DE2818649A1

DE2818649A1 - Verfahren zur trennung von peptiden

Info

Publication number: DE2818649A1
Application number: DE19782818649
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Ikushige; Susumu Matsushita
Original assignee: Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1977-04-28
Filing date: 1978-04-27
Publication date: 1978-11-02
Also published as: CA1084046A; JPS53135903A; US4181649A; JPS5721265B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung von Peptiden mit unterschiedlichen Eigenschaften.

Die Trennung von Peptiden mit bestimmten Eigenschaften durch das Verfahren der Gegenstromverteilung, durch Elektrophorese und durch chromatographische Verfahren ist bekannt.

Diese bekannten Verfahren haben verschiedene Nachteile, und ein zufriedenstellendes Verfahren zur Trennung von Peptiden wurde noch nicht erreicht.

Beim Verfahren der Gegenstromverteilung muß eine große Menge eines Lösungsmittels eingesetzt werden, weil die Peptide unter Ausnützung der unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten gegenüber den Lösungsmitteln auf zwei Arten von nicht mischbaren Lösungsmitteln verteilt werden. Eine automatische Vorrichtung, die für das Verfahren verwendet wird, ist bekannt, jedoch wird für die

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- 3 Trennung eine lange Arbeitszeit benötigt.

Beim Verfahren der Trennung mittels Elektrophorese werden Peptide unter Ausnützung von Unterschieden im Ladungszustand - der Peptidmolekiile getrennt. Die Arbeitsweise ist nicht einfach und benötigt Erfahrung. Eine vollständige Trennung läßt sich nicht erreichen, und die Trennung hat eine niedrige Reproduzierbarkeit.

Von den chromatographischen Verfahren sind das Verfahren der Ionenaustausch-Chromatographie, bei dem die Ionenaustausch funktion der Peptide angewendet wird, und das Verfahren der GeIfiltrationschromatographie, bei dem Unterschiede in der Molekülgröße der Peptide ausgenützt werden, praktisch angewendet worden.

Im Fall der Trennung von Peptiden durch das Verfahren der Ionenaustausch-Chromatographie ist jedoch das Ionenaustauschverhalten ^der Peptide sehr unterschiedlich, je nach Art und Kombination der Aminosäurebestandteile in den Peptiden. Die Aufstellung der Bedingungen für die Trennung der Peptide ist daher im Vergleich mit der Trennung von Aminosäuren kompliziert. Die Festsetzung der optimalen Bedingungen ist schwierig.

Andererseits wird beim Verfahren der GeIfiltrationschromatographie, durch das Peptide in Abhängigkeit von ihrer Molekülgröße getrennt werden, ein Gel eingesetzt, das eine zur Aufnahme der Peptide geeignete. Porengröße hat. Es ist daher im Vergleich mit dem Verfahren der lonenaustausch-Chromatographie einfacher, die Bedingungen für die Trennung der Peptide festzulegen.

Das im Handel erhältliche Gel, das für das Verfahren der GeIfiltrations-Chromatographie eingesetzt wird, hat

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jncirieh unter hohem Druck im Vergleich mit dem für das Verfahren der Ionenaustausch-Chromatographie eingesetzten Gel eine niedrige Festigkeit.

Außerdem ist für die Trennung der Peptide eine lange Zeit erforderlich, so wird berichtet, daß es 2 h bis 5,5 h dauert, um bei der Trennung von Aminosäuren, Dipeptiden und Tripeptiden mit Sephadex G-15 (im Handel erhältlichem Dextrangel) alle Bestandteile zu eluieren (beschrieben in Journal of Chromatography 4_8, 544 (197O)). Des weiteren ist die Trennbarkeit, die sich durch das Verfahren erzielen läßt, nicht zufriedenstellend. Daher wird das Verfahren der GeIfiltrations-Chromatographie nicht so oft angewendet wie das der Ionenaustausch-Chromatographie.

Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Trennung von Peptiden und anderen Bestandteilen einer Peptidlösung, das in einer einfachen und schnellen Arbeitsweise auch unter hohem Druck durchgeführt werden kann, gut reproduzierbar ist und eine zufriedenstellende Trennwirkung hat.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Trennung von Peptiden, bei dem man eine Lösung von Peptiden und ein Elutionsmittel durch eine ein Gel enthaltende Säule laufen läßt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gel ein vernetztes Stärkegel vom harten Typ einsetzt, wodurch Peptide und/oder andere Bestandteile nichtfraktioniert oder fraktioniert getrennt werden.

Die bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachstehend näher beschrieben. Peptide sind organische Verbindungen, in denen zwei oder mehr Aminosäurebestandteile durch Peptidbindungen verbunden sind.

Peptide werden abhängig von der Zahl der Aminosäureein-

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heiten in Oligopeptide, Polypeptide und Makropeptide eingeteilt. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können Peptide mit zwei bis etwa 100 Aminosäureeinheiten getrennt werden. Man erhält die Lösung der Peptide durch einen teilweisen Abbau von natürlichem Protein oder durch einen Reaktionsschritt einer Peptidsynthese.

Der erstgenannte Fall ist wichtig für eine Analyse der Aminosäuren von Peptiden, die zur Ermittlung der Struktur von natürlichem Protein durch Trennung bestimmter Peptidbindungen in einem Protein und Trennung der Peptide in einer Reihe von Schritten erhalten worden sind. Das Verfahren zur Trennung von Peptiden ist technologisch sehr wichtig.

Was den letztgenannten Fall betrifft, so sind verschiedene Peptidsynthesen entwickelt worden. Die Grundreaktion besteht darin, daß man durch Verbindung der Carboxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe einer anderen Aminosäure unter Kondensation nach der nachstehend angegebenen Reaktionsgleichung (1) eine Peptidbindung bildet:

? 2

R¹NHCHCOOH+ NH₂CIICOOR"

R₁ R₂ » R'NHCHCONHCHCOOR" (1)

In der Reaktionsgleichung (1) bedeuten R¹ eine Schutzgruppe für die Aminogruppe und R" eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe, während R und R₂ Seitenketten der jeweiligen Aminosäure darstellen.

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Die Schutzgruppen haben die Funktion, vor einer Nebenreaktion zu schützen und die Polarität der Aminosäure zu verringern, was zu einer besseren Löslichkeit in einem organischen Lösungsmittel führt.

Nach Synthese eines Peptids mit Schutzgruppen können die Schutzgruppen nach geeigneten Verfahren abgetrennt werden, um das Dipeptid in freier Form zu erhalten.

Es ist auch möglich, nur die Schutzgruppe für die Aminogruppe selektiv abzutrennen und das Produkt mit einer anderen Aminosäure, die eine Schutzgruppe für die Aminogruppe hat, zu verbinden, um das Tripeptid zu erhalten, das eine Schutzgruppe für die Aminogruppe hat. Auf diese Weise kann die Peptidsynthese wiederholt werden, um größere Peptide zu erhalten.

Von den Peptiden sind Dipeptide als Zwischenprodukte für die Synthese verschiedener Polypeptide geeignet. Auch die Dipeptide selbst sind wichtig, z.B. sind niedere Ester des cJb-L-Aspartyl-L-phenylalanins, wie etwa ot-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, wichtig als Süßstoffe, die süßer als Saccharose sind.

Die Peptide haben je nach Art der Aminosäurebestandteile und nach der Anzahl der Aminosäureexnheiten in den Peptiden verschiedene Eigenschaften. Die Peptide haben besondere Eigenschaften, z.B. verschiedene Löslichkeiten. So sind sie z.B. in einem organischen Lösungsmittel löslich oder in einer verdünnten' Salzlösung löslich, jedoch in Wasser unlöslich, oder in Wasser oder reinem Äthanol unlöslich, jedoch in 50 %igem Äthanol löslich. Die besonderen Eigenschaften der Peptide sind im Vergleich mit den Eigenschaften der Aminosäuren in komplizierter Weise ausgebildet.

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Das vernetzte Stärkegel vom harten Typ soll im Hinblick auf die Trennwirkung, die für die Analyse benötigte Zeit und die Behandlungsgeschwindigkeit der Probe die nachstehend angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften haben.

