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"Doppelrezeptor-Immunfluoreszenztest und Testpackung"
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Die Erfindung betrifft ein empfindliches Verfahren zur qualitativen
und quantitativen Bestimmung der Anwesenheit einer großen Anzahl von physiologisch
aktiven organischen Verbindungen (Liganden) und deren Rezeptoren. Bei diesem Verfahren
wird eine Verbindung von ähnlicher Struktur wie die zu bestimmende Verbindung (Ligandenanaloges)
an eine fluoreszierende Verbindung (im folgenden in Anlehnung an den englischen
Sprachgebrauch auch als Fluorescer bezeichnet) gebunden. Die unbekannte Verbindung
wird als Ligand bezeichnet, das Konjugat aus strukturell ähnlicher Verbindung und
Fluorescer wird als Ligandenanaloges-Fluorescer und Verbindungen, die eine spezifische
Struktur erkennen und eine Bindung mit dieser eingehen, werden als Rezeptoren bezeichnet
und sind im allgemeinen Antikörper.
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Bei der Bindung an einen Antikörper erleidet der Fluorescer im Vergleich
zum ungebundenen Zustand eine Veränderung der Quantenausbeute oder seiner Emissions-
und/oder Absorptionsspektren oder alle diese Veränderungen gleichzeitig. Zur Durchführung
des Tests ist es lediglich erforderlich, daß eine Änderung der Emissionsintensität
bei einer bestimmten Wellenlänge oder einer Bande von Wellenlängen eintritt.
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Die Geschwindigkeit, mit der der Fluorescer-Antikörper an den Fluorescer-Teil
des Ligandenanalogen-Fluorescers gebunden wird, oder die Menge des Fluorescer-Antikörpers,
der an den Fluorescer-Teil des Ligandenanalogen-Fluorescers im Gleichgewichtszustand
gebunden ist, stehen in Beziehung zur Menge des Liganden-Antikörpers,der an den
ligandenanalogen Teil des Ligandenanalogen-Fluoresccrs gebunden ist. Somit läßt
sich durch eine Kombination von Antikörpern sowohl gegen Liganden als auch gegen
Fluorescer mit Ligandenanalogem-Fluorescer und einer unbekannten Probe die Menge
des in der unbekannten Probe vorhandenen Liganden bestimmen, indem man die Emissionsintensität
bei einer bestimmten Wellenlänge oder einer Bande von Wellenlängen in Beziehung
zu Eichwerten setzt.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Fluoreszenzunterdrücker
(im folgenden auch als Quencher bezeichnet) mit einem Rezeptor konjugiert.
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Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine unbekannte Probe mit einem
Gehalt an Antiligandem mit Fluorescer-Antikörper und
Ligandenanalogem-Fluorescer
zu kombinieren und dadurch die Rezeptormenge in der unbekannten Probe zu bestimmen.
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Das Bedürfnis, die Anwesenheit von geringen Mengen an organischen
Bestandteilen nachzuweisen, nimmt ständig zu. Konzentrationen von besonderem Interesse
liegen im Bereich von etwa 10 4 bis 10 12 m oder noch darunter. Gebiete, auf denen
derartige Bestimmungen von Bedeutung sind, sind der Nachweis von mißbräuchlich verwendeten
Arzneistoffen in physiologischen Medien, die Einstellung von therapeutischen Dosen
von Arzneistoffen, die Diagnose von Krankheiten, bei denen die Anwesenheit, die
Abwesenheit oder eine bestimmte Menge eines speziellen organischen Bestandteils
für die Diagnose der Krankheit von Bedeutung sind, und die Bestimmung von Spurenbestandteilen
in Nahrungsmitteln.
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Weitere, nicht physiologische Gebiete von Interesse sind die wissenschaftliche
Forschung sowie die Bestimmung von Spurenverunreinigungen in Wasser oder anderen
Flüssigkeiten, die Qualitätskontrolle und dergl.
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Eine Möglichkeit zur Durchführung von Bestimmungen spezifischer Bestandteile
bietet der sogenannte Immuntest. Beim Immuntest wird ein Rezeptor, normalerweise
ein Antikörper, verwendet, der eine spezifische räumliche Struktur und Ladungsverteilung
(Epitop) in einem organischen Molekül erkennt. Antikörper sind relativ große Moleküle
mit einem Molekulargewicht von 150 000 oder darüber und sind ihrer Natur nach Proteine.
Somit ergibt sich bei den meisten organischen Verbindungen von Interesse durch
die
Bindung des Antikörpers mit der organischen Verbindung eine beträchtliche Erhöhung
des Molekulargewichts sowie eine Veränderung der Umgebung der organischen Verbindung
im Vergleich zu der Lösungsmittelumgebung. Bei Immuntests werden im allgemeinen
wäßrige Lösungsmittel verwendet.
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Beim Radioimmuntest erlaubt die starke Erhöhung des Molekulargewichts
die Trennung der an den Antikörper gebundenen organischen Verbindung von der nicht
gebundenen organischen Verbindung.
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Da ein radioaktives Detektormolekül vorhanden ist, läßt sich die Verteilung
der organischen Verbindung zwischen gebundenem und ungebundenem Zustand bestimmen.
Diese Verteilung steht in Beziehung zur Konzentration der organischen Verbindung
in der unebkannten Probe.
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Ein zweites Verfahren ist der sogenannte Spinimmuntest, der von der
Firma Syva Company unter der Handelsbezeichnung FRAT vertrieben wird. Bei diesem
Test wird eine stabile freiradikalische Verbindung an eine Verbindung, die der unbekannten
organischen Verbindung gleicht, gebunden. Die Spinstärke der spinmarkierten Verbindung
in der Lösung beeinflußt die Stärke des Elektronenspinresonanzspektrums. Wenn die
spinmarkierte Verbindung an einen Antikörper gebunden ist, ist die Kreiselbewegung
wesentlich langsamer als bei der ungebundenen Verbindung. Aus der Peakhöhe des Elektronenspinresonanzspektrums
kann man durch Vergleich mit bekannten Standards die Menge der in der Lösung vorhandenen
unbekannten Verbindung bestimmen.
Bei einem weiteren Verfahren
werden Enzyme als Detektoren verwendet. Dabei wird ein Enzym an die unbekannte Verbindung
gebunden. Ein derartiger Test wird von der Firma Syva Company unter der Handelsbezeichnung
EMIT vertrieben. Durch die Bindung der enzymgebundenen Verbindung an einen Antikörper
ergibt sich eine wesentliche Verringerung der Enzymaktivität.
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Somit kann man durch Messung der Enzymaktivität und durch Vergleich
mit einem Standard die Menge der unbekannten Verbindung in der Lösung bestimmen.
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Beispiele für Immuntests sind in den US-PSen 3 709 868, 3 690 834
und 3 654 090 und in der DT-AS 2 223 385 angegeben.
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Ferner wird auf die Arbeiten von Ludwig Brand und James R.
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Gohlke, "Fluorescene Probes for Structure, Annual Review of Biochemistry,
Bd. 41 (1972), S. 843 bis 868; und Stryer, Science, Bd. 162 (1968), S. 526, verwiesen.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen
Nachweis einer organischen Verbindung, für die ein Rezeptor, im allgemeinen ein
Antikörper, zur Verfügung steht oder hergestellt werden kann, sowie ein Verfahren
zum quantitativen Nachweis von Rezeptoren zur Verfügung gestellt. Die organische
Verbindung wird nachstehend als Ligand bezeichnet.
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Folgende Reagenzien werden verwendet: (1) Ligandenanaloges-Fluorescer(L.A.-F.),
bei dem der Ligendenteil im wesentlichen das gleiche Epitop wie der Ligand
aufweist,
(2) Antikörper für den Liganden (Antiligand), entweder zugesetzt oder in der unbekannten
Probe, und (3) Antikörper für den Fluorescer (Antifluorescer), vorzugsweise mit
mindestens einem daran gebundenen Quenchermolekül.
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Wenn die Reagenzien mit der unbekannten Probe in einem wäßrigen Medium
bei einem entsprechenden pH-Wert vereinigt werden, so steht das sich ergebende Emissionsspektrum
in bezug zur Menge des in der Lösung vorhandenen Liganden oder Antiliganden.
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Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Menge des an den Antifluorescer
gebundenen Fluorescers in bezug zur Menge des Liganden in der unbekannten Probe
steht. Bestimmt wird die Differenz im Emissionsspektrum zwischen ungebundenem Fluorescer
und an den Antikörper gebundenen Fluorescer.
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Somit wird erfindungsgemäß ein neues und empfindliches Verfahren zum
Nachweis einer großen Anzahl von organischen Verbindungen, für die ein Rezeptor
zur Verfügung steht oder hergestellt werden kann, oder zum Nachweis des Rezeptors
selbst bereitgestellt. In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren für Antigene
oder Haptene als Liganden, deren Anwesenheit oder Konzentration bestimmt werden
soll, verwendet. Ein entsprechendes Reagenz wird hergestellt, indem man eine Verbindung,
die mindestens ein Epitop mit dem Liganden gemeinsam hat (nachstehend als Ligandenanaloges
bezeichnet) mit einem Fluorescer kombiniert.Das Ligandenanaloge weist im allgemeinen
eine im wesentlichen gleiche räumliche Beschaffenheit und Ladungsverteilung
wie
der Ligand auf, so daß er in der Lage ist, in ausreichendem Maße mit dem Liganden
um die Rezeptorstellen, beispielsweise Antikörperstellen, zu konkurrieren.Das Epitop
des Ligandenanalogen befindet sich in ausreichender Nähe zum Fluorescer, so daß
zum Großteil der Antikörper gegen den Fluorescer und der Antikörper gegen den Liganden
sich nicht gleichzeitig am gleichen Molekül befinden können. Wenn das Konjugat aus
Ligandenanalogem und fluoreszierender Verbindung (Ligandenanaloges-Fluorescer) in
Lösung mit einem Antikörper gegen den Fluorescer und einen Antikörper gegen den
Liganden vereinigt wird, stellt sich ein Gleichgewichtszustand ein, der in Beziehung
zu den Bindungskonstanten der beiden Antikörper steht. Wird ein Ligand in die Lösung
eingebracht, so verändert sich das Gleichgewicht zwischen Antikörpern und Ligandenanalogem-Fluorescer,
da die wirksame Konzentration des Antikörpers gegen das Ligandenanaloge verringert
wird.
