DE2818124C2

DE2818124C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration eines Proteins in einer Antigenprobe

Info

Publication number: DE2818124C2
Application number: DE2818124A
Authority: DE
Inventors: Frederick J. Aladjem; Padmasini K. 91102 Pasadena Calif. Ayengar
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-04-25
Filing date: 1978-04-25
Publication date: 1983-12-08
Also published as: DE2818124A1

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.

Bei der immer rascheren Expansion der Erkenntnisse über die Rolle, die Proteine in Gesundheits- und Krankheitsfragen spielen, besteht ein zunehmender Bedarf an einer raschen und wirtschaftlichen quantitativen Methode zur Proteinbestimmung von Seren, Spinalflüssigkeiten. Gewebeextrakten u. dgl. Flüssigkeiten. Die Proteine, die in derartigen Flüssigkeiten auftreten, werden häufig durch immunchemische Vorgänge identifiziert, die vom Ausfällen eines jeden Proteins durch einen für das jeweilige Protein spezifischen Antikörper abhängen. Die Herstellung derartiger spezifischer Antikörper wird itimuliert, wenn Antigene (Fremdproteine) in einen lebenden Organismus eingeführt werden. Es können Antiseren hergestellt werden, die bekannte Gemische solcher Antikörper enthalten. Durch Reaktion einer Proteinprobe im Reagenzglas mit einem derartigen Antiserum und durch Beobachtung der sich daraus ergebenden Ausfällung oder des Nicht-Auftretens der Ausfällung können nützliehe Informationen in Hinblick auf die in der Probe vorhandenen Proteinarten gewonnen werden.

Aus der US-PS 39 94 587 ist ein elektronisch kompensiertes Densitometer zur Bestimmung der Menge einer lichtabsorbierenden chemischen Substanz in einem »Fleck« auf einer dünnen Schicht eines Trägermaterials. z.B. Silikagel, bekannt. Schwierigkeiten bei der Anwendung dieses Vorschlages ergeben sich hauptsächlich daraus, daß das Licht von dem Gel gestreut wird; eine derartige Lichtstreuung ist ein Störfaktor, der die Messung der tatsächlichen Lichtabsorption durch die zu bestimmende chemische Substanz erschwert. Dieser Schwierigkeit wird dadurch begegnet, daß die bekannten theoretischen Gleichungen von Kubelka-Munk angewendet werden und ein elektrischer Funktionsgenerator eingesetzt wird, der den direkten Ausgang des Densitometer entsprechend den theoretischen Gleichungen korrigiert. Im Gegensatz hierzu befaßt sich vorliegende Erfindung mit Immunreaktionen, von denen jede ein Ausfällen eines bestimmten Proteins durch den entsprechenden Antikörper umfaßt. Die resultierende Präzipitationszone wird durch eine Zunahme der Lichtstreuung sichtbar gemacht. Es handelt sich im vorliegenden Falle also um eine direkte Messung von Lichtstreuung und nicht um eine Korrektur der Lichtabsorption zur Kompensierung einer Hintergrundstreuung.

Des weiteren ist aus der DD-PS 1 13 108 ein automatisches Diffusionsplaitentestgerät bekannt, das zur Durchführung von Screening-Programmen biologisch wirksamer Substanzen verwendet wird, wobei unter anderem die Messung auf eine Bestimmung der Zeitdauer zurückgeführt wird. Diese Messungen beziehen sich auf die Radial-lmmundiffusion, die eine der bekannten quantitativen Methoden ist, bei denen der Antikörper zu Anfang gleichförmig über das Medium verteilt ist. Dagegen sind die bekannte Immunelektrophorese nach Grabar und Williams und eng benachbarter Methoden nur zur qualitativen Unterscheidung zwischen einzelnen Serumproteinen geeignet, nicht aber zur Erzielung quantitativer Messungen der Konzentrationen solcher Proteine.

Diese beiden Arten von Verfahren unterscheiden sich grundsätzlich in der Art und Weise, wie die beiden Hauptkomponenten zur Reaktion gebracht werden. Bei der Radial-lmmundiffusion diffundiert das Antigen aus einer Quelle in einen Bereich des Trägermediums, in welchem der ausgewählte Antikörper bereits gleichförmig verteilt ist. Dagegen diffundieren bei der Immunelektrophorese und ähnlichen Verfahren. Antigen und Antikörper von im Abstand zueinander versetzten Quellen in reaktiven Kontakt durch einen Bereich des Mediums, der zu Beginn vollständig frei von beiden Reaktanten ist.

Aus der Literaturstelle »Klinische Wochenschrift«, 48. Jg.. Heft 8, 1970, Seiten 485, 486 und 490 ergibt sich der grundsätzliche Unterschied zwischen quantitativen und qualitativen Analyseverfahren. Es wird die Immunelektrophorese als Möglichkeit der Unterscheidung der individuellen Ig erläutert, jedoch ausgeführt, daß die gewonnenen Ergebnisse nur »halbquantitativ« sind, da nur ausgesagt werden kann, ob die Konzentration größer oder kleiner als normal ist. Hiernach sind die verfügbaren, immunochemischen Verfahren zum quantitativen Bestimmen von Ig im Serum eine einfache Radial-lmmundiffusion (Elektroimmundiffusion nach Laurell). Hierbei ist der Antikörper zu Anfang gleichförmig über die gesamte Agarplatte verteilt. Beide Methoden benötigen monospezifische Antikörperlösungen.

Aus dem Stande der Technik ergibt sich somit, daß immundiflusionsverfahren, bei denen ein Antigen und ein Antikörper durch ein Medium diffundieren, das zu Beginn frei von beiden Reaktanten ist. wie z.B. die bekannte Immunelektrophorese nach Graber und Williams, qualitative Methoden sind, und daß zur quantitativen Bestimmung der Konzentration eines Proteins in einer Antigenprobe bisher nur solche Immundiffusions-Methoden angewandt wurden, bei denen das Antiserum im Gel gleichmäßig verteilt wird, wie z. B. die radiale

Immundiffusion nach Manzini. In diesem Zusammenhang wird auf die Literaturquelle »Dr. G. Müller, Klinische Biochemie und Laboratoriumsdiagnostik«, Stuttgart—New York, 1977. Seiten 52 und 53 hingewiesen, woraus sich eine Übersicht über die bekannten Immundiflusionsmethoden ergibt.

Aufgabe der Erfindung ist es. ein Verfahren der gattungsgemäßen Art zur quantitativen Bestimmung der Konzentration eines Proteins in einer Antigenprobe anzuwenden und optisch-elektronisch auszuwerten.

Dies wird gemäß der Erfindung mit den Merkmalen des Kennzeichens des Anspruches 1 erreicht.

Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Zur Durchführung der Erfindung können die zu messenden Ausfällzonen nach verschiedenen an sich bekannten Methoden erzielt werden. Vorzugsweise werden die Proteine in dem anfänglichen Antigengemisch zuerst teilweise fraktioniert, indem ihnen eine Wanderung in einer Dimension mit Geschwindigkeiten erteilt wird, die sich in charakteristischer Weise zwischen den verschiedenen Proteinen unterscheiden. Eine derartige selektive Wanderung kann beispielsweise eine einfache Diffusion, eine Elektrophorese oder eine kompliziertere Technik, z. B. die Chromatographie verwenden, ohne daß grundsätzlich die Art der Ausfällzonen, die durch den nachfolgenden Schritt der Immundiffusion erzeugt werden, geändert wird. Bei der Elektrophorese bewirken Unterschiede der elektOphoretischen Mobilität zwischen unterschiedlichen Proteinen, daß die Proteine in der Richtung des elektrischen Feldes entsprechend ihrer Mobilität verteilt werden. Im Anschluß an eine solche anfängliche Fraktionierung wird die resultierende, im wesentlichen lineare Verteilung von Proteinen, in Kontakt mit dem Antiserum durch Relativbewegung in einer anderen Dimension. 7.B. durch abwechselnde Diffusion in einem geeigneten Agar- oder Agarose-Trägermedium gebracht. Die Ausfaüzonen der entsprechenden Proteine sind dann vollkommen getrennt voneinander und können deutlich voneinander unterschieden werden.

Eine zweckmäßige Trennung der Auslallzonen einer Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen läßt sich auch ohne einen anfänglichen Fraktionierungsschritt erzielen, wenn Antigen und Antikörper in einer solchen Weise aufeinander zu diffundieren können, daß längliche Austlillzonen begrenzter Länge gebildet werden, die sich quer zu der Hauptdiffusionsrichtung erstrecken. Die Mobilitäten für die Diffusion unterschiedlicher Proteine und, oder ihrer Antikörper sied gewöhnlich ausreichend unterschiedlich, damit solche Auslallzonen deutlich unterschieden werden können. Jede auftretende Überlappung wird üblicherweise auf Teile der Zonen begrenzt, wobei die Zonenendpunkte üblicherweise deutlich getrennt sind.

Durch Anlegen eines elektronischen Feldes kann bei Immundiffusionsverfahren die Bewegung des Antigens und des Antikörpers aufeinander zu beschleunigt werden. Die resultierenden Ausfällzonen behalten jedoch die gleichen Grundformen wie bei Fehlen eines elektrischen Feldes. Der Ausdruck »Immundiffusion« ist somit als Diffusion mit oder ohne elektrisches Beschleunigungsfeld zu verstehen.

