Danach wurden sie auf ihre
Wasserlöslichkeit hin verglichen. Wie sich aus Fig. 1 ergibt, in der die Ergebnisse
dargestellt sind, fand bei Probe 2 eine Kristallisation statt d.h. sie wurde weiß
und trübe während Probe 3 mit dem erfindungsgemäß hergestellten Produkt durchsichtig
blieb und eine stark verbesserte Wasserlöslichkeit aufwies Probe 4, die durch Reinigen,
Eindicken und Trocknen von Probe 3 erhalten worden war, war eine sog. feste Lösungs,
in der die Bestandteile, wie o&-Glycosylsteviosid, Steviosid und α-Glucosylzuckerverbindungen
voneinander gegenseitig gelöst wurden,wobei die Löslichkeit so groß war, daß die
Probe sich unmittelbar in Wasser löste und selbst mit hohen Konzentrationen ungehindert
zu einer Paste löst,
Versuch 4; Identifizierung der o-Glycosylstevioside
5 g der in Versuch im(2.) erhaltenen Probe 4 wurden einem Lösungsmittelsystem aus
200 ml mit Wasser gesättigtem n-Butanol und 200 ml Wasser in einem Scheidetrichter
zugesetzt, worauf die o-Glucosylzuckerverbindungen und Glycoside in Probe 4 extrahiert
und mit dem Lösungsmittelsystem aufgeteilt und die n-Butanol-Phase wurde gesammelt.
Nach Trocknen des erhaltenden Faststoffs unter vermindertem Druck zur Entfernung
des n-Butanols wurde das getrocknete Produkt in einer geringen Menge Methanol gelöst,
wonach überschüssiger äthyläther zugesetzt und der gebildete Nieder-und schlag gesammelt
unter vermindertem Druck getrocknet und Pulver siert wurde. Es wurden 500 mg eines
pulverförmigen Produktes (Probe 5) erhalten. Probe 5 löste sich sehr leicht in Wasser
und war eine farblose, weißgefärbte und neutrale Substanz, die eine milde, weiche,
runde und angenehme Sße aufwies. Sie löste sich auch teilweise in niedrigmolekularen
Alkoholen, wie Methanol, äthanol und n-Butanol, war jedoch nur schlecht in Chloroform
und Äthyläther löslich. Das Infrarotspektrum der Probe 5 in KBr ist in der Fig,
2 dargestellt.Das W-Spektrum zeigte keine charakteristische Absorption, Eine wässrige
Lösung, die durch Lösen eines Teiles der Probe 5 in einer geringen Menge Wasser
hergestellt worden war, eine wässrige Lösung von Probe 1, die in gleicher Weise
wie Probe 5 gereinigt worden war, sowie eine Lösung von D-Glucose als Vergleichsubstanz
wurden auf eine mit Silicagel 60 ( Merck & Co,, Inc,, New Jersey, USA) beschichtete
Dünnschichtplatte aufgebracht, und es wurde
eine eindimensionale
Entwicklung in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform, Methanol und Wasser (30:20:4)
durchgeführt, Danach wurde die Dünnschichtplatte hinreichend an Luft getrocknet.
Danach wurde sie mit einer o,1 m Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,8, in der handelsübliche
kristalline Glucoamylase gelöst war, besprüht und 2 h bei 5o0C stehengelassen, wobei
darauf geachtet wurde, daß ein Trocknen verhindert wurde, Danach wurde die Platte
hinreichend an Luft getrocknet, und es wurde mit demselben Lösungsmittelsystem eine
zweidimensionale Entwicklung der Platte durchgeführt. Nach dem Trocknen wurde die
Platte mit einer methanolischen Lösung, die 50% Schwefelsäure enthielt besprüht,
erwärmt und entwickelt. Das Chromatogramm ist in Fig. 3 dargestellt. Wie aus Fig.
3 hervorgeht, wurden bei der Vergleichsprobe 1 aufgrund der eindimensionalen Entwicklung
zusätzlich zu dem Steviosidfleck mit dem Rf-Wert 1 ,ovo kleine Flecken von Rebaudiosid
A vom Rf-Wert o,88 und Rebaudiosid B yom Rf-Wert 1,17 gefunden, Demgegenüber zeigt
das Chromatogramm der Probe 5, daß außer den Flecken von Steviosid und den Rebaudiosiden
sechs neue Flecken von Substanzen auftreten, die in abnehmender Reihenfolge ihrer
Rf-Werte l,o9, o,8o, 0,67, 0,62, o,51 und o48 mit a, b, c, d, e bzw. f bezeichnet
wurden.
