DE2727208C2 - Doppel-Konjugat-Immunfluoreszenztest und Testbesteck - Google Patents

Description

(a) ein Konjugat aus Ligandenanalogem und Fluorescer und

(b) ein Konjugat aus Antifluorescer und Quencher in entsprechenden Mengen enthaltenden Testbestecks zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Testbesteck noch (c) den Antiliganden enthält.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden oder Antiliganden in einer Probe gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Das Bedürfnis, die Anwesenheit von geringen Mengen an organischen Bestandteilen nachzuweisen, nimmt ständig zu. Konzentrationen von besonderem Interesse liegen im Bereich von etwa 10~⁴ bis 10"¹² m oder noch darunter. Gebiete, auf denen derartige Bestimmungen von Bedeutung sind, sind der Nachweis von mißbräuchlich verwendeten Arzneistoffen in physiologischen Medien, die Einstellung von therapeutischen Dosen von Arzneistoffen, die Diagnose von Krankheiten, bei denen die Anwesenheit, die Abwesenheit oder eine bestimmte Menge eines speziellen organischen Bestandteils für die Diagnose der Krankheit von Bedeutung sind, und die Bestimmung von Spurenbestandteilen in Nahrungsmitteln. Weitere, nicht physiologische Gebiete von Interesse sind die wissenschaftliche Forschung sowie die Bestimmung von Spurenverunreinigungen in Waser oder anderen Flüssigkeiten, die Qualitätskontrolle und dergl.

Eine Möglichkeit zur Durchführung von Bestimmungen spezifischer Bestandteile bietet der sogenannte Immuntest. Beim Immuntest wird ein Rezeptor, normalerweise ein Antikörper, verwendet, der eine spezifische räumliche Struktur und Ladungsverteilung (Epitop) in einem organischen Molekül erkennt. Antikörper sind ! relativ große Moleküle mit einem Molekulargewicht von 150 000 oder darüber und sind ihrer Natur nach Pro- j teine. Somit ergibt sich bei den meisten organischen Verbindungen von Interesse durch die Bindung des Anti- I körpers mit der organischen Verbindung eine beträchtliche Erhöhung des Molekulargewichts sowie eine Veränderung der Umgebung der organischen Verbindung im Vergleich zu der Lösungsmittelumgebung. Bei Immuntests werden im allgemeinen wäßrige Lösungsmittel verwendet.

Beim Radioimmuntest erlaubt die starke Erhöhung des Molekulargewichts die Trennung der an den Antikör- ! per gebundenen organischen Verbindung von der nicht gebundenen organischen Verbindung. Da ein radioaktives Detektormolekül vorhanden ist, läßt sich die Verteilung der organischen Verbindung zwischen gebundenem und ungebundenem Zustand bestimmen. Diese Verteilung steht in Beziehung zur Konzentration der organischen Verbindung in der unbekannten Probe.

Ein zweites Verfahren ist der sogenannte Spinimmuntest, der von der Firma Syva Company unter der Handelsbezeichnung FRAT vertrieben wird. Bei diesem Test wird eine stabile freiradikalische Verbindung an eine Verbindung, die der unbekannter, organischen Verbindung gleicht, gebunden. Die Spinstärke- der spinmarkierten Verbindung in der Lösung beeinflußt die Stärke des Elektronenspinresonanzspektrums. Wenn die spinmarkierte Verbindung an einen Antikörper gebunden ist, ist die Kreiselbewegung wesentlich langsamer als bei der ungebundenen Verbindung. Aus der Peakhöhe des Elektronenspinresonanzspektrums kann man durch Ver- ι gleich mit bekannten Standards die Menge der in der Lösung vorhandenen unbekannten Verbindung bestimmen.

Bei einem weiteren Verfahren werden Enzyme als Detektoren verwendet. Dabei wird ein Enzym an die unbekannte Verbindung gebunden. Ein derartiger Test wird von der Firma Syva Company unter der Handelsbezeichnung EMIT vertrieben. Durch die Bindung der enzymgebundenen Verbindung an einen Antiköprer ergibt sich eine wesentliche Verringerung der Enzymaktivität. Somit kann man durch Messung der Enzymaktivitüt und

durchs erglsich mit einem Standard die Menge der unbekannten Verbindung in der Lösung Bestimmen.

Beispiele für Immuntests sind in den US-PSen 37 09 868,36 90 834 und 36 54 090 und in der DT-AS 22 2? 385 angegeben. Ferner wird auf die Arbeiten von Ludwig Brand und James R. Gohlke, »Fluorescene Probes for Structure, Annual Review of Biochemistry, Bd. 41 (1972), S. 843 bis 868; u.id Stryer, Science, Bd. 162 (1968), S. 526, verwiesen,

Aus der US-PS 39 35 074 ist ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden in einer Probe bekannt. Bei diesem Verfahren werden ein Konjugat aus einem Ligandenanalogen und einem Detektorliganden (der ein Fluorescer sein kann) und Antikörper gegen die beiden Bestandteile des Konjugats verwendet.

Wenn bei der Durchführung des in US-PS 39 35 074 beschriebenen Verfahrens der Antiligand an das Ligandenanalog-FIuorescer-Konjugat bindet, kann aHein durch diese Bindung schon eine bis zu 50%ige Verminderung der Fluoreszenz erfolgen. Die Bestimmung der eigentlich zu messenden Fluoreszenzabnahme, nämlich die, die auftritt, wenn der Antifluorescer an das Ligandenanalog-Fluorescer-Konjugat bindet, kann dadurch sehr ungenau werden oder sogar mißlingen.

Aus E. F. Ullman et al., The Journal of Biological Chemistry, Bd. 251, Nr. 14 (1976), S. 4172-4178, ist die Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Reagenzes einerseits und eines mit einer die Fluoreszenz löschenden is Substanz konjugierten Reagenzes andererseits in Immuntests bekannt. Auch hier können eine unspezifische Fluoreszenzverminderung oder ein hoher unspezifischer Fluoreszenz-Hintergrund den Test unzuverlässig machen.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Immuntest zu entwickeln, bei dem die vorstehend beschriebenen Nachteile nicht mehr auftreten und bei dem die Bindung des Antifluorescers an das Ligandenanaloges-Fluorescer-Konjugat zu einer deutlich stärkeren Verminderung der Fluoreszenz führt als dies bei der Bindung des Antiliganden an das Ligandenanalog-Fluorescer-Konjugat geschieht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man einen mit einen Fluoreszenzlöcher (Quencher) konjugierten Antifluorescer verwendet. Die Verwendung des neuen Konjugats aus Antifluorescer und Quencher führt überraschenderweise zu einer sehr starken Verminderung der Fluoreszenz im Test.

Folgende Reagenzien werden verwendet:

(1) Ligandenanaloges-Fluorescer (L.A.-F.), bei dem der Ligandenteil im wesentlichen das gleiche Epitop wie der Ligand aufweist,

(2) Antikörper für den Liganden (Antiligand), entweder zugesetzt oder in der unbekannten Probe, und

(3) Antikörper für den Fluorescer (Antifluorescer)

mit mindestens einem daran gebundenen Quenchermolekül. Wenn die Reagenzien mit der unbekannten Probe in einem wäßrigen Medium bei einem entsprechenden pH-Wert vereinigt werden, so steht das sich ergebende Emissionsspektrum in bezug zur Menge des in der Lösung vorhandenen Liganden oder Antiliganden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Menge des an das Konjugat aus Antifluorescer und Quenchergebundenen Fluorcscers in bezug zur Menge des Liganden in der unbekannten Probe steht. Bestimmt wird die Differenz im Emissionsspektrum zwischen ungebundenem Fluorescer und an das Konjugat aus Antikörper und Quenchergebundenen Fluorescer.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 und 3 beschrieben. Die Erfindung betrifft ferner das Konjugat gemäß Anspruch 4 und die Verwendungen eines Testbestecks gemäß Anspruch 5 und 6.

Somit wird erfindungsgemäß ein neues und empfindliches Verfahren zum Nachweis einer großen Anzahl von organischen Verbindungen, für die ein Rezeptor zur Verfugung steht oder hergestellt werden kann, oder zum Nachweis des Rezeptors selbst bereitgestellt. In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren für Antigene , oder Haptene als Liganden, deren Anwesenheit oder Konzentration bestimmt werden soll, verwendet. Ein entsprechendes Reagenz wird hergestellt, indem man eine Verbindung, die mindestens ein Epitop mit dem Liganden gemeinsam hat (nachstehend als Ligandenanaloges bezeichnet) mit einem Fluorescer kombiniert. Das Ligandenanaloge weist im allgemeinen eine im wesentlichen gleiche räumliche Beschaffenheit und Ladungsverteilung wie der Ligand auf, so daß er in der Lage ist, in ausreichendem Maße mit dem Liganden um die Rezep- torstellen, beispielsweise Antikörperstellen, zu konkurrieren. Das Epitop des Ligandenanalogen befindet sich in ausreichender Nähe zum Fluorescer, so daß zum Großteil das Antifluorescer-Quencher-Konjugat und der Antikörper gegen den Liganden sich nicht gleichzeitig am gleichen Molekül befinden können. Wenn das Konjugat aus Ligandenanalogem und fluoreszierender Verbindung (Ligandenanaloges-Fluorescer) in Lösung mit einem Antifluorescer-Quencher-Konjugat und einem Antikörper gegen den Liganden vereinigt wird, stellt sich ein Gleichgewichtszustand ein, der in Beziehung zu den Bindungskonstanten der beiden Antikörper steht. Wird ein Ligand in die Lösung eingebracht, so verändert sich das Gleichgewicht zwischen Antikörpern und Ligandenanalogem-Fluorescer, da die wirksame Konzentration des Antikörpers gegen das Ligandenanaloge verringert wird.