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Das Emissionsspektrum des Fluorescers wird durch dessen Umgebung beeinflußt.
Somit verändert sich das Emissionsspektrum eines an einen Antikörper gebundenen
Fluorescers im Vergleich zu ungebundenem Fluorescer. Diese Veränderung kann sich
durch eine Änderung in der Quantenausbeute oder im Emissions- oder Absorptionsspektrum
ergeben. Durch Berücksichtigung einer einzelnen Wellenlänge, durch Vergleich der
relativen Intensitäten von zwei Wellenlängen oder durch Integration einer Bande
vorhandene Ligand von Wellenlängen läßt sich der in einer unbekannten Probe / qualitativ
oder quantitativ bestimmen, indem man die Signalintensität
mit
der Signalintensität eines Standards vergleicht.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antifluorescer mit
einem Fluoreszenzunterdrücker (Quencher) für den Fluorescer konjugiert. Ein Quenchermolekül
ist in der Lage, die Fluoreszenz zu hemmen, wenn es innerhalb einer geringen Entfernung,
im allgemeinen weniger als etwa 100 Å, zum Fluorescermolekül vorliegt, indem es
Energie, die ansonsten als fluoreszierendes Licht emittiert wurde, aufnimmt. Das
Quenchermolekül weist eine Absorptionsbande auf, die sich mit der Emissionsbande
des Fluorescermoleküls überlappt. Das Quenchermolekül trägt zu einer weiteren Verringerung
der Fluorescenz der an Rezeptoren gebundenen Fluorescermoleküle bei. Auf diese Weise
wird der Hintergrund, der sich aus restlicher Fluoreszenz von durch Antifluorescer
gebundenem Fluorescer ergibt, weiter verringert.
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Die nachstehenden Gleichungen erläutern die verschiedenen Reaktionen,
die beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Liganden ablaufen: In Abwesenheit
von Liganden:
In Anwesenheit von Liganden ergibt sich die zusätzliche Reaktion:
Dabei haben die einzelnen Symbole folgende Bedeutungen: L.A-F:
an Fluorescer (F) gebundenes Ligandenanaloges (L.A.) X/Y: X gebunden an Y, d.h.
Antikörper gegen Fluorescer (Ab) gebunden an Fluorescer (F) hvr: Photon;die Indizes
1 und 2 geben- Licht von verschiedener Emissionsintensität an * : angeregter Zustand.
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Bei einer Lösung mit einer festen Konzentration an L.A-F, Fluorescer-Antikörper
(Antifluorescer) und Liganden-Antikörper (Antiligand), ist es offensichtlich, daß
die Anwesenheit des Liganden die zur Verfügung stehende Menge an Antiligandem verringert,
so daß der Gleichgewichtszustand, der in Abwesenheit des Liganden vorliegt, verändert
wird. Da die Emissionsintensität und/oder die Wellenlängen des emittierten Lichts
für an Antikörper gebundenen Fluorescer im Vergleich zu ungebundenem Fluorescer
verschieden sind, verändert sich das Emissionsspektrum in Abhängigkeit von der Menge
des in der Lösung vorhandenen Liganden.
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Bei der Durchführung einer Bestimmung können die Reagenzien in beliebiger
Reihenfolge kombiniert werden. Es gibt jedoch bestimmte Gesichtspunkte, aufgrund
derer bestimmte Reihenfolgen der Zugabe bevorzugt werden. Es wurde beispielsweise
festgestellt, daß die Verdrängung relativ langsam abläuft, d.h. daß nach der erfolgten
Bindung des Liganden oder des Ligandenanalogen an einen Antikörper die Verdrängung
des einen
durch das andere relativ langsam abläuft. Da sowohl der
Ligand als auch das Ligandenanaloge stark an den Antikörper gebunden sein können,
können die Bindungskonstanten dieser beiden Bindlmgen stark variieren. Wäre daher
die Bindungskonstante des Ligandenanalogen wesentlich höher als die des Liganden
im Gleichgewichtszustand, so könnte die Menge an Ligandem, der das Ligandenanaloge
verdrängt hat, sehr gering sein. Dadurch würde das Verfahren mit einer großen Ungenauigkeit
behaftet sein.
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Ferner ist es für das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich, daß die
Anwesenheit des an das Ligandenanaloge gebundenen Antiliganden die Bindung von Antifluorescer
an Fluorescer blockiert.
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Da die Verdrängung des Antiliganden vom Ligandenanalogen durch den
Antifluorescer langsam abläuft und die Bestimmung auf der Verteilung von gebundenem
und ungebundenem Fluorescer beruht, werden im allgemeinen Antiligand und Ligandenanaloges-Fluorescer
vor der Zugabe von Antifluorescer vereinigt.
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Angesichts der vorstehenden Uberlegungen gibt es zwei hauptvarianten
für das normale Vorgehen bei der Zugabe der Reagenzien: Vereinigen von unbekannter
Probe und Antiligandem und anschließende Zugabe von Ligandenanalogem-Fluorescer;
und Vereinigung von unbekannter Probe, Ligandenanalogem-Fluorescer und Antiligandem.
Wenn nach dem Stehenlassen oder Inkubieren ein relativ stabiler Zustand erreicht
ist, entweder in bezug auf eine reproduzierbare Veränderung in der Konzentration
der verschiedenen Reakti.onsspezies pro Zeiteinheit oder in bezug auf konstante
Konzentrationen bei den verschiedenen Reaktionsspezies,
kann der
zugängliche Fluorescer mit gegebenenfalls in Uberschuß zugesetztem Antifluorescer
titriert werden. Im allgemeinen beträgt die zwischen den Zugaben der Reagenzien
erforderliche Zeit weniger als etwa 2 Stunden.
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Der Wert läßt sich als der nach einer bestimmten Zeit erhaltene Wert
(Geschwindigkeit) oder als ein Wert, der sich relativ lang nicht oder nur sehr langsam
verändert, bestimmen.
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Im letztgenannten Fall wird im allgemeinen ein echtes Gleichgewicht
nicht erreicht, sondern vielmehr eine Antikörperverteilung, bezogen auf relative
Konzentrationen der verschiedenen Spezies anstatt auf relative Bindungskonstanten.
Erfindungsgemäß kann dies al s als Gleichgewichtszustand betrachtet werden, da sich
der abgelesene Wert nur sehr langsam mit der Zeit verändert.
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Durch Bestimmung des Emissionsspektrums unter Verwendung einer besonderen
Lichtquelle konstanter Intensität und durch Beobachtung der Emissionsintensität
bei einer speziellen Wellenlänge oder einer speziellen Bande von Wellenlängen kann
man das Ergebnis in Beziehung zu bekannten Standards setzen. Bei der Ausführung
des Verfahrens mit unbekannten Proben, was im wesentlichen auf die gleiche Weise
wie mit den Standards geschieht, läßt sich eine qualitative oder quantitative Bestimmung
der Menge des in der unbekannten Probe enthaltenen Liganden erreichen.
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Will man die Menge des Antiliganden bestimmen, so kann die unbekannte,
vermutlich den Antiliganden enthaltende Probe mit L.A.-F vereinigt und anschließend
der Antifluorescer zugesetzt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit sämtliche
drei Komponenten gleichzeitig zu vereinigen. Im allgemeinen wird der L.A.-F und
der Antifluorescer vor der Zugabe der unbekannten Probe nicht vereinigt und inkubiert.
Die Konzentrationen an L.A.-F und Antifluorescer werden proportional zum in Frage
kommenden Konzentrationsbereich des Antiliganden innerhalb der für die Ligandenbestimmung
gegebenen Verhältnisse verändert.
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Die bestimmbaren Ligandenkonzentrationen betragen etwa 10 bis 10'12
m und insbesondere etwa 10-5 bis 10-11 m. Die Konzentration an Ligandenanalogem-Fluorescer
variiert ebenfalls im gleichen Bereich und unterscheidet sich im allgemeinen um
nicht mehr als einen Faktor von 100 vom in Frage kommenden Konzentrationsbereich.
Die Antikörperkonzentrationen betragen im allgemeinen 0,5 bis 1000 : 1 = Anzahl
der bindenden Stellen pro Mol Ligandenanaloges-Fluorescer. Vorzugsweise beträgt
dieser Bereich 1 bis 10 : 1. In der US-PS 3 690 834 ist ein Verfahren zur Bestimmung
der bindenden Stellen beschrieben.
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Das Molverhältnis von Antikörper zu Ligandenanalogem und Fluorescer
hängt stark von der Bindungskonstanten des Antikörpers ab.
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Wie bereits angedeutet, wird normalerweise ein wäßriges Medium mit
einem Gehalt an nicht mehr als etwa 20 Volumprozent eines
organischen
polaren Lösungsmittels verwendet. Verschiedene Alkohole, Ketone, Äther und Ester
können in untergeordneten Mengen vorhanden sein.
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Der pH-Wert des Mediums liegt im allgemeinen im Bereich von 6 bis
9 und insbesondere im Bereich von 7 bis 8,5. Zur Einstellung des gewünschten pH-Werts
und zu dessen Aufrechterhaltung während der Bestimmung können verschiedene Puffer
verwendet werden. Beispiele dafür sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Barbitalpuffer.
Die Wahl des Puffers ist an sich für das erfindungsgemäße Verfahren nicht kritisch,
jedoch können in manchen Fällen bestimmte Puffer bevorzugt werden.
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Bei bestimmten Liganden und Fluorescern können geringe aber beachtenswerte
Mengen an nicht spezifischen Bindungen des Liganden oder Fluorescers an Protein
erfolgen. Aus diesem Grund beträgt die Proteinkonzentration des Testmediums vorzugsweise
weniger als 1 Gewichtsprozent und insbesondere weniger als 0,5 Gewichtsprozent und
vor allem weniger als 0,1 Gewichtsprozent.