-
Das Ergebnis der zweidimensionalen Entwicklung, das erzielt wurde,
nachdem Glucoamylase auf Probe 5 einwirken gelassen wurde, ergab, daß Flecken von
Rebaudiosid B ( Rf 1,17) und von D-Glucose (Rf o,45) von Substanz a stammten; Flecken
von Steviosid (Rf 1,oo) und D-Glucose (Rf o,45) von Substanz b; Flecken von Substanzb
Steviosid (Rf l,oo) und D-Glucose (Rf o,45) von Substanz d und
Flecken
Von Substanz b, Steviosid (Rf 1,00) und D-Glucose (Rf o,45) von Substanz f. Analog
stammten Flecken von Rebaudlosid A (Rf o,88) und D-Glucose (Rf o,45) von Substanz
c und Flecken von Rebaudiosid A (Rf o,88) und D-Glucose (Rf of45) von Substanz e.
-
Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß die Substanzen a bis
f durch die Einwirkung von Glucoamylase in D-Glucosederivate von Steviosid bzw.
Rebaudiosid und schließlich zu D-Glucose und Steviosid bzw, D-Glucose und Rebaudiosid
zersetzt wurden. Daher wurde geschlossen, daß Substanz a ein Produkt war, in dem
D-Glucose durch eine -Verknüpfung an Rebaudiosid B gebunden ist, und daß b, d und
f Subtanzen sind, in denen ein Mol Steviosid ebenfalls mit einer -Verknüpfung an
ein oder mehrere Mole D-Glucose gebunden sind. Illit anderen Worten die Flecken
wurden als solche von a -Monoglucosylsteviosid, & -Diglucosylsteviosid bzw.α-Triglucosylsteviosid
ermittelt4 Analog ergab sich, daß c und e α-Monoglucosylrebaudiosid A bzw.
ot-Diglucosylrebaudiosid A sind.
-
Die Substanzen a bis f zersetzten sich auch zu Steviosid und D-Glucose
bzw. Rebaudiosid und D-Glucose, wenn eine teilweise gereinigte α-Glucosidase,
die aus Schweineleber extrahiert worden war, in analoger Weise auf sie einwirken
gelassen wurde. Die Substanz f erwies sich als durch die Einwirkung von handelsüblicher
kristalliner ß-Amylase leicht zu Substanz b und Maltose zersetzbar.
-
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die durch die Einwirkung von
α-Glucosyltransferase neu gebildeten Substanzen solche sind, in
denen
1 Mol Steviosid durchot<Verknüpfung mit einem oder mehreren Molen D-Glucose bzwq
ein Mpl Rebaudiosid durch d-Verknüpfung mit einem oder mehreren Molen D-Glucose
verknüpft sind. Dies legt die Vermutung nahe, daß diese Substanzen auch im Menschen
oder im Tier in vivo in Steviosid oder Rebaudiosid zersetzbar sind.
-
Eine in gleicher Weise wie Probe 5 hergestellte Probe wurde an Silicagel
in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform, Methanol und Wasser ( 60:30:5) zur
Isolierung der Substanz b der Säulenchromatographie unterzogen, wonach die isolierte
Substanz zu einem Pulver getrocknet wurde. Sie war ein äußerst leicht wasserlösliches,
geruchloses und weißgefärbtes Süßungsmittel mit einer milden, weichen, jedoch intensiven
Süße und einem pH-Wert um den Neutralpunkt.
-
Sie war außerdem teilweise löslich in niedrigmolekularen Alkoholen,
wie Methanol Äthanol und n-Butanol, jedoch schwer löslich in Chloroform und Äthyläther.
Das Infrarot-Spektrum der Substanz b in KBr ist in Fig. 4 dargestellt.
-
Da Probe 5 als eine erfindungsgemäß hergestellte Substanz eine aus
gezeichnete Süße besitzt und frei von einem länger anhaltenden Nachgeschmack sowie
äußerst leicht wasserlöslich ist, ähnlich wie die Proben 3 und 4 gemäß Versuch 2-(2),
kann also die Aufgabe der Erfindung, die darin besteht, die Nachteile von Steviosid
zu beeine seitigen, dadurch gelöst werden, daß man ot-Glucosyloransferase 'auf eine
wässrige Lösung mit einem Gehalt an Steviosid und einer
Glucosylzuckerverbindung
unter Bildung von α-Glycosylsteviosid einwirken l8ßt, Die Erfindung wird im
folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.