Während nach bisherigen bekannten Methoden ein Verfahren zum Analysieren eines Serums verwendet wird, um vorhandene Proteine zu identifizieren, und die Bestimmung der tatsächlichen Mengen dieser Proteine dabei durch grundsätzlich andere Verfahren vorgenommen wird, ist es mit dem erfindungsgemäßen Vorschlag möglich. Verfahren, die nicht von Anfang an einen Antikörper gleichförmig über das Medium verteilen, einwandfrei zur Erzielung exakter quantitativer Ergebnisse zu verwenden und zuverlässige, quantitative Bestimmungen aus den gleichen Platten zu erzielen, die zur Identifizierung der spezifischen Proteine verwendet werden, so daß die beiden Hauptforderungen der klinischen Analyse durch ein einziges experimentelles Verfahren erfüllt werden.

Nachstehend wird die Erfindung in Verbindung mit der Zeichnung anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 eine schematische Ansicht einer Immunelektrophoreseplatte, wobei Fig. la eine typische Verteilung von Proteinen im Anschluß an die Elektrophorese zeigt, während die Fig. Ib, ic und Iu aufeinanderfolgenden Stufen der nachfolgenden Diffusions- und Immunausfällreaktion zeigen,

Fig. 2 einen schematischen axialen Schnitt durch eine typische Einrichtung zum Messen eines Objektträgers, Fig. 3 eine schematische Darstellung, die die Eigenschaften einer Ausfällzone veranschaulicht.

Fig. 4 eine graphische Darstellung, die die typische Abhängigkeit von Zonenendpunkten nach der Zeit wiedergibt.

Fig. 5 eine graphische Darstellung, die die typische Abhängigkeit der Zonenlänge von der Zeit wiedergibt, Fig. 6 eine graphische Darstellung, die die typische Abhängigkeit der Zeit von dem Auftreten der Anfangszone bei Proteinkonzentration wiedergibt,

Fig. 7 und 8 graphische Darstellung, die die typische Abhängigkeit der Zonenlänge von der Zeit und von der Proteinkonzentration wiedergibt,

Fig. 9 eine graphische Darstellung, die die tatsächlichen Intensitätsabtastungen über eine Ausfällzone bei zwei Inkubationszeiten wiedergibt,

Fig. 10 eine graphische Darstellung, die Intensitätsabtastungen über Ausfällzonen, die durch entsprechende Proteinkonzentrationen gebildet werden, wiedergibt.

Fie. 11 eine graphische Darstellung, die die Abhängigkeit des Parameters /'. von der Zeit wiedergibt,

Fig. 12 eine graphische Darstellung, die die Abhängigkeit des Parameters/, und des Parameters dl./dt von der Proteinkonzcniration wiedergibt,

Fig. 13 eine schematische Darstellung, die die Ableitung der Proteinkonzentrationswerte durch bekannte Additionen des Proteins zu der unbekannten Probe wiedergibt.

Die Immunelektrophorese ist als qualitatives Verfahren bekannt, und es gibt viele Ausführungsformen von Einrichtungen, um dieses Verfahren durchzuführen, die sich mehr im Detail als im Prinzip voneinander unterscheiden. Die Elektrophorese und die nachfolgende Diffusion und Immunreaktion werden typischerweise in ei- . ner einzigen Gelschicht mit einer Dicke von einem Bruchteil eines Millimeters bis mehreren Millimetern : durchgeführt, die auf einer optisch transparenten Platte aufgenommen ist. Ein bevorzugtes Trägermedium ist Agarose gesättigt mit Barbitalpuffer mit einem pH-Wert von etwa 8,6 und einer Ionenstärke von 0,1. Die aktiven Materialien werden typischerweise in Bohrungen einge- _: setzt, die aus dem Gelüberzug ausgespart werden, oder aber ausgebildet, wenn das Gel auf dem Träger geformt wird.

Fig. 1 zeigt schematisch eine Platte 20 mit einer typisehen Anordnung von Bohrungen, die die beiden kreisförmigen Antigenbohrungen 21 und 22 aufweisen, welche in gleichem Abstand auf entgegengesetzten Seiten der

länglichen Antikörperbohrung oder -mulde 24 mit der Achse 25 vcrsei/t sind, welche sich parullel zur Riclilung der Elektrophorese erstreckt. Mit dieser geometrischen Ausbildung von Bohrungen können zwei geiiennle Aiitigenlösungen oder zwei Proben der gleichen Lösung ^ gleichzeitig gegen die gleich'¹ Anükörperlösung auf jeder Platte gebracht werden. Erforderlichenfalls kann die Kapazität einer jeden !'latte vervielfacht werden, beispielsweise durch Anordnung zusätzlicher Antikörperbohrungen außerhalb der beiden dargestellten Antigenbohrun- in gen. wobei zusätzliche Aniigenbohrungen in bezug auf letztere außen angeordnet sind. In ähnlicher Weise können zusätzliche Aniigenbohrungen vorgesehen weiden. die weil genug von den Bohrungen 21 und 22 in der Richtung der Elektrophorese \ersetzt sind, damit ein f> Überlappen der Muster verhindert wird.

Die schraffierten Bereiche 26 und 28 in F ι g. 1A stellen typische angenäherte Verteilungen von \ier Varianten von Protein a. />. <■ und d aus Duplikatproben in den entsprechenden Bohrungen 21 und 22 im Anschluß an eine Periode der Elektrophorese in Richtung des Pfeiles 23 dar. Obgleich alle Proteine üblicherweise in der gleichen Richtung durch das flüssige Medium wandern, tendiert das Lösungsmittel dazu, eine Nutzladung zu Iuhren und einen resultierenden Fluß oder eine Elektroosmose relativ zum Gel zu besitzen. Somit können die Proteine eine Nutzbewegung in einer der beiden Richtungen relativ zu der Bohrung haben.

Wenn die Elektrophorese beendet ist und eine Antikörperlösung in der Bohrung 24 hinzugefügt worden ist. werden Auslallzonen durch wechselseitige Diffusion der Proteine ti. h. c u.id J nach F i g. 1A und die entsprechenden Antikörper erzeugt. Die Fig. 1 B. I C und I D zeigen typische Zonen bei entsprechenden Stufen der Entwicklung.

Die Pnizipilinbögen von nichtbezogenen Antigenen. die in 11 den Antikörpern gegen sie reagieren, formen sich unabhängig und können sich kreuzen, wenn sie ausreichend nahe beieinander sind, wie in Fig. 1 D gezeigt: die Bögen von Antigenen hingegen, die immun-chemisch 4<i aufeinander bezogen sind, schließen sich in einer kontinuierlichen Reaktion an. Die Ausfällzone d' in den Fig. IC und 1 D zeigt au. daß die Fläche i/der Fig. IA zwei verschiedene Proteine enthält, wodurch die Tatsache dargestellt ist. daß selbst Antigene, die eine identische elektrophoretische Mobilität haben, unterschiedliche Ausfallzonen bilden können. Die Zonen d und d' können andererseits so betrachtet werden, daß sie zwei getrennte Proteine darstellen, die zu Anfang in die Bohrung 21 eingesetzt worden sind und einer lmmundiffusion ohne anfängliche Elektrophorese ausgesetzt wurden. Die klare Trennung der entsprechenden Zonenenden ist dann bedingt durch unterschiedliche Diffusionsgeschwindigkeiten der Proteine oder ihrer Antikörper. In beiden Fällen kann jede derartige Zone unabhängig analysiert werden. wobei eine beliebige oder alle Methoden der zu beschreibenden Analyse verwendet werden können.

Gemäß der Erfindung werden die Ausfällzonen, die sich aufgrund der Immunelektrophorese ergeben, direkten quantitativen Messungen unterzogen. Solche Mes- eo sungen können nur die räumliche Position auf der Platte bestimmter ausgewählter Eigenschaften einer jeden interessierenden Auslallzone bestimmen, oder können quantitative photooptische Messungen der Lichtintensität einschließen. Für beide Arten der Messung wird die Zeitdauer festgestellt und kann als ein integraler Teil der Beobachtungsdaten verwendet werden. Wenn der Inkubationsvorgang ein Gleichgewicht erreichen kann, wobei

JO

35 eine nahezu statische Zonenkonfiguration erzielt wird, wird die exakte Zeitdauer für die Messungen unerheblich.

Positionsnie.ssungen aiii einem (ilasplättchen 20 können beispielsweise nut i IiIIe eines Mikroskops geringer Verstärkung vorgenommen werden. Wie schemalisch in Fig. 2 gezeigt, wird das Plättchen über eine einstellbare Öffnung 32 auf der Oberseite eines lichtdichten Gehäuses 30 mit den Lampen 36 und der dunklen Unterlage 34 aus lichlabsorbierendeni Material, z. B. schwarzem Samt, gesetzt. Das Mikroskop 40 weist die Objektivlinse 41. das Okular -',1 und ein Fadenkreuz oder ein anderes Bezugskreuz bei 43 m tier Brennebene auf. Das Mikroskop ist über dem Lichtgchäuse 30 auf einem Doppelgleitmechanismus 45 mit Spindelantrieb 46 und mit genauen, nicht im einzelnen dargestellten Skalen zur Ablesung der Mtkroskopposilion in zwei Koordinaten befestigt. Der besseren (bersicht wegen ist nur eine Koordinate der Bewegung direkt in der Zeichung angegeben. Es ist iiberlicherweise zweckmäßig. Koordinaten zu wühlen, deren v-Achse beispielsweise parallel zur Richtung der Elektrophorese und zur Längsersireckung der Antikörperbohrung verläuft, und den Nullpunkt der Koordinaten in oder in der Nähe der Achse 25 zu haben, wie in Fig. IA gezeigt ist.