Das Emissionsspektrum des Fluorescers wird durch dessen Umgebung beeinflußt. Somit verändert sich das Emissionsspektrum eines an einen Antikörper gebundenen Flucrcscers im Vergleich zu ungebundenem Fluorescer. Diese Veränderung kann sich durch eine Änderung in der Quantenausbeute oder im Emissionsoder Absorptionsspektrum ergeben. Durch Berücksichtigung einer einzelnen Wellenlänge, durch Vergleich der relativen Intensitäten von zwei Wellenlängen oder durch Integration einer Bande von Wellenlängen läßt sich der in einer unbekannten Probe vorhandene Ligand qualitativ oder quantitativ bestimmen, indem man die Signalintensität mit der Signalintensität eines Standards vergleicht.

Erfindungsgemäß ist der Antifluorescer mit einem Fluoreszenzlöscher (Quencher) für den Fluorescer konjugiert. Ein Quenchermolekül ist in der Lage, die Fluoreszenz zu hemmen, wenn es innerhalb einer geringen Entfernung, im allgemeinen weniger als 100 A, zum Fluorescermolekül vorliegt, indem es Energie, die ansonsten

als fluoreszierendes Licht emittiert würde, aufnimmt. Das Quenchermolekül weist eine Absorptionsbande auf, die sich mit der Emissonsbande des Fluorescermoleküls überlappt. Das Quenchermolekül trägt zu einer weiteren Verringerung der Fluoreszenz der an Rezeptoren gebundenen Fluorescermoleküle bei. Auf diese Weise wird der Hintergrund, der sich aus restlicher Fluoreszenz von durch Antifluorescer gebundenem Fluoresccr ergibt, weiter verringert.

Die nachstehenden Gleichungen erläutern die verschiedenen Reaktionen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Liganden ablaufen:

L.A-F + Abp-Q + Ab_L v==^ L.A-F/Abp-Q + Ab_L/L.A-F

LA-F +Av - L.A-F* > L.A-F + Av¹

Ab_L/L.A-F +Av » Ab_L/L.A-F* ► Ab_L/L.A-F +Av¹

L.A-F/Ab_rQ + Av > L.A-F*/Ab_rQ > L.A-F/Ab_L + Av²

In Anwesenheit von Liganden ergibt sich die zusätzliche Reaktion:

L + Ab_L ^=^ L/Ab_L
Dabei haben die einzelnen Symbole folgende Bedeutungen:

L.A-F: an Fluorescer (F) gebundenes Ligandenanaloges (L.A.)

Xl Y: X gebunden an Y, d. h. Antifluorescer-Quencher (Ab_F-Q) gebunden an Fluorescer (F)

Av: Photon; die Indizes 1 und 2 geben Licht von verschiedener Emissionsintensität an .

*: angeregter Zustand.

Bei einer Lösung mit einer festen Konzentration an L.A-F, Ab_F-Q und Liganden-Antikörper (Antiligand), ist es offensichtlich, daß die Anwesenheit des Liganden die zur Verfugung stehende Menge an Antiligandem verringert, so daß der Gleichgewichtszustand, der in Abwesenheit des Liganden vorliegt, verändert wird. Da die Emissionsintensität und/oder die Wellenlänge- des emittierten Lichts für an Antikörper gebundenen Fluorescer im Vergleich zu ungebundenem Fluorescer verschieden sind, verändert sich das Emissionsspektrum in Abhängigkeit von der Menge des in der Lösung vorhandenen Liganden.

Bei der Durchführung einer Bestimmung können die Reagenzien in beliebiger Reihenfolge kombiniert wer-' den. Es gibt jedoch bestimmte Gesichtspunkte, aufgrund derer bestimmte Reihenfolgen der Zugabe bevorzugt werden. Es wurde beispielsweise festgestellt, daß die Verdrängung relativ langsam abläuft, d. h. daß nach der erfolgten Bindung des Liganden oder des Ligandenanalogen an einen Antikörper die Verdrängung des einen durch das andere relativ langsam abläuft. Da sowohl der Ligand als auch das Ligandenanalog stark an den Antikörper gebunden sein können, können die Bindungskonstanten dieser beiden Bindungen stark variieren. Wäre daher die Bindungskonstante des Ligandenanalogen wesentlich höher als die des Liganden im Gleichgewichts* zustand, so könnte die Menge an Ligandem, der das Ligandenanaloge verdrängt hat, sehr gering sein. Dadurch würde das Verfahren mit einer großen Ungenauigkeit behaftet sein.

Ferner ist es für das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich, daß die Anwesenheit des an das Ligandenanaloge gebundenen Antiliganden die Bindung des Antifluorescer-Quencher-Konjugats an den Fluorescer blokkiert. Da die Verdrängung des Antiliganden vom Ligandenanalogen durch das Antifluorescer-Quencher-Konjugat langsam abläuft und die Bestimmung auf der Verteilung von gebundenem und ungebundenem Fluorescer beruht, werden im allgemeinen Antiligand und Ligandenanaloges-Fluorescer vor der Zugabe des Antifluorescer-Quencher-Konjugats vereinigt.

Angesichts der vorstehenden Überlegungen gibt es zwei Hauptvarianten für das normale Vorgehen bei der Zugabe der Reagenzien: Vereinigen von unbekannter Probe und Antiligandem und anschließende Zugabe von

so Ligandenanalogem-Fluorescer; und Vereinigung von unbekannter Probe, Ligandenanalogem-Fluorescer und Antiligandem. Wenn nach dem Stehenlassen oder Inkubieren ein relativ stabiler Zustand erreicht ist, entweder in bezug auf eine reproduzierbare Veränderung in der Konzentration der verschiedenen Reaktionsspezies pro Zeiteinheit oder in bezug auf konstante Konzentrationen bei den verschiedenen Reaktionsspezies, kann der zugängliche Fluorescer mit gegebenenfalls in Überschuß zugesetztem Antifluorescer-Quencher-Konjugat titriert werden. Im allgemeinen beträgt die zwischen den Zugaben der Reagenzien erforderliche Zeit weniger als etwa 2 Stunden.

Der Wert läßt sich als der nach einer bestimmten Zeit erhaltene Wert (Geschwindigkeit) oder als ein Wert, der sich relativ lang nicht oder nur sehr langsam verändert, bestimmen. Im letztgenannten Fall wird im allgemeinen ein echtes Gleichgewicht nicht erreicht, sondern vielmehr eine Antikörperverteilung, bezogen auf relative Kon-

ftn 7entrationen der verschiedenen Spezies anstatt auf relative Bindungskonstanten. Erfindungsgemäß kann dies als Gleichgewichtszustand betrachtet werden, da sich der abgelesene Wert nur sehr langsam mit der Zeit verändert.

Durch Bestimmung des Emissionsspektrums unter Verwendung einer besonderen Lichtquelle konstanter Intensität und durch Beobachtung der Emissionsintensität bei einer speziellen Wellenlänge oder einer spczicllen Bande von Wellenlängen kann man das Ergebnis in Beziehung zu bekannten Standards setzen. Bei der Ausführung des Verfahrens mit unbekannten Proben, was im wesentlichen auf die gleiche Weise wie mit den Standards geschieht, läßt sich eine qualitative oder quantitative Bestimmung der Menge des in der unbekannten Probe enthaltenen Liganden erreichen.

Will man die Menge des Antiliganden bestimmen, so kann die unbekannte, vermutlich den Antiliganden enthaltende Probe mit L.A.-F vereinigt und anschließend das Antifluorescer-Quencher-Konjugat zugesetzt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit sämtliche drei Komponenten gleichzeitig zu vereinigen. Im allgemeinen werden der L.A.-F und das Antifluorescer-Quencher-Konjugat vorderZugabe der unbekannten Probe nicht vereinigt und inkubiert. Die Konzentrationen an L.A.-F und Antifluorescer-Quencher-Konjugat werden propor- 5 tional zum in Frage kommenden Konzentrationsbereich des Antiliganden innerhalb der für die Ligandenbeslimmung gegebenen Verhältnisse verändert.

Die bestimmbaren Ligandenkonzentrationen betragen etwa 10 ~⁴ bis 10"'' m und insbesondere etwa 10 ^s bis fi

10 " m. Die Konzentration an Ligandenanalogem-Fluorescer variiert ebenfalls im gleichen Bereich und unter- f.

scheidet sich im allgemeinen um nicht mehr als einen Faktor von 100 vom in Frage kommenden Konzentra- io tionsbereich. Die Antikörperkonzentrationen betragen im allgemeinen 0,5 bis 1000 : 1 = Anzahl der bindenden , ·

Stellen pro Mol Ligandenanaloges-Fluorescer. Vorzugsweise beträgt dieser Bereich 1 bis 10 : 1. In der US-PS ''

36 90 834 ist ein Verfahren zur Bestimmung der bindenden Stellen beschrieben. Das Molverhältnis von Antikör- ; ■■>

per zu Ligandenanalogem und Fluorescer hängt stark von der Bindungskonstanten des Antikörpers ab.

Wie bereits angedeutet, wird normalerweise ein wäßriges Medium mit einem Gehalt an nicht mehr als etwa 20. 15 I?; Volumprozent eines organischen polaren Lösungsmittels verwendet. Verschiedene Alkohole, Ketone, Äther ip

und Ester könnenn in untergeordneten Mengen vorhanden sein. j|

Der pH-Wert des Mediums liegt im allgemeinen im Bereich von 6 bis 9 und insbesondere im Bereich von 7 bis j|

8,5. Zur Einstellung des gewünschten pH-Werts und zu dessen Aufrechterhaltung während der Bestimmung SJ

können verschiedene Puffer verwendet werden. Beispiele dafür sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Bar- 20 ;|i bitalpuffer. Die Wahl des Puffers ist an sich für das erfindungsgemäße Verfahren nicht kritisch, jedoch können in ja;

manchen Fällen bestimmte Puffer bevorzugt werden. '; ·'

Bei bestimmten Liganden und Fluorescern können geringe aber beachtenswerte Mengen an nicht spezifi- :;;!

sehen Bindungen des Liganden oder Fluorescers an Protein erfolgen. Aus diesem Grund beträgt die Proteinkon- ;_;

zcntration des Testmediums vorzugsweise weniger als 1 Gewichtsprozent und insbesondere weniger als 25 ;■■; 0,5 Gewichtsprozent und vor allem weniger als 0,1 Gewichtsprozent. Die Gesamtproteinkonzentration der j.»

unbekannten Probe kann durch vorherige Ultrafiltration, Gelfiltration, Fällung, Dialyse oder ähnliche Vor- f«

behandlungen möglichst gering gehalten werden. f|

Im allgemeinen werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Tests mäßige und während des Tests kon- ||

stant bleibende Temperaturen angewendet. Im allgemeinen betragen die Temperaturen etwa 15 bis 40⁰C und 30 || vorzugsweise etwa 25 bis 40⁰C. Höhere Temperaturen sind nicht erwünscht, da sie die Bindung der Antikörper i|>

an die Epitope verringern. ψ

Zur Durchführung der Bestimmung wird die Testlösung in eine Fluorimeterzelle eingebracht. Die Wahl der '£

anregenden Wellenlänge hängt vom Fluorescer ab. Die spezielle Wellenlänge oder Bande von Wellenlängen, bei %

denen das Emissionsspektrum gemessen wird, hängt vom Emissionsmaximum und dem Ausmaß an Störungen 35 ;-\ durch Lichtstreuung ab. Vorzugsweise wird eine intensive Lichtquelle mit einer einzigen Wellenlänge verwen- ^

dct. Auf diese Weise können Störungen durch Lichtstreuungseffekte möglichst gering gehalten werden. Wert- i.

volle monochromatische Lichtquellen, die eine größere Intensität als übliche mit einem Monochromator ver- !;

bundene Lichtquelle ergeben, sind Niederdruck-Emissionslampen und Laser. .