-
Beispiel 1 Fünf Liter eines sterilisierten Kulturmediums mit einem
Gehalt von 4% ( Gewicht/Volumen) Maltose, o,1% (Gewicht/Volumen) Kaliumdihydrogenphosphat,
0,1 % (Gewicht/Volumen) Ammoniumnitrat, o,o58 (Gewicht/Volumen) Magnesiumsulfat.
7 H23O, 0,05% (Gewicht/Volumen) Kaliumchlorid, o,2% (Gewicht/Volumen) Polypepton
und 18 (Gewicht/Volumen) Calciumcarbonat, das getrennt durch trockenes Erhitzen
sterilisiert und aseptisch zu dem beimpften Medium zugegeben worden war, wurde mit
einem Stamm von Mucor javanicus IFO 4570 beimpft und 44 h bei 30°C unter Belüften
und Rühren bebrütet. 480 g des feuchten Mycels, das aus der Kulturlösung erhalten
worden war, wurden zu 5 1 o,5 m Acetatpufferlösung vom pH 5,3 in 4 m Harnstoff lösung
hinzugegeben.
-
Das erhaltene Gemisch wurde 40 h bei 30°C stehengelassen. Die überstehende
Flüssigkeit des Gemisches wurde über Nacht gegen laufendes Leitungswasser dialysiert,
mit Ammoniumsulfat auf 0,9 gesättigt ( saturated to o,9 ammonium sulfate ) und über
Nacht bei 40 C stehengelassen Danach wurden die ausgefällten Bestandteile durch
Zentrifugieren gesammelt. Nach Suspendieren der Ausfällung in 100 ml Acetatpuffer
vom pH 6,o wurde das Gemisch zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit als
α-Glucosidase (E.C.3.2.1.20) verwendet.
-
15 g handelsübltches Steviosid und 300 flaltodextrin Vom Dextroseäquivalent
40 wurden in einem Liter heißem Wasser gelöst und das Gemisch auf 50°C gekühlt,
mit der oben beschriebenen α-Glucosidaselösung versetzt und 24 h bei 50°C
und bei einem pH-Wert von 6,0 stehengelassenw Die Umsetzungslösung wurde erhitzt,
um das in ihr befindliche Enzym zu inaktivieren, und anschließend filtriert Das
Filtrat wurde durch Hindurchleiten durch Ionenaustauscherharze (Amberlite IR-1 2oB
(H-Typ) und Amberlite IRA-94 (OH-Typ) (Rohm & Haas C°.r Philadelphia, USA) entsalzt
und unter vermindertem Druck eingedampft, Die erhaltene Lösung war ein flüssiges
Süßungsmittel mit einem Wassergehalt von 30% ( Gewicht/Gewicht ) Die Ausbeute an
dem flüssigen Süßungsmittel betrug 97t, bezogen auf trockene Festsubstanz und eingesetztes
Material ( against material ). Das Süßungsmittel war etwa zweimal so süß wie Saccharose,
bezogen auf feste Trockensubstanz, und von einem länger anhaltenden Nachgeschmack
frei, Es konnte ohne weiteres zum Süßen verschiedener Nahrungsmittel, Getränke und
Süßwaren verwendet werden.
-
Insbesondere kann es als nur geringfügig Karies erzeugendes Süßungsmittel
Verwendet werden, weil orale Karies erzeugende Mikroorganismen es nicht in Wasser
unlösliches Glucan umwandeln.
-
Beispiel 2 Fünf Liter des in Versuch 1-(1) beschriebenen Kulturmediums
wurden mit einem Stamm von Bacillus Megaterium FERM-P Nr. 935 beimpftlund das Gemisch
wurde 3 Tage unter Belüften und Rühren bebrütet. Nach Beendigung des Bebrütens wurde
die erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert
und die überstehende Flüssigkeit
mit Ammoniumsulfat (Sättigung o,7) ausgesalzt und anschließend zentrifugiert wodurch
ein Niederschlag erhalten wurde, Der Niederschlag enthielt 300 ooo Einheiten Cyclodextringlucanotransferase
(E.C.2.4.1.19), bestimmt nach der in Versuch 1-(1)beschriebenen Methode. Eine 30%
(Gewicht/Gewicht) Süßkartoffelstärke-Aufschlämmung vom pH 6,o wurde mit ot2%, bezogen
auf das Stärketrockengewicht, an einem handelsüblichen verflüssigenden Enzym versetzt,
und das Gemisch wurde kontinuierlich bei 85 bis 950C verflüssigt.