Für die Messungen der Lichtintensität weist das Mikroskop z. B. einen schräggestellten Strahlteilerspiegel 48 auf, der einen Teil des Lichtes in das Okular richtet, während ein anderer Teil ein reelles Bild in der Ebene einer Membran 52 bildet. Die Membran 52 überträgt dann in den photoempfindiichen Wandler 50 nur Strahlung a us der elementaren Fläche der Platte 20, die optisch mit dem Fadenkreuzbild zusammenfällt. Der Wandler 50 ist elektrisch mit der Verslärkungsschaltung 54 und dem Meßgerät 56 verbunden. Letzteres kann visuell beobachtet werden, und der Wert kann von Hand aufgezeichnet werden: das Meßgerät kann jedoch auch Vorkehrungen besitzen. z.B. eine Analog-Digilal-Schaltung sowie eine Ausdrucksvorrichiung. um die Lichtintensität in Abhängigkeil von einem Befehlssignal automatisch aufzuzeichnen. In der dargestellten Einrichtung nach Fig. 2 können zahlreiche Änderungen vorgenommen werden; beispielsweise kann die Dunkelfeldbeleuchtung durch direkte Beleuchtung oder durch Beleuchtung von oben so. daß aus der Zone rellektiertes Licht beobachtet oder gemessen wird, versetzt werden. Die Einrichtung zur Erzielung vollständig automatisierter Messungen wird weiter unten beschrieben.

Fig. 3 zeigt schemaiisch bestimmte bevorzugte Ausfällzoneneigenschafien. die für die Positionsmessung ausgewählt werden, wenn die Zone sich entwickelt. Die horizontale Linie 61 bei .V = V₁,, stellt den benachbarten Rand der Antikörperbohrung in dem Immunelektrophorese-Plättchen dar. Die Punkte £und Fun den Koordinaten (y,.. V₁.) und (Yj. Vj) stellen die linken und rechten Endpunkte der länglichen Zone 60 dar.

Zusätzlich zu den Zonenendpunkten fund F wurde als zweckmäßig festgestellt. Koordinaten einer Anzahl von Zwischenpunkten jeder Zone zu messen. Der einzige Punkt G an den Koordinaten (x._r \\) in Fig. 3 zeigt solche Punkte.

Da die Zone eine bestimmte Breite in der v-Richtung besitzt, kann die v-Koordinate eines jeden Zwischenpunktes, z. B. G. zweckmäßigerweise entweder bei 63 an der führenden Kante der Zone, die der Antikörperbohrung am nächsten liegt, bei 65 an der ablaufenden Kante der Zone, oder an einem oder mehreren Punkten, z. B. 64, innerhalb der Zone angeordnet werden, wobei zweckmä-

ßigerweise der Punkt maximaler Intensität eingeschlossen ist.

Wenn sich die Zone mit zunehmender Inkubationsdauer vergrößert, ändern die Punkte E, Fund G fortlaufend ihre relativen und ihre absoluten Positionen. Beispielsweise Werte von .V₁, und X₁- als Funktionen der Zeit sind in Fig. 4 für eine typische Proteinkonzentration aufgetragen. Derartige Positionswerte können direkt zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen verwendet werden, z. B., indem die Werte von .V₁, und x_f, die mit unbekannten Lösungen erzielt werden, mit entsprechenden Werten verglichen werden, die mit bekannten Konzentrationen von Proteinen bei gemessenen Zeitdauern erhalten werden. Zuverlässigere und exaktere Ergebnisse werden in der Regel erzielt, wenn von solchen Anfangsmessungen eine oder mehrere Funktionen abgeleitet werden, die der Zweckmäßigkeit halber als Parameter bezeichnet werden.

Ein wichtiger Parameter der Auslallzone, der verwendet wird, ist der Koordinatenunterschied .v_; — .v,„ nämlieh ein Maß für die Länge L der Auslallzone zu der bestimmten Zeit / der Messung. Die Änderung dieses Parameters mit der Inkubationsdauer ist in Fig. 5 für die typischen Daten nach Fig. 4 aufgetragen.

Andere Positionsparameter als der der Zonenlänge L können aus Messungen der sich entwickelnden Zone berechnet werden. Beispielsweise sind die Zonenkriimmung und ihre Änderung in der Längsersireckung der Zone nützliche Parameter, ferner auch die Gewinnung einer Information in bezug auf das Vorhandensein von Proteinabnormalitäten (siehe weiter unten). Ein großes Maß der Krümmung für den Zonenbogen als Ganzes oder für ein ausgewähltes Zonensegment kann durch verhältnismäßig einfache Vergleiche der x- und r-Koordinaten für drei zueinander versetzte Punkte auf der Zonenachse erhalten werden. Um exaktere Werte der Zonenkrümmung zu erzielen, wird die Zonenachse in typischer Weise durch eine Kurve der Art y=f(x) angepaßt, wobei f(x) eine geeignete Funktion von χ darstellen kann. Der Krümmungsradius R ergibt sich dann nach der Formel

(1)

[I₊O-')²]³'²

wenn ι' undy" die ersten und zweiten Ableitungen von v in bezug auf χ darstellen.

Eine geeignete Darstellfunktion für die Kurvenanpassung ergibt eine Parabel, typischerweise mit der Achse parallel zur.v-Achse. Eine derartige Parabel kann in äquivalenter Form wie folgt ausgedrückt werden:

(2a)

50

A(x-B)²+ C

(2 b)

55

= (I₂

B= -O₁IIa₂, C=a_o-afl4a₂.

Die Werte der Konstanten in den Gleichungen (2a) oder (2b) können direkt aus den Koordinaten dreier beliebiger Punkte der Zonenachse festgestellt werden, oder können durch kleinste Quadrate angepaßt werden oder durch andere bekannte Methoden auf eine gewünschte Anzahl solcher Punkte gebracht werden. Die Symmetrieachse der Parabel ist bei x=B, und die Kurve an dieser Achse ist ein Abstand C von der .v-Achse. Verwendet man die Formel (1), läßt sich der Kurvenradius wie folgt ausdrucken:

η

2/1

l+[4/i²(.Y-ß)²]³'²

Dieser Radius hat seinen maximalen Wert R₀ an der Symmetrieachse, wobei (3) sich reduziert auf

R₀ = IA (4)

Jede der obigen Größen, die als aus drei Punkten der Zonenachse abgeleitet angezeigt sind, kann als Parameter verwendet werden.

Ein weiterer Parameter, der zur Bestimmung der Proteinkonzentration zweckmäßig ist, ist die Zeitdauer T₀ des ersten Auftretens der Zone. Diese Zeitdauer ist durch direkte Beobachtung schwierig zu bestimmen. Nachfolgend wird eine praktische Methode zur Erzielung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Wertes für die Zeildauer des ersten Auftretens angegeben.

In den F i g. 4 und 5 stellen die fest ausgezogenen Linien typische Kurven direkter experimenteller Werte dar. Die Figuren weisen ferner Extrapolationen der fest ausgezogenen Kurven gegen frühere Zeiten dar. Die Extrapolationen sind gestrichelt dargestellt. Der Punkt 66, an dem die extrapolierten Kurven nach Fig. 4 sich treffen, stellt eine Zeitda uer dar, bei der die Zone die Länge Null haben mußte. Die extrapolierte Kurvenach Fig. 5 schneidet die Zeitachse im Punkt 67 und gibt einen äquivalenten Vorgang zum Auffinden von T₀. Eine derartige Extrapolation stellt eine vernünftige und außerordentlich zweckmäßige Definition für den Zeitpunkt des ersten Auftretens der Ausfällzone dar. Dieses Verfahren zur Bestimmung von 7"₍, hat den Vorteil, daß eine laufende Beobachtung der Platte nicht erforderlich ist.

In bezugauf die quantitativen Bestimmungen der Zonenlichtintensität wurde festgestellt, daß eine einzige Lichtintensitätsablesung nicht üblicherweise eine brauchbare Messung der Proteinkonzentration ergibt. Dies ist hauptsächlich durch die Veränderbarkeit der Zonenform und die Geschwindigkeit der Ausbildung sowie auch durch die Tendenz der Intensität zur Änderung bei expandierender Zone bestimmt.

Andererseits wurde festgestellt, daß die Veränderlichkeit solcher Faktoren weitgehend dadurch kompensiert werden kann, daß eine Reihe von Intensitätsablesungen an entsprechend ausgewählten Stellen vorgenommen wird und daß sie kollektiv zur Auswertung eines Intensitätsparameters behandelt werden. Ein bevorzugter Vorgang besteht darin, derartige Ablesungen in gleichförmigen Intervallen längs einer Linie zu nehmen, die sich linear über die Ausfällzone erstreckt, typischerweise in der v-Richtung bei einem bestimmten Wert von x. Eine derartige Serie weist vorzugsweise mehrere Intensitätswerte außerhalb der Zone auf jeder Seite auf. Die versetzten Werte werden dann gemittelt, damit eine Messung der Hintergrundintensität erzielt wird, die von jeder der Intensitätsablesungen innerhalb der Zone subtrahiert wird. Die resultierenden, eingestellten Intensitätswerte werden effektiv summiert, ergeben im Prinzip ein lineares Integral der Intensität längs einer die Zone bei einem ausgewählten Wert von a- kreuzenden Linie. Es wurde festgestellt, daß eine derartige lineare Intensitätssumme I_x dahin tendiert, mit der Inkubationsdauer in einer regulären und reproduzierbaren Weise zuzunehmen, wobei der Wert zu einem gegebenen 7citpi.nkt mit der Konzentration des reagierenden Proteins über einen weiten Bereich von experimentellen Bedingungen zunimmt.