Das im erfindungsgemäßen Test verwendete Hauptreagenz ist das konjugierte Molekül aus Ligandenanalo- 40 i gern und fluoreszierender Verbindung (Ligandenanaloges-Fluorescer). Dieses Molekül muß mit dem Liganden um die Rezeptorstellen konkurrieren oder zumindest in der Lage sein, spezifisch an Rezeptorstellen, die den Liganden binden, gebunden zu werden.

Die Bindungskonstante des Antiliganden für den Liganden soll sich von der Bindungskonstanten für das Ligandenanaloge nicht zu stark unterscheiden. Wenn der Ligand fluoresziert, sollte der Fluorescer bei der (den) 45 gemessenen Wcllenlänge(n) mindestens etwa 100 mal so groß sein wie die des Liganden bei der höchsten zu erwartenden oder gemessenen Konzentration. Die geringere Fluoreszenz des Liganden kann auf einem vom Fluorescer unterschiedlichen Absorptionsmaximum, einem unterschiedlichen Emissionsmaximum oder einer wesentlich geringeren Quantenausbeute beruhen.

Wie bereits erwähnt, gibt es für den Liganden große Variationsmöglichkeiten. Normalerweise weist er ein 50 Molekulargewicht von mindestens 110 und insbesondere von mindestens 125 auf, wobei nach oben keine Grenzen gesetzt sind, wenn auch im allgemeinen 10 Millionen nicht überschritten werden. Was den Liganden betrifft, so ist es wichtig, daß ein Rezeptor für den Liganden hergestellt werden kann oder zur Verfugung steht. Im allge- <·_,

meinen können Rezeptoren für die meisten organischen Verbindungen mit polarer Funktionalität hergestellt -"

werden. Verbindungen, für die Antikörper durch Bindung der Verbindung an eine Verbindung mit antigenen 55 Eigenschaften gebildet werden können, werden als Haptene bezeichnet. Verbindungen, die ohne chemische j

Modifikation die Antikörperbildung verursachen, werden als Antigene bezeichnet. In diesem Zusammenhang wird auf Kabat u. Mitarb., Experimental Immunochemistry, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1967, verwiesen.

Nicht-polymere Verbindungen von Interesse haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 125 bis 60 2000. Diese Verbindungen können sich in bezug auf Struktur, funktionelle Gruppen und physiologische Eigenschaften stark unterscheiden.

Es kann sich um acyclische, alicyclische oder heterocyclische, mono- und polycyclische, Verbindungen handeln. Als Heteroatome können Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Halogenatome, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Bor, Phosphor und Metallkationen der Gruppen IA und 2 A des Periodensystems enthalten sein. 65

Beispiele für Verbindungen mit funktioneilen Gruppen sind Alkohole, Äther, Carbonsäuren, Ester, Amide, Amine, d. h. primäre, sekundäre, tertiäre und quaternäre Amine, Halogenverbindungen, Nitrile und Mercaptoverbindungen. Im allgemeinen sind die Verbindungen ausschließlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff,

Stickstoff, Halogenatomen und Phosphor und insbesondere aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff zusammengesetzt. Bei Salzen sind die entsprechenden Metall- oder Ammoniumgegenionen vorhanden. Beispiele für heterocyclische Ringe, die vorhanden sein können, sind Pyrrol, Pyridin, Piperidin, Indol, Thiazol, Piperazin, Pyran, Cumarin, Pyrimidin, Purin, Triazin und Imidazol.

Aufgrund der großen Unterschiede der Verbindungen, die durch den erfindungsgemäßen Test bestimmt werden können, werden verschiedene, häufig künstliche Untergruppen gebildet, je nach der Anwesenheit von bestimmten funktioneilen Gruppen oder Ringstrukturen, aufgrund einer speziellen gemeinsamen Funktion oder aufgrund der Tatsache, daß die Verbindungen als eine Klasse erkannt wurden. Die Verbindungen der ersten Gruppe weisen eine Aminogruppe auf und zwar entweder als Teil eines heterocyclischen Rings oder als funktionelle Gruppe an einer aliphatischen Kette. Diese Verbindungen haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 110 bis 800 und insbesondere von etwa 125 bis 650.

Besonderes Interesse kommt unter den Verbindungen der ersten Gruppe den Alkaloiden und deren nach der Aufnahme gebildeten Stoffwechselprodukten zu. Eine wichtige Gruppe von Alkaloiden sind die Alkaloide der Morphingruppe. Beispiele dafür sind Morphin, Codein, Heroin und Morphin-glucuronid.

Verbindungen, die erfindungsgemäß als Reagenzien zum Nachweis von Morphinalkaloiden und deren Stoffwechselprodukten verwendet werden können, weisen zum großen Teil die folgende allgemeine Formel auf:

FlXO

NMe

HO

wobei X eine bindende Gruppe mit normalerweise 2 bis 8 Atomen (mit Ausnahme von Wasserstoff), insbesondere mit 2 bis 4 Atomen (mit Ausnahme von Wasserstoff), die nur Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatome enthält, bedeutet. Vorzugsweise ist eine Nicht-Oxocarbonylgruppe Teil der bindenden funktioneilen Gruppe. Fl bedeutet einen nachstehend erläuterten Fluorescer.

Beispiele für bindende Gruppen sind die Acetamido-, Acetimidino-, Succinat- oder Oxalatgruppe.

Eine weitere Gruppe von Alkaloiden sind die Kokainalkaloide, zu denen, insbesondere als Stoffwechselprodukte, Eenzoyl-ecgonin und Ecgonin gehören.

Eine weitere Gruppe von Alkaloiden sind die Cinchonaalkaloide, zu denen Chinin gehört.

Zu den Isochinolinalkaloiden gehört Mescalin.

Papaverin gehört zu den Benzylisochinolinalkaloiden.

Narcotin, Narcein und Cotarnin gehören zu den Phthalidisochinolinalkaloiden.
Beispiele für Indolpyridocolinalkaloide sind Yohimbin und Reserpin.

Beispiele für Ergotalkaloide sind Ergotamin und Lysergsäure.

Weitere Gruppen von Alkaloiden sind die Strychnin-, Pyridin-, Piperidin- und Pyrrolizidinalkaloide.

Von besonderem Interesse sind die Alkaloide, die zu den häufig mißbräuchlich verwendeten Arzneistöffen gehören, wie Morphin, Kokain, Mescalin und Lysergsäure. Emndungsgemäß lassen sich diese Verbindungen oder deren Stoffwechselprodukte, je nach der untersuchten physiologischen Flüssigkeit, analysieren.

Viele synthetische Arzneistoffe kommen in ihren physiologischen Eigenschaften ganz oder teilweise den natürlich vorkommenden, häufig mißbräuchlich verwendeten Arzneistoffen gleich. Dazu gehören Methadon, Meperidin, Amphetamin, Methamphetamin, Glutethimid, Diphenylhydantoin und Arzneistoffe aus der Gruppe der Benzdiazocycloheptane, Phenothiazi ; und Barbiturate.

so Catecholamine sind aufgrund ihrer physiologisc ien Eigenschaften von Interesse. Dazu gehören Epinephrin, Ephedrin, L-Dopa und Norepinephrin.

Ein weiterer Arzneistoff von Interesse ist der Tranquilizer Meprobamat.

Weitere Verbindungen von Interesse sind Tetrahydrocannabinol, Cannabinol und deren Derivate, hauptsächlich Verbindungen, die sich von Marihuana und seinen synthetischen Modifikationen und Stoffwechselprodukten ableiten. Von beträchtlichem Interesse sind auch die Steroide. Beispiele dafür sind Östrogene, Gestagene, Androgene, Nebennierendrindenhormone, Gallensäuren, Cardiotone, Glycoide, Aglycone, Saponine und Sapogenine.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen bilden die Vitamine, wie Vitamin A, Vitamine B, z. B. B,, B₆ und B₁₃, Vitamine E und Vitamin K.
Unter die Gruppe der Zucker fallen Mono- und Polysaccharide, insbesondere Di- und höhere Polysaccharide.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen stellen die Prostaglandine dar.

Beispiele für Verbindungen der Gruppe der Antibiotika sind Penicillin, Actinomycin und Chlormycetin. Einzelverbindungen von besonderem Interesse sind Serotonin, Spermin und Phenylbrenztraubensäure.

Beispiele für Verbindungen aus der Gruppe der Pestizide sind Fungizide, Insektizide, Bakterizide und Nematozide.