Das vernetzte Stärkegel vom harten Typ wird unter Verwendung eines Vernetzungsmittels hergestellt.

Beispiele für geeignete Vernetzungsmittel, die zur Herstellung des Gels eingesetzt werden, sind Divinylverbindungen wie Divinylbenzol, 1,5-Hexadien-3-in, Hexatrien, Divinyläther und Divinylsulfon und Diallylverbindungen wie Allylphthalat, 2,6-Diacry!phenol und Diallylcarbinol.

Am besten wird ein vernetztes Stärkegel vom harten Typ eingesetzt, das unter Verwendung von Divinylsulfon als Vernetzungsmittel hergestellt worden ist.

Das vernetzte Stärkegel vom harten Typ kann erhalten werden, indem man Stärke mit einem Vernetzungsmittel in einer Menge von 0,1 g bis 0,5 g des Vernetzungsmittels pro 1 g Stärke unter alkalischen Bedingungen zwischen Raumtemperatur und 100°C über einen Zeitraum von 1 h bis 6 h rührt und dann wäscht und nach der Teilchengröße klassiert.

Das durch Vernetzung mit Divinylsulfon hergestellte Gel hat eine solche mechanische Festigkeit, daß es gegenüber einem Druck von zumindest 196 bar beständig ist.

Vorzugsweise wird ein Gel mit einem Teilchendurchmesser zwischen 5 μπι und 177 \im eingesetzt. Um die Trennung der Peptide weiter zu verbessern, wird die Verwendung eines Gels mit einem kleineren Teilchendurchmesser (5 μπι bis 25 um)

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besonders bevorzugt. Ant besten wird ein poröses Gel mit einem im wesentlichen gleichmäßigen Porendurchmesser zwischen T, 3 nm und 125,O nm eingesetzt. Vernetzte Stärkegele vom harten Typ, deren Porendurchmesser außerhalb dieses Bereiches liegt, sind für eine exakte Trennung von Peptiden nicht geeignet.

Andererseits wird die Trennung von Peptiden bei den gleichen Bedingungen unter Anwendung von bekanntem, vernetζtem Dextrangel, Polyacrylamidgel oder Agarosegel wegen der Pulverisierung des Gels praktisch iricht durchgeführt.

Gele vom Siliciumdioxidtyp und vom Glastyp können nicht verwendet werden, da Peptide an solche porösen Gele vom harten Typ in hohem Maße adsorbiert werden.

Die Peptide werden erfindungsgemäß in Form einer Lösung eingesetzt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren kann ein Elutionsmittel eingesetzt werden, in dem die Peptide in stabiler Weise gelöst werden und das zu einer Benetzung des vernetzten Stärkegels vom harten Typ führt. Vorzugsweise wird eine wäßrige Lösung, die ein Salz, eine Säure oder eine Base enthält, oder ein Gemisch aus Wasser und einem nichtwäßrigen Medium als Elutionsmittel eingesetzt.

Wenn Peptide mit einer endständigen oder an der Seitenkette befindlichen, basischen funktioneilen Gruppe, d.h. wasserlösliche Peptide, getrennt werden, ist eine Kontrolle der Konzentration des Salzes oder der Säure notwendig, da die Peptide leicht an das Gel adsorbiert werden, wenn eine wäßrige Lösung mit einer niedrigen Konzentration des Salzes oder der Säure als Elutionsmittel eingesetzt wird.

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Es ist nicht entscheidend, welches Salz, welche Säure und welche Base man verwendet.

Beispiele für geeignete Salze sind Natriumacetat, Natriumphosphat, Ammoniumphosphat, Natriumeitrat, Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumborat, Natriumbicarbonat und Ammoniumbicarbonat.

Beispiele für geeignete Säuren sind Salzsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Phosphorsäure und citronensäure.

Beispiele für geeignete Basen sind Natriumhydroxid, Ammoniak , Natriumcarbonat und Ammoniumcarbonat.

Auch die Kaliumverbindungen wie Kaliumacetat, -phosphat, -citrat, -chlorid, -borat, -bicarbonat, -hydroxid und -carbonat, werden bevorzugt.