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Die Gesamtproteinkonzentration der unbekannten Probe kann durch vorherige
Ultrafiltration, Gelfiltration, Fällung, Dialyse oder ähnliche Vorbehandlungen möglichst
gering gehalten werden.
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Im allgemeinen werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Tests
mäßige und während des Tests konstant bleibende Temperaturen angewendet. Im allgemeinen
betragen die Temperaturen etwa 15 bis 400C und vorzugsweise etwa 25 bis 400C. Höhere
Temperaturen
sind nicht erwünscht, da sie die Bindung der Antikörper
an die Epitope verringern.
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Zur Durchführung der Bestimmung wird die Testlösung in eine Fluorimeterzelle
eingebracht.Die Wahl der anregenden Wellenlänge hängt vom Fluorescer ab. Die spezielle
Wellenlänge oder Bande von Wellenlängen, bei denen das Fmissionsspektrum gemessen
wird, hängt vom Emissionsmaximum und dem Ausmaß an Störungen durch Lichtstreuung
ab. Vorzugsweise wird eine intensive Lichtquelle mit einer einzigen Wellenlänge
verwendet. Auf diese Weise können Störungen durch Lichtstreuungseffekte möglichst
gering gehalten werden. Wertvolle monochromatische Lichtquellen, die eine größere
Intensität als übliche mit einem Monochromator verbundene Lichtquellen ergeben,
sind Niederdruck-Emissionslampen und Laser.
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Das im erfindungsgemäßen Test verwendete Hauptreagenz ist das konjugierte
Molekül aus Ligandenanalogem und fluoreszierender Verbindung (Ligandenanaloges-Bluorescer).
Dieses Molekül muß mit dem Liganden um die Rezeptorstellen konkurrieren oder zumindest
in der Lage sein, spezifisch an Rezeptorstellen, die den Liganden binden, gebunden
zu werden.
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Die Bindungskonstante des Antiliganden für den Liganden soll sich
von der Bindungskonstanten für das Ligandenanaloge nicht zu stark unterscheiden.
Wenn der Ligand fluoresziert, sollte der Fluorescer bei der (den) gemessenen Wellenlänge(n)
mindestens
etwa 100 mal so groß sein wie die des Liganden bei der
höchsten zu erwartenden oder gemessenen Konzentration. Die geringere Fluoreszenz
des Liganden kann auf einem vom Fluorescer unterschiedlichen Absorptionsmaximum,
einem unterschiedlichen Emissionsmaximum oder einer wesentlich geringeren Quantenausbeute
beruhen.
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Wie bereits erwahnt, gibt es für den Llganden große Variationsmöglichkeiten.
Normalerweise weist er ein Molekulargewicht von mindestens 110 und insbesondere
von mindestens 125 auf, wobei nach oben keine Grenzen gesetzt sind, wenn auch im
allgemeinen 10 Millionen nicht überschritten werden. Was den Liganden betrifft,
so ist es wichtig, daß ein Rezeptor für den Liganden hergestellt werden kann oder
zur Verfügung steht. Im allgemeinen können Rezeptoren für die meisten organischen
Verbindungen mit polarer Funktionalität hergestellt werden. Verbindungen, für die
Antikörper durch Bindung der Verbindung an eine Verbindung mit antigenen Eigenschaften
gebildet werden können, werden als Haptene bezeichnet. Verbindungen, die ohne chemische
Modifikation die Antikörperbildung verursachen, werden als Antigene bezeichnet.
In diesem Zusammenhang wird auf Kabat u. Mitarb., Experimental Immunochemistry,
Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1967, verwiesen.
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Nicht-polymere Verbindungen von Interesse haben im allgemeinen ein
Molekulargewicht von etwa 125 bis 2000. Diese Verbindungen können sich in bezug
auf Struktur, funktionelle Gruppen und physiologische Eigenschaften stark unterscheiden.
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Es kann sich um acyclische, alicyclische oder heterocyclische, mono-
und polycyclische, Verbindungen handeln. Als Heteroatome können Sauerstoff, Stickstoff,
Schwefel, lIalogenatome, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Bor, Phosphor und Metallkationen
der Gruppen 1A und 2A des Periodensystems enthalten sein.
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Beispiele für Verbindungen mit funktionellen Gruppen sind Alkohole,
Äther, Carbonsäuren, Ester, Amide, Amine, d.h. primäre, sekundäre, tertiäre und
quaternäre Amine, Halogenverbindungen, Nitrile und Mercaptoverbindungen. Im allgemeinen
sind die Verbindungen ausschließlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff,
Halogenatomen und Phosphor und insbesondere aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff
und Stickstoff zusammengesetzt. Bei Salzen sind die entsprechenden Metall-oder Ammoniumgegenionen
vorhanden.
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Beispiele für heterocyclische Ringe, die vorhanden sein können, sind
Pyrrol, Pyridin, Piperidin, Indol, Thiazol, Piperazin, Pyran, Cumarin, Pyrimidin,
Purin, Triazin und Imidazol.
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Aufgrund der großen Unterschiede der Verbindungen, die durch den erfindungsgemäßen
Test bestimmt werden können, werden verschiedene, häufig künstliche Untergruppen
gebildet, äe nach der Anwesenheit von bestimmten funktionellen Gruppen oder Ringstrukturen,
aufgrund einer speziellen gemeinsamen Funktion oder aufgrund der Tatsache, daß die
Verbindungen als eine Klasse erkannt
wurden. Die Verbindungen der
ersten Gruppe weisen eine Aminogruppe auf und zwar entweder als Teil eines heterocyclischen
Rings oder als funktionelle Gruppe an einer aliphatischen Kette.
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Diese Verbindungen haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa
110 bis 800 und insbesondere von etwa 125 bis 650.
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Besonderes Interesse kommt unter den Verbindungen der ersten Gruppe
den Alkaloiden und deren nach der Aufnahme gebildeten Stoffwechselprodukten zu.
Eine wichtige Gruppe von Alkaloiden sind die Alkaloide der Morphingruppe. Beispiele
dafür sind Morphin, Codein, Heroin und Morphin-glucuronid.
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Verbindungen, die erfindungsgemäß als Reagenzien zum Nachweis von
Morphinalkaloiden und deren Stoffwechselprodukten verwendet werden können, weisen
zum großen Teil die folgende allgemeine Formel auf:
wobei X eine bindende Gruppe mit normalerweise 2 bis 8 Atomen (mit Ausnahme von
Wasserstoff), insbesondere mit 2 bis 4 Atomen (mit Ausnahme von Wasserstoff), die
nur Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatome enthält,
bedeutet.
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Vorzugsweise ist eine Nicht-Oxocarbonylgruppe Teil der bindenden funktionellen
Gruppe. Fl bedeutet einen nachstehend erläuterten
Fluorescer.
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Beispiele für bindende Gruppen sind die Acetamido-, Acetimidino-,
Succinat- oder Oxalatgruppe.
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Eine weitere Gruppe von Alkaloiden sind die Kokainalkaloide, zu denen,
insbesondere als Stoffwechselprodukte, Benzoyl-ecgonin und Ecgonin gehören.
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Eine weitere Gruppe von Alkaloiden sind die Cinchonaalkaloide, zu
denen Chinin gehört.
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Zu den Isochinolinalkaloiden gehört Mesealin.
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Papaverin gehört zu den Benzylisochinolinalkaloiden.
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Narcotin, Narcein und Cotarnin gehören zu den Phthalidisochinolinalkaloiden.
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Beispiele für Indolpyridocolinalkaloide sind Yohimbin und Reserpin.
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Beispiele für Ergotalkaloide sind Ergotamin und Lysergsäure.
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Weitere Gruppen von Alkaloiden sind die Strychnin-, Pyridin-, Piperidin-
und Pyrrolizidinalkaloide
Von besonderem Interesse sind die Alkaloide,
die zu den häufig mißbräuchlich verwendeten Arzneistoffen gehören, wie Morphin,
Kokain, Mescalin und Lysergsäure. Erfindungsgemäß lassen sich diese Verbindungen
oder deren Stoffwechselprodukte, äe nach der untersuchten physiologischen Flüssigkeit,
analysieren.
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Viele synthetischen Arzneistoffe kommen in ihren physiologischen Eigenschaften
ganz oder teilweise den natürlich vorkommenden, häufig mißbräuchlich verwendeten
Arzneistoffen gleich. Dazu gehören Methadon, Meperidin, Amphetamin, Methairiphetamin,
Glutethimid, Diphenylhydantoin und Arzneistoffe aus der Gruppe der Benzdiazocycloheptane,
Phenothiazine und Barbiturate.
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Catecholamine sind aufgrund ihrer physiologischen Eigenschaften von
Interesse. Dazu gehören Epinephrin, Ephedrin, I=Dopa und Norepinephrin.
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Ein weiterer Arzneistoff von Interesse ist der Tranquilizer Meprobamat.
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Weitere Verbindungen von Interesse sind Tetrahydrocannabinol, Cannabinol
und deren Derivate, hauptsächlich Verbindungen, die sich von Marihuana und seinen
synthetischen Modifikationen und Stoffwechselprodukten ableiten. Von beträchtlichem
Interesse sind auch die Steroide. Beispiele dafür sind Östrogene, Gestagene, Androgene,
Nebennierendrindenhormone, Gallensäuren, Cardiotone, Glycoide, Aglycone, Saponine
und Sapogenine.
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Eine weitere Gruppe von Verbindungen bilden die Vitamine, wie Vitamin
A, Vitamine B, z.B. B1, B6 und 312 Vitamin E und Vitamin K.
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Unter die Gruppe der Zucker fallen Mono- und Polysaccharide, insbesondere
Di- und höhere Polysaccharide.
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Eine weitere Gruppe von Verbindungen stellen die Prostaglandine dar.
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Beispiele für Verbindungen der Gruppe der Antibiotika sind Penicillin,
Actinomycin und Chlormycetin. Einzelverbindungen von besonderem Interesse sind Serotonin,
Spermin und Phenylbrenztraubensäure.
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Beispiele für Verbindungen aus der Gruppe der Pestizide sind Fungizide,
Insektizide, Bakterizide und Nematozide.