Typische graphische Darstellungen der relativen Intensität, die während Querzonenabtastungen beobachtet wird, sind in Fig. 9 dargestellt. Die beiden Kurven wur-

den durch eine halbautomatische Einrichtung der weiter unten erläuterten Art aufgetragen, wobei die Abtastung in der i-Richtung bei .Y₉ vorgenommen wurde, dem Punkt der weitestgehenden Annäherung der Ausfällzonen an die Anlikörperbohrung. Die Spitzenwerte bei 74 und 77 in Fig. 9 sind durch die Zonen bedingt, die auf entgegengesetzten Seiten einer Antikörperbohrung durch identische Proteinproben in den beiden Antigenbohrungen einer Platte ähnlich nach Fig. 1 ausgebildet werHen. Die beiden kleinen Spitzenwerte bei 75 und 76 sind durch die entsprechenden Ränder der Antikörperbohrung bedingt, wobei ein zweckmäßiger Bezugswert erzielt wird, aus welchem Abstände, z. B. D. von ausgewählten Zonenpunkten zu dieser Bohrung gemessen werden. Der Parameter /_v. der weiter oben definiert wurde. entspricht im wesentlichen der Fläche unter einer Spitze. z.B. bei 74 oder 77 nach Fig. 9.

Die Spitzen 74 und 77 nach Fig. 9 wurden mit identischen Proben von menschlichem Serum-Albumin erzieh. Sie zeigen die typische Entwicklung der Auslallzonen zwischen einer Inkubationszeit von 2 Stunden (fest ausgezogene Kurve 70) und 4Stunden (gestrichelte Kurve 72). Obgleich die Zonenposition bemerkenswert stationär während der Zeitdauer zwischen diesen zwei Gruppen von Messungen bleibt, nimmt die Fläche einer jeden Spitze wesentlich zu. Die große Ähnlichkeit der Spitzen bei 74 und 77 ist bemerkenswert. Die beiden Kurven sind der besseren zeichnerischen Übersicht wegen in vertikaler Richtung um einen willkürlichen Abstand versetzt.

Fig. 10 zeigt eine schematische Darstellung, bei der typische Abtastungen in der r-Richtung auf Platten gezeigt sind, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Protein erstellt wurden: alle Werte wurden etwa bei dergleichen Inkubationsdauer gemessen. Die graphische Darstellung zeigt einwandfrei die zunehmende Fläche der individuellen Spitzen und die Verschiebung der gesamten Zone gegen die Antikörperbohrung mit zunehmender Proteinkonzentration. die von den Spitzen A nach C fortschreitet.

Während der Parameter /, besonders zweckmäßig zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen ist. werden noch bessere Ergebnisse aus einem Mehrfachintensitätsparameter erhalten, der durch Summieren oder Mitteln solcher linearer Intensitätssuminen bei mehreren unterschiedlichen .v-Werten erhalten wird. Eine typische Methode besteht darin, lineare Summen bei .Y₉ und bei Werten, die auf jeder Seite von .Y₉ um ein ausgewähltes Intervall versetzt sind, zu berechnen. Die Mittelung oder Summierung einer gleichförmigen, vorbestimmten Anzahl solcher linearer Summen reduziert den experimenteilen Fehler und verbessert die Gesamtgenauigkeit der Bestimmung der Pruieiiikuiiieiiiräiiun.

Bei einem anderen, in der Regel bevorzugten Verfahren wird jedesmal dann, wenn die Platte abgetastet wird, die Anzahl von linearen Summen, die in der Berechnung aufgenommen wird, vergrößert, wenn die Länge der Ausfällzone zunimmt. Ein beispielsweiser Vorgang dieser Art besteht darin, die lineare Summe der Intensität bei x_g zu bestimmen und mit der Berechnung solcher Summen auf jeder Seite von .Y₉ fortzufahren, bis der Wert der Summe unter einen ausgewählten Schwellwert fällt. Die Addition aller linearen Summen ergibt einen Parameter /., der im wesentlichen das Integral der Intensität der Ausfällzone zum Zeitpunkt der Abtastung ist. Diese Annäherung kann so genau wie gewünscht erhalten werden, und zwar innerhalb der Grenzen der Auflösung der Geräteanordnung, indem die x- und j'-Zuwachsanteile reduziert werden, mit denen die Messungen durchgeführt werden. Der Wert von /_ ändert sich besonders steil als eine Funktion der Proteinkonzentration über einen weiten Bereich von experimentellen Bedingungen. Dies ist der Fall, weil bei zunehmender Konzentration sowohl die .v- als auch die y-Dimensionen der Zone zunehmen, und die mittlere Intensität der Zone ebenfalls zunimmt. Diese steilere Abhängigkeit von der Proteinkonzentration macht den Gesamtintensitäi'-paramcter besonders wirksam als ein Kriterium zur Bestimmung der Konzentration.

Nach Erhalt experimenteller Werte für einen oder mehrere Parameter für eine zu analysierende Antigenprobe werden die Werte mit entsprechenden Gruppen von Standardwerten für die jeweiligen Parameter verglichen, die unter streng ähnlichen experimentellen Bedingungen, jedoch mit einer Reihe von Proteinlösungcn. die entsprechende bekannte Konzentrationen des interessierenden Proteins enthalten, gewonnen. Um eine solche Anordnung von Standardwerten zu erzielen, werden Standarddurchläufe mit derartigen Standardproteinlösungen ausgeführt, und es werden Messungen bei entsprechenden Punkten der entsprechenden Platten bei aufeinanderfolgenden Zeiten bei fortschreitender Inkubation durchgeführt. Die Standarddurchläiife werden vorzugsweise so durchgeführt, daß alle Bedingungen so nahe wie möglich identisch denen der experimentellen Durchlaufe sind, für die sie Bezugswerte darstellen sollen. Vorzugsweise wird ein getrennter Satz von Bezugswerten für jede Gruppe von experimentellen Durchläufen erzielt. Für Routinemessungen, für die die Bezugskurvenneigungen aus vorher gewonnenen Erfahrungswerten bekannt sind, kann manchmal sogar ein einziger Standarddurchlauf ausreichend sein.

Standardwerte des ausgewählten Parameters werden aus den Ergebnissen der Standardmessungen abgeleitet, typischerweise für jede Konzentration und zu verschiedenen Zeilen. Jeder gemessene Standardwert des Parameters wird deshalb als Funktion sowohl der Konzentration als der Zeit betrachtet. Wenn individuelle lineare Intensitätssuminen /_v getrennt betrachtet werden sollen, erfordert eine volle Identifizierung auch eine Spezifizierung des Wertes von .v.

Ein Vorteil der Verwendung der Zeit des ersten Auftretens der Zone als Parameter ist. daß Standardwerte von T_n nicht die Zeit als variable Größe einschließen. Das bedeutet, daß. obgleich die Auswertung von 7"₀ durch die beschriebenen Verfahren Messungen bei einer Reihe von definierten Zeiten erforderlich macht, dann, wenn T₀ einmal aus diesen Messungen gewonnen worden ist. die Zeitdauer der entsprechenden Messungen unwesentlich werden. Die Werte von T₀ können somit als Funktion der Proteinkonzentraüon C aufgetragen werden und ergeben c;nc einzige Standardkup.c. Eine derartige Kurve ist schematisch in Fig. 6 dargestellt: sie basiert aufwerten, die für entsprechende Konzentrationen durch das Extrapolationsverfahren, das in Verbindung mit den Fig. 4 und 5 beschrieben wurde, erhalten werden. Konzentrationswerte sind direkt aus der Kurve nach F i g. 6 für eine unbekannte Probe ablesbar, wenn T₀ einmal gemessen worden ist.

Im Falle von solchen Parametern, wie L, J_x und /- kann die Erstellung von Standardkurven weniger direkt sein. Da die Werte von den Zeiten abhängen, zu denen die Messungen durchgeführt werden, müssen die Serien von Bezugsstandardwerten in solcher Form erstellt werden, daß sie einen Bereich von Zeiten umfassen. Es ist nicht immer möglich. Daten für alle Konzentrationen zum gleichen Zeitpunkt zu messen. Jeder gemessene Wert wird deshalb seinem Zeitpunkt für die Messung zugeord-

net, und die resultierenden Standardwerte fur die entsprechenden Proteinkonzentrationen werden dann auf getrennten Kurven als Funktionen der Zeit aufgetragen.