Auch für die Trennung von hydrophoben Peptiden mit endständigen oder an der Seitenkette befindlichen nichtpolaren . Gruppen kann wie für die Trennung der wasserlöslichen Peptide eine wäßrige Lösung, die ein Salz, eine Säure oder eine Base enthält, als Elutionsmittel eingesetzt werden.
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Jedoch wird in diesem Fall die Adsorption der Peptide in einem beträchtlichen Maße erhöht, wenn die Konzentration des Salzes zu hoch ist. Daher wird vorzugsweise eine Mischung aus Wasser und einem nichtwäßrigen Medium eingesetzt.

Das nichtwäßrige Medium ist ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar ist.

Beispiele für geeignete nichtwäßrige · Medien sind

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-ιοί Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Isopropylalkohol und n-Propy!alkohol, Tetrahydrofuran, Acetonitril und Pyridin.

Das vernetzte Stärkegel vom harten Typ ist in einer wäßrigen Lösung einer Säure oder Base relativ stabil und ist insbesondere säurebeständig. Der pH des in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Elutionsmittels kann daher zwischen 1 und 12 liegen.

Das Elutionsmittel wird vorzugsweise mit einem pH zwischen 2 und 11 eingesetzt, da die Möglichkeit besteht, daß, wenn der pH höher oder niedriger ist, bei langem Betrieb die vernetzte Struktur geschädigt wird.

Wie vorstehend beschrieben, ist es mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, Peptide in Abhängigkeit von ihrer Molekülgröße der Reihe nach zu trennen, was nach dem bekannten Verfahren nicht erzielt werden konnte. Die Trennung der Peptide kann in einer einfachen Betriebsweise schnell erreicht werden.

Das Verfahren zur Trennung von Peptiden kann zur Untersuchung der Aminosäurebestandteile in natürlichen Proteinen und der Synthesen von Peptiden einen Beitrag leisten.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele·näher erläutert. 30

Beispiel 1

Als Probe wurden 5 ml einer Mischung von N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure, L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid und N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenyl-

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- 11 alaninmethylester verwendet.

Ein vernetztes Stärkegel vom harten Typ mit einem Teilchendurchmesser von 5 μΐη bis 1O μm und einem Porendurchmesser van 80,0 nm bis 1OQ nm (LS-TTO, hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.J wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 3,5 cm und einer Länge von GO cm gefüllt. Als Elutionsmittel wurde der Säule eine 0,05-molare, wäßrige Lösung von Natriumacetat mit .10 einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min unter einem Druck von 3,33 bar kontinuierlich zugeführt, und die Probe wurde in die Säule eingefüllt, um die 3 Bestandteile in der Probe zu trennen. Die 3 Bestandteile wurden getrennt und befanden sich in dem nach 32 bis 40 min, 56 bis 64 min bzw. 66 bis 74 min ausfließenden Elutions-' mittel.

Jede abgetrennte Lösung wurde mittels des in Beispiel 2 verwendeten Chromatographie-Apparats analysiert. 20

Durch das Ergebnis wurde die vollständige Trennung und Rückgewinnung der 3 Bestandteile bestätigt.

Beispiel 2
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Das in Beispiel 1 verwendete, vernetzte Stärkegel vom harten Typ wurde in eine Säule aus rostfreiem Stahl für die Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie mit einem Durchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 30 cm gefüllt. Die Säule wurde mit dem Chromatographie-Apparat HLC-802 UR (hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) verbunden. Eine 0,05-molare, wäßrige Lösung von Natriumacetat wurde als Elutionsmittel verwendet und unter einem Druck von 29,4 bar mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,8 ml/min durch die Säule laufen gelassen. 10 μ! der in

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Beispiel 1 verwendeten Probe wurden in den Chromatographie-Apparat gefüllt, wodurch man das in Fig. 1 gezeigte Chromatogramm erhielt.

ι- Die Konzentrationen der drei Bestandteile N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure, L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid und N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester der Probe konnten mittels der Peakflächen des Chromatogramms quantitativ gemessen werden.