Aminosäuren, Polypeptide und Proteine bilden eine weitere Gruppe. Polypeptide enthalten im allgemeinen etwa 2 bis 100 Aminosäureeinheiten (Molekulargewicht im allgemeinen unter 12 000). Größere Polypeptide werden Proteine genannt und bestehen im allgemeinen aus etwa 1 bis 20 Polypeptidketten. Polypeptide und

Proteine werden zusammmenfassend als Polyaminosäuren bezeichnet. Unter den Aminosäuren sind die Tri- und Tetrajodthyronine von besonderem Interesse. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verfahren, das sich zweier Antikörper als Reagenzien bedient, verwendeten Polyaminosäuren weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 10⁷ und insbesondere 10⁴ bis 10⁶ auf. Unter den Polypeptiden und Proteinen (Polyaminosäuren) sind Hormone, Globuline, Antigene und Produkte mit speziellen physiologischen s Aktivitäten von besonderem Interesse.

Die große Gruppe von Proteinen läßt sich in Proteine mit ähnlichen strukturellen Eigenschaften, Proteine mit speziellen biologischen Funktionen und in Proteine, die in Beziehung zu spezifischen Mikroorganismen, insbe-, sondere krankheitserregenden Mikroorganismen, stehen, unterteilen.

Die folgenden Proteine weisen jeweils eine verwandte Struktur auf: Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Skleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nucleoproteine, nicht klassifizierte Proteine, wie Somatotropin, Prolactin, Insulin und Pepsin.

Eine Anzahl von Proteinen, die im menschlichen Plasma vorkommen, sind von besonderer klinischer Bedeutung:

Priialbumin, Albumin, «i-Lipoprotein, «(-saures Glycoprotein, ar|-Antitrypsin, «pGlycoprotein, Transcortin, 4,6S-Postalbumin, tryptophanarmes «i-GIycoprotein, ffpx-Glycoprotein, Thyroxinbindendes Globulin, [nter-ff-trypsin-lnhibitor, Gc-Globulin: (Gc 1-1), (Gc 2-1), (Gc 2-2); Haptoglobin: (Hp 1-1), (Hp 2-1), (Hp 2-2); Ceruloplasmin, Cholinesterase, a₂-Lipoprotein(e), ^-Macroglobulin, ^-HS-Glycoprotein, Zn-a₂-Glycoprotein, arj-Neuramino-glycoprotein, Erythropoietin, jß-Lipoprotein, Transferrin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen, j3₂-Glycoprotein I, ./fe-Glycoprotein II, Immunglobulin G, (IgG) oder y G-Globulin der Formeln y₂/c₂ oder γ₂λ₂, Immunglobulin A (IgA) oder yA-Globulin der Formeln (Or₂K₂)" oder (α₂λ₂)^η, Immunglobulin M (IgM) oder yM-Globulin der Formeln (μ₂κ₂)⁵ oder (μ₂Λ₂)⁵, Immunglobulin D (IgD) oder yD-Globulin (yD) der Formeln ((S₂K₂) oder (δ₂λ₂), Immunglobulin E (IgE) oder yE-Globulin (yE) der Formeln (ε₂λ₂), freie leichtkettige Komplementfaktoren: Cl: CIq, CIr und CIs, C2, C'3 und α₂Ό, C'4, C'5, C6, C'7, C'8 und C'9.

Nachstehend sind wichtige Blutgerinnungsfaktoren zusammengestellt:

Nachstehend sind Beispiele für wichtige Proteinhormone aufgeführt:

Peptid- und Proteinhormone:

Parathyroidhormon (parathormone), Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, MeIanotropin (melanozytenstimulierendes Hormon, Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon), Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon), Thyrotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon (Interstitialzellen-stimulierendes Hormon), luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Prolactin), Gonadotropin (chorionisches Gonadotropin).

Gewebshormone:

Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin, Human-Piacenta-Lactogen.

Peptidhormone der Neurohypophyse:

Oxytocin, Vasopressin, Releasing-Faktor (RF): CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF.
Von Interesse sind ferner Mucopolysaccharide und Polysaccharide.

Internationale	Name
Bezeichnung
I	Fibrinogen
Il	Prothrombin
Ua	Thrombin
III	Gewebsthromboplastin
V und VI	Proaccelerin, Acceleratorglobulin
VII	Proconvertin
VIII	Antihämophiles Globulin (AHG)
IX	Christmas-Faktor, Plasma-Thromboplastin-Component (PTC)
X	Stuart-Prower-Faktor, Autoprothrombin III
XI	Plasma-Thromboplastin-Antecedent (PTA)
XII	Hagemann-Faktor
XIII	Fibrinstabilisierender Faktor

Spezielle Beispiele fur antigene Polysaccharide, die von Mikroorganismen abgeleitet sind, sind nachstehend aufgeführt:

Mikroorganismen-Species Hämosensitin gefunden in

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Streptococcus pyogenes Diplococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Corynebacterium diphtheriae

Actinobacillus mallei; Actinobacillus whitemori

Francisella tularensis

Pasteurella pestis Pasteurella pestis Pasteurella multocida Brucella abortus Haemophilus influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri Veillonella Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis

KJebsiella aerogenes

KJebsiella cloacae

Salmonella typhosa

Salmonella typhi-murium; Salmonella derby Salmonella pullorum

Shigella dysenteriae

Shigella flexneri

Shigalla sonnei

Rickettsiae

Candida albicans

Entamoeba histolytica Polysaccharid Polysaccharid Polysaccharid Polysaccharid Polysaccharid roher Extrakt

Lipopolysaccharid Polysaccharid Polysaccharid

kapsuläres Antigen roher Extrakt Polysaccharid

Polysaccharid Lipopolysaccharid Polysaccharid Polysaccharid Lipopolysaccharid Kochsalzlösung-Extrakt von 90% phenolextrahierten Mycobakterien und Polysaccharidfraktion von Zellen und Tuberculin Polysaccharid Polysaccharid Lipopolysaccharid, Polysaccharid Polysaccharid

Polysaccharid

roh, Poiysaccharid roher Extrakt Polysaccharid roher Extrakt

Weitere Verbindungen, Zellen, Viren und andere biologische Aggregate, die antigen wirken oder für die natürlich auftretende Rezeptoren gefunden werden können, lassen sich ebenfalls bestimmen.
¹ Die zur Bestimmung eingesetzten Mikroorganismen können intakt, lysiert, zermahlen oder auf andere Weise fragmentiert sein. Das erhaltene Produkt oder der Teil der Mikroorganismen werden beispielsweise durch Extraktion bestimmt. Beispiele für entsprechende Mikroorganismen sind nachstehend zusammengestellt:

Corynebacteria

Corynebacterium diptheriae

Pneumococci

Diplococcus pneumoniae

Streptococci

Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarus

Staphylococci

Staphylococcus aureus Staphylococcus albus

Ncisseriae

Neisseria meningii'dis Ncisseria gonorrheae

Enterobacteriaciae

Escherichia coli 1

Aerobacter aerogenes L coli form ige Bakterien

Klebsiella pneumoniae j

Salmonella typhosa Ί

Salmonella choleraesuis I Salmonellae

Salmonella typhimurium j

Shigella dysenteriae Shigella schmitzii Shigella arabinotarda Shigella flexneri Shigella boydii Shigella Sonnei

20

weitere enterische Bacillen

Proteus vulgaris j

Proteus mirabilis > Proteus

Proteus morgani J 25

Pscudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae

30

Hcmophilus-Bordetella-Gruppe

Hemophilus inftuenzae, H. ducreyi,

H. hemophilus,

H. aegypticus und

H. paraiufluenzae, Bordetella pertussis . 35

Pastcurellae

Pastcurella pestis Pasteurella tulareusis ' 40

Brucellae

Bruceila melitensis Bruceila abortus Bruceila suis

45

aerobe sporenbildende Bacillen Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus megaterium

Bacillus ce re us so

anaerobe sporenbildende Bacillen Clostridium botulinum Clostridium tetani

Clostridium perfringens 55

Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium tertium

Clnstridium hifermentans fin

Clostridium sporogenes

Mycobacteria

Mycobacterium tuberculosis hominis

Mycobacterium bovis 65

Mycobacterium avium Mycobacterium leprae Mycobacterium paratuberculosis

Actinomycetes (pilzähnliche Bakterien) Actinomyces israelii Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis

Spirochetes

Treponema pallidum Spirillum minus

10 Treponema pertenue Streptobacillus moniliformis

Treponema carateum Borrelia recurrentis Leptospira icterohemorrhagiae Leptospira canicola

Mycoplasmen

, Mycoplasma pneumoniae

weitere pathogene Mikroorganismen Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopaihiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis

Rickettsiae (bakterienartige Parasiten) Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetii Rickettsia quintana

Chlamydia (nicht klassifizierbare Parasiten bakerieller/viraler Art) Chlamydia-Agentien (Benennung unsicher)

Pilze

Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor corymbifer (Absidia corymbifera)

Rhizopus oryzae Ί

Rhizopus arrhizus > Phycomycetes

Rhizopus nigricans J

Sporotrichum scnenkii Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compacta Fonsecaea dermatitidis Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madureiia mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialosphora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Keratinomyces ajelloi Microsporum canis

10

Trichophyton rubrum Microsporum andouini

Viren 5

Adenoviren Herpes-Viren Herpes simplex _]0 Varicella (Chicken pox) Herpes Zoster (Shingles)

Virus B

Cytomegalovirus Pocken-Viren ^I5 Variola (smallpox)

Vaccinia

Poxvirus bovis Paravaccinia ₂₀ Molluscum contagiosum Picornaviren Poliovirus Coxsackievirus

ECHO-Virus ²⁵

Rhinoviruses

Myxoviren

Influenza (A, B, and C) Parainfluenza (1-4) 30 Mumps Virus Newcastle-Krankheit-Virus Masern-Virus Rinderpest-Virus Hundestaupe-Virus 35 Atmungs-Synzytium-Virus Röteln-Virus

Arboviren

östlicher Pferdeencephalitis-Virus _4Ü

westlicher Pferdeencephalitis-Virus

Sindbis-Virus Ch i kungunya-Virus Semliki-Wald-Virus Mayora-Virus ₄₅ St. Louis-Encephalitis-Virus California-Encephalitis-Virus Colorado-Tick-Fever-Virus Gelbfieber-Virus Dengue-Virus ₅₀