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Aminosäuren, Polypeptide und Proteine bilden eine weitere Gruppe.
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Polypeptide enthalten im allgemeinen etwa 2 bis 100 Aminosäureeinheiten
(Molekulargewicht im allgemeinen unter 12 000).
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Größere Polypeptide werden Proteine genannt und bestehen im allgemeinen
aus etwa 1 bis 20 Polypeptidketten. Polypeptide und Proteine werden zusammenfassend
als Polyaminosäuren bezeichnet.
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Unter den Aminosäuren sind die Tri- und Tetraåodthyronine von besonderem
Interesse. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verfahren, das sich zweier
Antikörper als Reagenzien
bedient, verwendeten Polyaminosäuren
weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 107 und insbesondere
104 bis 106 auf. Unter den Polypeptiden und Proteinen (Polyaminosäuren) sind Hormone,
Globuline, Antigene und Produkte mit speziellen physiologischen Aktivitäten von
besonderem Interesse.
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Die große Gruppe von Proteinen läßt sich in Proteine mit ähnlichen
strukturellen Eigenschaften, Proteine mit speziellen biologischen Funktionen und
in Proteine, die in Beziehung zu spezifischen Mikroorganismen, insbesondere krankheitserregenden
Mikroorganismen, stehen unterteilen.
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Die folgenden Proteine weisen jeweils eine verwandte Struktur auf:
Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Skleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine,
Chromoproteine, Lipoproteine, Nucleoproteine, nicht klassifizierte Proteine, wie
Somalotropin, Prolactin, Insulin und Pepsin.
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Eine Anzahl von Proteinen, die im menschlichen Plasma vorkommen, sind
von besonderer klinischer Bedeutung: Präalbumin, Albumin, a1-Lipoprotein, a1-saures
Glycoprotein, a1-Antitrypsin, a1-Glycoprotein, Transcortin, 4,6S-Postalbumin, tryptophanarmes
a1-Glycoprotein, OllX -Glycoprotein, Thyroxinbindendes Globulin, Inter-a-trypsin-Inhibitor,
Gc-Globulin: (Gc 1-1), (Gc 2-1), (Gc 2-2); Haptoglobin: (Hp 1-1), (Hp 2-1), (Hp
2-2); Ceruloplasmin, Cholinesterase, a2-Lipoprotein(e),
α2-Macroglobulin,
α2-HS-Glycoprotein, Zn-α2-Glycoprotein, α2-Neuramino-glycoprotein,
Erythroprotein, ß-Lipoprotein, Transferrin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen,
ß2-Glycoprotein I, B2-Glycoprotein II, Immunglobulin G, (IgG) oder Globulin der
Formeln γ 2K2 oder γ 2' Immunglobulin A (IgA) oder A-Globulin der Formeln
(a2K2)n oder (α2#2)n, Immunglobulin M (IgM) oder γM-Globulin der Formeln
(µ@K@)5 oder (µ2#2)@, Immunglobulin D (IgD) oder γD-Globulin (4D) der Formeln
(#2K2) oder (#2#2), Immunglobulin E (IgE) oder Globulin (γE) der Formeln (#2K2)
oder (#2#2), freie leichtkettige Komplementfaktoren: C'1: C'1q, C'1r und C'1s, C'2,
C'3, ß1A und 2D, C'4, C'5, C'6, C'7, C'8 und C'9.
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Nachstehend sind wichtige Blutgerinnungsfaktoren zusammengestellt:
Internationale Bezeichnung Name I Fibrinogen II Prothrombin IIa Thrombin IIIGewebsthromboplastin
V und VI Proaccelerin, Acceleratorglobulin VII Proconvertin VIII Antihämophiles
Globulin (AHG) IX Christmas-Faktor, Plasma-Thromboplastin-Gomponent (PTC) X Stuart-Prower-Faktor,
Autoprothrombin III XI Plasma-Thromboplastin-Antecedent (PTA) XII Hagemann-Faktor
XIII Fibrinstabilisierender Faktor
Nachstehend sind Beispiele für
wichtige Proteinhormone aufgeführt: Peptid- und Proteinhormone: Parathyroidhormon
(parathormone), Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin
(melanozytenstimulierendes Hormon, Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon),
Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon),Thyrotropin, Follikel-stimulierendes
Hormon , luteinisierendes Hormon (Interstitialzellen-stimulierendes Hormon), luteomammotropes
Hormon (Luteotropin, Prolactin), Gonadotropin (chorionisches Gonadotropin).
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Gewebshormone: Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin,
Human-Placenta-Lactogen.
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Peptidhormone der Neuroh n ophyse: Oxytocin, Vasopressin, Releasing-Faktor
(RF): CRF, LRF,TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF.
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Von Interesse sind ferner Mucopolysaccharide und Polysaccharide.
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Spezielle Beispiele für antigene Polysaccharide, die von Mikroorganismen
abgeleitet sind, sind nachstehend aufgeführt:
Mikroorganismen-Species
Hämosensitin gefunden in Streptococcus pyogenes Polysaccharid Diplococcus pneumoniae
Polysaccharid Ncisseria meningitidis Polysaccharid Neisseria gonorrhoeae Polysaccharid
Corynebacterium diphtheriae Polysaccharid Actinobacillus mallei; roher Extrakt Actinobacillus
whitemori Francisella tularensis Lipopolysaccharid Polysaccharid Pasteurella pestis
Pasteurella pestis Polysaccharid Pasteurella multocida kapsuläres Antigen Brucella
abortus roher Extrakt llaemophilus influenzae Polysaccharid llaemophilus pertussis
roh Treponema reiteri Polysaccharid Veillonella Lipopolysaccaharid Erysipelothrix
Polysaccharid Listeria monocytogenes Polysaccharid chromobacteriun lipopolysaccharid
Mycobactcrium tuberculosis Kochsalzlösung-Extrakt von 90 % phenolextrahierten iiycobaktcrien
und Polysaccharidfraktion von Zellen und Tuberculin Klebsiella aerogenes Polysaccharid
Klebsiella cloacae Polysaccharid Salmonella typhosa Lipopolysaccharid Polysaccharid
Salmonella typhi-murium; Polysaccharid Salmonella derby Salmonella pullorun Shigella
dysenteriae Polysaccharid Shigella flexneri Shigella sonnei roh, Polysaccharid .
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Rickettsiae roher Extrakt Candida albicans Polysaccharid Entamoeba
liistolytica roher Extrakt
Weitere Verbindungen, Zellen, Viren
und andere biologische Aggregate, die antigen wirken oder für die natürlich auftretende
Rezeptoren gefunden werden können, lassen sich ebenfalls bestimmen.
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Die zur Bestimmung eingesetzten Mikroorganismen können intakt, lysiert,
zermahlen oder auf andere Weise fragmentiert sein.
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Das erhaltene Produkt oder der Teil der Mikroorganismen werden beispielsweise
durch Extraktion bestimmt. Beispiele für entsprechende Mikroorganismen sind nachstehend
zusnmnlengestellt: Corynebacteria Corynebacterium diptheriae Pneumococci Diplococcus
pneumoniae Streptococci Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarus Stapbylococci
Staphylococcus aureus Staphylococcus albus
Neisseriae Neisseria
meningitidis Neisseria gonorrheae Enterobacteriaciae
Escherichia coli |
Aerobacter aerogenes # coliförmige Bakterien |
Klebisella pneumoniae # |
Salmonella typhosa |
Salmonella choleraesuis # Salmonellae |
Salmonella typhimurjum |
Shigella dysenteriae |
Shigella schmitzii |
Shigella arabinotarda Shigellae |
Shigella flexneri |
Shigella boydii |
Shigella Sonnei |
weitere enterische Bacillen
Proteus vulgaris |
Proteus mirabilis # Proteus |
Proteus morgani |
Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae
Hemophilus-Bordetella-Gruppe
Hemophilus influenzae, H. ducreyi, H. hemophilus, R. aegypticus und H. paraiufluenzae,
Bordetella pertussis Pas teurellae Pasteurella pestis Pasteurella tulareusis Brucellae
Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis aerobe sporenbildende Bacillen
Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus anaerobe
sporenbildende Bacillen Clostridium botulinum Clostridium tetani Clostridium perfringens
Clostridium novyi Clostridium septicum
Clostridium histolyticum
Clostridium tertium Clostridium bifermentans Clostridiun sporogenes Xycobacteria
Mycobacterium tuberculosis hominis Mycrobacterium bovis Mycrobacterium avium Mycrobacterium
leprae Hycobacterium paratuberculosis Actinomycetes (pilzähnliche Bakterien) Actinomyces
israelii Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis
Spirochetes Treponema pallidum Spirillum-minus Treponema pertenue Streptobacillus
moniliformis Treponema carateum Borrelia recurrentis Leptospira icterohemorrhagiae
Leptospira canicola
Mycoplasuen Nycoplasma pneumoniae weitere pathogene
Mikroorganismen Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus
moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis Rickettsiae (bakterienartige
Parasiten) Rickettsia prowazekii Rickettsia moosen Rickettsia rickettsii Rickettsia
conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi
Rickettsia burnetii Rickettsia quintana Chlamydia (nicht klassifizierbare Parasiten
bakterieller/ viraler Art) Chlamydia-Agentien (Benennung unsicher) Pilze Cryptococcus
neoformans Blastomyces dermatidis
Histoplasma capsulatum Coccidioides
immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor
corymbifer (Absidia corymbifera)
Rhizopus oryzae |
Rhizopus arrhizus # Phycomycetes |
Rhizopus nigricans |
Sporotrichum schenkii Yonsccaca pedrosoi Fonsecaea compacta Fonsecaea dermatitidis
Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi
Madurella Allescheria boydii Phialosphora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton
mentagrophytes Keratinomyces ajelloi Microsporum canis Trichophyton rubrum Microsporum
andouini Viren
Adenoviren Herpes-Viren Herpes simplex Varicella
(Chicken pox) Herpes Zoster (Shingles) Virus B Cytomegalovirus Pocken-Viren Variola
(smallpox) Vaccinia Poxvirus bovis Paravaccinia Molluscum contagiosum Picornaviren
Poliovirus Coxsackievirus ECH0-Virus Phinoviruses Myxoviren Influenza (A, B, and
C) Parainfluenza (1-4) Mumps Virus Newcastle-trankheit-Virus Masern-Virus Rinderpest-Virus
Hundestaupe-Virus
Atmungs-Synzytium-Virus Röteln-Virus Arboviren östlicher Pferdeencephalitis-Virus
westlicher Pferdeencephalitis-Virus Sindbis-Virus Chikungunya-Virus Semliki-Wald-Virus
Mayora-Virus St. Louis-Encephalitis-Virus California-Encephalitis-Virus Colorado-Tick-Fever-Virus
Geibfieber-Virus Dengue-Virus Reoviren Reovirus Typen 1-3 Hepatitis Hepatitis A-Virus
Hepatitis B-Virus Tumor-Viren Rauscher-Leukämie-Virus Gross-Virus Maloney-Leuk.mmie-Virus
Friend-Leukämie-Virus
Mäuse-Milchdrüsentumor-Virus Geflügel-Leukämie-Virus Rous-Sarkom-Virus Polyom-Virus
Simian-Virus 40 Papillom-Virus Beispiele für Mikroorganismenpräparate sind: Streptococcus
pyogenes' Protein Pasteurella pestis, Protein-Toxin Clostridium tetani, Toxoid Clostridium
perfringens, a-Lecithinase Escherichia coli, Filtrate Treponema reiteri, Proteinextrakt
Corynebacterium diphtheriae, Toxin, Toxoid Mycobacterium tuberculosis, Protein M.