-
Die iersetzung des Gemisches wurde bei 8o0C bis zu einem Dextroseäquivalent
von 20 durchgeführt, und s verflüssigende Enzym wurde durch Erhitzen inakitivert.
Danach wurde handelsübliches Steviosid in der verflüssigten Stärke gelöst, so daß
man ein Gemisch aus einem Teil handelsüblichem Steviosid und drei Teilen partiellen
Strkehydrolysats, bezogen auf trockene Festsubstanz, erhielt.
-
Das Gemisch wurde auf 50°C gekühlt, mit lo Einheiten Cyclodextringlucanotransferase
je Gramm Stärke versetzt und bei 50°C und einem pH-Wert von 6,o 48 h lang bebrütet.
Nach Inaktivieren des Enzyms in dem Umsetzungsgemisch durch Erhitzen wurde das erhaltene
Produkt analog, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, unter vermindertem Druck
eingedampft, getrocknet und pulverisiert, wobei man ein pulverförmiges Süßungsmittel
in einer Ausbeute von etwa 95%, bezogen auf trockene Festsubstanze erhielt Da das
Süßungsmittel nur schwach hygroskopisch war, ließ es sich leicht handhaben Seine
Wasserlöslichkeit war jedoch sehr hoch, und es löste sich leicht in kaltem Wasser
und selbst in hoher Konzentration leicht zu einer Paste.
-
Das SAßungsmittel war etwa 15mal so süß wie Saccharose, bezogen auf
trockene Festsubstanz, und es besaß eine milde, weiche, runde und angenehme Süße,
die frei Von einem länger anhaltenden Nachgeschmack war. Das Süßungsmittel kann
überall da verwendet werden, wo ein Süßen erforderlich ist, insbesondere eignet
es sich jedoch als Süßungsmittel mit geringer Neigung zur Karies-verursachung sowia
als nährstoffarmes Süßungsmittel.
-
Beispiel 3 3co g Kartoffelstärke und loo g nandelsUbliches Steviosid
wurden zu einem Liter Wasser hinzugegeben, und das Gemisch wurde anschließend mit
handelsüblicher bakterieller verzuckernde, ot-Amylase (E.C.3.2.1.1) in einer Menge
von lo Einheiten, bestimmt nach der in Versuch 1-(1) beschriebenen Methode, je Gramm
Stärke versetzt und unter Rühren auf 8o0C erhitzt. Nach Beendtung der Stärkeverflüssigung
wurde das Gemisch auf 6o0C gekühlt und zwei Tage stehengelassen. Nach dem Inaktivieren
der in dem erhaltenen Gemisch vorhandenen 9-Amylase durch Erhitzen wurde das Gemisch
in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, unter vermindertem
Druck eingedampft, getrocknet und pulverisiert, wonach man ein pulverförmiges Süßungsmittel
in einer Ausbeute von etwa 95%, bezogen auf feste Trockensubstanz, erhielt.
-
Das Süßungsmittel besaß ähnliche Eigenschaften, wie das gemäß Beispiel
2 erhaltene und kann ebenfalls verschiedenen Verwendungszwecken zugeführt werden.
-
Beispiel 4 Eine 3obige (Gewlcht/Gewicht) verflüssigte Stärkelösung
vom Dextroseäquivalent 15 wurde nach demselben Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben'
hergestellt. Zu der verflüssigten Stärke wurde handelsübliches Steviosid hinzugegeben
und in ihr gelöst sowie der dritte Teil des Stärkematerials an Saccharose sowie
anschließend zwei Einheiten Cyclodextringlucanotransferase (E.C.2.4.1.19) je Gramm
Stärke, bezogen auf feste Trockensubstanz, wonach das Gemisch 24 h bei 6o0C umgesetzt
wurde. Nach Inaktivieren des Enzyms durch Erhitzen wurde das erhaltene Gemisch nach
dem in Versuch 1-(2) beschriebenen Verfahren gereinigt, eingedampft und getrocknet,
wonach ein pulverförmiges Süßungsmittel erhalten wurde. Das Süßungsmittel war ein
Gemisch mit einem Gehalt an g -Glycosylsteviosid, d -Glycosylsaccharose usw. , inaem
die einzelnen Geschmackskomponenten dieser Verbindungen gut miteinander harmonisiert
waren und eine ausgezeichnete Qualität der Süße ergaben. Das Süßungsmittel war etwa
15mal so süß wie Saccharose.