Fig. 7 zeigt eine typische Gruppe solcher Kurven, bei denen Standardwerte des Parameters für drei Konzentrationen über der Zeit aufgetragen sind. Die angezeigte Extrapolation dieser Kurven auf L = O kann Standardwerte von 7"₀ für die Darstellung nach Fig. 6 ergeben, oder aber experimentelle Daten von T₀ zum Vergleich mit Fig. 6. In Fig. 7 werden vertikale Linien in einer Reihe von willkürlichen Zeitpunkten, z.B. /,, I₂ und /₃ gezogen. Ihre Schnittstellen mit den Kurven ergeben dann einen Satz von L-Werten für unterschiedliche Konzentrationen, die alle der gleichen Zeit entsprechen. Jeder solche Satz von L-Werten wird erneut als eine getrennte Kurve als Funktion der Konzentration aufgetragen. Das Ergebnis ist eine Anordnung von Kurven, deren jede L als Funktion der Proteinkonzentration für eine bestimmte Zeit zeigt. Eine solche Anordnung ist schematisch in Fig. 8 dargestellt und ist zum Vergleich mit einem experimentellen Parameterwert besser geeignet als die Auftragung über der Zeit nach Fig. 7.

Standardwerte für den Vergleich mit experimentellen Werten anderer Parameter werden in typischer Weise analog zu den für den Parameter L beschriebenen erzielt und behandelt.

Es wurde jedoch festgestellt, daß der Gesamtintensitätsparameter L, gemessen für eine gegebene Proteinkonzentration bei aufeinanderfolgenden Zeiten der Zonenentwicklung, linear mit der Zeit zunimmt. Diese lineare Beziehung ist in Fig. 11 dargestellt, in der/.über der Zeit für vier Lösungen aufgetragen ist, die die angezeigten bekannten Konzentrationen des Proteins Immunglobulin enthalten. Die angezeigten Werte von /. wurden durch einen entsprechend programmierten Mehrzweckrechner aus Intensitätswerten erstellt, die automatisch bei einer zweidimensionalen Anordnung von Zonenpositionen in der beschriebenen allgemeinen Weise gemessen wurden. Die in Fig. 11 gezeigten Punkte wurden ursprünglich automatisch aufgetragen, und die geradlinigen Kurven wurden jedem Satz von Punkten durch den Rechner angepaßt. Die Figur wurde von Hand neu gezeichnet und in stark reduziertem Maßstab reproduziert.

Die in Fig. 11 gezeigte lineare Beziehung trägt zur Erstellung von Standard- oder Bezugsdarstellungen bei. aus denen die Proteinkonzentration entsprechend einem experimentellen Wert des Parameters /. ausgelesen werden kann. Eine solche Kurve, die aus den Daten nach Fig. 11 abgeleitet ist, und die /. als Funktion der Konzentration für die Zeitdauer von 2,4 Stunden zeigt, ist in Fig. 12 bei 70 gezeigt.

Die lineare Abhängigkeit von /. von der Zeit bedeutet ferner, daß die Zeitableitung dljdt oder die Änderungsgeschwindigkeit von /. mit der Zeit konstant ist. Damit ergibt sich ein Parameter, der den praktischen Vorteil hat, daß er nicht von der Zeit abhängig ist. Die Kurve 72 in der F i g. 12 zeigt das typische Verhalten dieses Parameters als Funktion der Proteinkonzentration; jeder Punkt stellt die Neigung einer der Kurven nach Fig. 11 dar. Wie bereits in Verbindung mit dem Parameter T₀ und Fig. 6 erläutert, kann eine einzige Kurve, z. B. die Kurve 72 der Fig. 12, effektiv als Bezugskurve für den Parameter dl.jdt dienen.

Wenn die zu betrachtende Probe das interessierende oder die interessierenden Proteine bei verhältnismäßig geringen Konzentrationen enthält, werden die Probenlösungen vorzugsweise ergänzt, indem bekannte Mengen solcher Proteine direkt ohne Rest aufgehenden Teilen der Probe selbst hinzugefügt und die resultierenden Lösungen parallel zu der Originallösung durchgeführt werden, und mit Normen, die bekannte Konzentrationen des Proteins enthalten. Für den gewünschten Parameter für die entsprechenden Lösungen werden alle Werte zur gleichen Zeil erhalten, wobei die vorbeschriebene Technik des Interpolierens in bezug auf die Zeit erforderlichenfalls verwendet wird. Die Parameterwerte P, die für die regulären Standartlösungen erzielt werden, werden über der Proteinkonzentration in üblicher Weise aufgetragen, wie schematisch durch die Kurve 18 in Fig. 13 dargestellt. Ferner werden die Werte von P für die Originalantigenprobe und für die Teile der Probe, der das Protein in bekannter Menge hinzugefügt wurde, ebenfalls aufgetragen, was in typischer Weise in Form der entsprechenden Punkte h, i,j und k angedeutet ist. Diese Punkte werden relativ zu der horizontalen Konzentrationsachse aufgetragen, so, als ob die Lösungen nur das hinzugefügte Protein enthielten. Somit wird der Wert A für die Originalprobe bei C= 0 aufgetragen. Die Kurve 81 wird durch diese Punkte gezogen. Mit dieser beispielsweisen Anordnung der Daten kann die Proteinkonzentration in der Originalprobe in verschiedener Weise bewertet werden, was im wesent ichen stets den gleichen Wert ergeben soll. Somit kann jede gewünschte Anzahl dieser Vorgänge verwendet werden, und die resultierenden Werte werden gemittelt.

Zuerst ergibt die horizontale Projektion von dem Punkt Λ zur Schnittkurve 80 bei h' den Konzentrationswert, der bei C_h angezeigt ist, welcher der allgemeinen, vorbeschriebenen Vergleichsmethode entspricht. Ferner ergibt eine ähnliche Projektion eines jeden Wertes i,j und A: mit der Schnittkurve 80 ein Maß für die Konzentration, ausgedrückt in der Länge der Linien von;' nach /',7 nach/ und A- nach λ:', wobei alle diese Längen theoretisch gleich groß sind. Wenn der Wert von P bei A etwas unsicher ist, beispielsweise, weil die beobachtete Zone schwach ist, ergibt ein Mittelwert aller vier Intervalle einen zuverlässigeren Wert.

Ein weiteres Verfahren hat den Vorteil, daß es nicht nur die Genauigkeit einer ungewissen Bestimmung von A verbessern kann, sondern auch eine Antwort ergeben kann, selbst wenn die Originalprobe weniger als den Schwellwert des Proteins enthält, der erforderlich ist, um eine meßbare Ausfällzone zu erzeugen. In letzterem Fall wird der obere Teil der Kurve 81 durch die zur Verfügung stehenden Punkte i,j und A: gezogen und auf die /"-Achse extrapoliert, so daß eine Bestimmung von P bei A erzielt wird. Bei der Projektion der Kurve 81 ist die Standardkurve 80 sehr nützlich. Beispielsweise wird die Kurve 80 nach links in Fig. 13 verschoben, bis sie so weit wie möglich die Punkte i,j und A- darstellt.. Die Schnittstelle der schobenen Kurve 80 mit der P-Achse ergibt dann ein gutes Maß für den Punkt A, von welchem die Konzentration Q festgestellt wird. Ferner ergibt eine weitere Extrapolation der Kurve 81 auf die negative C-Achse bei — C_h eine direkte Ablesung für die Konzentration, die mit dem Wert C_h übereinstimmen sollte.

Die gewünschte Stützung auf die zusätzliche Standardkurve 81 hat den großen Vorteil, daß das identische Medium für die experimentellen und Bezugslösungen verwendet wird. Insbesondere wenn dieses Medium das Humanserum eines bestimmten Patienten ist, überwiegt dieser Vorteil die Möglichkeit eines geringen Fehlers beim Extrapolieren der Standardkurve. Durch Erhöhung der Anzahl von unterschiedlichen Beträgen des hinzugefügten Proteins (die drei in Fig. 13 dargestellten sind lediglich als Beispiel zu betrachten), und durch Verwendung

mehrerer Durchläufe für jeden Betrag kann die Zuverlässigkeit der Extrapolation fast ohne Begrenzung erhöht werden, und es läßt sich eine gute Anzeige des experimentellen Fehlers erzielen, der enthalten sein kann.

Es ist ferner möglich, Abnormaiitäten bestimmter Proteine in einer Antigenprobe anzuzeigen. Normales und abnormales Gammaglobulin beispielsweise haben geringfügig unterschiedliche Bereiche elektrophoretischer Mobilität, reagieren aber mit dem gleichen Antikörper, was zu Ausfällzonen mit unregelmäßiger und typisch to unsymmetrischer Verteilung von Präzipitin in Längsrichtung der Zone führt. Eine derartige Unregelmäßigkeit kann durch Vergleich experimenteller Werte beispielsweise des Intensitätsparameters für unterschiedliche Werte von .v angezeigt werden. Eine Beobachtung unsymmetrischer oder sonst unregelmäßiger Variationen solcher Werte gibt an, daß eine Abnormalität angetroffen worden ist, und diese Anzeige wird in hohem Maße verstärkt, wenn verschiedene unabhängige Bestimmungen bei jedem .v-Wert durchgeführt werden, und wenn die berechneten experimentellen Fehler zeigen, daß die Variation statistisch bedeutend ist.