Reoviren

Reovirus Typen 1-3

Hepatitis

Hepatitis Α-Virus ⁵⁵ Hepatitis B-Virus Tumor-Viren Rauscher-Leukämie-Virus

Groß-Virus ⁶⁰

Maloney-Leukämie-Virus Friend-Leukämie-Virus Mäuse-Milchdrüsentumor-Virus Gellügel-Leukämie-Virus Rous-Sarkom-Virus ⁶⁵ Polyom-Virus Simian-Virus 40

Papillom-Virus

Is'

Beispiele für Mikroorganismenpräparate sind:

Streptococcus pyogenes, Protein Pasteurella pestis, Protein-Toxin Clostridium tetani, Toxoid

Clostridium perfringens, <z-Lscithinase Escherichia coli, Filtrate Treponema reiten, Proteinextrakt Corynebacterium diphtheriae, Toxin, Toxoid ίο Mycobacterium tuberculosis, Protein

M. tuberculosis, Cytoplasma M. tuberculosis, Kulturfiltrat und Tuberculin Mycoplasma pneumoniae, »rohes« Antigen

Von Interesse sind Verbindungen der allgemeinen Formel: Hap-X-Fl

in der X und Fl die vorstehende Bedeutung haben und Hap einen HaptenwirkstofTmit einem Molekulargewicht von etwa 125 bis 1200 bedeutet, der häufig einen aromatischen (carbocyclischen) Ring, der durch 2 oder 3 aliphatische KohlenstofTatome von einem Stickstoffatom, normalerweise einer Amino- oder Amidogruppe, getrennt ist. Unter diese Definition von Hap fallen insbesondere folgende Verbindungen:

1. HO

OH ίο

wobei α den Wert 0 oder 1 hat,

R ein Wasserstoffatom oder einen Alkoxylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet, A ein Wasserstoffatom oder zusammen mit der anderen Bindung eine Doppelbindung bedeutet und Φ eine Phenylgruppe bedeutet.

Spezielle Beispiele für bindende Gruppen sind die Carboxymethoxyimino-, Acetylglycyl-, Butyrylglycyl-, 20 _t<

Glycyl-, Crotonylglycyl-, Acetyl-, Crotonyl-, Succindioyl- und Oxalylgruppe.

In den meisten Fällen verdrängt das Ligandenanaloge ein Wasserstoffatom des Liganden unter Bildung einer Bindung zu einer verknüpfenden Gruppe. Beispielsweise kann bei Morphin das Wasserstoffatom der phenolischen Hydroxylgruppe durch eine Bindung zum Methylenrest einer Acetylgruppe ersetzt werden. Das Wasserstoffatom, das durch eine Bindung zu einer verknüpfenden Gruppe ersetzt wird, kann an ein aliphatisches oder 25 < aromatisches Kohlenstoffatom, ein Sauerstoffatom oder Stickstoffatom gebunden sein. In einigen Fällen kann eine Oxocarbonylgruppe die verknüpfende Stelle unter Modifikation der Oxocarbonylgruppe zu einer Oxingruppe darstellen. In anderen Fällen kann die Hydroxylgruppe eines Carboxylrests durch eine verknüpfende > Gruppe unter Bildung eines Esters oder Amids ersetzt werden.

Weitere Möglichkeiten sind die Einführung von funktioneilen Gruppen, wie von Hydroxylgruppen, aus denen 30 ' Äther gebildet werden können, oder Aminogruppen, aus denen Diazogruppen gebildet werden können. '

Ein sehr wichtiger Faktor für das Ligandenanaloge besteht darin, daß es eine ausreichende strukturelle Ahn- '

lichkeit zum Liganden aufweist, so daß es durch den Antikörper gegen den Liganden erkannt werden kann. Da die Art der Addition stark variieren kann, können die Bindungskonstanten für den Liganden und das Ligandenanaloge verschieden sein, sollen aber höchstens um den Faktor 10³, vorzugsweise höchstens 10², differieren. 35

Meistens hat das Ligandenanaloge in einem beträchtlichen, wenn nicht überwiegenden Teil des Molekularvolumens die gleiche oder im wesentlichen gleiche Struktur und Ladungsverteilung (räumliche und polare Organisation) wie der Ligand. Da häufig die Bindungsstelle für ein Hapten bei der Herstellung des Antigens zur Bildung von Antikörpern die gleiche ist, wie sie zur Bindung des Fluorescers verwendet wird, wird der gleiche Teil des Ligandenmoleküls, der die Schablone für den Antikörper zur Verfugung stellt, durch das Ligandenanaloge 40 bei der Bindung an den Fluorescer ausgesetzt. ^

Aufgrund der sterischen Hemmung bei der Anwesenheit eines Antikörpers, der die Bindung eines weiteren \

Antikörpers an den Ligandenanalogen-FIuorescer verhindert, ist die bindende Gruppe im allgemeinen relativ kurz. Im allgemeinen weist die bindende Gruppe weniger als 25 Ä, vorzugsweise weniger als 20 Ä und insbesondere weniger als 15 A auf. Im allgemeinen beträgt die Länge der bindenden Gruppe etwa 1,5 bis 10 Ä. 45

Im Fall von großen Molekülen (Makromolekülen), wie Polypeptide und Proteine, als Liganden, stehen an der Oberfläche des Moleküls eine Reihe von verschiedenen Epitopen zur Verfugung, von denen jedes einen komple- _;

mentären Antikörper hat. Wenn das Makromolekül mit dem Fluorescer konjugiert ist, gibt es normalerweise eine Mehrzahl von an das Makromolekül gebundenen Fluorescermolekülen. _; '■

Je nach der räumlichen Beziehung des Fluorescermoleküls zu einem Epitop kann eine sterische Hemmung 50 % der gleichzeitigen Bindung eines Antikörpers gegen das Ligandenepitop und eines Antikörpers gegen den '

Fluorescer verhindert werden oder nicht Normalerweise gibt es jedoch eine Mehrzahl von Paaren von Epitopstellen und Fluorescermolekülen, wo in verschiedenem Ausmaß eine sterische Behinderung zwischen zwei verschiedenen Antikörpern auftritt. Unter konjugierten Molekülen aus Ligandenanalogem und Fluorescer sind g Moleküle zu verstehen, bei denen mehrere Epitop-FIuorescer-Paare in geeigneter Nachbarstellung für eine ste- · 55 % rische Wechselwirkung vorhanden sind. Die einfachere Moleküle mit einem Epitop und einem Fluorescer S| betreffende Feststellung trifft normalerweise auf die in Makromolekülen vorhandenen Epitop-Fluorescer-Paare zu. ff

Bei der Wahl des Fluorescers müssen eine Reihe von Gesichtspunkten berücksichtigt werden. Wie bereits p,

erwähnt, wird die Wahl des Fluorescers in bestimmten Umfang durch den Liganden bestimmt. Somit ist ein ||

Gesichtspunkt der, daß der Fluorescer eine Absorption bei höheren Wellenlängen als ein fluoreszierender 60 % Ligand oder ein an einen Antikörper gebundener Ligand aufweist g

Zusätzlich zu den Gesichtspunkten, die den speziell zu bestimmenden Liganden betreffen, kommen weitere ti

Einschränkungen bei der speziellen Wahl des Fluorescers hinzu. Da in der Praxis in Abwesenheit von Quen- %

chcr-Konjugat eine Änderung im Emissionsspektrum als Folge der Bindung oder Nichtbindung an einen Anti- Vi

fluorescer auftritt, ist ein starker Umgebungseinfluß auf die Emissionsintensität bei einer bestimmten Wellen- 65 ^! länge erwünscht. Dies kann die Folge einer wesentlichen Veränderung der Quantenausbeute oder eine Veränderung im Emissions- oder Absorptionsspektrum beim Übergang von gebundenem zu ungebundenem Fluorescer ■-.\ sein. _:;

13 %

Da Proteine bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm absorbieren, sollte der Fluorescer ein Absorptionsmaximum oberhalb von 300, im allgemeinen oberhalb von 350 und insbesondere oberhalb von 400 nm haben. Der Extinktionskoeffizient sollte größer als 10, vorzugsweise größer als 10³ und insbesondere größer als 10⁴ sein. Ferner ist es wünschenswert, daß der Fluorescer eine große Stokes-Verschiebung aufweist. Dies bedeutet, daß vorzugsweise eine wesentliche Streuung oder Differenz in den Wellenlängen zwischen dem Absorptionsmaximum und dem Emissionsmaximum des Fluorescers besteht.

Bei physiologischen Flüssigkeiten tritt als weiterer Gesichtspunkt die nicht-spezifische Bindung von Fluorescer an Protein hinzu. Bevorzugte Fluorescer weisen eine möglichst geringe nicht-spezifische Bindung auf, so daß der vorwiegende oder alleinige Effekt, der auftritt durch die Bindung des Fluorescers an seinen Antikörper hervorgerufen wird.

In den vorerwähnten Arbeiten sind eine Reihe von Fluorescers beschrieben; vgl. Styrer, a. a. O.; und Brand u. Mitarb., a.a.O.

Eine Gruppe von Fluorescein mit einer Reihe der vorerwähnten erwünschten Eigenschaften sind die Xanthenfarbstoffe, einschließlich die von 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol abgeleiteten Fluoresceine und die von 3,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol abgeleiteten Rosamine und Rhodamine. Die Rhodamine und Fluoresceine weisen eine 9-o-Carboxyphenylgruppe auf und sind Derivate von 9-o-Carboxyphenylxanthhydrol.

Diese handelsüblichen Verbindungen mit Substituenten am Phenylrest können als Bindungsstelle oder Bindungsfunktionalität verwendet werden. Beispielsweise sind amino- und isothiocyanat-substituierte Fluoresceine erhältlich. Eine weitere Gruppe von fluoreszierenden Verbindungen sind die Naphthylamine mit einer Aminogruppe in der a- oder/f-Stellung, im allgemeinen in der ^Stellung. Beispiele für derartige Naphthylaminoverbindungen sind l-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, l-Anilino-8-naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidi-, nyl-6-naphthalinsulfonat. Bei den Naphthalinverbindungen läßt sich eine gewisse nicht-spezifische Bindung an Protein feststellen, so daß bei ihrer Verwendung Testmedien verwendet werden müssen, deren Proteinmenge möglichst gering gehalten wird.