Fig. 1 zeigt das Chromatogramm, das man durch die

Trennung der drei Bestandteile nach dem Verfahren von Beispiel 2 erhielt.

Wie aus Fig. 1 hervorgeht, wurde für die Trennung der drei Bestandteile die relativ kurze Zeit von 40 min benötigt, und die drei Bestandteile wurden durch diese einfache Arbeitsweise getrennt.

Beispiel 3

In eine Säule mit einem Durchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 120 cm wurde ein vernetztes Stärkegel vom harten Typ mit einem Teilchendurchmesser von 15 μπι bis 20 μπι und einem Porendurchmesser von 20,0 nm bis 25,0 nm bzw. ein Dextrangel mit im wesentlichen dem gleichen Teilchen- und Porendurchmesser (Sephadex G-50 Superfein) gefüllt. Eine 0,05-molare, wäßrige Lösung von Natriumacetat wurde durch die Säule laufen gelassen.

Durch Auflösen von 0,5 g Glycylglycylglycin und 0,5 g

Glycin in 500 ml Wasser wurde eine Probe hergestellt. 100 ul der Probe wurden in die Säule gefüllt, und die Trennung von Glycylglycylglycin und Glycin wurde unter den in Tabelle 1 angegebenen Bedingungen bezüglich der Durch-

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- 13 flußgeschwindxgkeit und des Druckes durchgeführt.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, ließ sich die Trennung unter einem Druck von 0,49 bar bis 29,4 bar ohne irgendeinen nachteiligen Effekt für das vernetzte Stärkegel vom harten Typ glatt durchführen.

Andererseits konnte bei Verwendung des Dextrangels die Trennung unter einem Druck von 0,98 bar oder höher nicht durchgeführt werden.

Nach dem Betrieb wurde das Dextrangel aus der Säule entleert, und es wurde beobachtet, daß das Gel pulverisiert war.

	Tabelle 1	Dextrangel,
Druck	Vemetztes Stärkegel	Durchflußge
(bar)	vom harten Typ,	schwindigkeit
	Durchflußgeschwindig	(ml/min)
	keit (ml/min)	χ -
29,4	@ (1,8)	χ -
19,6	© (1,2)	X
9,8	Θ (0,6)	χ -
4,9	0 (0,3)	χ -
0,98	0 (0,06)	0 (0,1)
0,49	0 (0,03)

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Beispiel 4

Eine Säule mit einem Durchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 60 cm wurde mit einem vernetzten Stärkegel vom harten Typ mit einem Teilchendurchmesser von 15 um bis 20 |im und einem Porendurchmesser von 20,0 nm bis 25,0 nm gefüllt. Eine 0,05-molare, wäßrige Lösung von Essigsäure wurde als Elutionsmittel mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,8 ml/min unter einem Druck von 56,9 bar durch die Säule laufen gelassen.

100 μΐ einer Reaktionsmischung, die durch Hydrieren von N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester unter Bildung von L-Aspartyl-L-phenylalaninmethy!ester erhalten worden war, wurden als Probe in die Säule gefüllt. Der Arbeitsgang der Trennung wurde über einen Zeitraum von 2 Monaten kontinuierlich wiederholt, um die Ausbeute der Hydrierung zu messen, jedoch verminderte sich die Trennwirkung nicht.

Andererseits wurde der Arbeitsgang der Trennung mit dem Unterschied wiederholt, daß eine starke Säure, nämlich eine 1-molare, wäßrige Salzsäurelösung, als Elutionsmittel eingesetzt wurde, um die Trennbedingungen zu untersuchen. Es ergab sich, daß die Lösung nach einer Woche nicht mehr durchlaufen konnte.

Als der Arbeitsgang der Trennung unter Verwendung einer starken Base, nämlich einer 1-molaren, wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid, als Elutionsmittel wiederholt wurde, konnte die Lösung nach einer Woche nicht mehr durchlaufen.