Dieses Verfahren kann als spezieller Fall der allgemeinen Methode des Vergleichens der experimentell erhaltenen Werte unterschiedlicher Parameter angesehen werden, die in unterschiedlicher Weise auf die interessierende Abnormalität ansprechen. Für einige Parameter mit einem solchen Verhalten kann es wirksamer sein, die Werte der Proteinkonzentration zu vergleichen, die den entsprechenden beobachteten Parameterwerten entsprechen, statt die Parameterwerte selbst direkt zu vergleichen. Beispielsweise tendiert die beschriebene unregelmäßige Intensitätsverteilung längs der Zone bei Vorhandensein von abnormalem Gammaglobulin dazu, daß die Zone ra .eher als normal erscheint, was zu höheren Werten dc· berechneten Konzentration führt; hingegen tendiert der Gesamtintensitätsparameter /. dahin, daß etwa gleiche Konzentrationswerte für die normalen und abnormalen Proteine erzielt werden. Somit zeigt eine ziemlich schwache Übereinstimmung zwischen Konzentra- *o tionswerten, die mit T₀ und mit /. erzielt werden, das Vorhandensein von abnormalem Protein an.
Ein weiterer Parameter, der empfindlich auf das Vorhandensein von abnormalem Protein anspricht, ist die Krümmung der Längsachse der Zone. Bei Vorhandensein der Abnormalität tendiert die Krümmung dazu, sich in unregelmäßiger und unsymmetrischer Weise in Längsrichtung der Zone zu verändern, während die Gesamlkrümmung geringer als normal ist.

Weitere Vorteile sind last immer dadurch erzielbar, daß Mehrfachparameter verwendet werden, die spezifische Funktionen von zwei oder mehr Parametern umfassen, wie die beschriebenen Positions- oder Intensitätsparameter. Beispielsweise ergibt die Summe aus der Zonenlänge L und einem lnlensitätsparameter, deren jeder entsprechend dem experimentellen Fehler der Messung in geeigneter Weise bewertet wird, einen neuen Parameter, der zuverlässigere Resultate ergibt als wenn eine der Komponenten allein verwendet würde.

Eine weitere vorteilhafte Kombination umfaßt eine e>0 diflerentielle Funktion zweier Parameter, von denen eine mit zunehmerder Proteinkonzentration zunimmt, während die andere abnimmt. Somit ergibt ein Quotient oder eine Differenz solcher Parameter einen Mehrfachparameter mit einer steileren Abhängigkeil von der Konzentralion als jede der beiden Komponenten. Der Zeitpunkt T_n des ersten Auftretens der Zone isl ein Beispiel für einen Parameter, der eine inverse Beziehung zur Proteinkonzentration besitzt, und ist insbesondere zweckmäßig zum Aufbau solcher Quotienten. Der Abstand von der Antikörperbohrung zur Zone bei einem gewünschten Wert der .γ-Koordinate, beispielsweise der Abstand der engsten Annäherung bei .Y₉ hängt auch invers von der Konzentration ab und kann als Parameter in solchen Quotienten verwendet werden. Es wird in der Regel bevorzugt, den Parameter mit direkter Abhängigkeit von der Konzentration durch den mit inverser Abhängigkeit zu teilen, so daß der resultierende Mehrfachparameter eine direkte anstatt einer inversen Abhängigkeit besitzt.

Geeignete Bezugswerte für den Vergleich mit experimentell bestimmten Mehrfachparametern unbekannter Proben werden in typischer Weise aus Bezugswerten abgeleitet, die so erhalten werden, wie bereits für die entsprechenden Komponentenparameter beschrieben.

Während die Positions- und Intensitätsmessungen und die Parameterableitungen, die beschrieben worden sind, durch direkte visuelle und manuelle Operationen durchgeführt werden können, wie angezeigt worden ist, besteht ein besonderer Vorteil darin, daß die Operationen für teilweise oder im wesentlichen vollständige Automatisierung besonders gut geeignet sind.

In besonders zweckmäßiger und wirksamer Weise kann das Plättchen durch eine optische Vorrichtung, z. B. eine Fernsehkamera, eine ladungsgekoppelte Abtastvorrichtung oder eine äquivalente Vorrichtung abgetastet werden, um ein Videosignal zu erzeugen, das die Scheinhelligkeit des abgetasteten Bildes bei einer zweidimensionalen Anordnung von elementaren Flächen darstellt. Dieses Signal für jedes Element wird in typischer Weise in digitale Form umgewandelt und elektronisch in Verbindung mit Signalen gespeichert, die die λ- und v-Koordinaten der entsprechenden Position auf der Platte und die Beobachtungsdauer darstellen. Die gesamte Anordnung solcher Positionssi^nale oder das Signal für eine bezeichnete Position kann dann aus dem Speicher zur weiteren Verarbeitung zurückgewonnen werden. Auch kann jeder gewünschte Teil der Plättchenbildes entweder während des Abtastvorganges oder zu einem späteren Zeitpunkt mit Hilfe einer Kathodenstrahlröhre oder einer entsprechenden Sichtanzeigevorrichtung zur Anzeige gebracht werden. Systeme zum Abtasten, Speichern und Reproduzieren eines Bildes und zum Extrahieren eines Videosignales in digitaler Form für einen ausgewählten Bildpunkt sind in der Elektronik bekannt und stehen kommerziell zur Verfügung.

Zum automatischen Abtasten von Zonen können die Plättchen eines Satzes nacheinander aus der Inkubationskammer auf eine exakt definierte Abtastposition mit entsprechender Beleuchtung übertragen werden. Insbesondere, wenn die optische Abtastvorrichtung sowohl ein geringes Gewicht hat als auch kompakt ist. wie dies im Falle beispielsweise einer ladungsgekoppelten Vorrichtung zutrifft, ist es zweckmäßig, die Abtastvorrichtung auf einer Plattform zu befestigen, die in zwei Dimensionen über die stationäre Anordnung von Immundiffusions- oder Immunelektrophores-Plättchen beweglich ist. Diese Anordnung erleichtert die Anwendung des Abtastsystems als ein Hilfsmittel zum Füllen der Antigen- und Antikörperbohrungen. Zu diesem Zweck wird eine digitalgesteuerte Verteilvorrichtung in ortsfester, jedoch versetzter Beziehung zur Abtastvorrichtung angeordnet. Videosignale aus der Abtastvorrichtung werden in den Rechner eingespeist, der in geeigneter Weise programmiert ist, damit er die Formen der individuellen Bohrungen erkennt, oder damit maschinell ablesbare Symbole, die ihnen zugeordnet sind, identifiziert werden können.

Wenn die die Plattform tragende Abtastvorrichtung und Verteilvorrichtung rechnergesteuert über die Plättchen bewegt wird, kann sie auf einfache Weise angehalten werden, wenn die Achse der Abtastvorrichtung genau über einer ausgewählten Antigenbohrung angeordnet ist. Die Plattform kann dann um einen festen Zuwachsanteil bewegt werden, um die Verteilerspitze über der Bohrung zu zentrieren, so daß die korrekte Füllung exakt in die Bohrung eingebracht wird.

Wenn alle Bohrungen auf diese Weise mit den entsprechenden Antigenlösungen gefüllt sind, wobei die Verteilvorrichtung zwischen den Vorgängen gewaschen wird, wird die Elektrophorese eingeleitet. Ein ähnlicher Füllvorgang wird typischerweise ausgeführt, um die Antikörperbohrungen zu füllen, entweder nach Beendigung der Elektrophorese, oder unmittelbar nach dem Füllen der Antigenbohrungen, falls die Elektrophorese weggelassen wird. Nach der gewünschten Zeitdauer für die Diffusion wird die gleiche Abtastvorrichtung nacheinander an alle Positionen, an denen Ausfällzonen abgetastet werden sollen, über die gesamte Anordnung der Plättchen bewegt.

Das Abtastvermögen der Abtasteinrichtung wird vorzugsweise auch zum Abtasten der Anordnung von Plättchen vor dem Füllen der Bohrungen verwendet. Der Computer wird so programmiert, daß er die beobachteten Positionen der Antigen- und Antikörperbohrungen vergleicht, wobei jede Abweichung von der Gleichförmigkeit von Dimensionen oder relativen Positionen unter den Plättchen der Anordnung aufgezeichnet wird. Ein Plättchen oder eine individuelle Bohrung, die zu weit von der Norm abweicht, kann dann automatisch während des Füllvorganges ausgelassen werden; kleinere Abweichungen können durch automatisches Aufgeben geeigneter Korrekturen an die Parameterwerte, die letztlich von dem Computer abgeleitet werden, kompensiert werden.

Der anfängliche Zonenabtastvorgang weist in typischer Weise eine Anfrage durch den Computer für Videoinformation bei aufeinanderfolgenden Erkundungsadressen mit einem ausgewählten .v-Wert und mit y-Wer- ten auf, die fortschreitend um ein bestimmtes Intervall über den Bereich, in welchem die Zonenbildung vorgenommen ist, auftritt. Die Videointensitätswerte, die vom Register aufgenommen werden, werden mit x, j\ und i-Daten für jeden erkundeten Punkt gespeichert. Nach jeder solchen v-Abtastung wird die x-Koordinate um ein bestimmtes Intervall verschoben, und es wird eine ähnliche 3'-Abtastung durchgeführt, und die Resultate werden aufgezeichnet, bis die gesamte interessierende Fläche überstrichen worden ist. Jeder aufgenommene Intensitätswert wird in typischer Weise mit den vorher aufgenommenen und gespeicherten Werten verglichen. Wenn die beobachteten Intensitätsänderungen eine bestimmte Schwellwertcharakteristik einer Hintergrundfläche übersteigen, wodurch das Vorhandensein einer Ausfällzone angezeigt wird, wird jeder lntensilätswert innerhalb der Zone auf diese Weise im Speicher bezeichnet. Auch wird für jede v-Abtastung das Intensitätsmaximum beim Kreuzen der Zone identifiziert und aufgezeichnet, wobei die Zonenachse in Form von Serien von v-Werten bei gleichförmig versetzten .v-Werten aufgebaut wird. Die Endpunkte einer jeden Zone werden in typischer Weise als die End-.v-Werte in jeder Richtung identifiziert, bei denen ein Intensitätsmaximum identifiziert wurde. Wenn eine genauere Lokalisierung der Endpunkte erwünscht ist, wird der Computer so instruiert, daß er weitere Abtastungen in einem definierten Bereich um jeden Endpunkt bei reduzierten .v- und v-Intervallen durchführt.