Wie bereits erwähnt, kann die bindende Gruppe von einer funktioneilen Gruppe, die am Fluorescer vorhanden ist, oder einer funktioneilen Gruppe, die am Ligandenanalogen vorhanden ist, abgeleitet werden. U m für die notwendige Bindung zwischen den beiden Verbindungen zu sorgen, können entweder der Fluorescer oder das Ligandenanaloge modifiziert werden.

Die Quencher sind ebenfalls Farbstoffe, die so gewählt werden, das sie eine Absorptionsbande aufweisen, die mit der Emissionsbande des Fluorescers überlappt. Unter den Absorptions- und Emissionsbanden von Fluorescer und Quencher sind die im Testmedium beobachteten Banden, die durch das Testmedium und die Konjugation mit dem Protein beeinflußt sind, zu verstehen und nicht Banden, die in einer davon unterschiedlichen Umgebung auftreten. Die Verfahren zur Konjugation des Quenchers mit dem Rezeptor, im allgemeinen mit einem Antikörper, sind die gleichen wie zur Konjugation von Fluorescer mit Polypeptiden. Im allgemeinen ist mindestens 1 Quenchermolekül pro 100 000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors vorhanden, vorzugsweise 1 Quenchermolekül pro 75 000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors. Im allgemeinen ist höchstens 1 Quenchermolekül pro 1000, vorzugsweise pro 2000 und insbesondere pro 5000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptormoleküls vorhanden. Dabei kommt es vorwiegend auf die Löslichkeit an, da viele Farbstoffe eine geringe Löslichkeit in Wasser aufweisen und den Rezeptor unlöslich machen können.

Für Antikörper als Rezeptoren sind im allgemeinen etwa 2 bis 25, vorzugsweise 2 bis 20, insbesondere etwa 2 bis 16 und vor allem etwa 4 bis 16 Quenchermoleküle pro Antikörper vorhanden.

Für Fab-Fragmente liegen im allgemeinen 1 bis 16 und vorzugsweise 1 bis 12 Quenchermoleküle pro Fab-Fragment vor.

In den Beispielen 1 -8 wird die Herstellung bekannter Konjugate geschildert. In Beispiel 9 ist die Herstellung des neuen erfindungsgemäßen Konjugats beschrieben.

Beispiel 1
Herstellung eines Dansyl-BSA (Rinderserumalbumin)-Konjugats

In ein Scintillationsglas werden 10,0 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 und 500 mg Rinderserumalbumin (BSA; Miles Labs.; 7,8xlO~⁶ m) gegeben. Anschließend werden 100 mg l-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonylchlorid (DANSC; 3,7x 10~⁴ Mol; Seikagaku Kogyo Ko. Ltd., Japan) in 1 ml Aceton zugesetzt. Das Glas wird zugestöpselt, mit einer Aluminiumfolie bedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben und über Nacht bei mäßiger Geschwindigkeit geschüttelt. Am nächsten Morgen wird das überschüssige DANSC durch Filtration durch einen Baumwollbausch entfernt. Das Filtrat wird auf eine mit Sephadex G-25 beschickte Säule der Abmessungen 5x70 cm aufgesetzt und mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/Std. eluiert und in 9 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 57 bis 76 werden vereinigt (gelborangefarben) und durch Ultrafiltration durch Dow-Hohlfasem eingeengt. Die eingeengte Lösung weist einen Proteingehalt von 4 mg/ml auf. Diese Lösung wird auf eine NaCl-Konzentration von 0,15 m eingestellt und zur Sterilisation durch ein 0,25 μ Millipore-Filter filtriert. 2 ml-Proben werden zur Herstellung von Injektionsflüssigkeiten in sterile Ampullen gefüllt.

Aufgrund seiner Absorption bei 340 πΐμ läßt sich durch UV-Analyse des Dansyl-BSA-Konjugats die Anwesenheit von Daiisyl am BSA nachweisen. Unter Anwendung der experimentell bestimmten Extinktionskoeffi-

¹ zienten für Dansyl an Protein von ε = 3,3XlO³ wird die Haptenzahl dieses Konjugats zu 13,5 Dansyl/BSA bestimmt

Die Fluoreszenzeigenschaften dieses Konjugats werden kurz untersucht. Es werden folgende Parameter gefunden: Anregungsmaximum bei 338 πΐμ und Emissionsmaximum bei 498 πΐμ.

Beispiel 2
Herstellung eines Insulin-Dansyl-Konjugr.ts

In ein Scintillationsglas mit einem Gehalt an 3 ml gesättigtem NaHCO₃ werden 16,7 mg (2,9 XlO""⁶ Mol) Schweineinsulin gegeben. Die Lösung wird mit 9,8 mg (3,6 x 10"⁵MoI) DANSC, gelöst in 1 ml Dioxan, versetzt. Es bildet sich sofort ein gelber Niederschlag, der sich nach Zugabe von 0,5 ml Dioxan auflöst. Zur Beseitigung , eines sehr schwachen weißen Niederschlags (Carbonat) werden 0,5 ml H₂O zugegeben. Das Glas wird anschließend verschlossen, mit einer Aluminiumfolie abgedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben und über Nacht leicht geschüttelt. Am nächsten Morgen wird die Lösung mit Essigsäure auf den pH-Wert 5 angesäuert und sodann auf eine mit Sephadex G-IO beschickte Säule der Abmessungen 2,5 x 30 cm aufgesetzt. Man eluiert mit 0,2 m Essigsäure bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Std. Fraktionen von 1,6 ml Volumen werden aufgefangen. Es werden vier Peaks beobachtet. Der erste Peak (Fraktionen 17 bis 22) weist Fluoreszenz-Emissions- und Anregungsspektren auf, die typisch Tür Dansyl-Protein-Konjugate sind.

Beispiel 3
Herstellung eines Fluorescein-BSA-Konjugats

In ein Scintillationsglas werden 180 mg BSA (2,6 x 10~⁶ Mol); Pentex, kristallisiert), gelöst in 6 ml H₂O mit einem Gehalt an 180 mg K₂CO₃, gegeben. Anschließend werden 18,3 mg Fluorescein-isothiocyanat (FITC; 4,85 XIO⁵ Mol) zugegeben. Das Glas wird verschlossen, mit einer Aluminiumfolie abgedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben und über Nacht leicht bei Raumtemperatur geschüttelt. Am nächsten Morgen wird das Reaktionsgemisch mit 1 η HCl auf den pH-Wert 4 angesäuert, wobei sich ein schwerer Niederschlag bildet. Sodann wird mit 0,1 η NaOH auf den pH-Wert 8 alkalisch gemacht. Diese Lösung wird auf eine mit Sephadex G-IO beschickte Säule der Abmessungen 2,5 X 30 cm aufgesetzt und mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5,4 ml/Std. eluiert. Es werden Fraktionen von 0,9 ml Volumen aufgefangen. Die Fraktionen 43 bis 72 werden vereinigt. Die Haptenzahl wird aufgrund der UV-Absorption des Konjugats bei 493 ηΐμ unter Zugrundelegung eines Extinktionskoeffizienten für proteingebundenes Fluorescein von 7,2 x 10"⁴ berechnet. Es ergibt sich eine Haptenzahl von 14,5.

Beispiel 4

Herstellung eines Insulin-Fluorescein-Konjugats

In ein Scintillationsglas werden 35,1 mg Schweineinsulin (6,1 X 10"⁶MoI), gelöst in 3,5 ml 0,1 m Carbonatpufl'er vom pH-Wert 9,2 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl, gegeben. Die Lösung wird mit 4,8 mg FITC (1,2 x 10"⁵ Mol) versetzt. Das Glas wird zugestöpselt, mit einer Aluminiumfolie abgedeckt, in das Mittelloch eines Wirbelmischers gegeben und über Nacht leicht geschüttelt. Am nächsten Morgen wird das Gemisch mit 1 η HCI auf den pH-Wert 3 angesäuert (Blasenbildung). Der gebildete Niederschlag aus Fluorescein-thiocarbamylinsulin 4U wird anschließend mit 1 η NaOH basisch gemacht, bis er vollständig in Lösung gegangen ist. Die orangefarbene Lösung wird auf eine mit Sephadex G-IO beschickte Säule der Abmessungen 2,5 x 35 cm aufgesetzt und mit0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 mit einem NaCl-Gehalt von 0,15 m eluiert. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 12 m!/Std. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 2 ml aufgefangen. Die Fraktionen 24 bis 33 sind stark fluoreszierend und werden vereinigt. Diese Fraktionen werden direkt auf eine mit DEAE-Sephadex A-25 beschickte Säule der Abmessungen 2,5 x 30 cm, die vorher mit 0,05 m Tris-Puffer vom pH-Wert 7,1 mit einem Harnstoffgehalt von 7 m und einem NaCl-Gehalt von 0,1 m äquilibriert worden ist, aufgesetzt. Die EIution wird bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 12 ml/Std. mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0,1 m bis 1,0 m bei einem Gesamtvolumen von 500 ml vorgenommen. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 2 ml aufgefangen. Die Salzkonzentration wird auf 1,0 m gehalten, bis der letzte (vierte) Peak vollständig eluiert ist, was durch Absorptionsmessung bei 280 πΐμ festgestellt wird. Der erste Peak besteht aus von der Säule ausgewaschenen Produkten, der zweite aus nicht umgesetzten Insulin und sodann Mono-, Di- und Tri-fluorescein-insulin in der angegebenen Reihenfolge. Die Reinheit wird elektrophoretisch auf CAM mit Tris-Barbital-Puffer vom pH-Wert 8,8 bestimmt. Es wird 50 Minuten Strom bei 125 V angelegt. Angefärbt wird mit Ponceau S. Sämtliche Flecken sind fluoreszierend.