-
Es kann als Süßungsmittel für verschiedene Zwecke verwendet werden,
Insbesondere ist es, da seine Reduktionsfähigkeit gering ist, ein geeignetes Süßungsmittel
für Produkte, die Aminosäuren und Proteine enthalten, wie beispielsweise süßende
Nahrungsmittel, Getränke, Zuckerwaren und Gewürzgurken, die bei ihrer Herstellung
erhitzt werden. Da das Süßungsmittel kaum durch im Munde befindliche Karies erzeugende
Mikroorganismen in asser,unlösliches Glucan umgewandelt wird, ist es ein geeignetes
Süßungsmittel für Nahrungsmittel und Getränke mit geringer kar'ssfördernder Eigenschaft.
Beispiel
5 Es wurde die in Versuch 1-(2) beschriebene Umsetzung mit der Abweichung durchgeführt,
daß das grünlich-ockerfarbene rohe Steviosid STV-B, (Ikeda Tohka Industrie Co.,
Ltd., Fukuyama, Japan) mit einem Gehalt von nur etwa 50B Steviosid anstelle des
handelsüblichen Steviosids verwendet wurde.
-
Es wurde gefunden, daß das erhaltene Süßungsmittel eine beträchtlich
yerbesserte Qualität der Süße aufwies als das Süßungsmittel das unter Verwendung
von gereinigtem Steviosid erhalten worden war.
-
Das Süßungsmittel wurde analysiert. Dabei wurden große Mengen α-Glycosylrebaudiosid
A und α-Glycosylrebandiosid B neben α-Glycosylsteviosid gefunden.
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Das Süßungsmittel war etwa lomal so süß wie Saccharose und kann zum
Süßen verschiedener Nahrungsmittel, Getränke, Zuckerwaren und Arzneimittel verwendet
werden.
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Bei der Herstellung des süßungsmittels bietet die Entfernung der Färbung
des Ausgangsmaterials einige Schwierigkeiten, das Süßungsmittel kann jedoch mit
Vorteil in Produkten, wie Sojabohnensoße, Gewürzgurken oder eingesalzenem Gemüse
oder Nahrungsmittelkonserven, die in Sojasoße eingekocht worden sind, verwendet
werden, wobei die Färbung nicht von so großer Bedeutung ist. Ein Vorteil leWgt darin,
daß als Ausgangsraterial rohes Steviosid verwendet werden kann, das mit geringeren
Kosten und in größeren Mengen hergestellt werden kann als gereinigtes Steviosid.
-
Beispiel 6 10 Liter eines Kulturmediums mit einem Gehalt von 4% (
Gewicht/Volumen) Saccharose, o,58 (Gewicht/Volumen) Hefeextrakt, o,8% (Gewicht/Volumen)
Kaliumhydrogenphosphat, 2,4% (Gewicht/Volumen) Dikaliumhydrogenphosphat, o,o2% (Gewicht/Volumen)
Magnesiumssulfat . 7H20 und 0,5 % (Gewicht/Volumen) gereinigtem Steviosid wurden
mit 1% einer Impfkultur von Leuconostoc Mesenteroides IAM 1151 beimpft und das Gemisch
24 h bei 25°Coder stationären Züchtung unterworfen. Die erhaltene und Kulturbrühe
wurde zentrifugiert die überstehende Flüssigkeit in gleicher Weise wie die Reaktionslösung
gemäß Beispiel 1 gereinigt und eingedampft, wobei man ein flüssiges Süßungsmittel
mit einem Wassergehalt von 30% in einer Ausbeute von etwa 608 erhielt.
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Das Süßungsmittel Süßaß eine milde, weiche, runde und angenehme Süße,
die etwa 20mal so süß war wie diejenige von Saccharose und die keine Kristallisation
von Steviosid bewirkte. Da das Süßungsmittel hochviskos ist, verleiht es den Produkten,
in denen es verwendet wird, zugleich Süße und eine wünschenswerte Viskosität.
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Es eignet sich vorteilhafterweise zum Süßen von beispielsweise Fruchtsaft,
Sirup, Likör sowie von Gewürzgurken oder eingesalzenem Gemüse.
-
Das gleiche Kulturmedium, wie oben beschrieben, dem jedoch kein gereinigtes
Steviosid zugesetzt worden war, wurde mit der oben angegebenen Impfkultur beimpft
und das Gemisch in gleicher Weise beh-rAtet. Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe
werde zentrifugiert und die überstehende Lösung mit Calciumphosphatgel versetzt.