Wenn die vorhandenen Ausfallzonen so angeordnet und aufgezeichnet werden, werden direkte arithmetische Vorgänge auf den gespeicherten Daten durchgeführt, wodurch der beschriebene Intensitätssummenparameter I_x für jede Querabtastung einer Zone in der ^-Richtung erhalten wird; eine Addition dieser Werte ergibt den Gesamtintensitätsparameter I_x für die Zone. Eine Subtraktion der .r-Werte an den Zonenenden ergibt den Parameter L. Zusätzliche Parameter können durch entsprechende Rechnung erzielt werden, falls dies erwünscht ist.

Die beschriebenen Messungen werden vorzugsweise als ein einheitlicher Vorgang auf einem kompletten Satz von Plättchen durchgeführt, der eine oder mehrere unbekannte Proben und ferner einen Satz von bezogenen Normlösungen der oben beschriebenen Art und ausreichend vollständig zur Ermöglichung einer Bewertung der unbekannten Proben enthält. Nach jeder Abtastung eines solchen Plättchensatzes wird der Computer vorzugsweise so gesteuert, daß er Konzentrationswerte für jedes der Proteine, für die Ausfailzonen festgestellt wurden, ableitet. Wenn vorzugsweise Mehrfachstandarddurchläufe angeschlossen sind, kann der wahrscheinliche experimentelie Fehler für jeden berechneten Konzentrationswert abgeleitet werden. Computerprogramme für solche Berechnungen sind bekannt. Es werden vorzugsweise von der Konzentration eines jeden Proteins in der Probe mehrere unabhängige Bestimmungen gemacht, typischerweise durch Bezugnahme auf unterschiedliche Parameter; dann wird ein Mittelwert berechnet, wobei jeder Wert in der üblichen Weise entsprechend dem wahrscheinlichen Fehler bewertet wird.

Wenn der berechnete wahrscheinliche Fehler für diesen Mittelwert innerhalb des bestimmten Bereiches für die jeweilige zu betrachtende Probe liegt, sind keine weiteren Messungen erforderlich. Der Rechner erzeugt dann einen herkömmlichen Ausdruck oder eine andere Aufzeichnung der Endergebnisse zusammen mit so vielen ursprünglichen Daten, wie durch das Programm angefordert werden. Beispielsweise kann der Wissenschaftler, für den die Analyse durchgeführt wird, eine vollständige Kopie aller Daten auf Magnetband o. dgl. für eine mögliche künftige Bezugnahme für erforderlich halten, auch können Fotografien des Immundiffusionsplättchens angefertigt werden, entweder direkt oder unter Verwendung der Monitorröhre.

Gewöhnlich ermöglicht ein Abtastzyklus keine entsprechende quantitative Bestimmung eines Proteins, wenn dieses nicht in hoher Konzentration vorliegt. Nach einer entsprechenden zusätzlichen Inkubationsdauer, die von wenigen Minuten bis zu einer Stunde oder mehr dauern kann, wird der vorbeschriebene Abtastvorgang wiederholt, typischerweise für den gesamten Satz von Testplättchen und die entsprechenden Normen. Der Computer wird typischerweise so instruiert, daß er Plättchenflächen erkundet, in denen Zonen erwartet waren, jedoch während der vorausgehenden Abtastung nicht gefunden wurden, ferner auch Bereiche, die den vorausgehend gefundenen und aufgezeichneten Ausfallzonen entsprechen, wodurch vorzugsweise eine bestimmte Expansion oder Bewegung dieser Zonen ermöglicht wird, die in das Progrann auf der Basis der vorausgehenden Erfahrung eingeführt worden sind. Somit können die Computervorgänge eine Kontinuität der Behandlung der entsprechenden Proteinzonen zwischen einer Abtastung und der nächsten aufrechterhalten.

Gelegentlich liegen zwei Ausfällzonen aufgrund ihrer unterschiedlichen Proteine so nahe beieinander, daß ihr normales Wachstum letztlich eine Überlappung erzeugt.

Für durch Immunelektrophorese erzeugte Zonen tritt ei'.*e solche Überlappung normalerweise an den oder in der Nähe der Zonenenden auf und führt zu Überschneidungen der Zonen, wie dies in typischer Wehe für die Zonen α und b der F i g. 1D gezeigt ist. Wenn eine Immundiffusion ohne anfängliche Fraktionierung durchgeführt wird, tendiert die Überlappung dazu, daß sie auf die Zonenmittelteile begrenzt ist, als ob Zonen d\mü d dieser Figur zusammenwachsen. Der Computer wird dabei so programmiert, daß er eine solche Zonenüberlappung vorwegnimmt, damit er sie erkennt, wenn sie aufgetreten ist, und dann entsprechende Modifikationen in dem Vorgang durchführt, der zur Ableitung der verschiedenen Parameter verwendet wird.

Wenn die zu betrachtenden Proteine so beschaffen sind, daß Überlappungen erwartet werden, wird jede Platte in typischer Weise in einer frühen Stufe der Zonenentwicklung abgetastet, bevor Zonenüberlappungen aufgetreten sind (Fig. IB). Die Zonenachse und die Endpunkte können dann eindeutig angeordnet werden. Der Computer wird zweckmäßigerweise als Teil der regulären Verarbeitung einer jeden Abtastung zur Prüfung auf tatsächliche Überlappungen programmiert, z. B. durch Vergleichen der .v-, .v-Koordinaten für jeden gemessenen Punkt einer Zonenachse mit denen für die benachbarten Zonen, wobei eine Koinzidenz innerhalb eines bestimmten Schwellwertes eine Überlappung anzeigt. Alle Abtastungen weisen vorzugsweise eine Prüfung auf mögliche Überlappungen auf. Beispielsweise extrapoliert der Computer jede Zonenachse über die beobachteten Endpunkte hinaus und vergleicht die extrapolierten Achsenpunkte benachbarter Zonen. Eine solche Achsenextrapolation kann eine einfache lineare Verlängerung in Richtung der Achsenneigung in der Nähe eines jeden Endes aufweisen. Andererseits kann die beobachtete Zonenachse durch eine Parabel oder durch eine andere Kurve angepaßt weiden, die dann exakt extrapoliert werden kann.

Eine Zonenüberlappung kann auch dadurch angezeigt werden, daß die Geschwindigkeit der Änderung der Neigung der Zonenachse oder der Krümmungsradius der Achse an einer Reihe von Gruppen längs der Zone berechnet wird. Jede Abweichung von der normalerweise gleichmäßigen Änderung dieser Funktionen gibt an, daß die Zone aus zwei oder mehr sich überlappenden Zonen bestehen kann.

Wenn eine tatsächliche Überlappung auf einer Hälfte einer Zone festgestellt wird, kann häufig eine genügend genaue Kompensation durch einfachen Austausch der beobachtenden Intensitätswerte in dem Überlappungsbereich gegen Werte, die an den entsprechenden Punkten der anderen Hälfte der Zone beobachtet werden, vorgenommen werden. Eine derartige Korrespondenz zwischen zwei Punkten für Zonen aufgrund der immunelektrophorese ist typischerweise als gleicher \-Abstand auf entgegengesetzten Seiten von .Y₉ des Punktes engster Annäherung an die Antikörperbohrung und für Zonen aufgrund der direkten Immundiffusion als gleich einem i-Abstand auf entgegengesetzten Seiten der Zonenachse definiert. Die Achse innerhalb des Überlappungsbereiches kann üblicherweise durch Extrapolation festgelegt werden.

Falls erwünscht, stehen kompliziertere und genauere Kompensationsverfahren zur Verfügung. Beispielsweise wird der Computer so instruiert, daß er die Messung an der ausgewählten symmetrisch angeordneten Stelle der nicht beeinflußten Hälfte der Zone so einstellt, daß jede tatsächliche Abweichung von der Symmetrie der Zone berücksichtigt wird. Diese Unsymmetrie kann beispielsweise dadurch festgelegt werden, daß die Werte, die für die beiden Punkte während einer vorausgehenden Abtastung vor der Überlappung erhalten wurden, verglichen werden, und daß das Verhältnis dieser Werte als ein Korrekturfaktor eingeführt wird.

Ein weiteres AusführungsbeispieJ eines Kompensationsvorganges berücksichtigt auch den Intensitätswert, der tatsächlich im Bereich der Überlappung gemessen wird, der natürlich teilweise durch eine Zone und teilweise durch die andere bedingt ist. Der Computer wird so instruiert, daß er den beobachteten Wert an jeder Stelle der Überlappung in einem entsprechenden Verhältnis teilt. Ein entsprechendes Annäherungsverhältnis kann durch Vergleichen gemessener Werte für die beiden Zonen an in entsprechenden symmetrisch angeordheten, bereits beschriebenen Stellen erhalten werden, entweder mit der oder ohne die beschriebene Einstellung dieser Werte.