Beispiel 5
Herstellung eines Morphin-FIuorescein-Konjugats

In ein Reaktionsgefäß werden 68,8 mg (0,2 Millimol) O^Carboxymethylmorphin in 2 ml DMF gegeben. Das Gemisch wird auf -5°C abgekühlt und mit 26 μΐ (0,2 m Millimol) Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Anschließend wird das Gemisch 45 Minuten gerührt. Die erhaltene Lösung wird sodann langsam in Portionen von 0,05 ml zu 36 mg4-Aminofluorescein-hydrochlorid (σ-Isomer IIX HCl) in 1 ml Butanol (mit einem Eisbad gekühlt) gegeben. Vor dem Aufarbeiten wird das Gemisch 90 Minuten stehengelassen.

Sodann wird das Reaktionsgemisch direkt auf eine präparative dünnschichtchromatographische Platte aufgetragen und mit Chloroform, Methanol und Essigsäure (75 :50 :10) eluiert. Nach einer Wiederholung dieser Chromatographie wird das Produkt vom Kieselgel mit methanolischer Natriumhydroxidlösung extrahiert. Nach

dem Abdampfen des Methanols wird Wasser zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird gründlich gespült. Sodann wird das Produkt wieder in methanolischer Natriumhydroxidlösung gelöst und mit Wasser versetzt. Das Methanol wird abgedampft und der pH-Wert mit HCl auf 8,0 eingestellt. Man erhält eine Lösung des gewünschten Produkts.

Beispiel 6
Herstellung eines Thyroxin-Fluorescein-Konjugats

In ein Reaktionsgefäß werden 165 mg (0,2 Millimol) Methylthyroxinat-hydrochlorid, 8 ml frisch destilliertes Tetrahydrofuran und 15 ml wäßriger CarbonatpufTer (pH-Wert 9,2,0,1 m) gegeben. Nach dem Entgasen mit Stickstoff werden 77,8 mg (0,2 Millimol) FITC in 2 ml 1:1 Tetrahydrofuran/Carbonatpufler innerhalb von 5 Minuten unter Rühren zugesetzt. Der auf 7,8 abgefallene pH-Wert wird mit 2 η NaOH auf 9 eingestellt.

Das Gemisch wird über Nacht in einer Gefriertruhe aufbewahrt, sodann in ein Gemisch aus 20 ml Essigsäureäthylester und 20 ml 1 η HCl gegossen. Die Phasen werden getrennt. Die wäßrige Phase wird 1 mal mit 20 ml Essigsäureäthylester gewaschen. Die organischen Phasen werden vereinigt, 4 mal mit je 30 ml 1 η HCl und 2 mal mit je 200 ml Kochsalzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die flüchtigen Bestandteile werden unter vermindertem Druck entfernt.

Zur weiteren Reinigung wird das Produkt der präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 100 mg Kieselgel unterworfen. Das Laufmittel besteht zu 95 Volumprozent aus einem Gemisch aus 25 Volumprozent Diäthyläther und 25 Volumprozent Methylenchlorid und zu 5 Volumprozent aus Eisessig. Die mittlere Bande wird abgetrennt und mit Tetrahydrofuran extrahiert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels verbleiben 75 mg. Der Rückstand wird unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems und unter Verwendung von Kieselgel rechromatographiert. Man erhält 55 mg des gewünschten Produkts.

Beispiel 7
Herstellung eines Diphenylhydantoin-Konjugats an Fluorescein

Eine Lösung von 1-Carboxymethyldiphenylhydantoin in wasserfreiem Dimethylformamid wird unter Stickstoff tropfenweise mit 1 Moläquivalent SOCl₂ versetzt. Die Lösung wird sodann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Sodann wird 1 Äquivalent Triethylamin und Fluoresceinamin in wasserfreiem Dimethylformamid zugesetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden gerührt. Sodann wird das Lösungsmittel teilweise unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie [Kieselgel; Methanol: Chloroform = 1:1 (Volumenteile)] gereinigt. Die schnell wandernde fluoreszierende Bande besteht aus Diphenylhydantoin und dem gewünschten Produkt.

Beispiel 8
Konjugation mit N-Glycylfluoresceinamin

In 50 ml Essigsäureäthylester werden 1,04 g Fluoresceinamin suspendiert. Nach Zugabe von 1 Äquivalent Chloracetylchlorid wird das Gemisch unter Wasserausschluß 4 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Das als gelber Farbstoff ausgefallene Produkt wird durch präparative Dünnschichtchromatographie [Kieselgel; Chloroform : Methanol = 3:1 (Volumenteil)] gereinigt. Eine Lösung von 50 mg N-Chloracetylfluoresceinamin in 20 ml wasserfreiem Äthanol wird mit Ammoniak gesättigt. Das Gefäß wird sodann verschlossen. Das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man das gewünschte Produkt als gelben Farbstoff.

Eine Lösung der gewünschten Carbonsäure (1) und Triethylamin (2) in 0,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid wird bei - 10⁰C unter Rühren mit Chlorameisensäureisobutylester (3) versetzt. Nach ^]ή Stunde wird ein Überschuß an N-GIycylfluoresceinamin in wasserfreiem Dimethylformamid zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wird durch präparative Dünnschichtchromatographie [Kieselgel; Chloroform : Methanol = 1:1 (Volumteile)] gereinigt. Die schnell wandernde Bande enthält die gewünschte, fluoreszierende Verbindung.

(D

(2)

5-Phenyl-5-(4'-crotonsäure)-barbitursäure, 5 mg N-(5'-Carboxy-n-phentylcarbonyl)-dibenzazepin, 5 mg O-Carboxylmethyloxim von 3-Ketodigoxigenin, 5 mg

(3)

1,7	mg	2,3	mg
1,4	mg	1,9	mg
1,1	mg	1,5	mg

16

Beispiel 9 Konjugation von Rhodamin an Anti-(fluorescein)

1 ml Aliquotproben von Antiseren gegen Fluorescein werden bei 50prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat gefällt Der Niederschlag wird in 1 ml 0,1 m K₂HPO₄ gelöst und gegen die gleiche Lösung dialysiert Man erhält eine Lösung mit einer Konzentration von 9 mg/ml. Sodann werden 0,4 ml (3,6 mg) Anti-(fluorescein)-Antiseren und 0,17 ml Glycerin in ein Reaktionsgefäß gegeben. Der pH-Wert wird auf 9,5 gebracht Bei Raumtemperatur werden unter Rühren 0,8 mg Tetramethylrhodaminisothiocyanat in 100 μΐ Dimethylformamid zugegeben. Nach 3-stündiger Umsetzung wird die Lösung auf eine mit Sephadex LH-20 beschickte Säule der Abmessungen 0,9 X15 cm aufgesetzt Das Anti-(fluorescein) wird in einem Volumen von 1 ml gewonnen. ·

Die nachstehenden Versuche werden durchgeführt, um den praktischen Wert des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bestätigen. Dabei erhält man mit verschiedenen Instrumentenzellen unterschiedliche Ergebnisse, so daß absolute Werte nur bei Verwendung der gleichen Zellen verglichen werden können. Es wird ein Perkin-Elmer MPF-2a-Fluorimeter verwendet Antikörper gegen die Fluorescer werden nach üblichen Verfahren hergesteSlt Die Rinderserumalbumin-Konjugate werden Schafen injiziert. Nach Ablauf einer entsprechenden Zeit werden die Antikörper nach üblichen Verfahren geerntet Bezüglich der Verfahren zur Herstellung von Antikörpern wird auf folgende Literaturstellen verwiesen: Microbiology, Hober Medical Division, Harper and Rowe, 1969; Landsteiner, Specificity of Seriological Reactions, Dover Publications, New York, 1962; Kabat u. Mitarb., a. a. O; und Williams u. Mitarb., Methods in Immunology and Immunochemistry, Bd. 1, Academic Press, New York, 1967.

Folgende Reagenzien werden verwendet:

FLUMO (Fluorescein-Morphin-Konjugat, Beispiel 5) in Wasser in einer Korzeruration von 3 X \0'^h m; Antifluorescein mit einer Konzentration an bindenden Stellen von 5,6 X10"⁶ m in Wasser, 0,05 Phosphat, pH-Wert 8,0; Antimorphin mit einer Konzentration an bindenden Stellen von 2 x 10"⁴ m, 0,05 m Tris-HCl, pH-Wert 8,0, Kochsalzlösung; Puffer: Tris-Kochsalzlösung 0,05 m, pH-Wert 8,0. Opiatlösungen weisen 1000 ixg/ml Codein auf. Die Lösung wird sodann mit Puffer auf eine Endkonzentration von 4 ml verdünnt.

Sämtliche Bestimmungen werden bei der Empfindlichkeitsstufe 4 des Instruments durchgeführt. Die Lösungen werden in der Reihenfolge von links nach rechts, wie es in der nachstehenden Tabelle angegeben ist, vermischt. Das anregende Licht weist eine Wellenlänge von 460 nm auf. Das emittierte Licht wird bei 516 nm mit einer Bandbreite von 10 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Zelle Nr.	Fluorescein-	Anti-	Anti	Codein	Signal	Ablese
	Morphin,	fluorescein,	morphin,		intensität	zeit,
	VoI (μΙ)	VoI (μΙ)	VoI (μΐ)	VoI (μΙ)		min.
2	5	_	_	-	62
2	5	5	-	-	21
2	5	5	5	-	25
					26,5	5
					27,5	90
4	-	-	-	-	8
4	-	5	-	-	3,5
4	-	5	5	-	3,5
					5	5
					5,5	90
3	-	-	-	-	1,5
3	5	-	-	-	46
3	5	-	5	-	35,5
					35	5
3	5	5	5	-	23
					22,5	5
3	5	5	5	5	20
					16	90
1	-	-	-	-	11
I	-	-	5	-	14,5
I					14,5	5
1	-	5	5	-	5
I	-	5	5	5	5,5
					6	90

Bei Ablesungen in Abwesenheit von Material ist nur Puffer in der Zelle anwesend. Die Ablesezeiten geben die Zwischenräume vom Zeitpunkt der ersten Ablesung bis zur Ablesung des angegebenen Ergebnisses an. Die erste Ablesung wird möglichst rasch nach dem Mischen vorgenommen.