tuberculosis, Cytoplasma M. tuberculosis, Kulturfiltrat und Tuberculin Mycoplasma
pneumoniae, "rohes" Antigen
Von Interesse sind Verbindungen der
allgemeinen Formel: Hap-X-Fl in der X und Fl die vorstehende Bedeutung haben und
Hap einen Haptenwirkstoff mit einem Molekulargewicht von etwa 125 bis 1200 bedeutet,
der häufig einen aromatischen (carbocyclischen) Ring, der durch 2 oder 3 aliphatische
Kohlenstoffatome von einem Stickstoffatom, normalerweise einer Amino- oder Amidogruppe,
getrennt ist.
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Unter diese Definition von Hap fallen insbesondere folgende Verbindungen:
wobei a den Wert 0 oder 1 hat, R ein Wasserstoffatom oder einen Alkoxylrest mit
1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet, A ein Wasserstoffatom oder zusammen mit der
anderen Bindung eine Doppelbindung bedeutet und eine Phenylgruppe bedeutet.
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Spezielle Beispiele für bindende Gruppen sind die Carboxymethoxyimino-,
Acetylglycyl-, Butyrylglycyl-, Glycyl-, Crotonylglycyl-, Acetyl-, Crotonyl-, Succindioyl-
und Oxalylgruppe.
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In den meisten Fällen verdrängt das Ligandenanaloge ein Wasserstoffatom
des Liganden unter Bildung einer Bindung zu einer verknüpfenden Gruppe. Beispielsweise
kann bei Morphin das Wasserstoffatom der phenolischen Hydroxylgruppe durch eine
Bindung zum Methylenrest einer Acetylgruppe ersetzt werden.
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Das Wasserstoffatom, das durch eine Bindung zu einer verknüpfenden
Gruppe ersetzt wird, kann an ein aliphatisches oder aromatisches Kohlenstoffatom,
ein Sauerstoffatom oder Stickstoffatom gebunden sein. In einigen Fällen kann eine
Oxocarbonylgruppe die verknüpfende Stelle unter Modifikation der Oxocarbonylgruppe
zu einer Oxingruppe darstellen. In anderen Fällen kann die Hydroxylgruppe eines
Carboxylrests durch eine verknüpfende Gruppe unter Bildung eines Esters oder Amids
ersetzt werden.
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Weitere Möglichkeiten sind die Einführung von funktionellen Gruppen,
wie von Hydroxylgruppen, aus denen Äther gebildet werden können, oder Aminogruppen,
aus denen Diazogruppen gebildet werden können.
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Ein sehr wichtiger Faktor für das Ligandenanaloge besteht darin, daß
es eine ausreichende strukturelle Ähnlichkeit zum Liganden aufweist, so daß es durch
den Antikörper gegen den Liganden erkannt werden kann. Da die Art der Addition stark
variieren kann, können die Bindungskonstanten für den Liganden und das Ligandenanaloge
verschieden sein, sollen aber höchstens um den Faktor
vorzugsweise
höchstens 102, differieren.
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Meistens hat das Ligandenanaloge in einem beträchtlichen, wenn nicht
überwiegenden Teil des Molekularvolumens die gleiche oder im wesentlichen gleiche
Struktur und Ladungsverteilung (räumliche und polare Organisation) wie der Ligand.
Da häufig die Bindungsstelle für ein Hapten bei der Herstellung des Antigens zur
Bildung von Antikörpern die gleiche ist, wie sie zur Bindung des Fluorescers verwendet
wird, wird der gleiche Teil des Ligandenmoleküls, der die Schablone für den Antikörper
zur Verfügung stellt, durch das Ligandenanaloge bei der Bindung an den Fluorescer
ausgesetzt.
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Aufgrund der sterischen Hemmung bei der Anwesenheit eines Antikörpers,
der die Bindung eines weiteren Antikörpers an den Ligandenanalogen-Fluorescer verhindert,
ist die bindende Gruppe im allgemeinen relativ kurz. Im allgemeinen weise die bindene
Gruppe weniger als 25 Å, vorzugsweise weniger als 20 Å und insbesondere weniger
als 15 A auf. Im allgemeinen beträgt die Länge der bindenden Gruppe etwa 1,5 bis
10 A.
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Im Fall von großen Molekülen (Makromolekülen), wie Polypeptide und
Proteine, als Liganden, stehen an der Oberfläche des Moleküls eine Reihe von verschiedenen
Epitopen zur Verfügung, von denen Jedes einen komplementären Antikörper hat. Wenn
das Makromolekül mit dem Fluorescer konjugiert ist, gibt es normalerweise eine Mehrzahl
von an das Makromolekül gebundenen Fluorescermolekülen.
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Je nach der räumlichen Beziehung des Fluorescermoleküls zu einem Epitop
kann eine sterische Hemmung der gleichzeitigen Bindung eines Antikörpers gegen das
Ligandenepitop und eines Antikörpers gegen den Fluorescer verhindert werden oder
nicht.
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Normalerweise gibt es jedoch eine Mehrzahl von Paaren von Epitopstellen
und Fluorescermolekülen, wo in verschiedenem Ausmaß eine sterische Behinderung zwischen
zwei verschiedenen Antikörpern auftritt. Unter konjugierten Molekülen aus Ligandenanalogem
und Fluorescer sind Moleküle zu verstehen, bei denen mehrere Epitop-Fluorescer-Paare
in geeigneter Nachbarstellung für eine sterische Wechselwirkung vorhanden sind.
Die einfachere Moleküle mit einem Epitop und einem Fluorescer betreffende Feststellung
trifft normalerweise auf die in Makromolekülen vorhandenen Epitop-Fluorescer-Paare
zu.
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Bei der Wahl des Fluorescers müssen eine Reihe von Gesichtspunkten
berücksichtigt werden. Wie bereits erwähnt, wird die Wahl des Fluorescers in bestimmtem
Umfang durch den Liganden bestimmt. Somit ist ein Gesichtspunkt der, daß der Fluorescer
eine Absorption bei höheren Wellenlängen als ein fluoreszierender Ligand oder ein
an einen Antikörper gebundener Ligand aufweist.
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Zusätzlich zu den Gesichtspunkten, die den speziell zu bestimmenden
Liganden betreffen, kommen weitere Einschränkungen bei der speziellen Wahl des Fluorescers
hinzu. Da in der Praxis in Abwesenheit von Quencher-Konjugat eine Änderung im Emissionsspektrum
als
Folge der Bindung oder Nichtbindung an einen Antifluorescer auftritt, ist ein starker
Umgebungseinfluß auf die Emissionsintensität bei einer bestimmten Wellenlänge erwünscht.
Dies kann die Folge einer wesentlichen Veränderung der Quantenausbeute oder eine
Veränderung im Emissions- oder Absorptionsspektrum beim Ubergang von gebundenem
zu ungebundenem Fluorescer sein.
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Da Proteine bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm absorbieren, sollte
der Fluorescer ein Absorptionsmaximum oberhalb von 300, im allgemeinen oberhalb
von 350 und insbesondere oberhalb von 400 nm haben. Der Extinktionskoeffizient sollte
größer als 10, vorzugsweise größer als 103 und insbesondere größer als 104 sein.
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Ferner ist es wünschenswert, daß der Fluorescer eine große Stokes-Verschiebung
aufweist. Dies bedeutet, daß vorzugsweise eine wesentliche Streuung oder Differenz
in den Wellenlängen zwischen dem Absorptionsmaximum und dem Emissionsmaximum des
Fluorescers besteht.
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Bei physiologischen Flüssigkeiten tritt als weiterer Gesichtspunkt
die nicht-spezifische Bindung von Fluorescer an Protein hinzu. Bevorzugte Fluorescer
weisen eine möglichst geringe nichtspezifische Bindung auf, so daß der vorwiegende
oder alleinige Effekt, der auftritt durch die Bindung des Fluorescers an seinen
Antikörper hervorgerufen wird.
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In den vorerwähnten Arbeiten sind eine Reihe von Fluorescers beschrieben;
vgl. Stryer, a.a.O.; und Brand u. Mitarb., a.a.O.
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Eine Gruppe von Fluorescern mit einer Reihe der vorerwähnten erwünschten
Eigenschaften sind die Xanthenfarbstoffe, einschließlich die von 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol
abgeleiteten Fluoresceine und die von 5,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol abgeleiteten
Rosamine und Rhodamine. Die Rhodamine und Fluoresceine weisen eine 9-o-Carboxyphenylgruppe
auf und sind Derivate von 9-o-Carboxyphenylxanthhydrol.