Beispiel 5
Eine Säule mit einem Durchmesser von 7,5 mm und einer

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Länge von 120 cm wurde mit einem vernetzten Stärkegel vom harten Typ mit einem Teilchendurchmesser von 10 μι bis 15 μΐη und einem Porendurchmesser von 5,0 nm bis 15,0 nm gefüllt. Eine Mischung von 3 Volumen-% Wasser und 97 Volumen-% Methylalkohol wurde unter einem Druck von 1,47 bar mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,8 ml/min durch die Säule laufen gelassen.

Durch Auflösen von 2 mg N-Benzyloxycarbonyl— glycylglycinmethylester und 2 mg N-Benzyloxycarbonylglycylglycylglycinmethylester in 10 ml Methylalkohol wurde eine Probelösung hergestellt. 100 μΐ der Probelösung wurden in die Säule gefüllt. Es ergab sich, daß die Trennung der zwei Bestandteile glatt durchgeführt werden konnte.

Andererseits wurde der Arbeitsgang der Trennung mit dem Unterschied wiederholt, daß eine 0,6-molare, wäßrige Lösung von Natriumacetat als Elutionsmittel eingesetzt wurde. Dabei ergab sich, daß die zwei Bestandteile adsorbiert und nicht eluiert wurden.

Beispiel 6

Eine Säule mit einem Durchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 60 cm wurde mit einem vernetzten Stärkegel vom harten Typ mit einem Teilchendurchmesser von 15 μπι bis 20 μπι und einem Porendurchmesser von 20,0 nm bis 25,0 nm gefüllt. Eine 0,01-molare, wäßrige Lösung von Natriumhydroxid (pH 12) wurde unter einem Druck von 8,14 bar mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durch die Säule laufen gelassen.

Durch Auflösen von 2 mg Glycylglycylphenylalanin und 2 mg Phenylalanylglycylglycin in 10 ml Wasser wurde eine

Probelösung hergestellt. 100 μ.1 der Probelösung wurden in die Säule gefüllt. Es ergab sich eine Trennung der zwei Bestandteile.

Der Arbeitsgang der Trennung wurde mit dem Unterschied wiederholt, daß eine 0,1-molare, wäßrige Lösung von Natriumchlorid als Elutionsmittel eingesetzt wurde, wodurch die Trennung der zwei Bestandteile verbessert wurde.

Als der Arbeitsgang der Trennung unter Verwendung einer 0,2-molaren, wäßrigen Lösung von Essigsäure (pH 2,7) als Elutionsmittel wiederholt wurde, wurde die Trennung der zwei Bestandteile weiter verbessert.

Vergleichsbeispiel

Eine Säule mit einem Durchmesser von 4,2 cm und einer Länge von 200 cm wurde mit im Handel erhältlichem Dextran (Sephadex G-25) gefüllt. Eine wäßrige Lösung von Ammoniumbicarbonat (0,2 %) wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 50 ml/h als Elutionsmittel durch die Säule laufen gelassen.

Durch Einfüllen in die Säule wurde ein Gemisch der oligomeren Kondensate von Pentapeptiden (Tyrosylleucyl-prolyl-glutamyl-pheny!alanin) als Probe getrennt.

Es ergab sich die gewünschte Trennung des Pentameren, Tetrameren, Trimeren, Dimeren und Monomeren. Die Trennung dauerte jedoch langer als 40 h.

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Claims

Patentansprüche

(1. Verfahren zur Trennung von Peptiden, bei dem man eine Lösung von Peptiden und ein Elutionsmittel durch eine ein Gel enthaltende Säule laufen läßt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gel ein vernetztes Stärkegel vom harten Typ einsetzt, wodurch Peptide und/ oder andere Bestandteile nichtfraktioniert oder fraktioniert getrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein vernetztes Stärkegel vom harten Typ einsetzt, das eine solche mechanische Festigkeit, daß es gegenüber einem Druck von zumindest 196 bar beständig ist, einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 5 μ,πι bis 177 μΐη und einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 1,3 nm bis 125,0 nm hat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel ein Gemisch aus Wasser und einem nichtwäßrigen Medium einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel eine wäßrige Lösung eines Salzes, einer Säure oder einer Base mit einem pH zwischen 1 und 12 einsetzt.

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ORIGINAL INSPECTED