Die Ergebnisse zeigen daß dann, wenn keine Konkurrenz zwischen Codein und Fluorescein-Morphin stattfindet, die Ablesungen relativ stabil sind. In der Zelle Nr. 2 tritt eine Veränderung der Signalintensität von 2,5 Einheiten innerhalb von 90 Minuten ein, wobei eine Änderung von 1,5 Einheiten innerhalb der ersten 5 Minuten eintritt. Die Ergebnisse in der Zelle Nr. 4 zeigen, daß bei ausschließlicher Anwesenheit von Antikörpern die Hauptveränderung in der Ablesung innerhalb der ersten 5 Minuten eintritt, während innerhalb von 85 Minuten nur mehr eine Veränderung von 0,5 Einheiten eintritt. Die Ergebnisse in der Zelle 1 zeigen eine wesentliche Stabilität der Ablesungen, wenn Codein zu einem Gemisch der beiden Antikörper gegeben wird. Es tritt innerhalb von 90 Minuten nur eine Änderung von 0,5 Einheiten ein. Schließlich zeigen die Ergebnisse in der Zelle Nr. 3, daß bei beiden Antikörpern in Gegenwart von Codein und Fluorescein-Morphin eine Veränderung der Signalintensität von 6,5 Einheiten innerhalb von 90 Minuten erreicht wird.
Somit wird eine nachweisbare Veränderung der Fluoreszenz erreicht, wenn Codein in ein Gemisch aus FIuo-

is rescein-Morphin und Antikörpern zu Fluorescein und Morphin gegeben wird.

Weitere Untersuchungen werden mit dem Insulin-Fluorescein-Konjugat von Beispiel 4 durchgeführt.
Es läßt sich feststellen, daß bei Insulin nur das monosubstituierte Insulin immunologisch aktiv ist. Aus diesem Grund wird nur dieses für die Bestimmung verwendet Das Fluorescein-Insulin wird in einer Konzentration von 1 x]0~¹⁰ m in 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 eingesetzt Die verwendete Antiinsulinlösung weist

1 x 10"¹⁰ m bindende Stellen auf (Miles Lab.) Man läßt das Insulin bei 10"⁹ m 2 Tage lang in einem Kunststoffbehälter äquilibrieren und verwendet es dann in einer solchen Menge, daß die gewünschte Konzentration in der endgültigen Verdünnung erreicht wird. Das Insulin wird in Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,1 m CO₃ verwendet. Das Fluorescein-Insulin wird zu einer 2 X10"^l0 m Vorratslösung verarbeitet, die 2 Tage in 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert wird. Fluorescein-Insulin, Insulin und Antiinsulin werden vereinigt, mit Wasser verdünnt und sodann 1 Stunde inkubiert. Danach werden 120 μΐ Antifluorescein in einer Konzentration von 5,6 x 10~⁸ m an bindenden Stellen in 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 zugegeben. Die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien erfolgt von links nach rechts gemäß nachstehender Tabelle. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur. Die Versuche werden wiederholt, wobei die Reihenfolge der Zugabe so verändert wird, daß Insulin und Antiinsulin vor der Zugabe von Fluorescein-Insulin 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert werden und eine weitere 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur vorgenommen wird. Die Ergebnisse sind im wesentlichen die gleichen. Es wird die vorstehend angegebene Fluorimetereinrichtung verwendet. In der Tabelle II sind die Mengen von verschiedenen Materialien und die Veränderungen des Emissionsspektrums angegeben.

₃₅ Tabelle K

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß bei zunehmenden Insulinmengen eine Abnahme der Fluoreszenz beobachtet wird.

Schließlich wird auch mit einem Quencher konjugiertes Anti-(fluorescein) verwendet, nämlich mit Rhodamin konjugiertes Anti-(fluorescein).

Bei der Durchführung dieser Bestimmung werden 200 μΐ Puffer (0,1 m K₂HPO₄, pH-Wert 7,8,0,05 Prozent NaN₃) mit 30 μΐ mit Fluorescein konjugiertem MgG (1,6 x 10"⁹ m) bei einem Fluorescein/hlgG-Verhältnis von 14:1 vereinigt. Die vorgeschriebene Menge an Anti-(hlgG) und dieses Gemisch werden Vi Stunde bei Raumtemperatur inkubiei t. Anschließend werden 2,75 ml Puffer und 50 μΐ des mit Rhodamin konjugierten Anti-(fluoresceins) in einer Verdünnung von 1:10 zugegeben. Sodann wird die Fluoreszenz der Proben abgelesen. Die Konzentration an Anti-(hlgG) beträgt 2,4 mg/ml.

Tabelle III

Fluorescein-	Insulin	Antiinsulin	H2O	Endgültige	Fluoreszenz-
Insulin				Insulin	abnahme
				konzentration
(ml)	(ml)	(μ!)	(ml)	(mXlO"10)

2,0	—	10	2,0	—	0
2,0	0,4	10	1,6	1	. 16
2,0	2,0	10	-	5	21

Anti-(hlgG) Fluoreszenz

2	18,5
17,5	21,5
21,5	24,5
22,5	30,5
29,5	33,5
31,5

Daraus ergibt sich, daß das mit Rhodamin konjugierte Anti-(fluorescein) ein wirksamer Unterdrücker (Quencher) der Fluoreszenz ist Ferner geht aus dieser Tabelle hervor, daß erhöhte Mengen an Anii-(hIgG) einen erhöhten Schutz der Fluoreszenz gegen ein Quenchen durch Anti-(fluorcseein) bewirken.

Bei der nächsten Bestimmung werden unterschiedliche Konzentrationen an hlgG verwendet, um eine Konkurrenz des mit Fluorescein konjugierten hlgG um eine begrenzte Menge an Anti-(hlgG) zu bewirken. 100 al mit Fluorescein konjugiertes hlgG (1,6 x 10~⁹ m), 100 jxl MgG von verschiedenen Konzentrationen und 20 al Anti-ihlgG) in einer Konzentration von etwa 0,4 mg/ml werden vereinigt. Das Gemisch wird V2 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden 2,75 ml Puffer (vgl. oben) und 50 al mit Rhodamin konjugiertes AntHfluorescein), 1:10 verdünnt, zugegeben. Das Gemisch wird eine weitere '^Stunde inkubiert. Die Fluoreszenzablesungen werden nach einer ^lh Stunde durchgeführt In Tabelle IV sind die Ergebnisse zusammengestellt.

Tabelle IV

hlgG Fluoreszenz

(m)

85, 84

IXlO"⁷ 10, 9

IXlO"⁸ 10, 11

1X10"' 59,63

IXlO"¹⁰ 76,80

1X10" 82,87

Die Anwesenheit von hlgG bewirkt eine Bindung von Anti-(hlgG) und eine Verminderung des zur Verfugung stehenden Anti-(hlgG) für die Bindung an mit Fluorescein konjugiertem hlgG. Somit ist bei hohen hlgG-Kon-/entrationen das Fluorescein nicht durch die Anwesenheit von Anti-(hlgG) geschützt und durch das mit Rhodamin konjugierte Anti-(fluorescein) gequencht.

Aus den vorstehenden Untersuchungen ergibt sich, daß erfindungsgemäß ein sehr empfindlicher Test zur Verfügung gestellt wird, bei dem geringe Volumina mit sehr niedrigen Ligandenkonzentrationen auf ihre Anwesenheit an Liganden getestet werden können. Durch entsprechende Wahl der fluoreszierenden Verbindung (Fluorescet) und des Quenchers können eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Genauigkeit erreicht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Bestimmung von sehr unterschiedlichen Ligandentypen, wie kleincn Arzneistoffmolekülen mit einem Molekulargewicht von 100 bis 1000, Polypeptiden mit unterschiedlichen Molekulargewichten von etwa 500 bis zu um viele Größenordnungen höheren Werten sowie von anderen organischen Verbindungen, Techniken, die für herkömmliche Immuntests eingesetzt werden, eignen sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Tests. Dazu gehören beispielsweise die Herstellung der Antikörper, die Konjugation der Liganden an den Fluorescer und verschiedene Parameter zur Optimierung der Bindung von Antikörper an Liganden und Fluorescer.

Zur Durchfuhrung des erfindungsgemäßen Tests ist es besonders vorteilhaft, die Reagenzien in Testpackungen zur Verfügung zu haben, wo die relativen Verhältnisse so optimiert sind, daß eine maximale Empfindlichkeit des Tests erreicht wird. Durch derartige Testpackungen lassen sich Fehler durch das Bedienungspersonal verringern. Die vorbestimmten Verhältnisse der Reagenzien gewährleisten ein bestmögliches Ansprechen auf Veränderungen der zu analysierenden Konzentrationen. Die Reagenzien werden zweckmäßigerweise in Form von lyophilisierten Pulvern oder als wäßrige Konzentrate, unter Zusatz von Puffern, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Antioxidantien und dergl., zur Verfugung gestellt.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis eines Liganden oder Antiliganden in einer Probe, wobei man folgende Bestandteile in einem wäßrigen Medium vereinigt:

die Probe;

ein aus einem Ligandenanalogen und einer fluoreszierenden Verbindung (Fluorescer) gebildetes Konjugat (Ligandenanaloges-Fluorescer), wobei das Ligandenanaloge durch einen Antiliganden spezifisch erkennbar ist und das Ligandenanaloge und der Fluorescer genügend nahe durch eine bindende Gruppe aneinander gebunden sind, daß die gleichzeitige Bindung von Antiligand und einem Antikörper gegen den Fluorescer (Antifluorescer) sterisch gehemmt wird;

einen Antiligand zum Nachweis des Liganden; und einen Anitfluorescer;

und bei mindestens einer Wellenlänge die Intensität der Fluoreszenz in diesem Medium im Vergleich zu einem Standard mit bekannter Liganden- oder Antiligandenmenge bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Fluoreszenzlöscher (Quencher) konjugierten Antifluorescer verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Konjugat aus Quencher und Antifluorescer ein Verhältnis von Quencher zum Antifluorescer vorliegt, das im Durchschnitt einen Wert zwischen etwa 2 und 25 aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluorescer Fluorescein und der Quencher Rhodamin ist.

4. Konjugat aus einem Quencher und dem Antifluorescer zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Verwendung eines