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Danach wurde das Gemisch gegen Leitungswasser dialysiert und die dialysierte
Lösung erneut zentrifugiert, um das Calciumphosphatgej zu gewinnen 100 ml der Lösung
von Dextransaccharase (E.C.2.4.1.5.), die durch Eluieren und Eindampfen einer Suspension
des Gels in einer o,2m Natriumdihydrogenphosphatlösung, die mit Ammoniumsulfat bis
zu 0,35 gesättigt war, erhalten worden war, wurden mit 5 1 einer Ldsung umgesetzt,
die 4% (Gewicht/Volumen) Saccharose und o,5 e (Gewicht/Volumen) gereinigtes Steviosid
enthielt, wobei die Umsetzung 1o h bei 3o0C und einem pH-Wert von 5,3 durchgeführt
wurde.
-
Nach Inaktivierung durch Erhitzen wurde die Umsetzungslösung in der
gleichen Weise, wie oben beschrieben, gereinigt und konzentriert, wonach man ein
flüssiges Süßungsmittel in einer Ausbeute von etwa 90% , bezogen auf trockene Feststoffe
, erhielt. Da der Gehalt an α-Glycosylsteviosid in dem Süßungsmittel durch
Isomalto dextranase (E.C.3.2.1.94) tn Isomaltose, Steviosid und 4 -Monoglucosylsteviosid
umgewandelt wurde, ergab sich, daß das Süßungsmittel ein Gemisch darstellt, in dem
ein Mol Steviosid durch α -Verknüpfung an ein oder mehrere azole D-Glucose
gebunden ist.
-
Beispiel 7 Ein flüssiges Süßungsmittel, das durch Lösen von 26g des
pulverförmigen SüBungsmittels, das gemäß Beispiel 2 erhalten worden warE in 1 kg
Malbit (Maltitsirup für Lebensmittel mit 25% Wassergehalt der Hayashibara Co., L
td., Okayama, Japan) hergestellt worden war besaß eine ausgezeichnete Qualität seiner
Maße, die gleich derjenigen von Saccharose war, während der Nährwert des Süßungsr..'ttels
etwa 1/20 dessen von Saccharose betrug.
-
Das Süßungsmittel eignet sich zur Herstellung von nàhrstoffarmen Nahrungsmitteln,
Getränken und Zuckerwaren fÜr Verbraucherr deren Nahrungsmittelaufnahme Beschränkungen
unterliegt, wie beispielsweise Fettleibige, Diabetiker und figur- bzw. gewichtsbewußte
Personen; es kann auch als solches in Form von Tafelsirup verwendet werden.
-
Da durch im Mund vorhandene, Karies erzeugende Mikroorganismen weder
säure- noch wasserunlösliches Glucan aus ihm gebildet-wird; eignet es sich zur Herstellung
von'Nahrungsmitteln und Getränken, die nur in geringem Maße die Bindung von Karies
begünstigen.
-
Beispiel 8 960 g Glucose, 20 g Saccharose und 20 g des gemäß Beispiel
3 hergestellten Süßungsmittels wurden gleichmäßig miteinander vermischt und das
Gemisch zu einem pulverförmigen Süßungsmittel pu'verisierc.
-
Seine Süße war ungefähr gleich derjenigen von Saccharose, und die
Qualität seiner Süße war ausgezeichnet. Außerdem löste sich das Süßungsmittel in
kaltem Wasser.
-
Eine gekühlte wässrige Lösung des Süßungsmittels selbst kann als wohlschmeckendes
Getränk verwendet werden. Es wird angenommen, daß die ausgezeichnete Qualität der
Süße des pulverförmigen Süßungsmittelgemisches einem synergistischen Effekt der
drei Bestandteile Glucose, Saccharose und pulverförmiges Süßungsmittel zuzuschreiben
ist.
-
Beispiel 9 Ein komplexes Süßungsmittel wurde hergestellt,. in dem
man loo g des in Versuch 1-(2) als Probe Nr. 4 erhaltenen pulverförmigen Süßungsmittels
in 20 ml Wasser ldste und ihm gleichmäßig 1 kg Honig zumischte; Das Süßungsmittel
war etwa 2mal so süß wie Saccharose, und die Qualität seiner Süße war ausgezeichnet.
Außerdem verstärkte die Anwesenheit der Probe 4 das aroma des Honigs. Das Süßungsmittel
kann in beliebiger Weise für Schönheitsgetränke, Gesundhritsdlät und dergleichen
sowie als Geschmacksverbesserer für herbe Arzneimittel verwendet werden
L
e e r s e i t e