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Diese handelsüblichen Verbindungen mit Substituenten am Phenylrest
können als Bindungsstelle oder Bindungsfunktionalität verwendet werden Beispielsweise
sind amino- und isothiocyanatsubstituierte Fluoresceine erhältlich. Eine weitere
Gruppe von fluoreszierenden Verbindungen sind die Naphthylamine mit einer Aminogruppe
in der «- oder ß-Stellung, im allgemeinen in der a-Stellung. Beispiele für derartige
Naphthylaminoverbindungen sind 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalinsulfonat
und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat. Bei den Naphthalinverbindungen läßt sich
eine gewisse nicht-spezifische Bindung an Protein feststellen, so daß bei ihrer
Verwendung Testmedien verwendet werden müssen, deren Proteinmenge möglichst gering
gehalten wird.
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Wie bereits erwähnt, kann die bindende Gruppe von einer funktionellen
Gruppe, die am Fluorescer vorhanden ist, oder
einer funktionellen
Gruppe, die am Ligandenanalogen vorhanden ist, abgeleitet werden. Um für die notwendige
Bindung zwischen den beiden Verbindungen zu sorgen, können entweder der Fluorescer
oder das Ligandenanaloge modifiziert werden.
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Die Quencher sind ebenfalls Farbstoffe, die so gewählt werden, daß
sie eine Absorptionsbande aufweisen, die mit der Emissionsbande des Fluorescers
überlappt. Unter den Absorptions- und Emissionsbanden von Fluorescer und Quencher
sind die im Testmedium beobachteten Banden, die durch das Testmedium und die Konjugation
mit dem Protein beeinflußt sind, zu verstehen und nicht Banden, die in einer davon
unterschiedlichen Umgebung auftreten. Die Verfahren zur Konjugation des Quenchers
mit dem Rezeptor, im allgemeinen mit einem Antikörper, sind die gleichen wie zur
Konjugation von Fluorescer mit Polypeptiden. Im allgemeinen ist mindestens 1 Quenchermolekül
pro 100 000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors vorhanden, vorzugsweise 1 Quenchermolekül
pro 75 000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors. Im allgemeinen ist höchstens
1 Quenchermolekül pro 1000, vorzugsweise pro 2000 und insbesondere pro 5000 Molekulargewichtseinheiten
des Rezeptormoleküls vorhanden. Dabei kommt es vorwiegend auf die Löslichkeit an,
da viele Farbstoffe eine geringe Löslichkeit in Wasser aufweisen und den Rezeptor
unlöslich machen können.
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Pur Antikörper als Rezeptoren sind im allgemeinen etwa 2 bis 25, vorzugsweise
2 bis 20, insbesondere etwa 2 bis 16 und vor allem etwa 4 bis 16 Quenchermoleküle
pro Antikörper vorhanden.
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Für Fab-Fragmente liegen im allgemeinen 1 bis 16 und vorzugsweise
1 bis 12 Quenchermoleküle pro Fab-Fragment vor.
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Bei spiel 1 Herstellung eines Dansyl-BSA (Rinderserumalbumin)-Kon,jugats
In ein Scintillationsglas werden 10,0 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 und
500 mg Rinderserumalbumin (BSA; Miles Labs.; 7,8 x 10-6m) gegeben. Anschließend
werden 100 mg 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonylchlorid (DAGSC, @ 3,7 x 10 4 Mol;
Seikagaku Kogyo Ko. Ltd., Japan) in 1 ml Aceton zugesetzt. Das Glas wird zugestöpselt,
mit einer Aluminiumfolie bedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben
und über Nacht bei mäßiger Geschwindigkeit geschüttelt. Am nächsten Morgen wird
das überschüssige DANSC durch Filtration durch einen Baumwollbausch entfernt. Das
Filtrat wird auf eine mit Sephadex G-25 beschickte Säule der Abmessungen 5 x 70
cm aufgesetzt und mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 bei einer Strömungsgeschwindigkeit
von 50 ml/Std. eluiert und in 9 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 57 bis
76 werden vereinigt (gelborangefarben) und durch Ultrafiltration durch Dow-Hohlfasern
eingeengt. Die eingeengte Lösung weist einen Proteingehalt von 4 mg/ml auf. Diese
Lösung wird auf eine NaCl-Konzentration von 0,15 m eingestellt und zur Sterilisation
durch ein 0,25>1 Millipore-Filter filtriert. 2 ml-Proben werden zur Herstellung
von Injektionsflüssigkeiten in sterile Ampullen gefüllt.
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Aufgrund seiner Absorption bei 340 m» läßt sich durch UV-Analyse
des
Dansyl-BSA-Konjugats die Anwesenheit von Dansyl am BSA nachweisen. Unter Anwendung
des experimentell bestimmten Extinktionskoeffizienten für Dansyl an Protein von
t= 3,3 x wird die Haptenzahl dieses Konjugats zu 13,5 Dansyl/BSA bestimmt.
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Die Fluoreszenzeigenschaften dieses Konjugats werden kurz untersucht.
Es werden folgende Parameter gefunden: Anregungsmaximum bei 338 m;u und Emissionsmaximum
bei 498 mp.
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Beispiel 2 Herstellung eines Insulin-Dansyl-Kontjugats In ein Scintillationsglas
mit einem Gehalt an 3 ml gesättigtem NaHCO3 werden 16,7 mg (2,9 x 10 6 Mol) Schweineinsulin
gegeben.
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Die Lösung wird mit 9,8 mg (3,6 x 10 5 Mol) DANSC, gelöst in 1 ml
Dioxan, versetzt. Es bildet sich sofort ein gelber Niederschlag, der sich nach Zugabe
von 0,5 ml Dioxan auflöst. Zur Beseitigung eines sehr schwachen weißen Niederschlags
(Carbonat) werden 0,5 ml H20 zugegeben. Das Glas wird anschließend verschlossen,
mit einer Aluminiumfolie abgedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben
und über Nacht leicht geschüttelt.
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Am nächsten Morgen wird die Lösung mit Essigsäure auf den pH-Wert
5 angesäuert und sodann auf eine mit Sephadex G-10 beschickte Säule der Abmessungen
2,5 x 30 cm aufgesetzt. Man eluiert mit 0,2 m Essigsäure bei einer Strömungsgeschwindigkeit
von 10 ml/Std.
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Fraktionen von 1,6 ml Volumen werden aufgefangen. Es werden
vier
Peaks beobachtet. Der erste Peak (Fraktionen 17 bis 22) weist Fluoreszenz-Ernissions-
und Anregungsspektren auf, die typisch für Dansyl-Protein-Konjugate sind.
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Beispiel 3 Herstellung eines Fluorescein-BSA-Kon,jugats In ein Scintillationsglas
werden 180 mg BSA (2,6 x 10-6 Mol; Pentex, kristallisiert), gelöst in 6 ml H20 mit
einem Gehalt an 180 mg K2COn, gegeben. Anschließend werden 18,3 mg Fluorescein-isothiocyanat
(FITC; 4,85 x 10 5 Mol) zugegeben. Das Glas wird verschlossen, mit einer Aluminiumfolie
abgedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben und über Nacht leicht
bei Raumtemperatur geschüttelt. Am nächsten Morgen wird das Reaktionsgemisch mit
1 n HOl auf den pH-Wert 4 angesäuert, wobei sich ein schwerer Niederschlag bildet.
Sodann wird mit 0,1 n NaOH auf den pH-Wert 8 alkalisch gemacht. Diese Lösung wird
auf eine mit Sephadex G-10 beschickte Säule der Abmessungen 2,5 x 30 cm aufgesetzt
und mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 bei einer Strömungsgeschwindigkeit
von 5,4 ml/Std. eluiert.
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Es werden Fraktionen von 0,9 ml Volumen aufgefangen. Die Fraktionen
43 bis 72 werden vereinigt. Die Haptenzahl wird aufgrund der UV-Absorption des Konjugats
bei 493 m,u unter Zugrundelegung eines Extinktionskoeffizienten für proteingebundenes
Fluorescein von 7,2 x 104 berechnet. Es ergibt sich eine Haptenzahl von 14,5.
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Beispiel 4 Herstellung eines Insulin-Fluorescein-Konåugats In ein
Scintillationsglas werden 35,1 mg Schweineinsulin (6,1 x 10 6 Mol), gelöst in 3,5
ml 0,1 m Carbonatpuffer vom pH-Wert 9,2 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl, gegeben.
Die Lösung wird mit 4,8 mg FITC (1,2 x 10 5 Mol) versetzt. Das Glas wird zugestöpselt,
mit einer Aluminiumfolie abgedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben
und über Nacht leicht geschüttelt. auf den pH-Wert 3 Am nächsten Morgen wird das
Gemisch mit 1 n HCVangesäuert (Blasenbildung). Der gebildete Niederschlag aus Fluorescein-thiocarbamylinsulin
wird anschließend mit 1 n NaOH basisch gemacht, bis er vollständig in Lösung gegangen
ist. Die orangefarbene Lösung wird auf eine mit Sephadex G-10 beschickte Säule der
Abmessungen 2,5 x 35 cm aufgesetzt und mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4
mit einem NaCl-Gehalt von 0,15 m eluiert. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 12
ml/Std. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 2 ml aufgefangen. Die Fraktionen
24 bis 33 sind stark fluoreszierend und werden vereinigt. Diese Fraktionen werden
direkt auf eine mit DEAE-Sephadex A-25 beschickte Säule der Abmessungen 2,5 x 30
cm, die vorher mit 0,05 m Tris-Puffer vom pH-Wert 7,1 mit einem Harnstoffgehalt
von 7 m und einem NaCl-Gehalt von 0,1 m äquilibriert worden ist, aufgesetzt.
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Die Elution wird bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 12 ml/Std.