Wenn immer es möglich ist, ist es zweckmäßig, zwei oder mehr getrennte Berechnungsmethoden zur Kompensierung von Überlappungsbereichen vorzunehmen, die Resultate zu mitteln und den wahrscheinlichen Fehler zu bestimmen. Der Bereich der Überlappung ist jedoch gewöhnlich ein kleiner Bruchteil der gesamten Fläche einer Zone. Auf diese Weise brauchen selbst verhältnismäßig große Fehler bei der Annäherung an den echten Wert innerhalb der Überlappung das Endresultat nicht erheblich zu beeinflussen.

Auch ist es fürjede der beschriebenen Arten von Überlappung üblicherweise möglich, die Bestimmung der Proteinkonzentration in Form von Parametern vorzunehmen, die durch Teile der Zone bestimmt sind, welche durch die Überlappung nicht beeinflußt wird. Somit sind die vorzugsweise verwendeten Messungen die in der Nähe der Zonenmitte für Vorgänge ähnlich der Immunelektrophorese, und die in der Nähe der Zonenenden für Vorgänge ähnlich der direkten Immundiffusion.

Werte für die Parameter, die keine Reihe von Messungen bei aufeinanderfolgenden Inkubationszeiten erfordern, können beispielsweise aus Messungen erhalten werden, die durchgeführt worden sind, nachdem der Inkubationsvorgang ein weitgehendes Gleichgewicht erreichen konnte. Solche Messungen haben den Vorteil, daß die Zonenkonfigurationen scheinbar statisch sind, und daß die exakte Meßdauer deshalb nicht kritisch ist. Als weiteres Beispiel können bei einer gewünschten Inkubationsstufe die Ausfällzonen in bekannter Weise mit einem geeigneten Farbstoff gefärbt werden, und es können dann Zonenmessungen unter Verwendung selektiv übertragenen Lichtes durchgeführt werden. Dieses Meßverfahren ist üblicherweise besonders zweckmäßig, nachdem ein Gleichgewicht erzielt worden ist. da es dann nicht erforderlich ist, eine exakte Meßdauer zuzuweisen.

Vorstehend sind Verfahren beschrieben worden, mit deren Hilfe Immundiffusion. Immunelektrophorese und analoge Vorgänge verwendet werden können, um echte quantitative Messungen der Konzentrationen individueller Proteine in biologischen Flüssigkeiten zu erzielen. Die tatsächliche Verwendung der beschriebenen Verfahren hat gezeigt, daß Proteinkonzentrationen innerhalb von 5 % oaer besser bestimmt werden können. Die Erfindung stellt somit eine effektive und zweckmäßige Methode zur Herstellung einer großen Vielfalt von experimentellen und diagnostischen Bestimmungen dar.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren, bei dem ein Antigen und ein spezifischer Antikörper in reaktiven Kontakt etwa parallel zu einer Achse und durch einen Bereich eines tragenden Mediums diffundieren, das zu Beginn frei von beiden Reaktanten ist, und eine längliche Präzipitationszone bilden, dadurch gekennzeichnet, daß zur quantitativen Messung der Konzentration eines Proteins in einer Antigenprobe die Präzipitationszone durch eine optische Einrichtung abgetastet wird, um elektrische Signale zu erzeugen, die die zweidimensionale Anordnung von Positionen repräsentieren, welche teilweise innerhalb und teilweise außerhalb der Präzipitationszone verteilt sind, daß elektronisch aus den elektrischen Signalen der Wert eines ausgewählten Parameters der Präzipitations'zone abgeleitet wird, der sich in charakteristischer Weise mit der Proteinkonzentration ändert, und daß der resu!- tierende Parameterwert mit einem Satz von Bezugsparameterwerten von Bezugszonen verglichen wird, die durch äquivalente Immundiffusion einer Vielzahl von Bezugsantigenlösungen erzeugt werden, die jeweils bekannte Konzentrationen des Proteins enthalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Immundiffusion die Antigenprobe einer ausgewählten Proteinwanderung in einer Richtung etwa senkrecht zur Achse unterzogen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der ausgewählte Parameter der Abstand zwischen den Enden der Präzipilationszone ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Präzipitationszone in Querrichtung längs einer Vielzahl von zueinander im Abstand versetzten parallelen Abtastpfaden abgetastet wird, die sowohl Abtastpfade einschließen, welche die Zone kreuzen, als auch solche, die jenseits der Enden der Zone liegen, daß die elektrischen Signale verglichen werden, um Abtastpfade in der Nähe der entsprechenden Zonenenden auszuwählen, und daß der Abstand der ausgewählten Abtastpfade voneinander bestimmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Parameter die integrierte Zonenintensität ist. daß die elektrischen Signale die Lichtintensität an den entsprechenden Positionen der zweidimensionalen Anordnungen repräsentieren, und daß das Ableiten eines Parameterwertes die Summierung von Signalwerten an Positionen innerhalb der Zone umfaßt, die in Hinblick auf Werte an benachbarten Positionen außerhalb der Zone korrigiert sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Parameter die Zeit des ersten Auftretens der Präzipitationszone ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zone wiederholt abgetastet wird, wenn sie sich entwickelt, und daß ein Wert eines f>o zweiten Parameters aus den elektrischen Signalen für jede Abtastung erzeugt wird, wobei der zweite Parameter sich in charakteristischer Weise in Abhängigkeit von der Zeit ändert und zum Zeitpunkt des ersten Auftretens der Zone einen bekannten Wert hat, und wobei die resultierenden Werte des zweiten Parameters in der Zeit auf den bekannten Wert zurück extranoliert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Parameter der Abstand zwischen den Enden der Präzipitationszone ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Parameter die integrierte Zonenintensität ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein optisches Bild der abgetasteten Präzipitationszone an der Bildfläche einer Videokameraröhre erzeugt wird, dessen Intensität an jeder Position eine digitale Darstellung repräsentiert, und daß in einem einem digitalen Rechner zugeordneten Speicher die digitalen Darstellungen und die digitalen Adressen, die die entsprechenden Bildpositionen identifizieren, gespeichert werden.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Schirm einer Kathodenstrahlröhre ein Bild erzeugt wird, das auf die elektrischen Signale anspricht und diese Präzipitationszone darstellt.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß das Abtasten der Präzipitationszone während des Entstehens der Zone wiederholt durchgeführt wird, und daß die elektrischen Signale Lichtintensitätsmessungen an einer Vielzahl von Positionen, λ- und v-Koordinatenwerte an den entsprechenden Positionen, und den jeweiligen Messungen entsprechende Zeitwerte darstellen.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes Signal aus den elektrischen Signalen gewonnen wird, das sich mit zunehmender Proteinkonzentration erhöht, daß ein zweites Signal gewonnen wird, das mit zunehmender Proteinkonzentration abnimmt, und daß als kombiniertes Parametersignal ein drittes Signal gewonnen wird, das entgegengesetzt zu den ersten und zweiten Signalen anspricht.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekenzeichnet, daß das kombinierte Parametersignal das Verhältnis der ersten und zweiten Signale darstellt.

15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Anordnung von Positionen eine erste Position innerhalb der Präzipitationszone auf deren einer Seite und in einem Bereich der Überlappung mit einer anderen Zone aufweist, daß ein elektrisches Signal an einer zweiten Position erzeugt wird, die entsprechend auf der anderen Seite der ersten Zone und in einem überlappungsfreien Bereich angeordnet ist, und daß dieses Signal zur Erzeugung des elektrischen Signales für die erste Position verwendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Teile der Antigenprobe durch Hinzufügen unterschiedlicher bekannter Mengen des Proteins vorder Immundiffusion eines jeden Probenteiles angereichert worden sind, und daß die resultierende Präzipitationszone für jeden Probenteil den Schritten des Abtastens, des Erzeugens von Parameterwerten und des Vergleichens der resultierenden Parameterwerte mit dem Satz von Bezugsparameterwerten unterzogen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die resultierenden Parameterwerte für die entsprechenden P.uoenteile in Abhängigkeit von den hinzugefügten Proteinkonzentrationen registriert werden sowie die resultierenden Kurve extrapoliert wird, einen Wert für die Proteinkonzentration in der ursprünglichen Probe zu erhalten.

18. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällzone vor dem Abtasten der Präzipitationszone mit einem Farbstoff gefärbt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß elektronisch aus den elektrischen Signalen der entsprechende Wert eines weiteren Parameters der Präzipitationszone abgeleitet wird, der sich in charakteristischer Weise von dem ersten Parameter bu Vorhandensein bestimmter Abnormalitäten des Proteins unterscheidet, und daß die Werte des ersten Parameters und des weiteren Parameters miteinander verglichen werden, um das Vorhandensein einer selchen Abnormalität anzuzeigen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Parameter im wesentlichen die integrierte Zonenintensität und der andere Parameter die Zeit des ersten Auftretens der Präzipitationszone enthält, und daß die Parameterwerte in bezug auf die entsprechenden Proteinkonzentrationen verglichen werden.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der eine Parameter und der weitere Parameter Intensitätssummen sind, die sich über die Präzipitationszone bei entsprechenden, im Abstand versetzten Positionen längs der Zonenlänge erstrecken.

22. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß elektronisch aus den elektrischen Signalen die entsprechenden Werte der Zonenkurve bei einer Vielzahl von Zonensegmenten abgeleitet werden, und daß die Werte als eine Funktion der Segmentpositionen längs der Zonenlänge verglichen werden, um das Vorhandensein einer Proteinabnormalitäi anzuzeigen.