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mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0,1 m bis 1,0 m bei
einem Gesamtvolumen von 500 ml vorgenommen. Es werden Fraktionen mit einem Volumen
von 2 ml aufgefangen. Die Salzkonzentration wird auf 1,0 m gehalten, bis der letzte
(vierte)
Peak vollständig eluiert ist, was durch Absorptionsmessung
bei 280 festgestellt wird. Der erste Peak besteht aus von der Säule ausgewaschenen
Produkten, der zweite aus nicht umgesetztem Insulin und sodann Mono-, Di- und Tri-fluorescein-insulin
in der angegebenen Reihenfolge. Die Reinheit wird elektrophoretisch auf CAM mit
Tris-Barbital-Puffer vom pH-Wert 8,8 bestimmt. Es wird 50 Minuten Strom bei 125
V angelegt. Angefärbt wird mit Ponceau S.
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Sämtliche Flecken sind fluoreszierend.
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Bei spiel 5 Herstellung eines Morphin-Fluorescein-Konjugats In ein
Reaktionsgefäß werden 68,8 mg (0,2 Millimol) 03-Carboxymethylmorphin in 2 ml DMF
gegeben. Das Gemisch wird auf -50C abgekühlt und mit 26 µl (0,2 m Millimol) Chlorameisensäureisobutylester
versetzt. Anschließend wird das Gemisch 45 Minuten gerührt.
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Die erhaltene Lösung wird sodann langsam in Portionen von 0,05 ml
zu 36 mg 4-Aminofluorescein-hydrochlorid ( & -Isomer II x HCl) in 1 ml Butanol
(mit einem Eisbad gekühlt) gegeben. Vor dem Aufarbeiten wird das Gemisch 90 Minuten
stehengelassen.
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Sodann wird das Reaktionsgemisch direkt auf eine präparative dünnschichtchromatographische
Platte aufgetragen und mit Chloroform, Methanol und Essigsäure (75:50:10) eluiert.
Nach einer Wiederholung dieser Chromatographie wird das Produkt vom Kieselgel mit
methanolischer Natriumhydroxidlösung extrahiert. Nach dem Abdampfen des Methanols
wird Wasser zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird gründlich gespült. Sodann
wird das Produkt
wieder in methanolischer Natriunhydroxidlösung
gelöst und mit Wasser versetzt. Das Methanol wird abgedampft und der pH-Wert mit
HCl auf 8,0 eingestellt. Man erhält eine Lösung des gewünschten Produkts.
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Beispiel 6 Herstellung eines Thyroxin-Fluorescein-Konjugats In ein
Reaktionsgefäß werden 165 mg (0,2 Millimol) Methylthyroxinat-hydrochlorid, 8 ml
frisch destilliertes Tetrahydrofuran und 15 ml wäßriger Carbonatpuffer (pH-Wert
9,2, 0,1 m) gegeben. Nach dem Entgasen mit Stickstoff werden 77,8 mg (0,2 Millimol)
FITC in 2 ml 1:1 Tetrahydrofuran/Carbonatpuffer innerhalb von 5 Minuten unter Rühren
zugesetzt. Der auf 7,8 abgefallene pH-Wert wird mit 2 n NaOH auf 9 eingestellt.
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Das Gemisch wird über Nacht in einer Gefriertruhe aufbewahrt, sodann
in ein Gemisch aus 20 ml Essigsäureäthylester und 20 ml 1 n HCl gegossen. Die Phasen
werden getrennt. Die wäßrige Phase wird 1 mal mit 20 ml Essigsäureäthylester gewaschen.
Die organischen Phasen werden vereinigt, 4 mal mit je 30 ml 1 n HCl und 2 mal mit
je 200 ml Kochsalzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die flüchtigen
Bestandteile werden unter vermindertem Druck entfernt.
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Zur weiteren Reinigung wird das Produkt der präparativen Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung von 100 mg Kieselgel
unterworfen. Das Laufmittel
besteht zu 95 Volumprozent aus einem Gemisch aus 25 Volumprozent Diathyläther und
25 Volumprozent Methylenchlorid und zu 5 Volumprozent aus Eisessig.
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Die mittlere Bande wird abgetrennt und mit Tetrahydrofuran extrahient.
Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels verbleiben 75 mg. Der Rückstand wird unter
Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems und unter Verwendung von Kieselgcl
rechromatographlert.
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Man erhält 55 mg des gewünschten Produkt.
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Beispiel 7 Herstellung eines Diphenylh,ydantoin-Konjugats an Fluorescein
Eine Lösung von 1-Carboxymethyldiphenylhydantoin in wasserfreiem Dimethylformamid
wird unter Stickstoff tropfenweise mit 1 Moläquivalent SOC12 versetzt. Die Lösung
wird sodann über Nacht bei Rauntemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt. Sodann wird 1 quivalent Triätbylamin und Fluoresceinamin
in wasserfreiem Dimethylformamid zugesetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden gerührt.
Sodann wird das Lösungsmittel teilweise unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand
wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Kieselgel; Methanol:Chloroform
= 1:1 (Volumteile)) gereinigt. Die schnell wandernde fluoreszierende Bande besteht
aus Diphenylhydantoin und dem gewünschten Produkt.
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Beispiel 8 Konjugation mit N-Glycylfluoresc einamin A. In 50 ml Essigsäureäthylester
werden 1,04 g Fluoresceinamin
suspendiert. Nach Zugabe von 1 Äquivalent
Chloracetylchlorid wird das Gemisch unter Wasserausschluß 4 Stunden unter Rückfluß
erwärmt. Das als gelber Feststoff ausgefallene Produkt wird durch präparative Dünnschichtchromatographie
(Kieselgel; Chloroform:Methanol = 3:1 (Volumteile)) gereinigt. Eine Lösung von 50
mg N-Chloracetylfluoresceinamin in 20 ml wasserfreiem Äthanol wird mit Ammoniak
gesättigt. Das Gefäß wffird sodann verschlossen. Das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden
bei Haumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man das
gewünschte Produkt als gelben Feststoff.
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B. Eine Lösung der gewünschten Carbonsäure (1) und Triäthylamin (2)
in 0,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid wird bei -10°C unter Rühren mit Chlorameisensäureisobutylester
(3) versetzt.
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Nach 1/2 Stunde wird ein Uberschuß an N-Glycylfluoresceinamin in
wasserfreiem Dimethylformamid zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Anschließend
wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wird durch
präparative Dünnschichtchromatographie (Kieselgel; Chloroform: Methanol = 1:1 (Volumteile))
gereinigt. Die schnell wandernde Bande enthält die gewünschte, fluoreszierende Verbindung.
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(1) (2) (3) 5-Phenyl-5-(4'-crotonsäure)-barbitursäure, 5 mg 1,7 mg
2,3 mg N-(5'Carboxy-n-phentylcarbonyl)-dibenzazepin, 5 mg 1,4 mg 1,9 mg O-Carboxylmethyloxim
von 3-Ketodigoxigenin, 5 mg 1,1 mg 1,5 mg
Beispiel 9 Konjugation
von Rhodamin an Anti-(fluorescein) 1 ml Aliquotproben von Antiseren gegen Fluorescein
werden bei 50prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat gefällt. Der Niederschlag
wird in 1 ml 0,1 m K2HP04 gelöst und gegen die gleiche Lösung dialysiert. Man erhält
eine Lösung mit einer Konzentration von 9 mg/ml. Sodann werden 0,4 ml (3,6 mg) Anti-(fluorescein)-Antiseren
und 0,17 ml Glycerin in ein Reaktionsgefäß gegeben.
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Der ph--Wert wird auf 9,5 gebracht. Bei Raumtemperatur werden unter
Rühren 0,8 mg Tetratnethylrhodaminisothiocyanat in 100)11 Dimethylformamid zugegeben.
Nach 3-stündiger Umsetzung wird die Lösung auf eine mit Sephadex LH-20 beschickte
Säule der Abmessungen 0,9 x 15 cm aufgesetzt. Das Anti-(fluorescein) wird in einem
Volumen von 1 ml gewonnen.
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Die nachstehenden Versuche werden durchgefüEut, um den praktischeii
Wert des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bestätigen. Dabei erhält man mit verschiedenen
Instrumentenzellen unterschiedliche Ergebnisse, so daß absolute Werte nur bei Verwendung
der gleichen Zellen verglichen werden können. Es wird ein Perkin-Elmer MPF-2a-Fluorimeter
verwendet. Antikörper gegen die Fluorescer werden nach üblichen Verfahren hergestellt.
Die Rinderserumalbumin-Konjugate werden Schafen injiziert. Nach Ablauf einer entsprechenden
Zeit werden die Antikörper nach üblichen Verfahren geerntet. Bezüglich der Verfahren
zur Herstellung von Antikörpern wird auf folgende Literaturstellen verwiesen: Microbiology,-Hober
Medical Division, Harper and Rowe,
1969; Landsteiner, Specificity
of Seriological Reactions, Dover Publications, New York, 1962; Kabat u. Mitarb.,
a.a.O; und Williams u. Mitarb., Methods in Immunology and Immunochemistry, Bd. 1,
Academic Press, New York, 1967.
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Folgende Reagenzien werden verwendet: FIUMO (Fluorescein-Morphin-Konåugat,
Beispiel 5) in Wasser in einer Konzentration von 3 x 10-6 m; Antifluorescein mit
einer Konzentration an bindenden Stellen von 5,6 x 10 6 m in Wasser, 0,05 m Phosphat,
pH-Wert 8,0; Antimorphin mit einer Konzentration an bindenden Stellen von 2 x 10
4 m, 0,05 m Tris-HCl, pH-Wert 8,0, in Kochsalzlösung; Puffer:Tris-Kochsalzlösrng
0,05 m pH-Wert 8,0. Opiatlösungen weisen 1000 ,ug/ml Codein auf. Die Lösung wird
sodann mit Puffer auf eine Endkonzentration von 4 ml verdünnt.
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Sämtliche Bestimmungen werden bei der Empfindlichkeitsstufe 4 des
Instruments durchgeführt. Die Lösungen werden in der Reihenfolge von links nach
rechts, wie es in der nachstehenden Tabelle angegeben ist, vermischt. Das anregende
Licht weist eine Wellenlänge von 460 nm auf. Das emittierte Licht wird bei 516 nm
mit einer Bandbreite von 10 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
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Tabelle I Ab-Fluorescein- Anti- Anti- Signal- lese-Zelle Morphin,
fluorescein, morphin, Codein intensi- zeit, Nr. Vol(µl) Vol.(µl) Vol(µl) Vol(µl)
tät min.
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2 5 - - - 62 2 5 5 - - 21 2 5 5 5 - 25 26,5 5 27,5 90 4 - - - - 8
4 - 5 -4 - 5 5 - 3,5 5 5 5,5 90 3 - - - - 1,5 3 5 - - - 46 3 5 - 5 - 35,5 35 5 3
5 5 5 - 23 22,5 5 3 5 5 5 5 20 16 90 1 - - - 11 1 - - 5 - 14,5 1 14,5 5 1 - 5 5
- 5 1 - 5 5 5 5,5 6 90 Bei Ablesungen in Abwesenheit von Material ist nur Puffer
in der Zelle anwesend. Die Ablesezeiten geben die Zwischenräume vom Zeitpunkt der
ersten Ablesung bis zur Ablesung des angegebenen Ergebnisses an. Die erste Ablesung
wird möglichst rasch nach dem Mischen vorgenommen.
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Die Ergebnisse zeigen, daß dann, wenn keine Konkurrenz zwischen Codein
und Fluorescein-Morphin stattfindet, die Ablesungen relativ stabil sind. In der
Zelle Nr. 2 tritt eine Veränderung der Signalintensität von 2,5 Einheiten innerhalb
von 90 Minuten ein, wobei eine Änderung von 1,5 Einheiten innerhalb der ersten 5
Minuten eintritt. Die Ergebnisse in der Zelle Nr. 4 zeigen, daß bei ausschließlicher
Anwesenheit von Antikörpern die Hauptveränderung in der Ablesung innerhalb der ersten
5 Minuten eintritt, während innerhalb von 85 Minuten nur mehr eine Veränderung von
0,5 Einheiten eintritt. Die Ergebnisse in der Zelle 1 zeigen eine wesentliche Stabilität
der Ablesungen, wenn Codein zu einem Gemisch der beiden Antikörper gegeben wird.
Es tritt innerhalb von 90 Minuten nur eine Änderung von 0,5 Einheiten ein. Schließlich
zeigen die Ergebnisse in der Zelle Nr. 3, daß bei beiden Antikörpern in Gegenwart
von Codein und Fluorescein-Morphin eine Veränderung der Signalintensität von 6,5
Einheiten innerhalb von 90 Minuten erreicht wird.
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Somit wird eine nachweisbare Veränderung der Fluoreszenz erreicht,
wenn Codein in ein Gemisch aus Fluorescein-Morphin und Antikörpern zu Fluorescein
und Morphin gegeben wird.
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Weitere Untersuchungen werden mit dem Insulin-Fluorescein-Konjugat
von Beispiel 4 durchgeführt.
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Es läßt sich feststellen, daß bei Insulin nur das monosubstituierte
Insulin immunologisch aktiv ist. Aus diesem Grund wird
nur dieses
für die Bestimmung verwendet. Das Fluorescein-Insulin wird in einer Konzentration
von 1 x 10-10 m in 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 eingesetzt. Die verwendete
Antiinsulinlösung weist 1 x 10-10m bindende Stellen auf (Miles Lab.). Man läßt das
Insulin bei 10 9 m 2 Tage lang in einem Kunststoffbehälter äquilibrieren und verwendet
es dann in einer solchen Menge, daß die gewünschte Konzentration in der endgültigen
Verdünnung erreicht wird. Das Insulin wird in Kochsalzlösung mit einem Gehalt an
0,1 m C03 verwendet. Das Fluorescein-Insulin wird zu einer 2 x 10110 m Vorratslösung
verarbeitet, die 2 Tage in 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert wird.
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Fluoresccin-Insulin, Insulin und Antiinsulin werden vereinigt, mit
Wasser verdünnt und sodann 1 Stunde inkubiert. Danach werden 120 ,ul Antifluorescein
in einer Konzentration von 5,6 x 10-8 m an bindenden Stellen in 0,05 m Phosphatpuffer
vom pH-Wert 8,0 zugegeben. Die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien erfolgt von
links nach rechts gemäß nachstehender Tabelle. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur.
Die Versuche werden wiederholt, wobei die Reihenfolge der Zugabe so verändert wird,
daß Insulin und Antiinsulin vor der Zugabe von Fluorescein-Insulin 1 Stunde bei
370C inkubiert werden und eine weitere 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur
vorgenommen wird. Die Ergebnisse sind im wesentlichen die gleichen. Es wird die
vorstehend angegebene Fluorimetereinrichtung verwendet. In der Tabelle II sind die
Mengen von verschiedenen Materialien und die Veränderungen des Emissionsspektrums
angegeben.
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Tabelle II endgültige Fluorescein- Anti- H20 Insulinkon-Insulin Insulin
insulin zentratips Fluoreszenz-(ml) (ml) (pol) (ml) (m x 10 9U) abnahme 2,0 - 10
2,0 0 2,0 0,4 10 1,6 1 16 2,0 2,0 10 - 5 21 Aus dieser Tabelle geht hervor, daß
bei zunehmenden Insulinmengen eine Abnahme der Fluoreszenz beobachtet wird.
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Schließlich wird auch mit einem Quencher konjugiertes Anti-(fluorescein)
verwendet, nämlich mit Rhodamin konjugiertes Anti-(fluorescein).
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Bei der Durchführung dieser Bestimmung werden 200µl Puffer (0,1 m
K2HPO4, pH-Wert 7,8, 0,05 Prozent NaN3) mit 30µl mit Fluorescein konjugiertem hIgG
(1,6 x 10-9 9 m (bei einem Fluorescein/hIgG-Verhältnis von 14:1 vereinigt. Die vorgeschriebene
Menge an Anti-(hIgG) und dieses Gemisch werden 1/2 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend werden 2,75 ml Puffer und 50 µl des mit Rhodamin konjugierten Anti-(fluoresceins)
in einer Verdünnung von 1:10 zugegeben. Sodann wird die Fluoreszenz der Proben abgelesen.
Die Konzentration an Anti-(hIgG) beträgt 2,4 mg/ml.
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Tabelle III Anti-(hIgG) (}il) Fluoresz enz 2 1 17,5, 18,5 2 21,5,
21,5 5 22,5, 24,5 10 29,5, 30,5 25 31,5, 33,5 Daraus ergibt sich, daß das mit Rhodamin
konjugierte Anti-(fluorescein) ein wirksamer Unterdrücker (Quencher) der Fluoreszenz
ist.
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Ferner geht aus dieser Tabelle hervor, daß erhöhte Mengen an Anti-(hIgG)
einen erhöhten Schutz der Fluoreszenz gegen ein Quenchen durch Anti-(fluorescein)
bewirken.
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Bei der nächsten Bestimmung werden unterschiedliche Konzentrationen
an hIgG verwendet, um eine Konkurrenz des mit Fluorescein konjugierten hIgG um eine
begrenzte Menge an Anti-(hIgG) zu bewirken. 100 µl mit Fluorescein konjugiertes
hIgG (1,6 x 10-9 100 ul hIgG von verschiedenen Konzentrationen und 20 µl Anti-(hIgG)
in einer Konzentration von etwa 0,4 mg/ml werden vereinigt.
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Das Gemisch wird 1/2 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
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Anschließend werden 2,75 ml Puffer (vgl. oben) und 50>il mit Rhodamin
konjugiertes Anti-(fluorescein), 1:10 verdünnt, zugegeben. Das Gemisch wird eine
weitere 1/2 Stunde inkubiert. Die
Fluoreszenzablesungen werden
nach einer 1/2 Stunde durchgeführt.
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In Tabelle IV sind die Ergebnisse zusammengestellt.
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Tabelle IV hIgG Cm Fluoreszenz 85, 84 1x10-7 10, 9 1x10-8 10, 11
1x10 9 59, 63 1x10-10 76, 80 1x10 11 82, 87 Die Anwesenheit von hIgG bewirkt eine
Bindung von Anti-(hIgG) und eine Verminderung des zur Verfügung stehenden Anti-(hIgG)
für die Bindung an mit Fluorescein konjugiertem hIgG. Somit ist bei hohen hIgG-Konzentrationen
das Fluorescein nicht durch die Anwesenheit von Anti-(hIgG) geschützt und durch
das mit Rhodamin konjugierte Anti-(fluorescein) gequencht.
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Aus den vorstehenden Untersuchungen ergibt sich, daß erfindungsgemäß
ein sehr empfindlicher Test zur Verfügung gestellt wird, bei dem geringe Volumina
mit sehr niedrigen Ligandenkonzentrationen auf ihre Anwesenheit an Liganden getestet
werden können.
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Durch entsprechende Wahl der fluoreszierenden Verbindung (Fluorescer)
können eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Genauigkeit erreicht werden. Das
erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich zur Bestimmung von sehr
unterschiedlichen Ligendentypen, wie kleinen Arzneistoffmolekülen mit einem Molekulargewicht
von 100 bis 1000, Polypeptiden mit unterschiedlichen Molekulargewichten von etwa
500 bis zu um viele Größenordnungen höheren Werten sowie von anderen organischen
Verbindungen. Techniken, die für herkömmliche Immuntests eingesetzt werden, eignen
sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Tests. Dazu gehören beispielsweise
die Herstellung der Antikörper, die Konjugation der Liganden an den Fluorescer und
verschiedene Parameter zur Optimierung der Bindung von Antikörper an Liganden und
Fluorescer.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Tests ist es besonders vorteilhaft,
die Reagenzien in Testpackungen zur Verfüguiig zu haben, wo die relativen Verhältnisse
so optimiert sind, daß eine maximale Empfindlichkeit des Tests erreicht wird. Durch
derartige Testpackungen lassen sich Fehler durch das Bedienungspersonal verringern.
Die vorbestimmten Verhältnisse der Reagenzien gewährleisten ein bestmögliches Ansprechen
auf Veränderungen der zu analysierenden Konzentrationen. Die Reagenzien werden zweckmäßigerweise
in Form von lyophilisierten Pulvern oder als wäßrige Konzentrate, unter Zusatz von
Puffern, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Antioxidantien und dergl., zur Verfügung
gestellt.